DE3925748A1 - New recombinant deoxyribonucleic acid - from foot=and=mouth disease virus, for prodn. of attenuated virus particles, useful in vaccines - Google Patents
New recombinant deoxyribonucleic acid - from foot=and=mouth disease virus, for prodn. of attenuated virus particles, useful in vaccinesInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Plasmid, rekombinante DNA und Vektoren, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung zur Herstellung von infektiösen, intakten oder attenuierten Maul- und Klauenseuche-Viren und einen Impfstoff zur Immunisierung von Paarhufern gegen das Maul- und Klauenseuche-Virus.The invention relates to a plasmid, recombinant DNA and Vectors, a process for their preparation and their Use for the production of infectious, intact or attenuated foot-and-mouth disease viruses and one Vaccine to immunize artifacts against this Foot and mouth disease virus.
Die Maul- und Klauenseuche (MKS) ist weltweit eine der ökonomisch wichtigsten Krankheiten bei Rindern, Schwei nen und anderen Paarhufern. Sie wird durch MKS-Viren ausgelöst, die eine Gruppe nahe verwandter Erreger dar stellen. Man unterscheidet sieben serologisch nicht kreuzreagierende Typen, von denen drei in Europa und Südamerika vorkommen (A, C und O). In Afrika gibt es zusätzlich die drei Typen SAT I, SAT II und SAT III, und im Nahen Osten und in Rußland noch Asia I. Diese sero logisch unterschiedlichen Typen untergliedern sich ihrerseits in eine Reihe von serologisch untereinander kreuzreagierenden Subtypen (insgesamt mehr als 100). Die Viren sind sehr klein und einfach gebaut. Das Viruskap sid besteht aus einer Schicht von vier verschiedenen viralen Proteinen (VP1, VP2, VP3 und VP4) und umhüllt das Genom, eine Einzelstrang-RNA von ca. 8500 Nukleo tiden Länge.Foot-and-mouth disease (FMD) is one of the world's economically most important diseases in cattle, sweat and other paired hooves. It is caused by FMD viruses triggered, which represents a group of closely related pathogens put. One does not differentiate seven serologically cross-reacting types, three of which are in Europe and South America occur (A, C and O). There is in Africa additionally the three types SAT I, SAT II and SAT III, and in the Middle East and Russia still Asia I. This sero logically different types are subdivided in turn in a series of serologically with each other cross-reacting subtypes (more than 100 in total). The Viruses are very small and simply built. The virus cape sid consists of a layer of four different ones viral proteins (VP1, VP2, VP3 and VP4) and coated the genome, a single-stranded RNA of approximately 8500 nucleos tidal length.
Der größte Teil Europas und die USA sind mittlerweile zwar seuchenfrei, aber im Nahen Osten und vor allem in Südamerika und Afrika ist die MKS noch endemisch und trotz groß angelegter Impfaktionen nicht in den Griff zu bekommen. Die Ursachen dafür sind vielschichtig und hängen u. a. von geographischen Verhältnissen und von der richtigen Auswahl der Impfstämme ab. Der weltweite Bedarf an Impfstoff wird auf jährlich ca. 2×109 Dosen geschätzt.Most of Europe and the United States are now disease-free, but FMD is still endemic in the Middle East and especially in South America and Africa and, despite large-scale vaccination campaigns, cannot be dealt with. The causes of this are complex and depend, among other things, on geographical conditions and the correct selection of vaccine strains. The worldwide need for vaccine is estimated at approximately 2 × 10 9 doses annually.
Zur Herstellung von Vakzinen werden Viren in Gewebe- oder Organkultur gezüchtet, mit Chemikalien (Formaldehyd, Ethylenimin) inaktiviert und dann ver impft. Die chemische Inaktivierung der Viruspartikel ist kritisch. Zu starke Inaktivierung führt zum Verlust der immunogenen Eigenschaften, zu schwache Behandlung be wirkt, daß einige Viren überleben und zum Ausbruch der Krankheit führen.Viruses are used in the manufacture of vaccines in tissue or organ culture grown with chemicals (Formaldehyde, ethyleneimine) inactivated and then ver vaccinates. The chemical inactivation of the virus particles is critical. Too much inactivation leads to the loss of immunogenic properties, treatment too weak has the effect that some viruses survive and cause the outbreak of Lead disease.
Trotz der wegen dieser Problematik angewandten größten Vorsicht bei der Herstellung der Impfstoffe ist diese "klassische" Form der Vakzine suspekt und wird von vie len Ländern (z. B. Nordeuropa, USA, Teile von Argenti nien und Chile) nicht eingesetzt, sondern man hilft sich im Falle eines Ausbruchs durch radikales Abschlachten der kranken Rinder und Schweine und aller möglicherweise in Kontakt gekommener Tiere. Alternativ zu dieser Tot vakzine werden in manchen Ländern auch attenuierte Virusstämme eingesetzt. Sie stehen jedoch aufgrund der starken antigenen Variationen des Virus bei weitem nicht für alle Serotypen zur Verfügung. Ihre Herstellung bedarf oft jahrelanger Passagen eines Virus durch nicht natürliche Wirte (Hühnerembryonen oder Babymäuse) und oft gelten sie als unsicher, d. h. sie zeigen eine gewisse Tendenz zur virulenten Ausgangsform zu rever tieren.Despite the largest used because of this problem Care should be taken when preparing the vaccines "Classic" form of the vaccine is suspect and is used by many countries (e.g. Northern Europe, USA, parts of Argenti nien and Chile) not used, but one helps oneself in the event of an outbreak by radical slaughter the sick cattle and pigs and all possibly animals that have come into contact. Alternative to this dead vaccines are also attenuated in some countries Virus strains used. However, they are due to the strong antigenic variations of the virus are nowhere near available for all serotypes. Your manufacture often does not require years of passage of a virus through natural hosts (chicken embryos or baby mice) and they are often considered unsafe; H. they show one certain tendency towards the virulent starting form to rever animals.
Seit der Etablierung der Gentechnologie wurde versucht, eine alternative "Teilvakzine" zu entwickeln, die kein potentiell infektiöses Material mehr enthält. Die Idee bei der Konstruktion solch einer Vakzine war, immunolo gisch relevante Bereiche des Virus gentechnologisch darzustellen und als Impfstoff einzusetzen. Besonders geeignet für diesen Zweck schien das Hüllprotein VP1 zu sein, da mehr als 90% aller Virus-neutralisierender Antikörper in infizierten Tieren gegen dieses Protein gerichtet sind (Pfaff et al., EMBO J. 1, (1982), 869) .Since the establishment of genetic engineering, attempts have been made to to develop an alternative "partial vaccine" that does not potentially contains more infectious material. The idea in the construction of such a vaccine was immunological genetically relevant areas of the virus to be presented and used as a vaccine. Especially the coat protein VP1 seemed to be suitable for this purpose be as more than 90% of all virus neutralizing Antibodies against this protein in infected animals are directed (Pfaff et al., EMBO J. 1, (1982), 869).
Dieses Protein wurde in verschiedenster Form, meist als Fusion mit einem Teil eines bakteriellen Gens in E. coli exprimiert und in Kombination mit unterschiedlichen Ad juvantien an Rinder verimpft. Am wirksamsten waren Tan demfusionen bestimmter Teile dieses Proteins, speziell für die Serotypen A und C. Die immunologische Schutz wirkung erreichte aber bei weitem nicht die Höhe der klassischen Vakzine. Erfolgreicher waren Versuche der Vakzinierung mit synthetischen Peptiden, die von den auf dem VP1 lokalisierten antigenen Determinanten abgeleitet worden waren. Es gab wiederholt Publikationen, die von dem erfolgreichen Schutz von Rindern vor Infektion mit Hilfe solcher Peptide berichteten (Bittle et al., Nature 298 (1982) 30; DiMarchi et al., Science 232 (1986) 639- 640). Allerdings waren diese Resultate in keinem Fall reproduzierbar und auch hier lag die Schutzwirkung noch wesentlich unter der der Virusvakzine. Es bedarf einer oder zweier Wiederholungsimpfungen, um einen vollstän digen Schutz zu erreichen und das ist für Feldbedingun gen nicht akzeptabel. An diesem Ansatz einer Vakzineentwicklung wird heute noch geforscht. Man ver sucht vor allem, die Kombination bzw. Fusion von Pepti den aus verschiedenen Bereichen von VP1 und auch andere Strukturproteine (VP2, VP3). Die Erfolgseinschätzung ist unter Fachleuten jedoch eher negativ, was daran abzule sen ist, daß bekannte Firmen diese Forschung eingestellt haben.This protein was in various forms, mostly as Fusion with part of a bacterial gene in E. coli expressed and in combination with different ad juveniles vaccinated on cattle. Tan was the most effective demulsions of certain parts of this protein, specifically for serotypes A and C. The immunological protection However, the effect did not reach the level of classic vaccine. Attempts by the Vaccination with synthetic peptides, based on the derived from VP1 localized antigenic determinants had been. There have been repeated publications by the successful protection of cattle against infection with With the help of such peptides (Bittle et al., Nature 298 (1982) 30; DiMarchi et al., Science 232 (1986) 639- 640). However, these results were not in any case reproducible and the protective effect was still there significantly below that of the virus vaccine. One is needed or two re-vaccinations to make one complete to achieve protection and that is for field conditions not acceptable. At this approach one Vaccine development is still being researched today. One ver Above all, looking for the combination or fusion of Pepti from different areas of VP1 and others Structural proteins (VP2, VP3). The success assessment is among experts, however, rather negative, what can be seen sen is that well-known companies stopped this research to have.
Der unzureichende Immunschutz, der durch die rekombi nanten Impfstoffe erreicht wird, scheint im Falle des MKS-Virus darin begründet zu sein, daß die relevanten antigenen Strukturen sehr komplex sind, was sich u.a. darin zeigt, daß isolierte Hüllproteine oder zu stark chemisch inaktivierte Viruspartikel nur eine geringe Immunogenität besitzen. Die "richtigen", d. h. für die Induktion einer Immunität optimalen antigenen Strukturen sind offensichtlich nur auf den intakten Viren ausge bildet und beruhen auf der richtigen Anordnung und Faltung aller Hüllproteine. Solche Strukturen gentech nologisch zu imitieren ist zur Zeit noch nicht möglich.The insufficient immune protection caused by the recombi vaccines achieved, appears in the case of FMD virus to be based on the fact that the relevant antigenic structures are very complex, which among other things in it shows that isolated coat proteins or too strong chemically inactivated virus particles only a small one Possess immunogenicity. The "right", i.e. H. for the Induction of immunity to optimal antigenic structures are obviously only out for the intact viruses forms and are based on the correct arrangement and Folding of all coat proteins. Such structures gentech Imitating ecologically is not yet possible.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, auf alternative Weise unter Verwendung der heutigen gen technologischen Möglichkeiten das Problem der Impf stoffherstellung zu lösen sowie Möglichkeiten zur Impfung gegen verschiedene Virus-Serotypen zu eröffnen.The object of the present invention was therefore to alternative way using today's gen technological possibilities the problem of vaccination to solve fabric manufacturing and ways to Open vaccination against various virus serotypes.
Gelöst wird die Aufgabe durch die erfindungsgemäße re kombinante DNA, die die in pFMDV-YEP-poly-C als Insert enthaltene cDNA des Maul- und Klauenseuche-Virus ein schließlich der homopolymeren Cytidylsequenz (poly-C- Bereich), oder eine davon nur im Rahmen der natürlichen Variation des Virus abweichende DNA-Sequenz enthält.The object is achieved by the re Combined DNA which is inserted into pFMDV-YEP-poly-C as an insert included foot and mouth disease cDNA finally the homopolymeric cytidyl sequence (poly-C- Area), or one of them only in the context of natural Variation of the virus contains different DNA sequence.
Da RNA-Viren keine sogenannten proof-reading-Mechanismen haben, die - wie bei doppelsträngiger DNA möglich - die korrekte Sequenz des Virus überprüfen und gegebenenfalls Fehler korrigieren können, kann es nämlich bei RNA-Viren schon mal zum Austausch einzelner Nukleotide kommen, ohne daß dadurch in der Mehrzahl der Fälle die Virulenz oder Serospezifität beeinflußt würde.Because RNA viruses do not have so-called proof-reading mechanisms have - as is possible with double-stranded DNA - the check the correct sequence of the virus and if necessary RNA viruses can correct errors ever come to exchange individual nucleotides, without the virulence in most of the cases or serospecificity would be affected.
Die Klonierung einer vollständigen cDNA vom Maul- und Klauenseuche-Virus (MKS-Virus), wie sie bereits für eine Reihe anderer Picornaviren durchgeführt wurde, gelang trotz großer Anstrengung bisher in keinem Labor. Durch das in der Folge beschriebene erfindungsgemäße Verfahren wurde es erstmals ermöglicht, eine vollständige Kopie des kodierenden Teils des Maul- und Klauenseuchevirus zu erhalten, nämlich im besonders bevorzugten Plasmid pFMDV-YEP-poly-C und diese auch in E. coli zu klonieren. Von der cDNA kann - in vitro oder in vivo - mit Hilfe von RNA-Polymerase wieder eine vollständige RNA-Kopie transkribiert werden. Diese RNA führt in permissiven Animalzellen zur Produktion intakter Viruspartikel. Diese Möglichkeit der Rekonstituierung eines RNA-Virus aus klonierter cDNA wurde erstmals für das Poliovirus nachgewiesen (V.R. Racaniello und D. Baltimore, Science 214 (1981) 906-909).The cloning of a complete cDNA from the foot and Claw disease virus (FMD virus), as it has for one A number of other Picornaviruses were carried out successfully despite great efforts so far in no laboratory. By the inventive method described below it was possible for the first time to make a complete copy of the coding part of the foot and mouth disease virus obtained, namely in the particularly preferred plasmid pFMDV-YEP-poly-C and also to clone them in E. coli. The cDNA can - in vitro or in vivo - with the help a complete copy of RNA from RNA polymerase be transcribed. This RNA results in permissives Animal cells for the production of intact virus particles. This possibility of reconstituting an RNA virus cloned cDNA became the first for the poliovirus proven (V.R. Racaniello and D. Baltimore, Science 214 (1981) 906-909).
Die erfolgreiche Konstruktion dieses cDNA-Klones bzw. die Möglichkeit, aus klonierter DNA Viren erzeugen zu können, bedeutet zwar nicht, daß die auf diese Weise erzeugten Viren bereits Vakzinestämme sind. Dieser Klon ist jedoch eine hervorragende Ausgangsbasis dafür, solche attenuierten Stämme zu erzeugen.The successful construction of this cDNA clone or the ability to generate viruses from cloned DNA may not mean that in this way generated viruses are already vaccine strains. That clone is an excellent starting point for to produce such attenuated strains.
Die erfindungsgemäße rekombinante DNA führt zu replika tionsfähigen Viruspartikeln. Durch die zusätzlichen Linkersequenzen links und rechts des poly-C-Bereichs entsprechen diese Viren allerdings nicht genau dem Wildtyp. Ihre Vermehrung in BHK-Zellen entspricht zwar der des Wildtyps, ihr Virulenzverhalten gegenüber Baby mäusen ist aber etwa zehnfach niedriger. Es ist daher bevorzugt, die zusätzlichen Linkersequenzen durch an sich bekannte Methoden zu entfernen, wonach zu erwarten ist, daß die Virulenz des Wildtyps erhalten wird.The recombinant DNA according to the invention leads to replicas capable virus particles. Through the additional Left sequences to the left and right of the poly-C area however, these viruses do not exactly match that Wild type. Their increase in BHK cells corresponds that of the wild type, their virulence behavior towards babies mice is about ten times lower. It is therefore preferred, the additional linker sequences by an to remove known methods, what to expect is that the virulence of the wild type is preserved.
Die erfindungsgemäße bevorzugte rekombinante DNA enthält 19 Cytidylreste in ihrem poly-C-Bereich. Die Länge des poly-C in einzelnen, nach Transfektion enthaltenen und klonierten Viren wies überraschenderweise poly-C- Bereiche zwischen 50 und 180 Nukleotiden auf. Die Länge dieses homopolymeren Bereichs muß sich also im Laufe der Etablierung stabiler replikationsfähiger Viren mit Hilfe eines bisher unbekannten molekularen Mechanismus verän dern können. Die spontane Veränderung des poly-C- Bereichs ist allerdings nicht ganz unerwartet. Sie wurde auch schon bei natürlichen Virus-Isolaten beobachtet (Costa Giomi et al., J. Virol. 51 (1984) 799-805).The preferred recombinant DNA according to the invention contains 19 cytidyl residues in their poly-C region. The length of the poly-C in individual, contained after transfection and cloned viruses surprisingly showed poly-C Ranges between 50 and 180 nucleotides. The length this homopolymeric area must therefore change in the course of Establishment of stable replication-capable viruses with the help of a previously unknown molecular mechanism can. The spontaneous change of the poly-C- However, the range is not entirely unexpected. she got already observed with natural virus isolates (Costa Giomi et al., J. Virol. 51 (1984) 799-805).
Die erfindungsgemäße rekombinante DNA kann daher in ihrem poly-C-Bereich anstelle der in pFMDV-YEP-poly-C enthaltenen Anzahl eine beliebige Zahl von Cytidylresten zwischen 10 und 150, vorzugsweise 15 bis 50 Cytidylreste aufweisen.The recombinant DNA according to the invention can therefore in its poly-C region instead of that in pFMDV-YEP-poly-C contain any number of cytidyl residues between 10 and 150, preferably 15 to 50, cytidyl residues exhibit.
Zur Erzeugung attenuierter Virusstämme werden in der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA, vorzugsweise in einem Teil der Maul- und Klauenseuche-Virus-cDNA, der nicht für ein Hüllprotein des Virus kodiert, eine oder mehrere Deletionen von einem oder mehreren Nukleotiden erzeugt. Da zur Herstellung attenuierter Stämme für die verschiedenen Serotypen des Virus die für die Hüllpro teine kodierende Region des Genoms später durch ent sprechende cDNA anderer Serotypen ersetzt werden soll, wird vorzugsweise dieser Bereich nicht verändert.To generate attenuated virus strains, the recombinant DNA according to the invention, preferably in a part of the foot and mouth disease virus cDNA, the not encoded for a coat protein of the virus, one or multiple deletions from one or more nucleotides generated. As for the production of attenuated strains for the different serotypes of the virus for the envelope pro a coding region of the genome later through ent speaking cDNA of other serotypes should be replaced, this area is preferably not changed.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Er findung enthält daher die rekombinante DNA eine oder mehrere Deletionen im 3A-Gen (siehe Fig. 1) und insbesondere zwischen den Positionen 90 und 800 der Maul- und Klauenseuche-Virus-DNA-Sequenz.In a particularly preferred embodiment of the invention, the recombinant DNA therefore contains one or more deletions in the 3A gene (see FIG. 1) and in particular between positions 90 and 800 of the foot-and-mouth disease virus DNA sequence.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Er findung sind in der rekombinanten DNA die die Serospe zifität bestimmenden Gene (nämlich der Spezifität 0) gegen diejenigen der DNA eines Maul- und Klauenseuche- Virus mit anderer Serospezifität ausgetauscht.In a further preferred embodiment of the Er in the recombinant DNA are the serospe genes determining specificity (namely specificity 0) against those of a foot-and-mouth disease DNA Virus with another serospecificity exchanged.
Durch Austausch der entsprechenden Serospezifitäts-be stimmenden Gene werden nach der oben beschriebenen Her stellung von Viren aus der rekombinanten DNA Virusstämme mit anderer Serospezifität erhalten, wobei der gege benenfalls attenuierte Charakter des Ausgangsstammes im wesentlichen beibehalten bleibt. Für die praktische An wendung heißt das, daß ein einmal festgelegter atte nuierter Charakter eines Virusstamms auf rekombinanter DNA-Ebene auf alle anderen Serotypen übertragbar ist.By exchanging the corresponding serospecificity tuning genes are according to the Her Provision of viruses from the recombinant DNA virus strains obtained with a different serospecificity, the opp also attenuated character of the parent strain in the remains essentially unchanged. For practical use This means that once a record has been defined nuanced character of a virus strain on recombinant DNA level is transferable to all other serotypes.
Mit der erfindungsgemäßen, die vollständige cDNA ent haltenden rekombinanten DNA hat man somit das Vehikel an der Hand, attenuierte Viren nicht nur für diesen einen, sondern auch für alle anderen Serotypen zu konstruieren.With the invention, the complete cDNA ent The recombinant DNA holding the vehicle is thus on hand, attenuated viruses not only for this one, but also to construct for all other serotypes.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Plasmid konstruktion, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie aus einem in prokaryontischen oder/und eukaryontischen Wirtszellen selbständig replikationsfähigen DNA-Molekül besteht, in das sie einligiert eine rekombinante DNA enthält, die sie unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors zu transkribieren in der Lage ist.Another object of the invention is a plasmid construction, which is characterized in that it from one in prokaryotic and / or eukaryotic Host cells independently replicable DNA molecule exists in which it ligates a recombinant DNA contains them under the control of an appropriate one Promoter is able to transcribe.
Für die Vermehrung der rekombinanten cDNA in Bakterien kommen als bevorzugte Ausführungsform der Erfindung Plasmide oder R-Vektoren in Frage, für die Vermehrung in Hefezellen in erster Linie Derivate des 2 Mikron- Circels (Broach et al., (1983) in Experimental Manipu lation of Gene Expression, Herausgeb. Inouye, M., Academic Press, Inc., N.Y., S. 83) und für Animalzellen virale oder Virus-abgeleitete Vektoren. For the propagation of recombinant cDNA in bacteria come as a preferred embodiment of the invention Plasmids or R-vectors in question for propagation in yeast cells primarily derivatives of the 2 micron Circels (Broach et al., (1983) in Experimental Manipu lation of Gene Expression, Ed. Inouye, M., Academic Press, Inc., N.Y., p. 83) and for animal cells viral or virus-derived vectors.
In einer speziell bevorzugten Ausführungsform für die Darstellung einer für die Transfektion geeigneten RNA in vitro enthält der Vektor den SP6-Promotor. Für die Dar stellung von für die Transfektion geeigneter RNA in vivo (in Hefe) enthält der Vektor vorzugsweise den Gal 10 Promotor.In a particularly preferred embodiment for the Representation of an RNA suitable for transfection in The vector contains the SP6 promoter in vitro. For the dar provision of RNA suitable for transfection in vivo (in yeast) the vector preferably contains the gal 10 promoter.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist das Plasmid pFMDV-YEP-poly-C, DSM 5453, hinterlegt am 21.07.1989 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorga nismen in Braunschweig.A particularly preferred embodiment of the invention the plasmid pFMDV-YEP-poly-C, DSM 5453, is deposited on July 21, 1989 at the German Collection for Mikroorga nisms in Braunschweig.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen rekombinanten DNA, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Maul- und Klauenseuche-Virus-Genom zunächst in zwei Teil stücken, nämlich den Bereichen vor und hinter dem poly- C-Bereich in getrennten Ansätzen kloniert, beide Teile anschließend isoliert, über eine Linker-Sequenz ver knüpft, nachträglich eine poly-C-Sequenz in diesen Lin ker insertiert und gegebenenfalls die Linker-Sequenz sowie andere Sequenzen zur Erzeugung der Deletionen nach an sich bekannten Methoden entfernt.Another object of the invention is a method for the production of a recombinant according to the invention DNA, which is characterized by the fact that the mouth and claw disease virus genome initially in two parts pieces, namely the areas in front of and behind the poly C area cloned in separate approaches, both parts then isolated, ver via a linker sequence attaches a poly-C sequence to this line ker inserted and optionally the linker sequence as well as other sequences for generating the deletions known methods removed.
Wie bereits oben ausgeführt, war es bisher nicht gelun gen, eine vollständige cDNA des MKS-Virusgenoms zu klo nieren. Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es jetzt jedoch möglich, zu einer derartigen vollständigen viralen cDNA zu gelangen.As already mentioned above, it has not been successful so far gene to cloak a complete cDNA of the FMD virus genome kidneys. It is through the method according to the invention however now possible to such a complete viral cDNA.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Entfernung von Linker-Sequenzen oder zur Deletion vorgesehenen Se quenzen über gerichtete Mutagenese bewirkt, und gege benenfalls der Austausch der die Serospezifität bestimmenden Gene nach an sich bekannten Methoden (z. B. mit Hilfe von Restriktionsschnittstellen oder über ho mologe Rekombination) vorgenommen.In a preferred embodiment, the removal of linker sequences or Se intended for deletion sequences via directed mutagenesis, and counter also the exchange of the serospecificity determining genes according to methods known per se (e.g. with the help of restriction interfaces or via ho mologe recombination).
Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Vektors inser tiert man eine erfindungsgemäße rekombinante DNA in ein geeignetes, in einer Wirtszelle selbständig replika tionsfähiges DNA-Molekül. Hierzu wird vorzugsweise als DNA-Molekül ein Plasmid oder ein R-Vektor, ein 2 µ- Circle-Derivat oder ein Virus-abgeleitetes Replikon verwendet.To produce a vector according to the invention tiert a recombinant DNA according to the invention in a suitable, replica independently in a host cell capable DNA molecule. For this purpose, preferably as DNA molecule, a plasmid or an R vector, a 2 µ Circle derivative or a virus-derived replicon used.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen rekombinanten DNA oder eines erfindungsgemäßen Vektors zur Herstellung von infektiösen, virulenten oder attenuierten Maul- und Klauenseuche-Viren, wozu man die rekombinante DNA bzw. den Vektor nach an sich bekannten Methoden in RNA transkribiert, diese isoliert, mit der erhaltenen RNA anschließend für Maul- und Klauenseuche-Viren permissive Zellen transfiziert und die darin gebildeten Viren aus dem Zellkulturmedium gewinnt. Die erfindungsgemäße Ver wendung der rekombinanten DNA oder des Vektors erlaubt es, sowohl infektiöse unveränderte Maul- und Klauen seuche-Viren zu erzeugen, die dann beispielsweise zur weiteren Erforschung von viralem Verhalten oder anderen Grundlagen verwendet werden können, oder aber auch attenuierte Maul- und Klauenseuche-Viren herzustellen, welche dann als Impfstoff zur Immunisierung von Paarhu fern gegen das Maul- und Klauenseuche-Virus verwendet werden können, was wiederum ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist. Hierbei wird die Strategie bei der Entwicklung sicherer Vakzinestämme sein, nach Möglichkeit mehrere Deletionen an verschiedenen Stellen im Genom einzubauen und daraus erhaltene Maul- und Klauenseuche-Virus-Partikel als Impfstoff zur Immuni sierung zu verwenden. Another object of the present invention is the use of a recombinant DNA according to the invention or a vector according to the invention for the production of infectious, virulent or attenuated foot and mouth Claw epidemic viruses, for which the recombinant DNA or the vector according to known methods in RNA transcribed, isolated, with the RNA obtained subsequently permissive for foot-and-mouth disease viruses Transfected cells and the viruses formed therein the cell culture medium wins. The Ver allowed use of the recombinant DNA or the vector it, both infectious unchanged foot and claws to generate epidemic viruses, which are then used, for example, for further research into viral behavior or others Basics can be used, or else to produce attenuated foot-and-mouth disease viruses, which is then used as a vaccine to immunize Paarhu used against foot-and-mouth disease virus can be, which in turn is another subject of present invention. This is the strategy be in the development of safe vaccine strains, after Possibility of multiple deletions in different places to be built into the genome and the mouth and mouth Claw epidemic virus particles as a vaccine for immunization to use.
Für den Einsatz solcher Stämme in Regionen, wo durch das Auftreten vieler verschiedener Virustypen in erhöhtem Maß mit Rekombinationen zwischen Wildtyp und Impfvirus gerechnet werden muß, können die attenuierten Stämme alternativ auch zur Produktion einer chemisch inakti vierten Totvakzine herangezogen werden. Solch ein Impfstoff, der zusätzlich chemisch inaktivierte Virus partikel enthält, ist wiederum eine bevorzugte Ausfüh rungsform der Erfindung. Durch diese doppelte Ab sicherung könnte die Sicherheit des Impfstoffs um meh rere Größenordnungen gesteigert werden, so daß ein Seuchenausbruch weder aufgrund einer mangelhaften in aktivierten Vakzinecharge, noch aufgrund von Rekombina tionsereignissen zustandekommen könnte.For the use of such strains in regions where through the Occurrence of many different virus types in increased Measure with recombinations between wild type and vaccine virus The attenuated strains can be expected alternatively also for the production of a chemically inactive fourth dead vaccine can be used. Such a Vaccine, the additionally chemically inactivated virus contains particles is again a preferred embodiment tion form of the invention. Through this double Ab safety could increase the safety of the vaccine rere orders of magnitude are increased, so that a Epidemic outbreak neither due to poor in activated vaccine batch, still due to recombina events could occur.
Die erfindungsgemäße erstmalige Bereitstellung einer vollständigen klonierten cDNA des Maul- und Klauen seuche-Virus bzw. das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer solchen DNA sowie der tatsächlich er haltene Klon pFMCV-YEP-poly-C stellen einen gewaltigen Schritt vorwärts bei der Entwicklung gentechnologisch hergestellter Impfstoffe gegen die Maul- und Klauenseu che dar. Nicht nur die Erzeugung intakter natürlicher Viruspartikel zur Erforschung von Grundlagen dieses Virus wird hierdurch ermöglicht, sondern auch die Her stellung mutierter, vor allem durch Deletionen atte nuierter Viren, welche dann wiederum als Impfstoffe zur Immunisierung gegen das Maul- und Klauenseuche-Virus verwendbar sind. Vor allem der Austausch der die Sero spezifität bestimmenden Regionen in den erfindungsge mäßen rekombinanten DNAs und Vektoren erlaubt, einen einmal erhaltenen attenuierten Charakter für die Viren für alle bekannten Serospezifitäten des Virus auszunut zen. The first-time provision of a complete cloned foot and claw cDNA epidemic virus and the method according to the invention Production of such a DNA as well as that actually holding clone pFMCV-YEP-poly-C represent a formidable Step forward in genetic engineering manufactured vaccines against foot and mouth seu che. Not just the production of intact natural Virus particles to research the basics of this Virus is made possible by this, but also the fro position of mutated, especially through deletions nucleated viruses, which in turn are used as vaccines Immunization against foot-and-mouth disease virus are usable. Especially the exchange of the Sero regions determining specificity in the fiction according to recombinant DNAs and vectors attenuated character for the viruses once obtained for all known serospecificities of the virus Zen.
Das folgende Beispiel erläutert in Verbindung mit den Figuren die Erfindung weiter. Hierbei zeigen die Figu ren:The following example explains in connection with the Figures the invention further. Here, the Figu ren:
Fig. 1 eine schematische Darstellung des MKS-Virusge noms. Das Genom des MKS-Virus ist eine einzel strängige RNA mit Plus-Strang Polarität und hat eine Länge von ca. 8500 Nukleotiden. Ein ca. 1300 Nukleotide langer, nicht kodierender Bereich am 5′-Ende trägt ein kovalent gebunde nes Protein (VPg) und eine homopolymere Cyti dylsequenz (poly-C). Das 3′-Ende ist po lyadenyliert. Die Genprodukte werden zunächst in Form eines einzigen Polyproteins transla tiert und später durch virale und zelluläre Proteasen in die reifen Genprodukte (L, 1A, 1B etc.) prozessiert. Fig. 1 is a schematic representation of the FMD virus genome. The genome of the FMD virus is a single-stranded RNA with plus-strand polarity and has a length of approximately 8500 nucleotides. An approximately 1300 nucleotide long, non-coding region at the 5'-end carries a covalently bound protein (VPg) and a homopolymeric cytidyl sequence (poly-C). The 3'-end is po lyadenylated. The gene products are first translated in the form of a single polyprotein and later processed by viral and cellular proteases into the mature gene products (L, 1A, 1B etc.).
Fig. 2 die vollständige Sequenz der verschiedenen verwendeten Primer von Beispiel 1a) und 1b), Fig. 2 shows the complete sequence of the various primers used in Example 1a) and 1b),
Fig. 3 die Nukleotidsequenz des 5′-terminalen Be reichs des MKS-Virus-Genoms pFMDVff und pFMDV- YEP. Der Übergang von der Sequenz des Vektors pSP64 in die des MKS-Virus ist im oberen Teil der Figur eingezeichnet. Die Länge der in die NheI Schnittstelle eingesetzten homopolymeren Cytidylsequenz (unten im Bild) wurde durch Sequenzanalyse bestimmt. Der Übergang in die publizierte MKS-Virussequenz (Forss et al., 1984; Position 92) ist angegeben. Fig. 3 shows the nucleotide sequence of the 5'-terminal region of the FMD virus genome pFMDVff and pFMDV-YEP. The transition from the sequence of the vector pSP64 to that of the FMD virus is shown in the upper part of the figure. The length of the homopolymeric cytidyl sequence inserted into the NheI interface (bottom in the picture) was determined by sequence analysis. The transition to the published FMD virus sequence (Forss et al., 1984; position 92) is indicated.
Fig. 4 die Konstruktion des cDNA-Klons pFCMVff, Fig. 4 shows the construction of the cDNA clone pFCMVff,
Fig. 5 die Eliminierung von Fremdsequenzen zwischen SP6-Promotor und viralem Anteil in pFMDV-5′. Fig. 5, the elimination of foreign sequences between the SP6 promoter and viral portion in pFMDV-5 '.
Das Plasmid wurde partiell mit SphI und voll ständig mit HindIII verdaut, die Schnittstel len mit E.coli DNA-Polymerase aufgefüllt (HindIII) bzw. zurückgetrimmt (SphI) und die DNA anschließend mit T4 DNA-Ligase zirkulari siert.The plasmid became partially full of SphI and full constantly digested with HindIII, the interface len filled with E.coli DNA polymerase (HindIII) or trimmed back (SphI) and the DNA then circularly with T4 DNA ligase siert.
Fig. 6 Plasmid pFMDV-YEP und die beiden Ausgangsklone YEP51 und pFMDVff. Fig. 6 plasmid pFMDV-YEP and the two starting clones YEP51 and pFMDVff.
Fig. 7 die Insertion von poly-C in pFMCDV-YEP. Fig. 7 shows the insertion of poly-C in pFMCDV-YEP.
Eine der größten Schwierigkeiten bei der Konstruktion eines vollständigen cDNA-Klones des Maul- und Klauen seuche-Virus stellt eine 100 bis 150 Nukleotide lange homopolymere Cytidylsequenz (poly-C) im vorderen Bereich des Genoms dar (Fig. 1), die sich auf eine nicht näher bekannte Weise negativ auf die Replikationsfähigkeit von Plasmiden in E. coli auswirkt. Um diese Schwierigkeit zu umgehen, wurde erfindungsgemäß das FMDV-Genom zunächst in zwei Teilstücken, nämlich dem Bereich vor und hinter dem poly-C in getrennten Ansätzen kloniert und diese beiden Teile anschließend über eine Linkersequenz ver knüpft. Durch die erfindungsgemäße nachträgliche Inser tion einer poly-C-Sequenz in diesen Linker wurde ein replikationsfähiges Plasmid erhalten, das nach in vitro Transkription in RNA und anschließender Transfektion permissiver Zellen wieder zu infektiösen Viren führte. Im folgenden ist die Konstruktion des Klones, enthaltend Plasmid pFMDV-YEP-poly-C, (DSM 5453) in mehreren Einzel abschnitten beschrieben. Mit den von diesen Klonen sowohl in vitro (mit Hilfe von SP6 RNA-Polymerase) als auch in vivo (in Hefezellen) synthetisierten RNA ist es gelungen, durch Transfektion permissiver Animalzellen (Baby Hamster Kidney Zellen) replikationsfähige Maul- und Klauenseuche-Viren zu erhalten. Bezüglich der Richt linien für den Umgang mit rekombinanten Nukleinsäuren ist bei der Durchführung von Versuchen folgendes zu beachten: Alle Experimente mit klonierter Maul- und Klauenseuche-Virus-cDNA, einschließlich der Transforma tion von Bakterien und Hefezellen und der Isolation von RNA, die der vollständigen Länge des Virus entspricht, können unter L1/L2-Bedingungen durchgeführt werden. Die Transfektion von Animalzellen mit der vollständigen RNA oder cDNA des Virus bedarf dagegen der höchsten Labor sicherheitsstufe L4.One of the greatest difficulties in the construction of a complete cDNA clone of the foot and mouth disease virus is a 100 to 150 nucleotide long homopolymeric cytidyl sequence (poly-C) in the front region of the genome ( FIG. 1), which relates to a not known in more detail negatively affects the replication ability of plasmids in E. coli. In order to avoid this difficulty, the FMDV genome was first cloned according to the invention in two sections, namely the area in front and behind the poly-C in separate approaches, and these two parts were then linked via a linker sequence. By subsequently inserting a poly-C sequence into this linker according to the invention, a replicable plasmid was obtained which, after in vitro transcription in RNA and subsequent transfection of permissive cells, again led to infectious viruses. The construction of the clone containing plasmid pFMDV-YEP-poly-C, (DSM 5453) is described in several individual sections below. With the RNA synthesized by these clones both in vitro (with the help of SP6 RNA polymerase) and in vivo (in yeast cells), it was possible to obtain foot-and-mouth disease viruses capable of replication by transfection of permissive animal cells (baby hamster kidney cells) . Regarding the guidelines for the handling of recombinant nucleic acids, the following must be observed when carrying out experiments: All experiments with cloned foot-and-mouth disease virus cDNA, including the transformation of bacteria and yeast cells and the isolation of RNA that are complete Length of the virus can be performed under L1 / L2 conditions. In contrast, the transfection of animal cells with the complete RNA or cDNA of the virus requires the highest laboratory security level L4.
Allgemeine Methoden der Prozessierung von Nukleinsäuren, wie RNA- und DNA-Reinigung, Gelelektrophorese, cDNA- Synthese, Ligation und Transformation von DNA, wurden nach Standard-Vorschriften durchgeführt, wie sie z. B. in T. Maniatis et al. (1982), Cold Spring Harbor Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., beschrieben sind.General methods of processing nucleic acids, such as RNA and DNA purification, gel electrophoresis, cDNA Synthesis, ligation and transformation of DNA carried out according to standard regulations, such as. B. in T. Maniatis et al. (1982) Cold Spring Harbor Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. are.
Restriktionsendonukleasen wurden nach den von den Her stellern empfohlenen Protokollen verwendet.Restriction endonucleases were carried out according to the methods of Her recommended protocols.
Zur Synthese der Minus-Strang-cDNA wurden 10 µg RNA des Maul- und Klauenseuche-Virus Stamm 01 Kaufbeuren, zunächst für 3 Minuten auf 80°C erhitzt, und dann in einem 100 µl Standard-Ansatz (Maniatis et al., s.o.) mit 5 µl p(dT)12-18 als Primer und 50 Einheiten re verser Transkriptase für eine Stunde bei 42°C inku biert. Danach wurde das Volumen des Ansatzes durch Zugabe von 100 µl H₂O verdoppelt, 5 Minuten auf 100°C erhitzt und schnell abgekühlt. Die Plus-Strangsynthese wurde durch Zugabe von 50 pmol eines synthetischen Oligonukleotides komplementär zur Sequenz der ersten 30 Nukleotide hinter dem poly-C (Position 92 bis 12 der publizierten Nukleotidsequenz des Virus; Forss et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 6587-6601) und der Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym NheI am 5′-Ende (vollständige Sequenz des Primers s. Fig. 2) und Inkubation mit 20 Einheiten DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) für 2 Stunden bei 25°C durchgeführt. Die doppelsträngige cDNA wurde präparativ über ein 1% Agarosegel aufgetrennt, mit Ethidiumbromid angefärbt und nur der in voller Länge vorhandene Anteil (Größe von ca. 8 kb) aus dem Gel ausgeschnitten. Die DNA wurde elektrophoretisch eluiert, durch Ethanolpräzipitation konzentriert und in einem 50 µl Ligationsansatz mit 100 pmol HpaI-Linker (Sequenz s. Fig. 2) ligiert. Nach Restriktion mit HpaI wurden die überschüssigen Linker durch Gelfiltration über Sephadex G150 (2 ml Säule in 10 mM Tris, pH 8,0, 0,1 M Na- Acetat, 1 mM EDTA) abgetrennt, die hochmolekulare cDNA nach Einengen unter Vakuum auf ca. ¹/₃ des Volumens durch Ethanolpräzipitation konzentriert und in einen pSP64-Vektor (M. R. Green et al., Cell 32 (1983), 681-694) in eine zuvor in analoger Weise eingeführte HpaI-Schnittstelle (in die SmaI-Schnittstelle der Mischlinkerregion des Vektors) einligiert. Nach Transformation kompetenter E. coli HB101-Zellen wurden die in der Hybridisierung mit dem oben beschriebenen radioaktiv markierten Primer der Plus- Strang-cDNA positiv reagierende Klone durch Restriktions- und Sequenzanalyse der cDNA-Enden charakterisiert. Ein auf diese Weise identifizierter und für weiterführende Konstruktionen geeignet erscheinender Klon hatte eine bezüglich des im Vektor vorhandenen Sp6-Promotors positive Orientierung der cDNA, war am 5′-Ende der cDNA vollständig (d. h. enthielt die NheI- Restriktions-Schnittstelle) und besaß am 3′-Ende der viralen Sequenz einen homopolymeren Trakt von 60 bis 70 Adenylnukleotiden (poly-A).To synthesize the minus-strand cDNA, 10 µg RNA of the foot and mouth disease virus strain 01 Kaufbeuren were first heated to 80 ° C for 3 minutes and then in a 100 µl standard mixture (Maniatis et al., See above) incubated with 5 µl p (dT) 12-18 as primer and 50 units reverse transcriptase for one hour at 42 ° C. The volume of the mixture was then doubled by adding 100 μl of H₂O, heated to 100 ° C. for 5 minutes and cooled rapidly. The plus-strand synthesis was complementary to the sequence of the first 30 nucleotides behind the poly-C (positions 92 to 12 of the published nucleotide sequence of the virus; Forss et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) by adding 50 pmol of a synthetic oligonucleotide. , 6587-6601) and the recognition sequence for the restriction enzyme NheI at the 5'-end (complete sequence of the primer see FIG. 2) and incubation with 20 units of DNA polymerase I (Klenow fragment) for 2 hours at 25 ° C. . The double-stranded cDNA was preparatively separated on a 1% agarose gel, stained with ethidium bromide and only the full length portion (size of approx. 8 kb) was cut out of the gel. The DNA was eluted electrophoretically, concentrated by ethanol precipitation and ligated in a 50 μl ligation mixture with 100 pmol HpaI linker (sequence see FIG. 2). After restriction with HpaI, the excess linkers were separated by gel filtration over Sephadex G150 (2 ml column in 10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 M Na acetate, 1 mM EDTA), the high molecular weight cDNA after concentration under vacuum to approx ¹ / ₃ of the volume concentrated by ethanol precipitation and into a pSP64 vector (MR Green et al., Cell 32 (1983), 681-694) in a previously introduced in an analogous HpaI interface (in the SmaI interface of the mixed linker region of the vector). After transformation of competent E. coli HB101 cells, the clones reacting positively in the hybridization with the above-described radio-labeled primer of the plus-strand cDNA were characterized by restriction and sequence analysis of the cDNA ends. A clone identified in this way and appearing suitable for further constructions had a positive orientation of the cDNA with respect to the Sp6 promoter present in the vector, was complete at the 5'-end of the cDNA (ie contained the NheI restriction site) and had on the 3rd '-End of the viral sequence a homopolymeric tract of 60 to 70 adenyl nucleotides (poly-A).
Der dem 5′-Ende des viralen Genoms entsprechende Klon wurde in ähnlicher Weise konstruiert, indem ein synthetisches Oligonukleotid komplementär zu den letzten 17 Nukleotiden vor dem poly-C (die Sequenz dieser Region wurde zuvor in unserem Labor ermittelt, s. Fig. 3) und wiederum mit der NheI-Erkennungssequenz am 5′-Ende (Sequenz s. Fig. 2) als Primer für die Minusstrang-cDNA diente. Der Plus-Strang wurde mit Hilfe eines 51 Nukleotide langen Oligonukleotides homolog zur 5′-Sequenz vom MKS-Virus 01K (s. Fig. 2) und DNA-Polymerase synthetisiert. Die erhaltene 372 Nukleotide lange doppelsträngige cDNA wurde mit Hilfe von EcoRI-Adaptoren (Fig. 2) in den mit EcoRI linearisierten und dephosphorylierten pSP64-Vektor eingesetzt. Orientierung und Vollständigkeit der cDNA wurde durch Sequenzanalyse überprüft. Eine schematische Darstellung des pFMDV-3′ und des pFMDV-5′-Klons ist in der oberen Hälfte der Fig. 4 wiedergegeben. Um bei der späteren in vitro Transkription mit SP6 RNA Polymerase möglichst wenige Fremdnukleotide am 5′-Ende der FMDV-RNA zu erhalten, wurde die Linker- Region des Vektors und die EcoRI-Adaptor-Sequenz zwischen dem SP6-Promotor und dem Beginn der FMDV- cDNA, wie in Fig. 5 dargestellt, zum größten Teil eliminiert. Dazu wurde das Plasmid partiell mit SphI und vollständig mit HindIII verdaut, die Schnittstellen mit E.coli DNA-Polymerase und dNTPs aufgefüllt (HindIII) bzw. durch die 3′-Exonukleaseaktivität des Enzyms zurückgetrimmt (SphI) und die DNA anschließend mit T4 DNA-Ligase zirkularisiert.The clone corresponding to the 5 'end of the viral genome was constructed in a similar manner by adding a synthetic oligonucleotide complementary to the last 17 nucleotides before the poly-C (the sequence of this region was previously determined in our laboratory, see Fig. 3) and again with the NheI recognition sequence at the 5 'end (sequence see Fig. 2) served as a primer for the minus strand cDNA. The plus strand was synthesized with the help of a 51 nucleotide long oligonucleotide homologous to the 5 'sequence from the FMD virus 01K (see FIG. 2) and DNA polymerase. The 372 nucleotide long double-stranded cDNA obtained was inserted with the aid of EcoRI adapters ( FIG. 2) into the pSP64 vector linearized and dephosphorylated with EcoRI. Orientation and completeness of the cDNA was checked by sequence analysis. A schematic representation of the pFMDV-3 'and the pFMDV-5' clone is shown in the upper half of FIG. 4. In order to obtain as few foreign nucleotides as possible at the 5'-end of the FMDV-RNA during later in vitro transcription with SP6 RNA polymerase, the linker region of the vector and the EcoRI adapter sequence between the SP6 promoter and the beginning of the FMDV cDNA as shown in Fig. 5 largely eliminated. For this purpose, the plasmid was partially digested with SphI and completely with HindIII, the interfaces were filled in with E. coli DNA polymerase and dNTPs (HindIII) or trimmed back by the 3′-exonuclease activity of the enzyme (SphI) and the DNA was subsequently extracted with T4 DNA Circularized ligase.
Im nächsten Schritt wurden der 5′- und der 3′-Klon zu einem Gesamtklon (= komplette Maul- und Klauenseuche Virus cDNA ohne poly-C) wie in Fig. 4 gezeigt, vereinigt. Zu diesem Zweck wurde die DNA des Plasmids pFMDV-3′ mit NheI und partiell mit PvuI geschnitten (Lage der Schnittstellen s. Fig. 4), die entstehenden DNA-Fragmente über ein 1% Agarosegel aufgetrennt, mit Ethidiumbromid angefärbt, die 8.7 kb große, die virale cDNA enthaltende, PvuI-NheI-Bande ausgesschnitten und eluiert. In analoger Weise wurde die DNA der wie oben beschrieben verkürzten Form des Plasmids pFMDV-5′ mit PvuI und partiell mit NheI geschnitten, und die den SP6-Promotor und das 5′-Ende der viralen cDNA enthaltende 2.7 kb große PvuI-NheI-Bande isoliert. Die beiden 2.7 kb und 8.7 kb DNA-Fragmente wurden anschließend mit T4cDNA Ligase zum Klon pFMDVff vereinigt.In the next step, the 5'- and 3'-clones were combined to form a total clone (= complete foot-and-mouth disease virus cDNA without poly-C), as shown in FIG. 4. For this purpose, the DNA of the plasmid pFMDV-3 'was cut with NheI and partially with PvuI (position of the interfaces see Fig. 4), the resulting DNA fragments separated on a 1% agarose gel, stained with ethidium bromide, which was 8.7 kb in size , the PvuI-NheI band containing viral cDNA was excised and eluted. In an analogous manner, the DNA of the shortened form of the plasmid pFMDV-5 'as described above was cut with PvuI and partially with NheI, and the 2.7 kb PvuI-NheI band containing the SP6 promoter and the 5' end of the viral cDNA isolated. The two 2.7 kb and 8.7 kb DNA fragments were then combined with T4cDNA ligase to form the clone pFMDVff.
Da nicht zu erwarten war, daß ein für die Infektiosität der Viren wahrscheinlich notwendiger homopolymerer Cytidyltrakt von 50-100 Nukleotiden Länge in E.coli stabil aufrecht zu erhalten sein würde, wurde die cDNA in einen Hefevektor umkloniert. Als geeignete Vektoren boten sich Derivate des 2 µ-Circle an, die in Hefe in höheren Kopienzahl vorliegen können. Durch Tailing der PstI-Schnittstellen des Hefevektors YEP51 (Broach et al. in: Experimental Manipulation of Gene Expression, Herausgeb. M. Inouye (1983), Acade mic Press Inc., N.Y. S. 83 ff.) wurde zunächst über prüft, ob die Klonierung langer CG-haltiger Sequenzen in Hefe möglich ist. Nach dem positiven Ausgang die ses Experiments wurde die virale cDNA aus pFMDVff in diesen Vektor eingesetzt. Die Klonierungsstrategie ist in Fig. 6 dargestellt. Der Hefevektor wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII geschnitten und die überstehenden Enden der Schnittstellen mit DNA-Polymerase aufgefüllt. Die DNA von pFMDVff wurde mit HpaI und partiell mit NheI geschnitten und die Enden des isolierten, die komplette virale cDNA ent haltenden ca. 8 kb langen Fragmentes ebenfalls mit DNA-Polymerase aufgefüllt. Die nach der Ligierung beider DNA-Fragmente erhaltenen Transformanden wurden durch Koloniehybridisierung mit dem radioaktiv mar kierten 0.6 kb großen NheI-Fragment aus pFMDVff auf rekombinante Plasmide untersucht. Ein auf diese Weise identifizierter Klon enthielt das komplette virale cDNA-Fragment einschließlich des SP6-Promotors in positiver Orientierung in Bezug auf den sich auf dem Hefevektor befindenden Gal 10-Promotor, wie durch Restriktionsanalyse festgestellt wurde (= pFMDV- YEP).Since it was not to be expected that a homopolymeric cytidyl tract of 50-100 nucleotides in length that was probably necessary for the infectivity of the viruses would be stably maintained in E. coli, the cDNA was recloned into a yeast vector. Derivatives of the 2 μ-circle, which may be present in higher copy numbers in yeast, were suitable vectors. By tailoring the PstI interfaces of the yeast vector YEP51 (Broach et al. In: Experimental Manipulation of Gene Expression, Ed. M. Inouye (1983), Acade mic Press Inc., NYS 83 ff.), It was first checked whether the cloning long CG-containing sequences in yeast is possible. After the positive outcome of this experiment, the viral cDNA from pFMDVff was inserted into this vector. The cloning strategy is shown in Fig. 6. The yeast vector was cut with the restriction enzymes BamHI and HindIII and the protruding ends of the interfaces were filled in with DNA polymerase. The DNA from pFMDVff was cut with HpaI and partially with NheI, and the ends of the isolated, approximately 8 kb-long fragment containing the complete viral cDNA were also filled in with DNA polymerase. The transformants obtained after the ligation of both DNA fragments were examined for recombinant plasmids by colony hybridization with the radioactively labeled 0.6 kb NheI fragment from pFMDVff. A clone identified in this way contained the complete viral cDNA fragment including the SP6 promoter in a positive orientation with respect to the Gal 10 promoter located on the yeast vector, as determined by restriction analysis (= pFMDV-YEP).
In die einzige in pFMDV-YEP verbleibende NheI- Schnittstelle wurde mit Hilfe von terminaler Transfe rase eine homopolymere Cytidylsequenz eingefügt, wie schematisch in Fig. 7 dargestellt ist. Dazu wurde das Plasmid mit NheI geschnitten und die einzelsträngige 5′ überstehenden Enden mit DNA-PolymeraseI und dNTPs aufgefüllt. Der Ansatz wurde geteilt und an die frei en 3′-Enden der DNA mit terminaler Transferase unter Standard-Bedingungen (Maniatis et al., s.o.) jeweils eine durchschnittlich 50 Nukleotide lange poly-C bzw. poly-G-Sequenz angefügt. Danach wurden beide Ansätze mit NotI (Position 2028 auf der viralen Sequenz) geschnitten und die entstandenen Subfragmente auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt. Vom poly-C-Ansatz wurde das große Fragment (ca. 13 kb) und vom poly-G- Ansatz das kleine Fragment (ca. 2.7 kb) aus dem Gel eluiert und zusammen mit T4-DNA-Ligase ligiert.In the only NheI site remaining in pFMDV-YEP, a homopolymeric cytidyl sequence was inserted using terminal transferase, as is shown schematically in FIG. 7. For this purpose, the plasmid was cut with NheI and the single-stranded 5 ′ projecting ends were filled in with DNA polymerase I and dNTPs. The approach was divided and an average of 50 nucleotides long poly-C or poly-G sequence was added to the free 3 ′ ends of the DNA with terminal transferase under standard conditions (Maniatis et al., See above). Then both approaches were cut with NotI (position 2028 on the viral sequence) and the resulting subfragments were separated on a 1% agarose gel. The large fragment (approx. 13 kb) was eluted from the poly-C approach and the small fragment (approx. 2.7 kb) from the poly-G approach and ligated together with T4 DNA ligase.
Von diesem Ligaseansatz aus wurde auf drei verschie denen Wegen eine infektiöse RNA erhalten:From this ligase approach, three were used who received an infectious RNA because of:
-
1. Durch direkte Transkription mit SP6-RNA-Polymera
se.
Zu einem ausreichend großen Ligaseansatz (1 pmol von jedem der beiden "getailten" Fragmente) wurden nach 3 h Inkubation mit T4-Ligase bei 22°C alle 4 dNTPs in einer Endkonzentration von je 100 µM und DNA-Polyme raseI in einer Endkonzentration von 100 Einheiten/ml zugesetzt und 10 min weiter inkubiert. Nach Phenolex traktion und Ethanolpräzipitation konnte die DNA direkt, d. h. ohne vorherige Linearisierung durch ein Restriktionsenzym mit SP6 RNA-Polymerase transkri biert werden (Melton et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 7035-7056). Die auf diese Weise gewonnene RNA muß nicht weiter gereinigt werden, sondern kann nach Ethanolpräzipitation direkt für die Transfektion von permissiven Animalzellen (BHK-Zellen) nach der Cal ciumphosphat-Methode (s.u.) eingesetzt werden. Diese Technik umgeht zwar die Schwierigkeit, eine poly-C haltige DNA in einem Wirtsorganismus zu etablieren. Die relativ schwierige Darstellung ausreichender Mengen an Fragmenten mit C- bzw. G-Tails und die vielen Einzelschnitte bis zur Gewinnung der RNA las sen diesen Weg auf Dauer aber zu aufwendig erschei nen. 1. By direct transcription with SP6 RNA polymerase.
For a sufficiently large ligase batch ( 1 pmol of each of the two "detailed" fragments), after 4 h of incubation with T4 ligase at 22 ° C., all 4 dNTPs in a final concentration of 100 μM each and DNA polymerase I in a final concentration of 100 Units / ml were added and incubation was continued for 10 min. After phenol extraction and ethanol precipitation, the DNA could be transcribed with SP6 RNA polymerase directly, ie without prior linearization through a restriction enzyme (Melton et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 7035-7056). The RNA obtained in this way does not have to be purified further, but can, after ethanol precipitation, be used directly for the transfection of permissive animal cells (BHK cells) using the calcium phosphate method (see below). This technique avoids the difficulty of establishing a poly-C-containing DNA in a host organism. The relatively difficult representation of sufficient quantities of fragments with C- or G-tails and the many individual cuts until the RNA was obtained, however, make this route appear too time-consuming. -
2. Durch Etablierung stabiler Hefeklone
Ein wie unter b) beschrieben angefertigter Liga tionsansatz wurde für die Transformation von kompe tenten Hefezellen (GY92) herangezogen. Die Transfor mation von nach der LiCl-Methode kompetent gemachter Hefezellen (R. Rothstein, in: DNA Cloning, Volume II, Herausg. B. Rickwood und B.D. Hamers, IRL Press, Oxford (1986), S. 45-66) mit einem Ligaseansatz von je 0.1 pmol beider Fragmente führt typischerweise zu 20-50 Leucin-autotrophen Hefeklonen. Mehrere sol cher Klone wurden in 5 ml eines Leucin-freien Mediums mit 2% Glucose als Kohlenstoffquelle bis zu einer Zelldichte von 5×107 Zellen/ml aufgewachsen, dann in ein Medium gleicher Zusammensetzung, aber mit 2% Galactose statt Glucose als Kohlenstoffquelle umge setzt, und 5 h weiter bei 30°C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in 400 µl einer Guanidiniumisothiocyanatlösung (Maniatis et al., s.o., S. 189) suspendiert und 10 min bei 60°C inku biert. Dann wurden 400 µl einer 80% gepufferten Phe nollösung zugesetzt und kräftig geschüttelt. Nach Zugabe von 400 µl 0.1M Na-Acetat und 1.2 ml Chloro form wurde erneut geschüttelt und das sich nun bil dende Zweiphasensystem durch kurze Zentrifugation getrennt. Die in der wässrigen (oberen) Phase befind liche RNA wurde nochmals mit 80% Phenol extrahiert, dann durch Ethanolpräzipitation und zweimaliges Nach waschen mit 70% Ethanol von Salzen befreit und in 50 µl H2O aufgenommen. 10 µl dieser Roh-RNA reichten aus, um eine kleine Schale (5 cm Durchmesser) BHK- Zellen nach der Calziumphosphat-methode zu transfi zieren. Nach unseren Ergebnissen führten etwa 50% der Hefeklone zu infektiösen Viren. 2. By establishing stable yeast clones
A ligation approach prepared as described under b) was used for the transformation of competent yeast cells (GY92). The transformation of yeast cells made competent by the LiCl method (R. Rothstein, in: DNA Cloning, Volume II, ed. B. Rickwood and BD Hamers, IRL Press, Oxford (1986), pp. 45-66) with a Ligase preparation of 0.1 pmol each of both fragments typically leads to 20-50 leucine autotrophic yeast clones. Several such clones were grown in 5 ml of a leucine-free medium with 2% glucose as a carbon source to a cell density of 5 × 10 7 cells / ml, then in a medium of the same composition, but with 2% galactose instead of glucose as a carbon source sets, and incubated for 5 h at 30 ° C. The cells were harvested by centrifugation, suspended in 400 μl of a guanidinium isothiocyanate solution (Maniatis et al., See p. 189) and incubated at 60 ° C. for 10 min. Then 400 ul of an 80% buffered phenol solution were added and shaken vigorously. After adding 400 µl 0.1M Na acetate and 1.2 ml chloroform, the mixture was shaken again and the two-phase system that was now formed was separated by brief centrifugation. The RNA in the aqueous (upper) phase was extracted again with 80% phenol, then freed of salts by ethanol precipitation and washing twice with 70% ethanol and taken up in 50 μl H 2 O. 10 µl of this crude RNA were sufficient to transfi a small dish (5 cm diameter) BHK cells by the calcium phosphate method. According to our results, approximately 50% of the yeast clones led to infectious viruses. -
3. Durch Etablierung stabiler Klone in E.coli
Ein wie unter e) beschriebener Ligationsansatz wurde auch für die Transformation von kompetenten E.coli Zellen angefertigt. Die Länge der homopolymeren C- Sequenz in der aus einigen auf diese Weise erhaltenen Klone extrahierten Plasmid-DNA wurde durch Sequenz analyse auf 15-25 Nukleotide bestimmt. Die von einem dieser Plasmide mit Hilfe von SP6 RNA-Polymera se in vitro abgeleitete RNA führte unerwarteterweise nach Transfektion von BHK-Zellen ebenfalls zu infek tiösen Maul- und Klauenseuche Viren. Die poly-C-Se quenz im Klon, enthaltend das Plasmid pFMDV-YEP-poly- C, ist nur 19 Nukleotide lang. Die Länge der poly-C- Sequenz mehrerer, durch Transfektion mit der von diesem Plasmid abgeleiteten RNA erhaltenen Viren war unterschiedlich (60-180 Nukleotide) wie durch T1- RNase-Verdau der viralen RNA und anschließende Gel elektrophorese der Spaltprodukte nachgewiesen werden konnte. Es ist nicht bekannt, auf welche Weise die poly-C-Sequenz verlängert wird. Es könnte bereits bei der RNA-Synthese in vitro durch ein "Ausgleiten" der SP6-RNA-Polymerase geschehen. Die Beobachtung, daß eine Heterogenität der poly-C-Sequenz auch bei natür lichen Maul- und Klauenseuche Viruspopulationen auf tritt (Costa Giomi et al., J. Virol. 51, (1984) 799- 805) spricht allerdings eher für einen solchen Me chanismus bei der Replikation der RNA durch die vira le RNA-Polymerase.
Wegen der einfachen Kultivierung von E.coli-Zellen und der sehr gut reproduzierbaren Transfizierbarkeit von BHK-Zellen mit Plasmid-abgeleiteter in vitro synthetisierter RNA erscheint diese Methode am geeig netsten, um nach zukünftiger Mutagenese des Plasmids pFMDV-YEP-poly-C zu Mutanten des Maul- und Klauenseu che Virus zu gelangen.- g) Protokoll für die in vitro-Synthese von RNA
10 µg zirkulärer pFMDV-YEP-poly-C-DNA wurde in 100 µl 40 mM Tris pH 7.5, 6 mM MgCl2, 2 mM Spermidin, 10 mM DTT, Einheit/µl RNAsin (Genofit GmbH, Heidelberg) und je 500 µM aller 4 rNTPs mit 10 Einheiten SP6-RNA- Polymerase für 1 h bei 40°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Phenolextraktion gestoppt und die Nu kleinsäure mit Ethanol präzipiert. Für die Transfek tion brauchte die Plasmid-DNA nicht abgetrennt zu werden. - h) Protokoll für die Transfektion von BHK-Zellen
Konfluente BHK-(Baby-Hamster-Kidney)-Zellen wurden 20 bis 30 Stunden vor der Transfektion durch Trypsin- Behandlung von der Gefäßwand abgelöst und in 1 : 5 verdünnter Suspension in Eagles-Medium (modifiziert nach Dulbecco), das mit 10% Newborn Calf-Serum, 500 µg/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin supplementiert war, ausgesät. 4 h vor der Transfektion wurde das Medium noch einmal erneuert. 1 bis 10 µg RNA, bzw. die Mischung von DNA und RNA wurden in 0,5 ml sterilem 124 mM CaCl2 gelöst, dann wurde tropfenweise eine frisch angesetzte Lösung von 50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4, pH 7,1, unter stetigem Schütteln zugegeben. Nach 30 min bei Raumtemperatur wurde das gebildete RNA-Calciumphos phat-Präzipitat tropfenweise zu den Zellen gegeben. Die angegebene Menge war ausreichend für 2-3 5 cm Gewebekulturschalen. Ca. 10 h danach wurde das Kul turmedium erneuert, wobei die meisten nicht aufgenom menen Calciumphosphatkristalle entfernt wurden. Die Zellen lysierten typischerweise 2-3 Tage nach der Transfektion. Zur Bestätigung der Virus-induzierten Lyse wurde eine Aliquot des Kulturmediums zu einer weiteren, 2-3 Tage alten und noch nicht konfluenten BHK-Zellkultur gegeben. Diese Kultur lysierte norma lerweise innerhalb von 24 h vollständig.
A ligation approach as described under e) was also prepared for the transformation of competent E. coli cells. The length of the homopolymeric C sequence in the plasmid DNA extracted from some clones obtained in this way was determined by sequence analysis to be 15-25 nucleotides. The RNA derived in vitro from one of these plasmids with the aid of SP6 RNA polymerase unexpectedly also led to infectious foot-and-mouth disease viruses after transfection of BHK cells. The poly-C sequence in the clone, containing the plasmid pFMDV-YEP-poly-C, is only 19 nucleotides long. The length of the poly-C sequence of several viruses obtained by transfection with the RNA derived from this plasmid was different (60-180 nucleotides) as could be demonstrated by T1 RNase digestion of the viral RNA and subsequent gel electrophoresis of the cleavage products. It is not known how the poly-C sequence is extended. It could already happen during RNA synthesis in vitro by "slipping" of the SP6 RNA polymerase. The observation that a heterogeneity of the poly-C sequence also occurs in natural foot-and-mouth disease virus populations (Costa Giomi et al., J. Virol. 51, (1984) 799-805), however, speaks in favor of such a measurement mechanism in the replication of RNA by the viral RNA polymerase.
Because of the simple cultivation of E.coli cells and the very reproducible transfectability of BHK cells with plasmid-derived RNA synthesized in vitro, this method appears to be the most suitable for mutation after future plasmid pFMDV-YEP-poly-C mutation of the foot and mouth disease virus.- g) Protocol for the in vitro synthesis of RNA
10 µg of circular pFMDV-YEP-poly-C-DNA was in 100 µl 40 mM Tris pH 7.5, 6 mM MgCl 2 , 2 mM spermidine, 10 mM DTT, unit / µl RNAsin (Genofit GmbH, Heidelberg) and 500 µM each 4 rNTPs with 10 units of SP6 RNA polymerase were incubated for 1 h at 40 ° C. The reaction was stopped by phenol extraction and the nucleic acid was precipitated with ethanol. The plasmid DNA did not have to be separated for the transfection. - h) Protocol for the transfection of BHK cells
Confluent BHK (baby hamster kidney) cells were detached from the vessel wall 20 to 30 hours before the transfection by trypsin treatment and in 1: 5 diluted suspension in Eagles medium (modified according to Dulbecco), which was mixed with 10% Newborn Calf serum, 500 µg / ml penicillin, 100 µg / ml streptomycin and 2 mM L-glutamine was supplemented. The medium was renewed again 4 h before the transfection. 1 to 10 µg of RNA, or the mixture of DNA and RNA, were dissolved in 0.5 ml of sterile 124 mM CaCl 2 , then a freshly prepared solution of 50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na 2 HPO was added dropwise 4 , pH 7.1, added with constant shaking. After 30 min at room temperature, the RNA calcium phosphate precipitate formed was added dropwise to the cells. The stated amount was sufficient for 2-3 5 cm tissue culture dishes. Approx. The culture medium was renewed 10 hours later, with most of the calcium phosphate crystals not taken up being removed. The cells typically lysed 2-3 days after transfection. To confirm the virus-induced lysis, an aliquot of the culture medium was added to another, 2-3 day old and not yet confluent BHK cell culture. This culture normally completely lysed within 24 hours.
- g) Protokoll für die in vitro-Synthese von RNA
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|---|---|---|---|
| DE3925748A DE3925748A1 (en) | 1989-08-03 | 1989-08-03 | New recombinant deoxyribonucleic acid - from foot=and=mouth disease virus, for prodn. of attenuated virus particles, useful in vaccines |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100371342C (en) * | 2004-01-02 | 2008-02-27 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | Foot and mouth disease virus infectious complementary deoxyribonucleic acid and its preparation method |
| RU2631129C1 (en) * | 2007-05-21 | 2017-09-19 | Федеральное Казенное Предприятие "Щелковский Биокомбинат" | Method for production of foot-and-mouth disease vaccine, and foot-and-mouth disease vaccine |
-
1989
- 1989-08-03 DE DE3925748A patent/DE3925748A1/en not_active Withdrawn
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