DE3924442A1 - Multilayer device for measuring amylase activity in body fluid - contains oligosaccharide substrate, glucosidase and hydrophilic copolymer in the reagent layer - Google Patents
Multilayer device for measuring amylase activity in body fluid - contains oligosaccharide substrate, glucosidase and hydrophilic copolymer in the reagent layerInfo
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- C12Q2334/10—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases p-Nitrophenol derivatives
Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Analysenelement, insbesondere ein Analysenelement zum Auffinden einer speziellen Komponente in einer Fluidumprobe, vornehmlich ein mehrlagiges Analysen element zum Testen von Amylase in einer biologischen Fluidum probe.The invention relates to an analysis element, in particular a Analysis element to find a special component in a fluid sample, primarily a multi-layer analysis element for testing amylase in a biological fluid sample.
Eine enzymatische Amylasebestimmung mit Hilfe eines Oligo saccharidsubstrats zeichnet sich durch eine hervorragende Quantifizierbarkeit und ausgezeichnete Genauigkeit aus. In dieser Hinsicht weit weniger gut geeignet sind die Farbstoff stärkemethode, bei der eine quantitative Bestimmung durch Bil dung von Niederschlägen unter Ausnutzung des Unterschieds in der Molekulargewichtsverteilung bei Verwendung eines mit einem Reaktivfarbstoff gefärbte Stärke enthaltenden Farbstoff stärkesubstrat, z.B. blauer Stärke oder Aminopectinazule, erfolgt, oder die Jodstärkemethode, bei der eine quantitative Bestimmung der nach Amylaseeinwirkung verbliebenen Reststärke nach der bekannten Jodstärkereaktion erfolgt. Ein weiterer Vorteil der enzymatischen Methode besteht darin, daß dabei eine spätere enzymatische Reaktion getestet werden kann. Be sonders gut eignen sich enzymatische Methoden, die mit den verschiedensten Oligosacchariden, z.B. G5 oder G7, mit ein gebautem p-Nitrophenol (im folgenden als "PNP" bezeichnet), z.B. PNP-G5 oder PNP-G7 und Glucosidase, arbeiten.An enzymatic amylase determination using an oligo saccharide substrate is distinguished by excellent quantifiability and excellent accuracy. In this regard, the dye starch method is far less suitable, in which a quantitative determination is made by forming precipitates, taking advantage of the difference in the molecular weight distribution when using a dye containing a reactive dye-colored starch substrate, for example blue starch or aminopectinazule, or the iodine starch method, in which a quantitative determination of the remaining starch after exposure to amylase is carried out according to the known iodine starch reaction. Another advantage of the enzymatic method is that a later enzymatic reaction can be tested. Enzymatic methods which are particularly suitable are those which use various oligosaccharides, for example G 5 or G 7 , with a built-in p-nitrophenol (hereinafter referred to as "PNP"), for example PNP-G 5 or PNP-G 7 and glucosidase, work.
Diese Methode läßt sich auch mit mehrlagigen Analysenelementen durchführen und ist beispielsweise aus der JP-OS 1 75 199/1987 bekannt.This method can also be used with multilayer analysis elements perform and is for example from JP-OS 1 75 199/1987 known.
Diese mehrlagigen Analysenelemente lassen jedoch immer noch erheblich zu wünschen übrig und bedürfen weiterer Verbesse rungen.However, these multilayer analysis elements still leave much to be desired and need further improvement stanchions.
Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein hinsichtlich Ge nauigkeit und Präzision verbessertes und mit dem System "Oligosaccharidsubstrat/Glucosidase" arbeitendes Analysen element zum Testen von Amylaseaktivität zu schaffen.The invention had the object of a Ge accuracy and precision improved and with the system "Oligosaccharide substrate / glucosidase" analyzes creating element for testing amylase activity.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein mehrlagiges Analysen element zum Testen von Amylaseaktivität aus einem Schicht träger und - aufeinanderfolgend auf dem Schichtträger ange ordnet - einer Reagenzschicht und einer porösen Ausbreit schicht, das ein Oligosaccharidsubstrat zum Testen von Amylaseaktivität und Glucosidase aufweist und dessen Reagenz schicht ein hydrophiles hochmolekulares Polymerisat, bei dem es sich um ein Mischpolymerisat aus einem hydrophilen Mono meren und einem hydrophoben Monomeren handelt, enthält.The invention thus relates to a multi-layer analysis element for testing amylase activity from one layer carrier and - successively on the layer carrier arranges - a reagent layer and a porous spread layer, which is an oligosaccharide substrate for testing Has amylase activity and glucosidase and its reagent layer a hydrophilic high molecular polymer in which it is a copolymer of a hydrophilic mono mers and a hydrophobic monomer.
Der Schichtträger eines erfindungsgemäßen Analysenelements ist weder hinsichtlich seiner Bauweise noch seiner Werkstoffe beschränkt, sofern er nur Lichtdurchlässigkeit besitzt und flüssigkeitsundurchlässig ist. Er kann aus den verschieden sten Polymerisaten, wie Celluloseacetat, Polyethylen terephthalat, Polycarbonat oder Polystyrol bestehen. In gleicher Weise eignen sich auch anorganische Werkstoffe, wie Glas. Der Schichtträger kann jede beliebige Dicke auf weisen, vorzugsweise beträgt die Dicke jedoch 50-250 µm. Je nach dem Gebrauchszweck kann die Oberfläche der Betrach tungsseite des Schichtträgers bearbeitet sein. In einigen Fällen kann auch diejenige Oberfläche des Schichtträgers, auf die die Reagenzschicht aufgebracht werden soll, zur Ver besserung der Haftung der Reagenzschicht an dem Schichtträger mit einer lichtdurchlässigen Haftschicht bzw. einem licht durchlässigen Vorstrich versehen werden.The layer support of an analysis element according to the invention is neither in terms of its construction nor its materials limited if it only has translucency and is impermeable to liquids. He can be different Most polymers, such as cellulose acetate, polyethylene terephthalate, polycarbonate or polystyrene. In inorganic materials are equally suitable, like glass. The substrate can have any thickness have, but preferably the thickness is 50-250 microns. Depending on the intended use, the surface can be viewed be processed side of the layer support. In some The surface of the substrate, to which the reagent layer is to be applied, for ver improvement of the adhesion of the reagent layer to the layer support with a translucent adhesive layer or a light permeable primer.
Die poröse Ausbreitschicht eines erfindungsgemäßen Analysen
elements besitzt mehrere Funktionen, nämlich
(1) ein bestimmtes Volumen einer Fluidumprobe bei konstantem
Volumen pro Flächeneinheit in der Reagenzschicht zu ver
teilen und vorzugsweise
(2) Substanzen oder Faktoren, die entweder die analytische
Reaktion in der Fluidumprobe und/oder
(3) die gewünschte Hintergrundwirkung, bei der das während
der spektralphotometrischen Analyse durch den Schicht
träger durchgelassene Meßlicht reflektiert wird, stören,
zu entfernen (vgl. JP-OS 21 677/1978).The porous spreading layer of an analysis element according to the invention has several functions, namely
(1) to distribute a certain volume of a fluid sample at constant volume per unit area in the reagent layer, and preferably
(2) Substances or factors affecting either the analytical reaction in the fluid sample and / or
(3) disturb the desired background effect, in which the measurement light transmitted through the layer carrier during the spectrophotometric analysis is reflected, to remove (cf. JP-OS 21 677/1978).
Folglich kann die poröse Ausbreitschicht aus einer Schicht mit lediglich der Funktion (1) oder einer Schicht mit den Funktionen (2) und/oder (3) neben (1) bestehen. Andererseits können mehrere der Funktionen, einschließlich (1), üblicher weise getrennt und getrennte Schichten für die einzelnen Funktionen vorgesehen werden. Andererseits können Schichten mit zwei der Funktionen (1), (2) und (3) mit einer die rest liche Funktion ausübenden Schicht kombiniert werden. Ein er findungsgemäßes Analysenelement kann somit eine Ausbreit schicht aus einem nichtfasrigen porösen Medium in Form eines sogen. "Bürsten- oder Pinselpolymerisats" mit Titandioxid und Cellulosediacetat (vgl. JP-OS 21 677/1978), eine Ausbreit schicht aus einem hydrophilisierten Gewebe (vgl. JP-OS 1 64 356/1980), eine Ausbreitschicht mit Faserstruktur (vgl. JP-OS 94 658/1982, 1 25 847/1982, 1 97 466/1982 und 70 161/1983) oder eine Ausbreitschicht mit gebundener Teilchenstruktur (Vgl. JP-OS 90 167/1983) enthalten. Insbesondere eine Ausbreit schicht mit Faserstruktur und eine Ausbreitschicht mit ge bundener Teilchenstruktur eignen sich als Grundmaterial, das auch den Blutkörperchenanteil rasch zu transportieren vermag. Consequently, the porous spreading layer can consist of a layer with only the function ( 1 ) or a layer with the functions ( 2 ) and / or ( 3 ) next to ( 1 ). On the other hand, several of the functions, including ( 1 ), can usually be separated and separate layers provided for the individual functions. On the other hand, layers with two of the functions ( 1 ), ( 2 ) and ( 3 ) can be combined with a layer performing the rest of the function. A he analytical element according to the invention can thus a spreading layer from a non-fibrous porous medium in the form of a so-called. "Brush or brush polymers" with titanium dioxide and cellulose diacetate (cf. JP-OS 21 677/1978), a spreading layer made of a hydrophilized fabric (cf. JP-OS 1 64 356/1980), a spreading layer with a fiber structure (cf. JP -OS 94 658/1982, 1 25 847/1982, 1 97 466/1982 and 70 161/1983) or a spreading layer with bound particle structure (see JP-OS 90 167/1983). In particular, a spreading layer with a fiber structure and a spreading layer with a bound particle structure are suitable as the base material, which is also able to quickly transport the blood cell portion.
Die Ausbreitschicht eines Analysenelements gemäß der Erfin dung sollte eine von ihrem Porenvolumen bestimmte Dicke auf weisen, zweckmäßigerweise beträgt sie etwa 100-500, vor zugsweise etwa 150-350 µm. Das Porenvolumen sollte vorzugs weise etwa 20-85% betragen.The spreading layer of an analytical element according to the Erfin should have a thickness determined by their pore volume exhibit, expediently it is about 100-500 preferably about 150-350 microns. The pore volume should be preferred about 20-85%.
Dem erfindungsgemäßen Analysenelement können - falls er wünscht - die verschiedensten Zusätze, wie Konservierungs mittel, Netzmittel u.dgl., einverleibt werden.The analytical element according to the invention can - if he wishes - various additives, such as preservatives medium, wetting agent and the like.
Insbesondere eignen sich Netzmittel zur Steuerung der Ausbreit geschwindigkeit u.dgl., wenn auf ein erfindungsgemäßes Analysenelement eine Flüssigkeitsprobe appliziert wird.Wetting agents are particularly suitable for controlling the spread speed and the like. When on an inventive Analysis element a liquid sample is applied.
Es können die verschiedensten verfügbaren Netzmittel, z.B. ionische, wie anionische oder kationische, und nicht-ionische Netzmittel, vorzugsweise nicht-ionische Netzmittel, verwendet werden. Beispiele für verwendbare nicht-ionische Netzmittel sind Polyalkylenglykolderivate von alkylsubstituierten Phenolen, wie 2,5-Di-tert.-butylphenoxypolyethylenglykol, p-Octyl phenoxypolyethylenglykol und p-Isononylphenoxypolyethylen glykol, oder Polyalkylenglykolester höherer Fettsäuren. Diese Netzmittel vermögen in wirksamer Weise die Ausbreitgeschwin digkeit der Fluidumprobe in die Reagenzschicht zu steuern und gleichzeitig das Entstehen des unerwünschten "chromatographi schen Phänomens" zu hemmen. Vorzugsweise sind die Netzmittel in der Reagenzschicht enthalten.A wide variety of available wetting agents, e.g. ionic, such as anionic or cationic, and non-ionic Wetting agents, preferably non-ionic wetting agents, are used will. Examples of usable non-ionic wetting agents are polyalkylene glycol derivatives of alkyl substituted phenols, such as 2,5-di-tert-butylphenoxypolyethylene glycol, p-octyl phenoxypolyethylene glycol and p-isononylphenoxypolyethylene glycol, or polyalkylene glycol ester of higher fatty acids. These Wetting agents are effective at spreading speed control the fluid sample in the reagent layer and at the same time the emergence of the undesirable "chromatographi phenomenon. "The wetting agents are preferred contained in the reagent layer.
Die genannten Netzmittel können in einem großen Mengenbereich zum Einsatz gelangen, ihre Menge beträgt jedoch zweckmäßiger weise 0,005-25, vorzugsweise 0,05-15 Gew.-%.The wetting agents mentioned can be used in a large quantity range are used, but their amount is more appropriate example 0.005-25, preferably 0.05-15 wt .-%.
Ein erfindungsgemäßes Analysenelement kann je nach dem Ge brauchszweck beliebig aufgebaut sein. So können bei einem er findungsgemäßen Analysenelement mit den funktionswesentlichen Schichten eine Reflexionsschicht und eine Haftschicht (vgl. US-PS 39 92 158), eine Strahlungsblockierschicht (vgl. US-PS 40 42 335), eine Sperrschicht (vgl. US-PS 40 66 403), eine Wanderungshemmschicht (vgl. US-PS 41 66 093), eine Fänger schicht (vgl. JP-OS 90 859/1980) und eine zerstörbare, schoten artige Einheit (vgl. US-PS 41 10 079) kombiniert werden.An analysis element according to the invention can, depending on the Ge can be set up as required. So he can analysis element according to the invention with the essential functions Layers a reflection layer and an adhesive layer (cf. US-PS 39 92 158), a radiation blocking layer (cf. US-PS 40 42 335), a barrier layer (cf. US-PS 40 66 403), a Migration inhibition layer (cf. US-PS 41 66 093), a catcher layer (see JP-OS 90 859/1980) and a destructible, pods like unit (see. US-PS 41 10 079) can be combined.
Die verschiedensten Schichten eines erfindungsgemäßen Analysenelements können durch Auftragen in der jeweils ge wünschten Dicke durch Schlitztrichterbeschichtung, Extru sionsbeschichtung, Tauchbeschichtung u.dgl., d.h. nach in der photographischen Industrie bekannten Verfahren, oder durch Aufeinanderlaminieren der betreffenden Schichten ausgebildet werden.The most diverse layers of an inventive Analysis element can be applied by applying in each ge desired thickness by slot funnel coating, extru ion coating, dip coating and the like, i.e. after in processes known in the photographic industry, or by laminating the relevant layers together be formed.
Bei Verwendung eines erfindungsgemäßen Analysenelements läßt sich die Menge einer speziellen Verbindung in einer Fluidum probe nach der Anfangsgeschwindigkeitsmethode oder der Reaktionsendpunktmethode oder durch Reflexionsspektral photometrie von der Schichtträgerseite her ermitteln. Der jeweils erhaltene Meßwert läßt sich in eine zuvor aufgestellte Eichkurve eintragen und aus dem Eintrag die Menge an der speziellen Verbindung bestimmen.When using an analysis element according to the invention the amount of a particular compound in a fluid sample according to the initial speed method or the Reaction endpoint method or by reflection spectral Determine photometry from the substrate side. The the measured value obtained in each case can be set up in a previously established one Enter the calibration curve and from the entry the amount of determine special connection.
Die Menge der auf das erfindungsgemäße Analysenelement zu applizierenden Fluidumprobe läßt sich beliebig wählen, sie beträgt jedoch allgemein etwa 5 bis etwa 50, zweckmäßiger weise 5 bis etwa 20, vorzugsweise 10 µl.The amount of the analysis element according to the invention applying fluid sample can be chosen arbitrarily, they however, is generally about 5 to about 50, more convenient as 5 to about 20, preferably 10 ul.
Ein erfindungsgemäßes Analysenelement eignet sich in hervor ragender Weise zur Analyse von Vollblut, Serum und Plasma. Des weiteren können mit einem erfindungsgemäßen Analysenele ment auch andere Körperfluida, z.B. Urin, Lymphe, Rückenmarks flüssigkeit u.dgl. analysiert werden. Bei Verwendung von Voll blut läßt sich zur Vermeidung einer Störung des Meß(licht) strahls durch Blutkörperchen eine Strahlungsblockierschicht oder eine sonstige reflektierende Schicht vorsehen.An analysis element according to the invention is suitable in FIG excellent for the analysis of whole blood, serum and plasma. Furthermore, with an analysis element according to the invention other body fluids, e.g. Urine, lymph, spinal cord liquid and the like to be analyzed. When using full blood can be measured to avoid interference with the measurement (light) a radiation blocking layer through blood cells or provide another reflective layer.
Bei dem in der Reagenzschicht eines erfindungsgemäßen Analysenelements zu verwendenden hydrophilen hochmolekularen Polymerisat handelt es sich um ein solches mit einem hydro phoben Monomeren vornehmlich im Kernteil des hochmolekularen Polymerisatteilchens und einem hydrophilen Monomeren im Hülleteil.The one in the reagent layer of an inventive Analytical element to be used hydrophilic high molecular weight Polymer is one with a hydro phobic monomers mainly in the core part of the high molecular weight Polymer particles and a hydrophilic monomer in the Envelope part.
Beispiele für erfindungsgemäß zu verwendende hydrophobe Monomere sind Styrole, wie Styrol, Methylstyrol u.dgl., Acrylate und Methacrylate mit Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatom(en), Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Acryl nitril, Methacrylnitril und dergleichen.Examples of hydrophobic to be used according to the invention Monomers are styrenes such as styrene, methyl styrene and the like. Acrylates and methacrylates with alkyl groups with 1 to 4 Carbon atom (s), vinyl chloride, vinylidene chloride, acrylic nitrile, methacrylonitrile and the like.
Beispiele für erfindungsgemäß verwendbare hydrophile Monomere sind Acrylamide, wie Acrylamid, Isopropylacrylamid u.dgl., Methacrylamide, wie Methactrylamid, Isopropylmethacrylamid und dergleichen, N-Vinylpyrrolidon und Derivate desselben, Vinylalkohole (die durch Polymerisation von Vinylacetat und anschließende Hydrolyse erhalten wurden), mit hydrophilen Gruppen substituierte Acrylate, z.B. Hydroxyethylacrylat und dergleichen, mit hydrophilen Gruppen substituierte Acrylsäure, Methacrylsäure und deren Salze.Examples of hydrophilic monomers which can be used according to the invention are acrylamides such as acrylamide, isopropylacrylamide and the like, Methacrylamides such as methactrylamide, isopropyl methacrylamide and the like, N-vinylpyrrolidone and derivatives thereof, Vinyl alcohols (which are obtained by polymerizing vinyl acetate and subsequent hydrolysis were obtained), with hydrophilic Group substituted acrylates, e.g. Hydroxyethyl acrylate and the like, substituted with hydrophilic groups Acrylic acid, methacrylic acid and their salts.
Jeweils mindestens eines der genannten hydrophoben Monomeren und hydrophilen Monomeren können miteinander mischpolymeri siert werden.In each case at least one of the hydrophobic monomers mentioned and hydrophilic monomers can be intermixed be settled.
In den erfindungsgemäß einsetzbaren hydrophilen hochmole kularen Polymerisaten beträgt die Menge an hydrophilen Monomereneinheiten zweckmäßigerweise etwa 99 bis etwa 75, vorzugsweise etwa 97 bis etwa 80 Gew.-%, und der hydrophoben Monomereneinheiten zweckmäßigerweise etwa 25 bis etwa 1, vor zugsweise etwa 20 bis etwa 3 Gew.%.In the hydrophilic high moles that can be used according to the invention kular polymers is the amount of hydrophilic Monomer units expediently from about 99 to about 75, preferably about 97 to about 80% by weight, and the hydrophobic Monomer units conveniently from about 25 to about 1 preferably about 20 to about 3% by weight.
Der Gehalt des erfindungsgemäßen Analysenelements an dem hydrophilen hochmolekularen Polymerisat beträgt vorzugsweise 5,0-30,0 g/m2.The content of the hydrophilic high-molecular polymer in the analytical element according to the invention is preferably 5.0-30.0 g / m 2 .
Die Polymerisationsreaktion zur Herstellung erfindungsgemäß verwendbarer hochmolekularer Polymerisate erfolgt beispiels weise durch Eintragen des hydrophoben Monomeren und des hydrophilen Monomeren in Wasser, Erhöhen der Temperatur unter Rühren und Durchführen einer Polymerisation für eine bestimm te Zeit unter Zusatz eines wasserlöslichen Polymerisations anspringmittels, z.B. von Kaliumpersulfat oder Ammoniumper sulfat.The polymerization reaction for the preparation according to the invention usable high molecular weight polymers, for example as by entering the hydrophobic monomer and hydrophilic monomers in water, raising the temperature below Stir and carry out a polymerization for a certain te time with the addition of a water-soluble polymerization starting means, e.g. of potassium persulfate or ammonium per sulfate.
Weitere geeignete Polymerisationsverfahren sind die Block mischpolymerisation oder die Pfropfmischpolymerisation. In diesem Falle sind die hydrophilen Monomereneinheiten und die hydrophoben Monomereneinheiten deutlich in Polymerisatsegmente getrennt.The blocks are further suitable polymerization processes mixed polymerization or graft-mixed polymerization. In in this case, the hydrophilic monomer units and the hydrophobic monomer units clearly in polymer segments Cut.
Das in der geschilderten Weise durch Mischpolymerisation des hydrophilen Monomeren mit dem hydrophoben Monomeren er haltene erfindungsgemäß einsetzbare Polymerisat besitzt Körnchenstruktur mit den wiederkehrenden hydrophoben Monomeren einheiten vornehmlich im Kernteil und den wiederkehrenden hydrophilen Monomereneinheiten vornehmlich im Hülleteil. Wenn dieses körnchenförmige Polymerisat zu einer Schicht verar beitet wird, erhält man eine stabile Schicht bzw. einen stabilen Film, die bzw. der sich weder beim Erwärmen noch im Laufe der Zeit ändert. Wenn also ein solches hochmolekulares Polymerisat zur Bildung der hydrophilen Polymerisatschicht eines mehrlagigen Analysenelements verwendet wird, quillt bei den hochmolekularen Polymerisatteilchen mit den wiederkehren den hydrophoben Monomereneinheiten vornehmlich im Kernteil letzterer bei Wassereinwirkung niemals übermäßig stark, während die Teilchen als solche infolge Anwesenheit der wie derkehrenden hydrophilen Monomereneinheiten vornehmlich im Hülleteil bei Wassereinwirkung in angemessener Weise quellen und auf diese Weise ein gleichmäßiges Eindringen der zu analysierenden Komponente ermöglichen. Durch Verwendung des aus dem beschriebenen hochmolekularen Polymerisat gebildeten Films als hydrophile Polymerisatschicht eines erfindungsge mäßen Analysenelements erreicht man denselben Effekt wie bei Durchführung einer Filmhärtungsbehandlung. Im Vergleich zu einem Analysenelement, das einer Filmhärtungsbehandlung unter worfen wurde, zeigt jedoch ein erfindungsgemäßes mehrlagiges Analysenelement eine weit bessere Lagerfähigkeit und eine höhere Genauigkeit.This in the manner described by mixed polymerization of the hydrophilic monomer with the hydrophobic monomer holds polymer usable according to the invention Granular structure with the repeating hydrophobic monomers units mainly in the core part and the recurring hydrophilic monomer units mainly in the shell part. If process this granular polymer into a layer is processed, you get a stable layer or one stable film, which neither when heated nor in Changes over time. So if such a high molecular weight Polymer to form the hydrophilic polymer layer of a multi-layer analysis element swells the high molecular polymer particles with the recurring the hydrophobic monomer units mainly in the core part the latter never excessively strong when exposed to water, while the particles as such due to the presence of the like returning hydrophilic monomer units mainly in Swell the casing part appropriately when exposed to water and in this way an even penetration of the enable analyzing component. By using the formed from the high molecular weight polymer described Films as a hydrophilic polymer layer of a fiction The same analytical element achieves the same effect as with Carrying out a film hardening treatment. Compared to an analytical element undergoing film hardening treatment was thrown, but shows a multi-layer according to the invention Analytical element a much better shelf life and a higher accuracy.
Der Polymerisationsgrad der erfindungsgemäß einzusetzenden hochmolekularen Polymerisate ist nicht kritisch, sofern er lediglich eine Filmbildung (aus dem hydrophilen Polymerisat) ermöglicht. Das gleiche gilt für die Teilchengröße der er findungsgemäß einzusetzenden hochmolekularen Polymerisat teilchen.The degree of polymerization of those to be used according to the invention high molecular weight polymers is not critical unless he only a film formation (from the hydrophilic polymer) enables. The same goes for the particle size of the he high molecular weight polymer to be used according to the invention particles.
Im folgenden werden spezielle Beispiele für erfindungsgemäß einzusetzende hochmolekulare Polymerisate angegeben:The following are specific examples of the invention High molecular weight polymers to be used specified:
- 1. Acrylamid/Methylmethacrylat-Mischpolymerisat (Gewichtsverhältnis: 95 : 5)1. Acrylamide / methyl methacrylate copolymer (Weight ratio: 95: 5)
- 2. Acrylamid/Methylmethacrylat-Mischpolymerisat (Gewichtsverhältnis: 90 : 10)2. Acrylamide / methyl methacrylate copolymer (Weight ratio: 90:10)
- 3. Acrylamid/n-Butylacrylat-Mischpolymerisat (Gewichtsverhältnis: 95 : 5)3. Acrylamide / n-butyl acrylate copolymer (Weight ratio: 95: 5)
- 4. Acrylamid/n-Butylacrylat-Mischpolymerisat (Gewichtsverhältnis: 90 : 10)4. Acrylamide / n-butyl acrylate copolymer (Weight ratio: 90:10)
- 5. Acrylamid/Methylacrylat-Mischpolymerisat (Gewichtsverhältnis: 85 : 15) 5. Acrylamide / methyl acrylate copolymer (Weight ratio: 85:15)
- 6. Methacrylamid/Methylmethacrylat-Mischpolymerisat (Gewichtsverhältnis: 80 : 20)6. Methacrylamide / methyl methacrylate copolymer (Weight ratio: 80:20)
- 7. Methacrylamid/Methylacrylat-Mischpolymerisat (Gewichtsverhältnis: 75 : 25)7. Methacrylamide / methyl acrylate copolymer (Weight ratio: 75:25)
- 8. Acrylamid/Styrol-Mischpolymerisat (Gewichtsverhältnis: 95 : 5)8. Acrylamide / styrene copolymer (Weight ratio: 95: 5)
- 9. Acrylamid/Acrylnitril-Mischpolymerisat (Gewichtsverhältnis: 90 : 10)9. Acrylamide / acrylonitrile copolymer (Weight ratio: 90:10)
- 10. Isopropylacrylamid/Methylmethacrylat-Mischpolymerisat (Gewichtsverhältnis: 90 : 10)10. Isopropylacrylamide / methyl methacrylate copolymer (Weight ratio: 90:10)
- 11. N-Vinylpyrrolidon/Methylmethacrylat-Mischpolymerisat (Gewichtsverhältnis: 95 : 5)11. N-vinylpyrrolidone / methyl methacrylate copolymer (Weight ratio: 95: 5)
- 12. N-Vinylpyrrolidon/Methylacrylat-Mischpolymerisat (Gewichtsverhältnis: 90 : 10)12. N-vinyl pyrrolidone / methyl acrylate copolymer (Weight ratio: 90:10)
- 13. N-Vinylpyrrolidon/n-Butylacrylat-Mischpolymerisat (Gewichtsverhältnis: 95 : 5)13. N-vinylpyrrolidone / n-butyl acrylate copolymer (Weight ratio: 95: 5)
- 14. N-Vinylpyrrolidon/Styrol-Mischpolymerisat (Gewichtsverhältnis: 90 : 10)14. N-vinylpyrrolidone / styrene copolymer (Weight ratio: 90:10)
- 15. N-Vinylpyrrolidon/Acrylnitril-Mischpolymerisat (Gewichtsverhältnis: 85 : 15)15. N-vinylpyrrolidone / acrylonitrile copolymer (Weight ratio: 85:15)
- 16. N-Vinylpyrrolidon/Vinylidenchlorid-Mischpolymerisat (Gewichtsverhältnis: 90 : 10)16. N-vinylpyrrolidone / vinylidene chloride copolymer (Weight ratio: 90:10)
- 17. Vinylalkohol/Styrol-Mischpolymerisat (Gewichtsverhältnis: 95 : 5)17. Vinyl alcohol / styrene copolymer (Weight ratio: 95: 5)
- 18. Hydroxyethylacrylat/Methylmethacrylat-Mischpolymerisat (Gewichtsverhältnis: 90 : 10).18. Hydroxyethyl acrylate / methyl methacrylate copolymer (Weight ratio: 90:10).
Die Reagenzschicht eines erfindungsgemäßen Analysenelements kann eine Filmdicke, gemessen in trockenem Zustand, von zweck mäßigerweise etwa 5 bis etwa 50, vorzugsweise etwa 10 bis 35 µm, aufweisen. Weiterhin kann die Reagenzschicht erforderlichenfalls ein kationisches, anionisches oder nicht-ionisches Netzmittel enthalten.The reagent layer of an analysis element according to the invention can a film thickness, measured in the dry state, of purpose moderately about 5 to about 50, preferably about 10 to 35 µm, exhibit. Furthermore, the reagent layer can if necessary a cationic, anionic or non-ionic wetting agent contain.
Beispiele für in der Reagenzschicht eines erfindungsgemäßen mehrlagigen Analysenelements verwendbare Puffer sind bekannte Puffer wie Carbonate, Borsäure, Phosphorsäure und ein Good′scher Puffer. Besonders gut eignet sich ein Good′scher Puffer, insbesondere N-2-Hydroxyethylpiperazin-N′-2-ethan sulfonsäure.Examples of in the reagent layer of an invention Buffers that can be used in multilayer analysis elements are known Buffers such as carbonates, boric acid, phosphoric acid and a Good buffer. A Good'scher is particularly suitable Buffers, especially N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethane sulfonic acid.
Als Glucosidase kann erfindungsgemäß gewünschtenfalls α-Glucosidase und/oder β-Glucosidase verwendet werden. Der Glucosidasegehalt des erfindungsgemäßen Analysenelements beträgt zweckmäßigerweise 10 000 bis 100 000 E/m2.According to the invention, if desired, α- glucosidase and / or β- glucosidase can be used as the glucosidase. The glucosidase content of the analytical element according to the invention is expediently 10,000 to 100,000 U / m 2 .
Als Oligosaccharidsubstrat zum Testen von Amylaseaktivität eignet sich erfindungsgemäß ein selbstentwickelbares Oligo saccharidsubstrat, das in Gegenwart von Amylase zu Mono sacchariden, Disacchariden, Trisacchariden und Tetra sacchariden mit daran gebundenem p-Nitrophenol zu dissoziieren vermag.As an oligosaccharide substrate for testing amylase activity a self-developable oligo is suitable according to the invention saccharide substrate, which in the presence of amylase to mono saccharides, disaccharides, trisaccharides and tetra dissociate saccharides with attached p-nitrophenol can
Als Oligosaccharidsubstrat zum Testen von Amylaseaktivität eignen sich erfindungsgemäß p-Nitrophenyl-α-D-maltoheptaosid (PNP-G7), p-Nitrophenyl-α-D-maltohexaosid, p-Nitrophenyl-α-D maltopentaosid (PNP-G5) und dergleichen. Weitere geeignete Oligosaccharide sind solche mit speziellen Substituenten in der p-Nitrophenylgruppe (vgl. JP-OS 2199/1985) und Oligo saccharide mit blockierten nicht-reduzierten Enden (vgl. JP-OS 51 960/1987).According to the invention, p-nitrophenyl- α- D-maltoheptaoside (PNP-G 7 ), p-nitrophenyl- α -D-maltohexaoside, p-nitrophenyl- α -D maltopentaoside (PNP-G 5 ) and are suitable as an oligosaccharide substrate for testing amylase activity the like. Other suitable oligosaccharides are those with special substituents in the p-nitrophenyl group (cf. JP-OS 2199/1985) and oligo-saccharides with blocked non-reduced ends (cf. JP-OS 51 960/1987).
Weiterhin eignen sich auch Oligosaccharidsubstrate, die in Gegenwart von Amylase zu Monosacchariden, Disacchariden, Trisacchariden und Tetrasacchariden mit daran gebundener Indolylgruppe aufspaltbar sind, beispielsweise 5-Brom-4-chlor 3-indolyl-α-D-maltoheptaosid.Also suitable are oligosaccharide substrates which, in the presence of amylase, can be split into monosaccharides, disaccharides, trisaccharides and tetrasaccharides with an indolyl group attached to them, for example 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- α- D-maltoheptaoside.
Der Gehalt eines erfindungsgemäßen Analysenelements an dem Oligosaccharidsubstrat zum Testen von Amylaseaktivität be beträgt zweckmäßigerweise 0,5-3,0 g/m2.The content of an analysis element according to the invention in the oligosaccharide substrate for testing amylase activity is expediently 0.5-3.0 g / m 2 .
Die genannten Oligosaccharidsubstrate zum Testen von Amylase aktivität und die Glucosidase können in jeder der Schichten enthalten sein. Vorzugsweise sollte die Glucosidase in der Reagenzschicht enthalten sein. Insbesondere sollten sowohl das Oligosaccharidsubstrat als auch die Glucosidase in der Reagenzschicht enthalten sein.The oligosaccharide substrates mentioned for testing amylase activity and the glucosidase can be found in each of the layers be included. Preferably, the glucosidase in the Reagent layer may be included. In particular, both the oligosaccharide substrate as well as the glucosidase in the Reagent layer may be included.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veran schaulichen.The following examples are intended to illustrate the invention vivid.
Auf einen vorgestrichenen durchsichtigen Polyethylen terephthalatschichtträger einer Dicke von etwa 180 µm werden die in der folgenden Tabelle I angegebenen Beschichtungs massen aufgetragen. On a prepainted clear polyethylene Terephthalate layer carrier with a thickness of about 180 microns the coating given in Table I below mass applied.
Vorstrich: N-Vinylpyrrolidon/Vinylacetat-Mischpolymerisat
(Gewichtsverhältnis 20 : 80) 0,88 g/m²
(mit Hilfe eines n-Butanollösungsmittels aufgetragen).Primer: N-vinyl pyrrolidone / vinyl acetate copolymer (weight ratio 20:80) 0.88 g / m²
(applied with an n-butanol solvent).
Die Meßergebnisse bezüglich der Schleierreflexionsdichte unmittelbar nach dem Trocknen (Schleier D R ) nach 7tägiger Lagerung bei 40°C für die erfindungsgemäßen Analysenelemente 1 bis 4 und die Vergleichsanalysenelemente 1 und 2 sind in Tabelle II angegeben.The measurement results relating to the fog reflection density immediately after drying (Schleier D R ) after 7 days of storage at 40 ° C. for the analysis elements 1 to 4 according to the invention and the comparative analysis elements 1 and 2 are given in Table II.
Die Messung erfolgt unter Verwendung eines Filters bei 405 nm.The measurement is carried out using a filter 405 nm.
Aus Tabelle II geht hervor, daß die erfindungsgemäßen Analysen elemente 1 bis 4 mit dem hydrophilen hochmolekularen Polymeri sat in Form eines Mischpolymerisats aus einem hydrophilen Monomeren mit einem hydrophoben Monomeren in der Reagenz schicht im Vergleich zu den Vergleichsanalysenelementen 1 und 2 deutlich geringere Schleierwerte aufweisen. Table II shows that the analyzes according to the invention elements 1 to 4 with the hydrophilic high molecular polymer sat in the form of a copolymer of a hydrophilic Monomers with a hydrophobic monomer in the reagent layer in comparison to the comparative analysis elements 1 and 2 have significantly lower fog values.
Die erfindungsgemäßen Analysenelemente 1 bis 4 und die Ver gleichsanalysenelemente 1 und 2 werden in 1,5 cm große Recht ecke geschnitten. Jedes Rechteck wird zur Herstellung eines "Analysedias" zum Testen von Amylaseaktivität in ein Kunst stoffrähmchen eingesetzt.The analysis elements 1 to 4 according to the invention and the ver equal analysis elements 1 and 2 are right in 1.5 cm cut corner. Each rectangle is used to make one "Analysis slides" for testing amylase activity in an art fabric frame used.
Danach werden auf die poröse Ausbreitschicht jeweils 10 µl Humansera mit Amylaseaktivitätswerten von 159, 618 und 1074 E/1 aufgetragen. Nach einer Inkubation unter Kontrolle der Wasserverdampfung werden die Reflexionsdichten nach 3 min und 30 s bzw. 7 min bei 405 nm gemessen, um die Reflexions dichteunterschiede (Δ D R ) zu ermitteln. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.Then 10 μl of human sera with amylase activity values of 159, 618 and 1074 U / l are applied to the porous spreading layer. After an incubation under the control of water evaporation, the reflection densities are measured after 3 min and 30 s or 7 min at 405 nm in order to determine the reflection density differences ( Δ D R ). The results are summarized in Table III.
Aus Tabelle III geht hervor, daß die erfindungsgemäßen Analysenelemente 1 bis 4 weit empfindlicher sind als die Vergleichsanalysenelemente 1 und 2.Table III shows that the inventive Analysis elements 1 to 4 are far more sensitive than that Comparative analysis elements 1 and 2.
Bei Verwendung eines mehrlagigen Analysenelements mit einem p-Nitrophenol abspaltenden, selbstentwickelbaren Substrat, z. B. PNP-G5 oder PNP-G7, Glucosidase und einem hydrophilen hochmolekularen Polymerisat lassen sich erfindungsgemäß die Analysenergebnisse bei der Bestimmung der Amylaseaktivi tät hinsichtlich Genauigkeit und Präzision deutlich ver bessern.When using a multilayer analysis element with a p-nitrophenol-releasing, self-developable substrate, e.g. B. PNP-G 5 or PNP-G 7 , glucosidase and a hydrophilic high molecular weight polymer, according to the invention the analysis results in the determination of the amylase activity can be improved considerably in terms of accuracy and precision.
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