DE3915928A1

DE3915928A1 - New polysaccharide(s) used in drugs

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Publication number: DE3915928A1
Application number: DE19893915928
Authority: DE
Inventors: Hueseyin Ziya Prof Dr Oezel; Can Baser Kemal Prof D Huesnue; Ismail Dr Carbik; Hildebert Prof Dr Wagner
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1989-05-16
Filing date: 1989-05-16
Publication date: 1990-11-22

Abstract

Compounds of formula (I) are new. R = middle degree of methylation of approximately 90% and independent of each other, H, alkali(ne earth) cation of M.W.T. of 30,000-40,000 D determined by HPLC-GPC. Isolation of (I) and a pharmaceutical preparation containing (I) are also claimed.

Description

Die Erfindung betrifft ein Polysaccharid mit immunstimulierender Wirkung, Verfahren zu dessen Gewinnung sowie Arzneimittel enthaltend dieses Poly saccharid.The invention relates to a polysaccharide with an immunostimulating effect, Process for its production and pharmaceuticals containing this poly saccharide.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Polysaccharidgemisch, das als Zwischenprodukt bei der Gewinnung der Reinsubstanz anfällt, dessen Her stellung und ein Arzneimittel enthaltend dieses Polysaccharidgemisch.The invention further relates to a polysaccharide mixture which as Intermediate product in the production of the pure substance is obtained, the origin position and a drug containing this polysaccharide mixture.

Die Immunstimulation als therapeutisches Konzept ist in der Medizin seit langem bekannt. Im allgemeinen versteht man darunter die Verabreichung von Substanzen, die selbst nur eine geringe bzw. überhaupt keine antigene Wirkung aufweisen, die jedoch in der Lage sind primär auf unspezifische Art und Weise die körpereigenen Abwehrmechanismen zu induzieren. Nach heutigen Erkenntnissen ist eine Vielzahl von Stoffen in der Lage, die Immunabwehr zu stimulieren, wobei insbesondere verschiedene Mineralien, zum Beispiel Al(OH)₃, MgSO₄, Beryllium, pflanzliche Öle mit oder ohne Zusatz von Mykobakterien sowie eine Reihe von pflanzlichen Wirkstoff gruppen wie Alkaloide, Sesqui- und Diterpenverbindungen, Chinone und Polysaccharide zu nennen sind. Der gesamte Komplex der Immunstimulierung wird ausführlich beschrieben von zum Beispiel Chedid, L., et al. "Immun stimulation", Springer-Verlag , Heidelberg/New York, 1980; Heidelberger, M., "Structure and Immunological Specificity of Polysaccharides"; Fort schritte der chem. org. Naturst. 42, 288 (1982); Drews, J., "Immunpharma kologie", Springer Verlag, 1986, G. Dannhardt, Therapeutikon 11, November 1988, 653; "Immunopotention" Ciba Foundation Symposium, Elsevier, Amsterdam 1973, "Immunopharmacology of Infectious Diseases, Ed. J.A. Majde, Alan R. Liss, New York, 1987.Immune stimulation as a therapeutic concept has long been known in medicine. In general, this means the administration of substances which themselves have little or no antigenic activity, but which are primarily able to induce the body's defense mechanisms primarily in a non-specific manner. According to current knowledge, a large number of substances are able to stimulate the immune defense, in particular various minerals, for example Al (OH) ₃ , MgSO ₄ , beryllium, vegetable oils with or without the addition of mycobacteria, and a number of active plant groups such as alkaloids, sesqui and diterpene compounds, quinones and polysaccharides. The entire complex of immune stimulation is described in detail by, for example, Chedid, L., et al. "Immun stimulation", Springer-Verlag, Heidelberg / New York, 1980; Heidelberger, M., "Structure and Immunological Specificity of Polysaccharides"; Progress of the chem. org. Naturst. 42: 288 (1982); Drews, J., "Immunopharmacology", Springer Verlag, 1986, G. Dannhardt, Therapeutikon 11, November 1988, 653; "Immunopotention" Ciba Foundation Symposium, Elsevier, Amsterdam 1973, "Immunopharmacology of Infectious Diseases, Ed. JA Majde, Alan R. Liss, New York, 1987.

Die genaue Wirkungsweise immunstimulierender Substanzen konnte in den meisten Fällen bis heute nicht endgültig geklärt werden. Generell zeigen diese Substanzen unter anderem einen Einfluß auf die Funktion und/oder Proliferation von immunkompetenten Zellen, wobei sie jedoch keine Ge dächtnisreaktion hinterlassen. Dies bedeutet, daß als Wirkungsziele für die immunstimulierenden Substanzen die Makrophagen und Granulocyten sowie T- und B-Lymphozyten im Vordergrund stehen. Die Wirkung kann auf direktem oder indirektem Wege, zum Beispiel über das Komplementsystem oder über Lymphozyten, über die Produktion von Kininen, zum Beispiel Interferon, Interleukine, Tumor-Nekrose-Faktor, Colony stimulation factor und andere, sowie über eine Steigerung von Makro- und Mikrophagocytose erfolgen. Wegen der Verflechtung von unspezifischen und spezifischen Abwehr mechanismen ist dabei mit Kaskadeneffekten und der gleichzeitigen Beein flussung mehrerer Abwehrmechanismen zu rechnen.The exact mode of action of immunostimulating substances could be found in the in most cases have not yet been finally clarified. Generally show these substances have an influence on the function and / or Proliferation of immunocompetent cells, but they do not have any Ge leave memory reaction. This means that as targets for the immunostimulating substances the macrophages and granulocytes as well The focus is on T and B lymphocytes. The effect can be on direct or indirectly, for example via the complement system or via Lymphocytes, about the production of kinins, for example interferon, Interleukins, tumor necrosis factor, colony stimulation factor and others, as well as an increase in macro and micro phagocytosis. Because of the integration of non-specific and specific defense mechanisms is with cascade effects and the simultaneous leg flow of several defense mechanisms.

In der Medizin ergeben sich als bevorzugte Anwendungsgebiete für die Immunstimulation vor allem die Therapie von Mischinfektionen, chronisch persistierenden, chemotherapieresistenten, bakteriellen und viralen Infektionen, die Prophylaxe von opportunistischen Infektionen bei Risiko patienten, die Therapie der malignen Erkrankungen und in gewissem Umfang auch die Behandlung von Autoimmunerkrankungen. Immunstimulantien können auch bei der Zytostatika-Therapie zur teilweisen Kompensation der damit verbundenen Immunsuppression eingesetzt werden.In medicine, there are preferred areas of application for the Immune stimulation especially the therapy of mixed infections, chronic persistent, chemotherapy-resistant, bacterial and viral Infections, prophylaxis of opportunistic infections at risk patients, the therapy of malignancies and to some extent also the treatment of autoimmune diseases. Immune stimulants can also with cytostatics therapy to partially compensate for this associated immunosuppression can be used.

Es ist bekannt, daß verschiedene Polysaccharide, insbesondere aus Pilzen und höheren Pflanzen, in der Lage sind die Aktivität des Immunsystems zu steigern. Zu den bekanntesten Immunstimulantien aus dieser Reihe gehören die α-1,3/1,6-Glukane Lentinan und Schizophyllan, vergleiche zum Bei spiel "Immunpharmacology of Infectious Diseases", Springer Verlag 1986.It is known that various polysaccharides, especially from mushrooms and higher plants, are able to increase the activity of the immune system increase. The most well-known immune stimulants in this series include the α-1,3 / 1,6-glucans lentinan and schizophyllan, compare to the game "Immunopharmacology of Infectious Diseases", Springer Verlag 1986.

Aus der EP-A 02 46 069 ist ein wäßriger Extrakt aus Pflanzen der Gattung Nerium mit proliferationshemmenden Eigenschaften bekannt.EP-A 02 46 069 describes an aqueous extract from plants of the genus Nerium known for its anti-proliferative properties.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es ein neues Polysaccharid mit immunstimulierender Wirkung, Verfahren zu dessen Gewinnung und ein Arzneimittel enthaltend dieses Polysaccharid zur Verfügung zustellen. The object of the present invention is a new polysaccharide immunostimulating effect, method for its production and a To provide medicinal products containing this polysaccharide.

Überraschenderweise hat die Anmelderin gefunden, daß aus den Blättern und Stengeln des Nerium oleander Baumes ein Polysaccharid mit immun stimulierender Aktivität isoliert werden kann.Surprisingly, the applicant has found that from the leaves and Stems of the Nerium oleander tree a polysaccharide with immune stimulating activity can be isolated.

Das erfindungsgemäße Polysaccharid setzt sich im Gegensatz zu den bisher bekannten Lentinan- und Schizophyllan-Polysacchariden praktisch aus schließlich aus α (1→4) verknüpften D-Galakturonsäureeinheiten zusammen, deren Carboxylgruppen zu ca. 90% methyliert sind. Das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Polysaccharids wurde mit 30 000 bis 40 000 D, be vorzugt mit ca. 35 000 D, in der HPLC-Gelpermeationschromatographie er mittelt.The polysaccharide according to the invention is in contrast to those previously used known Lentinan- and Schizophyllan polysaccharides practically finally composed of α (1 → 4) linked D-galacturonic acid units, whose carboxyl groups are methylated to about 90%. The molecular weight of the polysaccharide according to the invention was 30,000 to 40,000 D, be preferably with approx. 35,000 D, in HPLC gel permeation chromatography averages.

Die Überprüfung der immunstimulierenden Wirkung des erfindungsgemäßen Polysaccharids erfolgte durch in vitro Verfahren, die die Leistungs fähigkeit des mononukleären Systems, sowie die Stimulierbarkeit vom T- und B-Lymphozyten zu messen gestatten.The review of the immunostimulating effect of the invention Polysaccharides were made by in vitro methods that performed Ability of the mononuclear system, as well as the stimulability of the T and Allow to measure B lymphocytes.

Bei diesen Untersuchungen wurde überraschend gefunden, daß das er findungsgemäße Polysaccharid insbesondere die Sekretion des Tumor- Nekrose-Faktors deutlich zu steigern vermag. Der Tumor-Nekrose-Faktor wird von den Makrophagen bei Induktion gebildet und in die Blutbahn abge geben. Er spielt in der Tumorabwehr eine wichtige Rolle.In these investigations, it was surprisingly found that he polysaccharide according to the invention in particular the secretion of the tumor Necrosis factor can increase significantly. The tumor necrosis factor is formed by the macrophages upon induction and released into the bloodstream give. It plays an important role in tumor defense.

Auch in weiteren Tests zeigte das erfindungsgemäße Polysaccharid immun stimulierende Aktivität.The polysaccharide according to the invention was also immune in further tests stimulating activity.

Es wurde weiterhin gefunden, daß ein Polysaccharidgemisch, das als Zwischenprodukt erhalten wird nicht nur eine allgemein immunstimulierende Aktivität, sondern im besonderen auch über eine die Zellproliferation hemmende Aktivität verfügt.It has also been found that a mixture of polysaccharides known as Intermediate product is not only obtained a general immunostimulating Activity, but in particular also via cell proliferation inhibitory activity.

Dieses Polysaccharidgemisch, das man durch Ausfällung der Polysaccharide aus dem Extrakt der Pflanze erhält, enthält im wesentlichen das oben beschriebene α(1→4) verknüpfte Galakturonan, sowie weitere Galak turonane unterschiedlichen Molekulargewichts und auch Oligosaccharide. This mixture of polysaccharides, which is obtained by precipitation of the polysaccharides obtained from the extract of the plant essentially contains the above described α (1 → 4) linked galacturonan, as well as other Galak turonans of different molecular weights and also oligosaccharides.

Als Ausgangsmaterial zur Isolierung der erfindungsgemäßen Polysaccharide sind Stengel und Blätter des Oleanderbaumes (Nerium oleander) geeignet. Vorzugsweise verwendet man die Blätter.As a starting material for the isolation of the polysaccharides according to the invention stems and leaves of the oleander tree (Nerium oleander) are suitable. The leaves are preferably used.

Das Verfahren zur Isolierung des erfindungsgemäßen Polysaccharids besteht im wesentlichen darin, daß man das zerkleinerte Ausgangsmaterial mit der ca. 5-fachen Menge eines polaren anorganischen Lösungsmittels, bevorzugt destilliertes Wasser, für 2 bis 4, vorzugsweise 2,5 bis 3 Stunden kocht, anschließend die festen Teile abfiltriert, den Extrakt auf Raumtemperatur abkühlen läßt und nochmals filtriert.The method for isolating the polysaccharide according to the invention is essentially in that the shredded starting material with the about 5 times the amount of a polar inorganic solvent, preferred distilled water, boils for 2 to 4, preferably 2.5 to 3 hours, then filtered off the solid parts, the extract Allow to cool to room temperature and filter again.

Man erhält aus dem Extrakt eine Polysaccharidrohfraktion als Zwischen produkt mit immunstimulierender Aktivität durch Fällung mit Alkohol, über Komplexbildung mit Schwermetallsalzen oder quartären Ammoniumsalzen. Vorzugsweise fällt man die Polysaccharide mit Ethanol, den man im Ver hältnis von 3 : 1 bis 1 : 3, vorzugsweise im Verhältnis 1 : 1 zusetzt. Nach Stehenlassen für mindestens 12 Stunden filtriert man ab, nimmt den Rück stand in destilliertem Wasser auf und wiederholt die Fällung zweimal. Den letzten Rückstand, den man wiederum in Wasser aufnimmt kann man gege benenfalls lyophilisieren.A crude polysaccharide fraction is obtained as an intermediate from the extract product with immunostimulatory activity by precipitation with alcohol, about Complex formation with heavy metal salts or quaternary ammonium salts. The polysaccharides are preferably precipitated with ethanol, which is used in Ver ratio of 3: 1 to 1: 3, preferably in a ratio of 1: 1. To Allow to stand for at least 12 hours, remove the residue got up in distilled water and repeated the precipitation twice. The the last residue, which can be taken up in water, can be countered if necessary, lyophilize.

Die Rohfraktion trennt man durch herkömmliche Gelchromatographiever fahren, zum Beispiel unter Verwendung einer Biogel® P-60 Säule in nieder- und hochmolekulare Bestandteile auf.The crude fraction is separated by conventional gel chromatography drive, for example using a Biogel® P-60 column in low and high molecular weight components.

Aus der hochmolekularen Fraktion isoliert man anschließend durch Ionen austauschchromatographie, zum Beispiel unter Verwendung einer DEAE- Sepharose® C 6-B Säule, durch Elution mit zum Beispiel einem 0-1 m NaCl Gradienten das erfindungsgemäße Polysaccharid bei einer NaCl Konzentra tion von ca. 0,2 m.The high molecular weight fraction is then isolated by ions exchange chromatography, for example using a DEAE Sepharose® C 6-B column, by elution with, for example, a 0-1 m NaCl Gradients of the polysaccharide according to the invention at a NaCl concentration tion of approx. 0.2 m.

example Isolation of the polysaccharide according to the invention from Nerium oleander Scroll

Die Ausbeute an Polysacchariden variiert nach Herkunft und Erntezeit des Ausgangsmaterials.The yield of polysaccharides varies depending on the origin and harvest time of the Source material.

Alle im folgenden beschriebenen Arbeiten wurden, wenn nicht anders ange gegeben, bei 4°C ausgeführt.All of the work described below was done unless otherwise stated given, carried out at 4 ° C.

Die Blätter des Nerium oleander Baumes wurden zerkleinert und in der ca. 5-fachen Menge destillierten Wasser 3 Stunden lang gekocht. Die festen Anteile wurden abfiltriert und nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde ein weiteres mal filtriert. Das Filtrat wurde mit Ethanol (96%) 1 : 1 versetzt. Diese Lösung wurde für 12 Stunden stehen gelassen, die gebildete Gel suspension abfiltriert und der Rückstand in destilliertem Wasser aufge nommen. Diese Lösung wurde wieder mit Ethanol (96%) 1 : 1 versetzt und für 12 Stunden stehengelassen. Die gebildete Gelsuspension wurde abfiltriert, der Rückstand in destilliertem Wasser gelöst und ein drittes mal mit Ethanol (96%) 1 : 1 versetzt. Nach Stehenlassen für mindestens 12 Stunden wurde die Gelsuspension abfiltriert, der Rückstand in destilliertem Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Auf diese Weise wurde ein Roh extrakt als Zwischenprodukt erhalten.The leaves of the Nerium oleander tree were shredded and in the approx 5 times the amount of distilled water boiled for 3 hours. The firm Portions were filtered off and, after cooling to room temperature, a filtered again. The filtrate was mixed with ethanol (96%) 1: 1. This solution was left to stand for 12 hours, the gel formed suspension filtered and the residue dissolved in distilled water taken. This solution was again mixed with ethanol (96%) 1: 1 and for Let stand for 12 hours. The gel suspension formed was filtered off, the residue dissolved in distilled water and a third time with Ethanol (96%) 1: 1 added. After standing for at least 12 hours the gel suspension was filtered off, the residue in distilled Water absorbed and lyophilized. In this way it became a raw extract obtained as an intermediate product.

Dieses Zwischenprodukt wird qualitativ weiterhin durch das in der Fig. 1 gezeigte Chromatogramm charakterisiert. Zur Gewinnung des erfindungs gemäßen Polysaccharids wurden die niedermolekularen Substanzen von den hochmolekularen Substanzen schonend getrennt. Dazu wurde der Rohextrakt in Wasser gelöst, die Lösung zentrifugiert und der Überstand auf eine Biogel P-60-Säule gegeben und mit destilliertem Wasser eluiert, wobei zwei Fraktionen erhalten wurden. Die erste Fraktion enthielt ein Polysaccharidgemisch vom Molekulargewichtsbereich 17 000 bis 1 20 000 D. Die zweite Fraktion (MG ca. < 10000 D) enthielt niedermolekulare Poly und Oligosaccharide und andere Substanzen.This intermediate product is further qualitatively determined by that in FIG. 1 characterized shown chromatogram. To obtain the Invention According to the polysaccharide, the low molecular weight substances from the high-molecular substances carefully separated. In addition, the crude extract was dissolved in water, the solution centrifuged and the supernatant to a Biogel P-60 column added and eluted with distilled water, whereby two fractions were obtained. The first fraction contained one Polysaccharide mixture of the molecular weight range 17,000 to 1 20,000 D. The second fraction (MW approx. <10000 D) contained low molecular weight poly and oligosaccharides and other substances.

Das erfindungsgemäße Polysaccharid wurde durch Chromatographie der hoch molekularen Fraktion an einer Anionenaustauscher DEAE Sepharose® CL 6 B Säule erhalten. Dazu wurde die hochmolekulare Fraktion in Wasser gelöst und auf die mit DEAE Sepharose® gefüllte Säule gegeben und mit einem 0-1-m NaCl Gradienten eluiert. Dabei eluierte das erfindungsgemäße Poly saccharid bei ca. 0,2 m NaCl. Es zeigt eine positive optische Drehung von 38,12° (1 mg/ml H₂O, Raumtemperatur).The polysaccharide according to the invention was obtained by chromatography of the high molecular weight fraction on an anion exchanger DEAE Sepharose® CL 6 B column. For this purpose, the high molecular weight fraction was dissolved in water and placed on the column filled with DEAE Sepharose® and eluted with a 0-1-m NaCl gradient. The poly saccharide according to the invention eluted at about 0.2 M NaCl. It shows a positive optical rotation of 38.12 ° (1 mg / ml H ₂ O, room temperature).

Die Fig. 1 zeigt ein für die Zusammensetzung des Zwischenprodukts charakteristisches Chromatogramm. Das verwendete Säulensystem ist: µ-Bondagel 125 + µ-Bondagel 500 (getrennte Säulen). Elution mit 0,5 m Phosphatpuffer pH 6,0.1 shows a for the composition of the intermediate characteristic chromatogram. The column system used is: µ-Bondagel 125 + µ-Bondagel 500 (separate columns). Elution with 0.5 m Phosphate buffer pH 6.0.

Für das erfindungsgemäße Polysaccharid wurde die folgende Struktur ermittelt:The structure for the polysaccharide of the present invention was as follows determined:

in der der Rest R einen mittleren Methylierungsgrad von etwa 90% aufweist und im übrigen unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkali- oder Erd alkalikation bedeutet.in which the radical R has an average degree of methylation of about 90% and otherwise independently of one another hydrogen, alkali or earth alkalization means.

Die Struktur des erfindungsgemäßen Polysaccharids wurde weiters durch Methanol-Bestimmung und ¹³C-NMR-Spektroskopie untersucht. In diesen Untersuchungen wurde gefunden, daß das Polysaccharid nur aus D- Galakturonsäureeinheiten besteht, die zu ca. 90% methyliert sind.The structure of the polysaccharide according to the invention was also investigated by methanol determination and ¹³ C-NMR spectroscopy. In these studies it was found that the polysaccharide consists only of D-galacturonic acid units, which are approximately 90% methylated.

Die Permethylierungsanalyse lieferte die Bindungsverhältnisse dieses Galakturonans (Hakomori, S.I., J. Biochem. (Tokyo) 55, 205 (1964)).The permethylation analysis provided the bond ratios of this Galacturonans (Hakomori, S.I., J. Biochem. (Tokyo) 55, 205 (1964)).

Die GC-MS Ergebnisse der Permethylierungsanalysen zeigten, daß die Poly saccharidkette aus α (1→4) verknüpften D-Galakturonsäureeinheiten be steht, deren Carboxylgruppen zu ca. 90% methyliert sind. Außer α (1→4) glykosidischen Bindungen konnten keine anderen Bindungsverhältnisse nachgewiesen werden. Das heißt: Die Polysaccharidkette ist linear aufge baut und besitzt keine Verzweigungen.The GC-MS results of the permethylation analyzes showed that the poly saccharide chain from α (1 → 4) linked D-galacturonic acid units stands, whose carboxyl groups are methylated to about 90%. Except α (1 → 4) Glycosidic bonds could not have any other binding relationships be detected. That means: The polysaccharide chain is linear builds and has no branches.

Zur weiteren Analyse dieses Polysaccharids wurde zunächst das Molekular gewicht bestimmt.For further analysis of this polysaccharide, the molecular was first weight determined.

Die Molekulargewichtsbestimmung erfolgt mittels HFLC-Gelpermeations chromatographie (HP-GPC). Verwendetes HP-GPC-System: µ-Bondagel E 125 + 5 Bondagel E 500 (Fa. Waters).The molecular weight is determined by means of HFLC gel permeation chromatography (HP-GPC). HP GPC system used: µ-Bondagel E 125 + 5 Bondagel E 500 (from Waters).

Puffersystem: 0,5 M Phosphatpuffer, pH 6Buffer system: 0.5 M phosphate buffer, pH 6

Als Vergleichssubstanzen wurden Dextran T 10, T 40, T 70, T 110, T 2000 und Glucose verwendet.Dextran T 10, T 40, T 70, T 110, T 2000 were used as reference substances and glucose used.

In dieser Methode wurde für das erfindungsgemäße Polysaccharid ein Molekulargewicht von 30 000 bis 40 000 D, vorzugsweise von ca. 35 000 D ermittelt.This method was used for the polysaccharide according to the invention Molecular weight from 30,000 to 40,000 D, preferably from about 35,000 D. determined.

Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß das Molekulargewicht in Abhängig keit der angewandten Untersuchungsmethoden variieren kann.However, it should be noted that the molecular weight is dependent the examination methods used can vary.

Durch den Carbazoltest (Bitter, T. und Muir, H.M., Analyt. Biochem. 4, 330 (1962) wurde der Uronsäuregehalt des erfindungsgemäßen Polysaccharids bestimmt.By the carbazole test (Bitter, T. and Muir, H.M., Analyt. Biochem. 4, 330 (1962) became the uronic acid content of the polysaccharide according to the invention certainly.

Uronsäuregehalt in % % Uronic acid content

Zur Bestimmung der Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Polysaccharids wurde dieses mit TFA versetzt und 2 Stunden lang bei 121°C im Trocken schrank erhitzt. Nach der Entfernung von TFA wurde eine Dünnschicht chromatographie durchgeführt.To determine the composition of the polysaccharide according to the invention it was mixed with TFA and dry at 121 ° C for 2 hours cabinet heated. After the removal of TFA, a thin layer became chromatography performed.

Adsorbens: Kieselgel G F₂₅₄-Fertigplatten für die Nano-DC(HPTLC) 20×20 cm (Fa. Merck)
Laufmittelsystem: n-Butanol-Aceton-Essigsäure-Wasser (35 : 35 : 10 : 20)
Detektion: Anilindiphenylaminophosphorsäure
Als Ergebnis wurde gefunden, daß nur D-Galacturonsäure nachweisbar ist.Adsorbent: silica gel GF _{254 finished} plates for nano-DC (HPTLC) 20 × 20 cm (Merck)
Solvent system: n-butanol-acetone-acetic acid-water (35: 35: 10: 20)
Detection: aniline diphenylaminophosphoric acid
As a result, it was found that only D-galacturonic acid was detectable.

Die α (1→4) Verknüpfung der D-Galakturonsäure wurde zusätzlich mit Pektinase untersucht. Das Polysaccharid wurde in destilliertem Wasser gelöst und mit Pektinase 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. An schließend wurde mittels Dünnschichtchromatographie die freigesetzte Galakturonsäure nachgewiesen.The α (1 → 4) linkage of D-galacturonic acid was additionally with Pectinase examined. The polysaccharide was in distilled water dissolved and incubated with pectinase for 3 hours at room temperature. On finally, the released was by means of thin layer chromatography Detected galacturonic acid.

Die pharmakologische Wirkung des erfindungsgemäße Polysaccharids wurde in anerkannten in vitro Tests untersucht.The pharmacological effect of the polysaccharide according to the invention was tested in recognized in vitro tests.

Da es bislang keine spezifischen Testmethoden zur Überprüfung der immun stimulierenden Wirkung von Substanzen gibt, verwendet man bis heute primär solche in vitro- und in vivo-Verfahren, die den Einfluß von Verbindungen oder Pflanzenextrakten auf den Funktionszustand und die Leistungsfähigkeit des mononuklearen Systems, sowie die Stimulierbarkeit von T- und B-Lymphozyten zu messen gestatten.As there are currently no specific test methods to check the immune stimulating effects of substances are still used today primarily those in vitro and in vivo methods that show the influence of Compounds or plant extracts on the functional state and the Performance of the mononuclear system, as well as the stimulability of T and B lymphocytes.

Bei diesen Untersuchungen wurde festgestellt, daß das erfindungsgemäße Polysaccharid insbesondere im Tumor-Nekrose Faktor Freisetzungstest wirksam ist. In these investigations it was found that the invention Polysaccharide especially in the tumor necrosis factor release test is effective.

TNF (Tumor-Nekrose-Faktor) ist ein Protein, das beim Menschen aus 157 Aminosäuren besteht. Es wird bei Induktion in Makrophagen synthetisiert und in die Blutbahn abgegeben. TNF stimuliert das Abwehrsystem und tötet die Tumorzellen ab. Bei dem TNF-Test wird die zu testende Substanz den Versuchstieren injiziert. Danach wird im Blut der Versuchstiere die TNF-Konzentration anhand der nekrotischen Wirkung auf Tumorzellinien gemessen und als Parameter für die stimulatorische Wirkung der Test substanzen verwendet.TNF (tumor necrosis factor) is a protein that is derived from 157 in humans Amino acids. It is synthesized by induction in macrophages and released into the bloodstream. TNF stimulates the immune system and kills the tumor cells. In the TNF test, the substance to be tested is the Laboratory animals injected. Then the test animals become in the blood TNF concentration based on the necrotic effect on tumor cell lines measured and as a parameter for the stimulatory effect of the test substances used.

Der Tumor-Nekrose-Faktor-Test (TNF-T) wurde nach Stimpl, M., Proksch, A., Wagner, H. und Lohmann-Matthes, M.L. Infection and Immunity 46, 845 (1984), durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dar gestellt.The tumor necrosis factor test (TNF-T) was carried out according to Stimpl, M., Proksch, A., Wagner, H. and Lohmann-Matthes, M.L. Infection and Immunity 46, 845 (1984). The results are shown in the following table posed.

TNF-Test-Ergebnisse TNF test results

PS = erfindungsgemäßes Polysaccharid PS = polysaccharide according to the invention

Wie aus der Tabelle entnehmbar ist, bewirkt das erfindungsgemäße Poly saccharid eine deutliche Steigerung der TNF Konzentration, d.h. es induziert in den Makrophagen die Synthese des TNF.As can be seen from the table, the poly according to the invention brings about saccharide a significant increase in TNF concentration, i.e. it induces the synthesis of TNF in the macrophages.

Die immunstimulierende Wirkung der als Zwischenprodukt erhaltenen Roh fraktion wurde ebenfall im Tumor-Nekrose-Faktor Freisetzungstest, s.o., überprüft. Die Ergebnisse zeigt die folgende Tabelle. The immune stimulating effect of the crude obtained as an intermediate Fraction was also in the tumor necrosis factor release test, see above, checked. The results are shown in the following table.

TNF-T-Ergebnisse TNF-T results

Die immunstimulierende Wirkung der Polysaccharidrohfraktion wurde zusätzlich im Granulozyten-Test nach Brandt untersucht (Brandt, L., Scand. J. Haemat.(Suppl.)2 (1967).The immunostimulatory effect of the raw polysaccharide fraction was additionally examined in the granulocyte test according to Brandt (Brandt, L., Scand. J. Haemat. (Suppl.) 2 (1967).

Im Granulozyten-Test nach Brandt wird durch in vitro-Versuche die Zahl der phagozytierten Hefezellen oder Bakterien durch eine Granulozyten fraktion, die aus Humanserum gewonnen wurde, unter dem Mikroskop bestimmt. Man mißt die prozentuale Steigerung der Phagozytose durch die erfindungsgemäßen Polysaccharide. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt.In the Brandt granulocyte test, the number is determined by in vitro tests the phagocytosed yeast cells or bacteria by a granulocyte fraction obtained from human serum under the microscope certainly. The percentage increase in phagocytosis by the polysaccharides according to the invention. The results are as follows Shown in the table.

Wie die Ergebnisse in der Tabelle zeigen, bewirkt das als Zwischenprodukt erhaltene Polysaccharidgemisch eine deutliche Steigerung der Phagozytose, die mit den im TNF-Freisetzungstest erhaltenen Stimulierungsdaten gut korrelieren.As the results in the table show, this works as an intermediate polysaccharide mixture obtained a significant increase in phagocytosis, those with the stimulation data obtained in the TNF release test were good correlate.

Dieses Zwischenprodukt besitzt weiterhin eine die Zellvermehrung hemmende Wirkung (antiproliferative Wirkung). This intermediate also has an inhibitory effect on cell proliferation Effect (antiproliferative effect).

Das erfindungsgemäße Polysaccharid bzw. das Polysacchridgemisch kann entweder getrennt als Reinsubstanz oder in Form von pharmazeutischen Zubereitungen verabreicht werden, wenngleich es im allgemeinen wirksamer ist, die Verbindung in Form einer pharmazeutischen Zubereitung zu ver abreichen. Vorzugsweise liegt die Zubereitung in Form einer Formulierung vor, dieThe polysaccharide according to the invention or the polysacchride mixture can either separately as a pure substance or in the form of pharmaceutical Preparations are administered, although it is generally more effective is to ver the compound in the form of a pharmaceutical preparation submit. The preparation is preferably in the form of a formulation before that

1) the polysaccharide according to the invention or the polysacchride mixture alone contains and
2) one or more suitable binders, carrier materials and / or other auxiliary substances and
3) optionally further therapeutic agents or adjuvants having.

Die Trägermaterialien, Bindemittel und/oder Hilfsstoffe müssen pharma zeutisch und pharmakologisch verträglich sein, so daß sie mit den anderen Bestandteilen der Zubereitung vereinbar sind und keine nachteilige Wirkung auf den behandelten Organismus ausüben.The carrier materials, binders and / or auxiliaries must be pharma be ceutical and pharmacologically compatible, so that they are compatible with the others Components of the preparation are compatible and not disadvantageous Have an effect on the treated organism.

Die Formulierungen schließen jene ein, die für die parenterale (ein schließlich subkutane, intradermale, intramuskuläre und intravenöse) oder orale Verabreichung geeignet sind, wenngleich der am besten geeignete Verabreichungsweg von dem Zustand des Patienten abhängt.The formulations include those for parenteral ( finally subcutaneous, intradermal, intramuscular and intravenous) or oral administration is suitable, although the most appropriate The route of administration depends on the condition of the patient.

Die Herstellung der Formulierungen erfolgt unter Anwendung von an sich auf dem Gebiet der Pharmazie bekannten Verfahren. Alle Verfahren schließen den Schritt ein, das erfindungsgemäße Polysaccharid bzw. das Polysaccharidgemisch (d.h. den Wirkstoff) mit dem Trägermaterial, Binde mittel und/oder Hilfsstoffe, wobei letztere einen zusätzlichen Bestand teil darstellen, zu vermischen bzw. zu vereinigen. Im allgemeinen werden die Formulierungen dadurch hergestellt, daß man den Wirkstoff mit den flüssigen Trägermaterialien oder den feinteiligen Trägermaterialien oder beiden innig vermischt und dann erforderlichenfalls das erhaltene Produkt in die gewünschte Verabreichungsform bringt. Die erfindungsgemäßen Formulierungen, die für die orale Verabreichung geeignet sind, können in Form von diskreten Einheiten, wie Kapseln, Cachets oder Tabletten, die jeweils eine vorbestimmte Menge des erfindungsgemäßen Wirkstoffes enthalten, sowie in Form von Pulvern oder Granulaten, in Form einer Lösung oder einer Suspension in einer wäßrigen oder nicht wäßrigen Flüssigkeit, oder in Form einer Emulsion zum Beispiel in Form von Liposomen, vorliegen.The formulations are prepared using per se Processes known in the field of pharmacy. All procedures include the step, the polysaccharide according to the invention or the Polysaccharide mixture (i.e. the active ingredient) with the carrier material, bandage agents and / or auxiliaries, the latter an additional stock represent part, mix or unite. Generally will the formulations are prepared by adding the active ingredient to the liquid carrier materials or the finely divided carrier materials or both intimately mixed and then, if necessary, the product obtained into the desired form of administration. The invention Formulations suitable for oral administration can be found in Form of discrete units, such as capsules, cachets or tablets in each case a predetermined amount of the active ingredient according to the invention contain, as well as in the form of powders or granules, in the form of a Solution or a suspension in an aqueous or non-aqueous Liquid, or in the form of an emulsion, for example in the form of Liposomes.

Der Wirkstoff kann auch in Form eines Bolus oder einer Paste vorliegen.The active ingredient can also be in the form of a bolus or a paste.

Die Tabletten kann man durch Pressen oder Vergießen herstellen, wobei man gegebenenfalls eines oder mehrere der üblichen Hilfsmittel zugibt.The tablets can be made by pressing or pouring, whereby one optionally adding one or more of the usual auxiliaries.

Die für die parenterale Verabreichung geeigneten Formulierungen schließen sterile Injektionslösungen in wäßrigen oder nicht wäßrigen Medien, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Materialen, die die Formulierung im Hinblick auf den menschlichen Organismus isotonisch machen, ein. Weiter kann das erfindungsgemäße Polysaccharid bzw. Poly saccharidgemisch in Form von sterilen Suspensionen in wäßrigen oder nicht wäßrigen Medien, die Suspensionsmittel und Verdickungsmittel enthalten können, vorliegen. Die Formulierungen können als Einzel- oder Mehrfach-Dosis vorliegen, beispielsweise in Form von Ampullen oder dicht verschlossenen Fläschchen und können auch in lyophilisierter Form ge lagert werden, so daß es lediglich erforderlich ist, bei notwendiger Ver abreichung steriles flüssiges Trägermaterial, beispielsweise für In jektionszwecke geeignetes Wasser, unmittelbar vor Verwendung zuzugeben. Die unmittelbar vor der Verabreichung bereiteten Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulver, Granulaten und Tabletten der oben beschriebenen Art bereitet werden. Close the formulations suitable for parenteral administration sterile injection solutions in aqueous or non-aqueous media, the Antioxidants, buffers, bacteriostats and dissolved materials that the Formulation isotonic with regard to the human organism make a. Furthermore, the polysaccharide or poly according to the invention saccharide mixture in the form of sterile suspensions in aqueous or non-aqueous media, suspending agents and thickeners may contain exist. The formulations can be used individually or Multiple doses are present, for example in the form of ampoules or tightly sealed vials and can also be in lyophilized form be stored so that it is only necessary if necessary Ver administration of sterile liquid carrier material, for example for In water suitable for injection purposes, to be added immediately before use. The solutions for injection and prepared immediately before administration Suspensions can be made from sterile powders, granules and tablets be prepared as described above.

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können neben den vorhin genannten Bestandteilen andere für die in Rede stehenden Formulierungen geeignete Bestandteile enthalten. So können beispielsweise die auf oralem Weg zu verabreichenden pharmazeutischen Zubereitungen Aromastoffe enthalten.In addition to those mentioned above, the preparations according to the invention can Ingredients other suitable for the formulations in question Components included. For example, the oral route administering pharmaceutical preparations contain flavorings.

Die zur Applikation geeigneten Mengen des Wirkstoffes variieren in Ab hängigkeit vom jeweiligen Therapiegebiet. Im allgemeinen enthält eine Einzeldosis 5 bis 95% aktiven Bestandteil. Dies entspricht bei einer einmaligen Applikation zum Beispiel 50µg bis 100 mg pro Dosis/Mensch parenteral und 1 mg bis 500 mg peroral. Diese Dosierung kann jedoch in Abhängigkeit des Verabreichungsweges, des Patientenzustandes und des Therapiegebietes in breiten Grenzen variieren.The amounts of the active ingredient suitable for application vary in Ab dependence on the respective therapy area. Generally contains one Single dose 5 to 95% active ingredient. This corresponds to a single application, for example 50µg to 100 mg per dose / person parenterally and 1 mg to 500 mg orally. However, this dosage can be in Dependence of the route of administration, the patient's condition and the Therapy area vary within wide limits.

Claims

1. Polysaccharide of the general formula: in which the radical R has an average degree of methylation of about 90% and, independently of one another, means hydrogen, alkali or alkaline earth metal cations and has a molecular weight of 30,000 to 40,000 D, determined in HPLC gel permeation chromatography

2. Polysaccharide according to claim 1, in which at least 80%, preferably about 90% of the carboxyl groups are methylated.

3. Polysaccharide according to one of claims 1 or 2, characterized records that it was obtained from plants of the genus Nerium.

4. A method for obtaining a polysaccharide according to one of claims 1 to 3, characterized in that

a) boils parts of the Nerium oleander tree in a polar inorganic solvent;
b) the solids are filtered off, filtered after cooling at room temperature, the polysaccharides precipitate, the precipitate is filtered off and taken up in a polar inorganic solvent and this crude extract is optionally lyophilized;
c) the crude extract is separated by gel filtration into a high and low molecular weight fraction and the acidic polysaccharide is eluted from the high molecular weight fraction by ion exchange chromatography and elution with a salt gradient.

5. The method according to claim 4, wherein in step a) as a polar inorganic solvent distilled water used.

6. The method according to claim 4, wherein the solid parts in about 5 times the amount of distilled water boils.

7. The method according to any one of claims 4 to 6, in which the output material boils for 2 to 4, preferably 2.5 to 3 hours.

8. The method according to any one of claims 4 to 7, in which the Polysaccharides in stage b) by adding ethanol (96%) in Ratio 1: 1 fails.

9. The method according to claim 8, wherein the ethanol precipitation twice repeated.

10. The method according to any one of claims 4 to 9, in which in step c) perform the elution with a 0-1-m NaCl gradient.

11. The method according to claim 4, wherein the leaves of nerium oleander used as the starting material.

12. Polysaccharide mixture with immunostimulating and antiproliferative activity from plants of the genus Nerium, obtainable from:

a) boiling parts of the plant in a polar inorganic solvent;
b) separating the solid portions, cooling the extract to room temperature, filtration and precipitation of the polysaccharides; From separation of the precipitate, dissolving the residue and, if necessary, lyophilization.

13. polysaccharide mixture according to claim 12, characterized in that the polar inorganic solvent in stage a) is water.

14. polysaccharide mixture according to claim 12 and 13, characterized in that the plant parts in 5 times the amount of water for 2 to 4, preferably boils for 2.5 to 3 hours.

15. polysaccharide mixture according to claim 12, 13 or 14, characterized records that the polysaccharides in step b) by adding Ethanol (96%) fails in a ratio of 1: 1.

16. polysaccharide mixture according to claim 15, characterized in that the ethanol precipitation is repeated twice.

17. polysaccharide mixture according to one of claims 12 to 16, characterized characterized in that it is essentially a polysaccharide after a of claims 1 to 3, further galacturons of different molecular contains weight and oligosaccharides.

18. polysaccharide mixture according to one of claims 12 to 17, further ge kennzeicnnet by the HPLC chromatogram shown in FIG. 1, obtained at Separation of the polysaccharide mixture via µ-Bondagel 125 and µ-Bondagel 500 and elution with 0.5 m phosphate buffer pH 6.0.

19. Pharmaceutical preparation containing an active ingredient Polysaccharide according to one of claims 1 to 3 or a polysaccharide Mixture according to one of claims 12 to 18 in conjunction with conventional pharmacologically acceptable carriers and / or excipients.

20. Use of a polysaccharide according to one of claims 1 to 3 or of the polysaccharide mixture according to one of claims 12 to 18 as Immune stimulant.

21. Use of a polysaccharide mixture according to one of claims 12 to 18 as an antiproliferative agent.