DE3904303A1 - Structural phosphoprotein (pp28) of human cytomegalovirus (HCMV), its preparation and use - Google Patents
Structural phosphoprotein (pp28) of human cytomegalovirus (HCMV), its preparation and useInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein strukturelles HCMV-Phosphopro tein von 28 kD (pp 28) und immunogene Teile davon, seine gentechnische Herstellung sowie seine Verwendung als Diagnostikum und zur Erzeugung von Antikörpern und Impfstoffen.The invention relates to a structural HCMV phosphopro 28 kD (pp 28) and immunogenic parts thereof, its genetic engineering and its use as Diagnostic and for the production of antibodies and Vaccines.
In mehreren Untersuchungen sind HCMV-Polypeptide mit Molekulargewichten von etwa 28 kD bisher beschrieben worden. Roby und Gibson (Roby, C. und Gibson, W. (1986) J. Virol. 59, 714-727) und Nowak et al. (Nowack, B. et al. (1984) Virology 132, 325-338) beschreiben ein Phosphopro tein von etwa 24 kC bzw. 29 kD. In beiden Veröffentlichun gen wird vermutet, daß dieses Protein in der Matrix lokalisiert ist. Pereira et al. (Pereira, L. et al. (1984) Virology 139, 73-86) beschreiben einen monoklona len Antikörper, der aus infizierten Zellextrakten ein 25 kD Glykoprotein präzipitiert, das zum Glykoprotein D-Komplex gehört. Irmiere und Gibson (Irmiere, A. und Gibson, W. (1985) J. Virol 56, 277-283) haben ein 28 kD Protein identifiziert, das sowohl im A- als auch im B-Kapsid verschiedener HCMV-Stämme gefunden wurde. Re et al. (Re, M. C. et al. (1985) J. Gen. Virol. 66, 2507-2511) untersuchen ein 28 kD Strukturprotein mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers P2G11 (MAK P2G11). Dabei bleibt offen, ob es sich um das von Pereira et al. (a. a. O.) oder um das von Nowak et al. (a. a. O.) beschriebene Protein handelt.HCMV polypeptides have been included in several studies Molecular weights of about 28 kD described so far been. Roby and Gibson (Roby, C. and Gibson, W. (1986) J. Virol. 59, 714-727) and Nowak et al. (Nowack, B. et al. (1984) Virology 132, 325-338) describe a phosphopro 24 kC or 29 kD. In both publications gene is suspected that this protein in the matrix is localized. Pereira et al. (Pereira, L. et al. (1984) Virology 139, 73-86) describe a monoclonal len antibody derived from infected cell extracts 25 kD glycoprotein precipitates to the glycoprotein D complex belongs. Irmiere and Gibson (Irmiere, A. and Gibson, W. (1985) J. Virol 56, 277-283) have a 28 kD Protein identified that is found in both A and B-capsid of various HCMV strains was found. Re et al. (Re, M.C. et al. (1985) J. Gen. Virol. 66, 2507-2511) examine a 28 kD structural protein with the help of a monoclonal antibody P2G11 (MAK P2G11). That remains remains open as to whether it is the one of Pereira et al. (loc. cit.) or to that of Nowak et al. (loc. cit.) protein described acts.
Da ein Strukturprotein von 28 kD von fast allen hochposi tiven humanen Seren erkannt wird, und somit unter den 28 kD-Proteinen eines der Hauptimmunogene des HCMV zu finden ist, erschien es wünschenswert, das dafür kodie rende HCMV-Gen zu identifizieren und zu isolieren. Ein weiteres Ziel bestand darin, dieses Gen dann in geeigne ten Wirtsystemen zu exprimieren, um es genauer zu charak terisieren und gegebenenfalls als weiteres Hauptimmunogen von HCMV zu etablieren.As a structural protein of 28 kD from almost all high posi tive human sera is recognized, and thus among the 28 kD proteins one of the main immunogens of HCMV it was desirable to find the code for it Identify and isolate the resulting HCMV gene. A Another goal was to make this gene suitable express host systems to characterize it more precisely terize and, if necessary, as a further main immunogen of establishing HCMV.
Es wurde gefunden, daß mit dem MAK P2G11 (Re et al. a. a. O.) aus einer HCMV-cDNA-Genbank Klone identifiziert und isoliert werden können, die für ein 28 kD-Phosphopro tein (pp 28) kodieren. Bisher war ein 28 kD großes Phospho protein nicht bekannt.It was found that the MAK P2G11 (Re et al. a. a. O.) from a HCMV cDNA library clones identified and can be isolated for a 28 kD phosphopro encode tein (pp 28). So far it was a 28 kD phospho protein not known.
Zur Herstellung der Genbank wurde aus mit HCMV, Stamm Ad 169, infizierten menschlichen Vorhaut-Fibroblastenzellen 96 bis 120 Stunden nach der Infektion die poly(A)⁺-RNA isoliert, in ds-DNA überführt und ohne Größenfraktionie rung in den handelsüblichen Phagen-Expressionsvektor lambdagt11 eingefügt. Hierzu wurde der Vektor mit EcoRI gespalten und mit alkalischer Phosphatase (aus Kälberdarm) behandelt, um die intramolekulare Religation zu unter drücken. Durch Anfügen von EcoRI-Linkern wurde die cDNA zwischen die Phagenarme eingefügt und in vitro verpackt. Aus 100 ng ds-cDNA wurde so eine Genbank erhalten, die etwa 5 · 105 unabhängige Rekombinanten und 18% Wildtyp- Phagen enthielt.To produce the gene bank, the poly (A) ⁺-RNA was isolated from HCMV strain Ad 169, infected human foreskin fibroblast cells 96 to 120 hours after the infection, converted into ds-DNA and without size fractionation into the commercially available phage expression vector lambdagt11 inserted. For this purpose, the vector was cleaved with EcoRI and treated with alkaline phosphatase (from calf intestine) in order to suppress intramolecular religation. By adding EcoRI linkers, the cDNA was inserted between the phage arms and packaged in vitro. A gene library was thus obtained from 100 ng ds cDNA, which contained approximately 5 × 10 5 independent recombinants and 18% wild-type phages.
Das "Screening" der Genbank erfolgte nach der Methode von R. A. Young und R. W. Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 1194-1198, jedoch mit der Abwandlung, daß Meer rettich-Peroxidase an Protein A gekoppelt wude und 4-Chlor-1-naphthol als Detektionssystem diente, unter Einsatz des vorstehend beschriebenen monoklonalen Anti körpers P2G11. Bei diesem "Immunoscreening" werden die auf Nitrozellulosefiltern vorhandenen Kolonien vorsichtig inkubiert und nach Entfernen ungebundener Reaktanden positive Plaques mit dem genannten modifizierten Detek tionssystem nachgewiesen.The Genbank was "screened" using the method of R. A. Young and R. W. Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 1194-1198, but with the modification that sea radish peroxidase was coupled to protein A and 4-chloro-1-naphthol served as the detection system, below Use of the monoclonal anti described above body P2G11. With this "immunoscreening" the Colonies present on nitrocellulose filters are cautious incubated and after removing unbound reactants positive plaques with the modified detector mentioned proven system.
Beim "Screening" der Genbank mit MAK P2G11 wurden von 150 000 rekombinanten lambdagt11 Phagen zwei positive Signale erhalten. Ein Klon mit einer Insertion von etwa 270 Basenpaaren (bp) wurde für die weitere Charakteri sierung ausgewählt und gereinigt; er erhielt die Bezeich nung BUML-1.When screening the gene bank with MAK P2G11 from 150,000 recombinant lambdagt11 phages two positive Receive signals. A clone with an insertion of about 270 base pairs (bp) was used for the further characteri selected and cleaned; he received the designation BUML-1.
Der E. coli Stamm Y 1089 wurde mit dem rekombinierten Phagen infiziert und die Synthese des β-Galaktosidase- Fusionsproteins durch Zugabe von Isopropylthiogalaktosid (IPTG) induziert. Hierbei wurde ein Fusionsprotein von etwa 130 kD gebildet, das deutlich größer als die β-Galak tosidase (118 kD) ist und das nicht in E. coli-Zellen gefunden wird, die mit lambdagt11 infiziert sind; es ist auch nicht in mit BUML-1 infizierten, aber nicht indu zierten Zellen vorhanden. In "Western Blot" Analysen reagiert nur das 130 kD Polypeptid mit MAK P2G11. Es ergibt sich somit, daß der rekombinierte Klon BUML-1 ein Fusionsprotein mit einem HCMV-Protein-Anteil syntheti siert.E. coli strain Y 1089 was infected with the recombined phage and the synthesis of the β- galactosidase fusion protein was induced by adding isopropylthiogalactoside (IPTG). A fusion protein of approximately 130 kD was formed, which is significantly larger than the β -galactosidase (118 kD) and is not found in E. coli cells infected with lambdagt11; it is also not present in cells infected with BUML-1 but not induced. In "Western blot" analyzes, only the 130 kD polypeptide reacts with MAK P2G11. It follows that the recombined clone BUML-1 synthesizes a fusion protein with an HCMV protein portion.
Die cDNA-Insertion von etwa 270 bp wurde nun verwendet, um das Gen für das HCMV-Protein im Virus-Genom zu lokali sieren: Hierfür wurde die o. g. cDNA-Insertion mit 8 Cosmid Klonen hybridisiert, die das gesamte Genom von HCMV umspannen (B. Fleckenstein et al. (1982) Gene 18, 39-46). Das Cosmid pCM 1058, das die HindIII-Fragmente P, R und S enthält, hybridisierte mit der cDNA. Eine ein gehendere "Southern Blot"-Analyse dieser Region begrenzte das HCMV-DNA-Fragment auf ein 500 bp KpnI/SmaI-Fragment am linken Ende des HindIII-R-Fragments (Fig. 1). Mittels einer SstII-Spaltstelle war es möglich, die cDNA dem rechten KpnI/SmaI-Fragment in der Genomorientierung wie in Fig. 1 gezeigt zuzuordnen. The cDNA insert of about 270 bp was now used to locate the gene for the HCMV protein in the virus genome: For this purpose, the above cDNA insert was hybridized with 8 cosmid clones that span the entire genome of HCMV (B Fleckenstein et al. (1982) Gene 18, 39-46). The cosmid pCM 1058, which contains the HindIII fragments P, R and S, hybridized with the cDNA. A more thorough "Southern blot" analysis of this region limited the HCMV DNA fragment to a 500 bp KpnI / SmaI fragment at the left end of the HindIII-R fragment ( Fig. 1). Using an SstII cleavage site, it was possible to assign the cDNA to the right KpnI / SmaI fragment in the genome orientation as shown in FIG. 1.
In "Nothern Blot"-Analysen hybridisierte das cDNA-Frag ment von BUML-1 am stärksten zu einer 1,3 kb großen späten mRNA, die vollständig vom HindIII-R-Fragment her transkribiert wird.The cDNA question hybridized in "Northern blot" analyzes ment of BUML-1 most strongly to a 1.3 kb size late mRNA derived entirely from the HindIII-R fragment is transcribed.
10 von 14 zufällig gewählten HCMV-positiven Seren reagier ten mit p28, das aus gereinigten Viren stammte; dieselben Seren reagierten ebenfalls mit einem Fusionsprotein (p271, siehe Beispiel 1) aus gentechnischer Synthese. Bei in vitro phosphorylierten HCMV-Partikeln (phosphoryliert analog zu Roley, C. und Gibson, W. a. a. O.) konnte ein phosphoryliertes p28 sowohl mit MAK P2G11 als auch mit Antikörpern gegen das Fusionsprotein p271 (siehe Beispiel 1) präzipitiert werden. Das spricht dafür, daß das klonierte Protein phosphoryliert ist und somit als pp28 bezeichnet werden kann.10 of 14 randomly chosen HCMV-positive sera react with p28 derived from purified viruses; the same Sera also reacted with a fusion protein (p271, see example 1) from genetic engineering synthesis. At in vitro phosphorylated HCMV particles (phosphorylated analogous to Roley, C. and Gibson, W. a. a. O.) could phosphorylated p28 with both MAK P2G11 and with Antibodies against the fusion protein p271 (see example 1) be precipitated. That suggests that cloned protein is phosphorylated and thus as pp28 can be designated.
Da pp28 in den Mengen, die für Diagnostika und Vakzinen erforderlich sind, nur unter großem technischen Aufwand zu isolieren wäre, ist die erfindungsgemäße gentechnische Herstellungsweise besonders vorteilhaft. Es zeigte sich, daß nicht nur von eukaryotischen Zellen exprimierte Produkte antigen wirken, sondern auch Expressionsprodukte von Bakterien. Da Bakterien von Fremdgenen keine Phospho proteine erzeugen, war nicht zu erwarten, daß auch bakteriell hergestelltes "HCMV-pp28" oder Teile davon stark immunogen wirken. Es zeigte sich jedoch, daß auch solche Proteine von entsprechenden Seren ebenso eindeutig erkannt werden wie authentisches pp28.Since pp28 in the quantities required for diagnostics and vaccines are required only with great technical effort to be isolated is the genetic engineering according to the invention Production method particularly advantageous. It was found, that not only expressed from eukaryotic cells Products antigen act, but also expression products of bacteria. Because bacteria from foreign genes do not have phospho producing proteins was not expected to happen bacterially produced "HCMV-pp28" or parts thereof have a strong immunogenic effect. However, it turned out that too such proteins from corresponding sera are also unique recognized as authentic pp28.
Die Erfindung betrifft folglichThe invention therefore relates to
- a) die gereinigte und isolierte DNA-Sequenz des KpnI/SmaI- Fragments am linken Ende des HindIII-R-Fragments von HCMV gemäß Fig. 1 einschließlich ihrer Transkriptions produkte, a) the purified and isolated DNA sequence of the KpnI / SmaI fragment at the left end of the HindIII-R fragment of HCMV according to FIG. 1, including their transcription products,
- b) diese Sequenz ganz oder teilweise enthaltende DNA- Strukturen und Vektoren,b) DNA sequence containing this sequence in whole or in part Structures and vectors,
- c) mit solcher DNA transformierte pro- oder eukaryotische Zellen,c) pro- or eukaryotic transformed with such DNA Cells,
- d) die von diesen Zellen aufgrund der Transformation exprimierten Polypeptide oder Teile davon,d) those of these cells due to the transformation expressed polypeptides or parts thereof,
- e) deren Aminosäuresequenzen sowie deren Verwendung als Diagnostikum,e) their amino acid sequences and their use as Diagnostic,
- f) Antikörper gegen die Polypeptide unter (d) einschließ lich ihrer Anwendung zur passiven Immunisierung, zur Diagnostik und zur Reinigung besagter Polypeptide,f) Include antibodies against the polypeptides under (d) Lich their application for passive immunization, for Diagnosis and cleaning of said polypeptides,
- g) Impfstoffe gegen HCMV, die Peptide und Aminosäure sequenzen von (e) alleine oder in Kombination enthal ten,g) vaccines against HCMV, the peptides and amino acid contain sequences of (e) alone or in combination ten,
- h) sowie ein Verfahren zur gentechnischen Herstellung der unter (d) angeführten Polypeptide oder Teilen davon.h) and a method for the genetic engineering production of the polypeptides or parts thereof mentioned under (d).
Weitere Ausgestaltungen der Erfindung sind in den nach folgenden Beispielen und den Patentansprüchen definiert.Further embodiments of the invention are in the following examples and the claims.
Zunächst wurde das Plasmid pHM 7 erzeugt durch Einbau des ca. 500 bp KpnI-SmaI-Fragments in M13mp11. Man erhält das Plasmid p271 durch Insertion des ca. 500 bp EcoRI-SmaI- Fragments von pHM 7 in pEX-2 (Stanley, K. und P. Luzio (1984) EMBO Journal 3, 1429-1434). Insertion in pEX 1 und pEX 3 ergab keine Fusionsproteine. Das Plasmid p271 kodiert also für ein Fusionsprotein von etwa 133 kD, bestehend aus einem pp28 Anteil (ca. 18 kD) fusioniert mit einem Cro/β-Galaktosidase-Hybridprotein (ca. 115 kD). Die Induktion der Expression in geeigneten E. coli-Stämmen erfolgt durch Hitzeinaktivierung eines temperatursensi tiven Repressors. E. coli pop 2136 (Stanley, K. und P. Luzio a. a. O.) wurde zu einer Dichte von 0,2-0,3 (A600 nm) bei 30°C angezüchtet und die Synthese des Fusionsproteins durch schnellen Temperaturwechsel auf 42°C induziert. Nach 90 Min. bei 42°C wurden die Zellen geerntet und das pp28 Protein nach bekannten Methoden gereinigt. Das Fusionsprotein beträgt etwa 5% der Gesamtproteinmasse.First, the plasmid pHM 7 was generated by incorporating the approximately 500 bp KpnI-SmaI fragment in M13mp11. The plasmid p271 is obtained by inserting the approximately 500 bp EcoRI-SmaI fragment from pHM 7 into pEX-2 (Stanley, K. and P. Luzio (1984) EMBO Journal 3, 1429-1434). Insertion in pEX 1 and pEX 3 resulted in no fusion proteins. The plasmid p271 thus codes for a fusion protein of approximately 133 kD, consisting of a pp28 portion (approximately 18 kD) fused with a Cro / β- galactosidase hybrid protein (approximately 115 kD). Expression is induced in suitable E. coli strains by heat inactivation of a temperature-sensitive repressor. E. coli pop 2136 (Stanley, K. and P. Luzio op. Cit.) Was grown to a density of 0.2-0.3 (A 600 nm ) at 30 ° C. and the synthesis of the fusion protein by rapid temperature changes to 42 ° C induced. After 90 minutes at 42 ° C., the cells were harvested and the pp28 protein was purified by known methods. The fusion protein is about 5% of the total protein mass.
Durch die nachstehend beschriebenen Umklonierungen konnte (1) die Expression von pp28 als Fusionsprotein insgesamt verbessert und (2) der Fremdanteil im Fusionsprotein verkleinert werden. Als Ausgangsplasmid wurde pBD2IC2OH (Europäische Patentanmeldung EP 02 36 978) gewählt. Dieses Plasmid kodiert also für einen gegenüber pEX-2 wesentlich (um mehr als 60%) verkürzten β-Galaktosidase- Anteil, die Induktion erfolgte über das Lac-Promoter- System durch Zugabe von Isopropylthiogalaktosid (IPTG).The recloning described below (1) improved the expression of pp28 as a fusion protein overall and (2) reduced the foreign content in the fusion protein. PBD2IC2OH (European patent application EP 02 36 978) was chosen as the starting plasmid. This plasmid thus codes for a β- galactosidase fraction which is significantly (more than 60%) shorter than that of pEX-2; the induction took place via the Lac promoter system by adding isopropylthiogalactoside (IPTG).
Zwei Strategien wurden zur Klonierung von pp28-DNA-Frag ments aus p271 gewählt:Two strategies were used to clone pp28 DNA frag selected from p271:
(1) p271 wurde mit EcoRI und SmaI geschnitten, die EcoRI- Überhänge mittels Klenow-Fragment aufgefüllt. Das re sultierende ca. 500 bp-Fragment wurde in die SmaI-Stelle von pBD2IC2OH eingesetzt. Die Linkerregion des erzeugten Plasmids pGB10 hat die folgende DNA-Sequenz (verifiziert durch indirektes Sequenzieren am Doppelstrang):(1) p271 was cut with EcoRI and SmaI, the EcoRI- Overhangs filled in using a Klenow fragment. The right Sulting approximately 500 bp fragment was in the SmaI site used by pBD2IC2OH. The linker region of the generated Plasmid pGB10 has verified the following DNA sequence ( by indirect sequencing on the double strand):
(2) Der Leserahmen in der Linkerregion von pBD2IC2OH wurde durch Auffüllen der BamHI-Stelle verschoben (→ Plasmid pGB11). Danach konnte das Eco RI/SmaI-Fragment aus p271 ohne vorheriges Auffüllen der Eco RI-Stelle direkt in das mit Eco RI und NruI geschnittene pGB11 eingesetzt werden. Die Linkerregion des resultierenden Plasmids pGB12 hat die folgende DNA-Sequenz:(2) The reading frame in the linker region of pBD2IC2OH was shifted by filling the BamHI site (→ plasmid pGB11). Then the Eco RI / SmaI fragment from p271 without filling up the Eco RI point directly into the pGB11 cut with Eco RI and NruI can be used. The linker region of the resulting plasmid pGB12 has the following DNA sequence:
Die Abschätzung der Färbeintensität der entsprechenden Proteinbanden nach Auftrennung von E. coli-Gesamtextrakten ergab, daß nach Induktion des p271-kodierten Proteins dieses etwa 5% des Gesamtproteingehalts ausmachte, während die entsprechenden Werte für pGB10 und pGB12 durchgängig bei etwa 20% lagen. Wird der verringerte Fremdproteingehalt in den pGB10- und pGB12-kodierten gegenüber dem p271-kodierten Fusionsprotein in Betracht gezogen, ergibt sich durch die Verwendung von pGB10 bzw. pGB12 eine etwa zehnfache Steigerung der pp28-Expression. The estimation of the coloring intensity of the corresponding Protein bands after separation of total E. coli extracts revealed that after induction of the p271-encoded protein this made up about 5% of the total protein content, while the corresponding values for pGB10 and pGB12 were consistently around 20%. Will the reduced Foreign protein content in the pGB10 and pGB12 coded versus the p271-encoded fusion protein drawn, results from the use of pGB10 or pGB12 an approximately ten-fold increase in pp28 expression.
Legende zu Fig. 1
Oberer Teil: Physikalische Genomkarte von HCMV für die
Restriktionsendonukleasen HindIII und EcoRI.
Unterer Teil: Restriktionskarte für das HindIII-R-Frag
ment. Die schraffierte Region zeigt den Bereich der cDNA
des Klons BUML-1.Legend to Fig. 1
Upper part: Physical genomic map of HCMV for the restriction endonucleases HindIII and EcoRI.
Lower part: restriction map for the HindIII-R fragment. The hatched region shows the region of the cDNA of the clone BUML-1.
Claims (11)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3904303A DE3904303A1 (en) | 1988-02-24 | 1989-02-14 | Structural phosphoprotein (pp28) of human cytomegalovirus (HCMV), its preparation and use |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3805717 | 1988-02-24 | ||
| DE3904303A DE3904303A1 (en) | 1988-02-24 | 1989-02-14 | Structural phosphoprotein (pp28) of human cytomegalovirus (HCMV), its preparation and use |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3904303A1 true DE3904303A1 (en) | 1989-09-07 |
Family
ID=25865145
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE3904303A Withdrawn DE3904303A1 (en) | 1988-02-24 | 1989-02-14 | Structural phosphoprotein (pp28) of human cytomegalovirus (HCMV), its preparation and use |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE3904303A1 (en) |
-
1989
- 1989-02-14 DE DE3904303A patent/DE3904303A1/en not_active Withdrawn
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8141 | Disposal/no request for examination |