DE3900650A1 - VITAMIN B12 DETERMINATION - Google Patents

VITAMIN B12 DETERMINATION

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Abstract

To determine vitamin B12, a sample solution is incubated with at least two receptors R1 and R2, of which R1 mediates binding to the solid phase and R2 is labelled, where the receptor used as one of the two receptors R1 or R2 contains a monoclonal antibody which is capable of specific binding with B12 and has an affinity constant of at least 5 x 10<9> l/mol for B12, and the receptor used as the other receptor R2 or R1 contains B12 or an analogue thereof, and the two phases are separated and the labelling in one of the two phases is measured.

Description

Vitamin B12 oder Cobalamin ist ein in Körperflüssigkeiten wie Vollblut, Plasma, Serum in niedriger Konzentration (ca. 10-14 mol/l) vorkommendes essentielles Vitamin, für das insbesondere die starke Bindung an die B12-Transportproteine (die Trans-Cobalamine) bemerkenswert ist. Die Erscheinungen von Vitamin-B12-Mangel, der begründet sein kann in einer unzureichenden Vitaminzufuhr durch die Nahrung, durch Malabsorptions-Syndrome, einen genetisch induzierten Mangel eines oder mehrerer Trans-Cobalamine oder durch die Gegenwart von Darmparasiten, wie z. B. dem Fischbandwurm (Diphyllobothria), kann sich in verschiedenen Erscheinungsbildern zeigen, die vom Alter des Individuums und der Dauer der Vitamin- B12-Insuffizienz abhängen. Ein geringer Vitamin-B12-Mangel bewirkt eine Verringerung der roten Blutkörperchen, wodurch weiter eine Reihe von Stoffwechselstörungen auftreten, und megoblastische Anämien. Bei Kindern wird das Nervensystem angegriffen, und in einigen Fällen kann Blindheit resultieren.Vitamin B12 or cobalamin is an essential vitamin found in body fluids such as whole blood, plasma, serum in low concentrations (about 10 -14 mol / l), for which in particular the strong binding to the B12 transport proteins (the trans-cobalamins) is remarkable , The manifestations of vitamin B12 deficiency that may be due to inadequate dietary vitamin intake, malabsorption syndromes, a genetically-induced deficiency of one or more trans-cobalamins, or the presence of intestinal parasites such as As the fish tapeworm (Diphyllobothria), can show in different appearances, which depend on the age of the individual and the duration of vitamin B12 insufficiency. A low vitamin B12 deficiency causes a reduction in red blood cells, which further causes a number of metabolic disorders, and megoblast anemia. In children, the nervous system is attacked, and in some cases, blindness can result.

Die derzeit gebräuchlichen Methoden zur Bestimmung von Cobalaminen, insbesondere von Cyanocobalamin (Vitamin B12) in stark verdünnten wäßrigen Lösungen (wie z. B. dem Blutserum) basieren auf Verfahren unter Verwendung radioaktiver Markierungsstoffe, in denen Intrinsic-Factor (IF) als bindendes Reagenz verwendet wird. Die gebräuchlichen Techniken arbeiten unter Verwendung von ⁵⁷Co-B12 als Marker unter Zugrundelegung eines kompetitiven Prinzips, bei dem freie und markierte Analyte um die Bindung mit dem IF kompetieren. Die Trennung von gebundenem und freiem Analyt (bound/free-Trennung) erfolgt dann aufgrund von Methoden wie z. B. unter Verwendung von Aktivkohle, festphasengebundenem IF oder magnetischer Trennung, bei der IF an paramagnetische Partikel gebunden ist (vgl. Brit. J. Haemat. 22 [1972], 21-31, Clin. Chem. 24 [1978], 460-466, Clin. Biochemistry 18 [1985], 261-266).The currently used methods for the determination of Cobalamines, especially of cyanocobalamin (vitamin B12) in very dilute aqueous solutions (such as blood serum) are based on methods using Radioactive tracers in which intrinsic factor (IF) is used as the binding reagent. The common techniques work using ⁵⁷Co-B12 as a marker on the basis of a competitive Principle in which free and labeled analytes um Compete the binding with the IF. The separation of  bound and free analyte (bound / free separation) then takes place due to methods such. B. using of activated carbon, solid phase IF or magnetic Separation, IF in paramagnetic particles is bound (see Brit J. Haemat 22 [1972], 21-31, Clin. Chem. 24 [1978], 460-466, Clin. Biochemistry 18 [1985], 261-266).

Vor der Bestimmung von Vitamin B12 in Körperflüssigkeiten ist es erforderlich, Vitamin B12 von seinen im Blut vorhandenen Bindeproteinen abzulösen. Dies erfolgt beispielsweise durch Hitzeeinwirkung oder durch Zerstörung des Bindeproteins im alkalischen Bereich (pH < 13,5) unter der Einwirkung des SH-Bindungen spaltenden Thiols Dithiothreitol (DTT) (Inkubation der Serumprobe mittels DTT im alkalischen Bereich). Durch Zugabe von organischen Stoffen, z. B. Aceton, oder durch Zugabe von kompetitiven, kreuzreagierenden Spezies, z. B. Cobinamid, kann diese Zerstörung verstärkt werden. Vorteilhaft wird bei der Bestimmung außerdem Alkalicyanid zugesetzt, um die Extraktionsfähigkeit des Vitamin B12 zu steigern, und um die Cobalamine in eine stabile und nachweisbare Form, nämlich das Cyanocobalamin, zu überführen.Before the determination of vitamin B12 in body fluids It is necessary to have vitamin B12 in his blood replace existing binding proteins. This is done, for example by heat or by destruction of the binding protein in the alkaline range (pH <13.5) under the action of the SH bond-splitting thiol Dithiothreitol (DTT) (Incubation of the serum sample by means of DTT in the alkaline range). By adding organic Fabrics, e.g. Acetone, or by adding competitive, cross-reacting species, e.g. As Cobinamide, this can Destruction be strengthened. Is advantageous in the Determination also alkali metal cyanide added to the Extend the ability to extract vitamin B12, and to make the cobalamins into a stable and detectable Form, namely the cyanocobalamin to convict.

Die Nachteile der bekannten Verfahren zur Bestimmung von Vitamin B12 sind insbesondere in der Verwendung von Intrinsic-Factor begründet. So werden falsche Ergebnisse beobachtet, wenn der verwendete Intrinsic-Factor nicht ausreichend rein ist (max. 5% Verunreinigung durch andere B12-Bindeproteine). Zahlreiche Proben enthalten offenbar Antikörper gegen IF, welche die IF-Bindungsfähigkeit für radiomarkiertes B12 blockieren. Dies kann zu niedrige Vitamin-B12-Werte vortäuschen.The disadvantages of the known methods of determination of vitamin B12 are in particular in the use of Intrinsic factor justified. This will be wrong results observed when the intrinsic factor used is not is sufficiently pure (max 5% contamination by other B12 binding proteins). Numerous samples included apparently antibodies to IF, which the IF binding ability for radiolabeled B12. This can be too pretend low vitamin B12 levels.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Verfahren zur Bestimmung von Vitamin B12 bereitzustellen, mit dem auf die Verwendung von Intrinsic-Faktor verzichtet werden kann und damit die vorstehend genannten Nachteile vermieden werden können, und das auf rasche, einfache und reproduzierbare Weise eine genaue Bestimmung von Vitamin B12 im Serum ermöglicht.Object of the present invention was therefore, a To provide a method for the determination of vitamin B12, with the on the use of intrinsic factor can be omitted and thus the above Disadvantages can be avoided, and that simple and reproducible way an accurate determination of vitamin B12 in serum.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Bestimmung von Vitamin B12 durch Inkubation einer Probelösung mit mindestens zwei Rezeptoren R₁ und R₂, von denen R₁ die Bindung an die feste Phase vermittelt und R₂ markiert ist, Trennung der beiden Phasen und Messung der Markierung in einer der beiden Phasen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als einen der beiden Rezeptoren R₁ oder R₂ einen Rezeptor verwendet, der einen spezifisch mit B12 bindefähigen, monoklonalen Antikörper, der für B12 eine Affinitätskonstante von mindestens 5 × 10⁹ l/mol hat, enthält und als anderen Rezeptor R₂ oder R₁ einen Rezeptor verwendet, der B12 oder ein Analogon davon enthält.The invention therefore relates to a method for Determination of vitamin B12 by incubation of a Sample solution with at least two receptors R₁ and R₂, of which R₁ mediates binding to the solid phase and R₂ is marked, separating the two phases and Measurement of the marking in one of the two phases, the characterized in that one of the both receptors R₁ or R₂ uses a receptor, one specifically bindable with B12, monoclonal Antibody that has an affinity constant of B12 for B12 has at least 5 × 10⁹ l / mol, contains and as others Receptor R₂ or R₁ uses a receptor, the B12 or an analogue thereof.

Das erfindungsgemäße Verfahren bedeutet einen entscheidenden Fortschritt für die klinische Diagnostik, da die Vitamin-B12-Bestimmung einer der letzten Parameter war, für die kein immunologischer Test, unter Verwendung von immobilisierten monoklonalen Antikörpern kommerziell erhältlich war.The inventive method means a crucial Advance for clinical diagnostics, as the Vitamin B12 determination was one of the last parameters for which no immunological test, using immobilized monoclonal antibodies commercially was available.

Für die erfindungsgemäße immunologische Bestimmungsmethode eignen sich im Prinzip alle gängigen Immuno- Assays, wie Radio-Immuno-Assay, Enzym-Immuno-Assay, Fluoreszenz-Immuno-Assay usw. Ferner sind sämtliche Verfahrensvarianten, wie kompetitiver Immuno-Assay, IEMA-Verfahren usw., anwendbar. For the immunological method of determination according to the invention are in principle all common immunological Assays, such as radioimmunoassay, enzyme immunoassay, Fluorescence immunoassay, etc. Further, all are Process variants, such as competitive immunoassay, IEMA procedure, etc., applicable.  

Zur Bestimmung von Vitamin B12 hat sich als besonders zweckmäßig ein kompetitiver Enzym-Immuno-Assay oder ein Verfahren nach dem IEMA-Prinzip erwiesen. Bei dem kompetitiven Enzym-Immuno-Assay konkurriert das zu bestimmende B12 mit einer bekannten Menge markiertem B12 um die Bindungsstellen des trägergebundenen monoklonalen Antikörpers. Das Testverfahren kann auch so durchgeführt werden, daß das zu bestimmende B12 und trägergebundene B12 um im Unterschuß vorhandene Bindungsplätze des markierten monoklonalen Antikörpers konkurrieren. Der an das trägerfixierte B12 gebundene Anteil des markierten monoklonalen Antikörpers wird anhand der Markierung bestimmt. Diese Variante kann auch so abgewandelt werden, daß der monoklonale Antikörper nicht markiert eingesetzt wird. Der an das trägerfixierte B12 gebundene Antikörperanteil wird dann ermittelt, indem mit einem gegen den Fc-Teil des Antikörpers gerichteten Antikörper inkubiert und der gebundene markierte Anteil bestimmt wird. Bei dem IEMA-Verfahren wird markierter, monoklonaler Antikörper im Überschuß zugegeben. Der überschüssige, nicht an B12 gebundene markierte Antikörper wird mit Hilfe einer Hapten-Trägermatrix aus der Lösung entfernt. Die verschiedenen Varianten dieser Testmethoden sowie Einzelheiten zur Durchführung dieser Verfahren sind in der Literatur ausführlich beschrieben. Es sind jedoch auch andere immunologische Hapten­ bestimmungsverfahren zur B12-Bestimmung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper möglich, so wie sie z. B. in den deutschen Anmeldungen DE-P 38 34 766 oder DE-P 38 22 750 beschrieben sind.To determine vitamin B12 has proven to be special suitably a competitive enzyme immunoassay or a Proved method according to the IEMA principle. In the competitive Enzyme immunoassay competes with the one to be determined B12 with a known amount of labeled B12 um the binding sites of the carrier-bound monoclonal Antibody. The test procedure can also be carried out this way be determined that the B12 to be determined and carrier-bound B12 around binding sites present in deficit of the labeled monoclonal antibody. The bound to the carrier-fixed B12 portion of the labeled monoclonal antibody is determined by the label certainly. This variant can also be modified be that the monoclonal antibody is not labeled is used. The to the carrier-fixed B12 bound antibody content is then determined by with a directed against the Fc portion of the antibody Antibodies incubated and the bound labeled portion is determined. In the IEMA process, marked, Monoclonal antibody added in excess. The excess labeled antibody not bound to B12 is using a hapten carrier matrix from the Solution removed. The different variants of this Test methods and details of how to do this Methods are described in detail in the literature. However, there are also other immunological haptens Determination method for B12 determination using the antibodies according to the invention are possible, as well as they z. B. in the German applications DE-P 38 34 766 or DE-P 38 22 750 are described.

Erfindungsgemäß wird mindestens ein monoklonaler Antikörper eingesetzt, der spezifisch gegen Vitamin B12 gerichtet ist und eine Affinitätskonstante von < 5×10⁹ l/mol, vorzugsweise größer 10¹⁰ l/mol und besonders bevorzugt größer 5×10¹⁰ l/mol sowie eine Kreuzreaktivität gegen Methylcobalamin und Cyanocobalamin von 100% gegen Cobinamid von < 0,05%, gegen Purinylcobinamid von 1,1%, gegen Cobryrinsäure-diamid von < 0,05% gegen 2-Hydroxy-5,6-dimethylbenzimidazolylcobamid von 1,5% und gegen (Carboxy(2-cyanamino-4,5-dimethylphenyl)- amino)cobamid von 0,07% aufweist.According to the invention, at least one monoclonal antibody used specifically directed against vitamin B12 and an affinity constant of <5 × 10⁹ l / mol, preferably greater than 10¹⁰ l / mol and more preferably greater than 5 × 10¹⁰ l / mol and a cross-reactivity against  Methylcobalamin and cyanocobalamin of 100% against Cobinamide of <0.05%, against purinylcobinamide of 1.1%, against Cobryrinsäure diamide of <0.05% against 2-Hydroxy-5,6-dimethylbenzimidazolylcobamide of 1.5% and against (carboxy (2-cyanamino-4,5-dimethylphenyl) - amino) cobamid of 0.07%.

Die monoklonalen Antikörper können als komplette Antikörper, chimäre Antikörper oder bivalente Antikörperfragmente eingesetzt werden.The monoclonal antibodies can be used as complete antibodies, chimeric antibodies or bivalent antibody fragments be used.

Zur Bestimmung von Vitamin B12 wird die Probelösung daher mit mindestens zwei Rezeptoren R₁ und R₂ inkubiert.The test solution is used to determine vitamin B12 therefore with at least two receptors R₁ and R₂ incubated.

Rezeptor R₁ vermittelt dabei die Bindung an die Festphase. Dazu kann der Rezeptor R₁ entweder direkt oder über einen Spacer an der Festphase gebunden sein oder aber in löslicher Form vorliegen und erst nach Durchführung der immunologischen Reaktion immobilisiert werden. Rezeptor R₁ enthält entweder einen spezifisch mit Vitamin B12 bindefähigen, monoklonalen Antikörper oder Vitamin B12 oder ein Analogon davon.Receptor R₁ mediates the binding to the Solid phase. For this purpose, the receptor R₁ either directly or be bound to the solid phase via a spacer or in soluble form and only after Implementation of the immunological reaction immobilized become. Receptor R₁ either contains a specific with vitamin B12 bindable monoclonal antibodies or vitamin B12 or an analog thereof.

Die Bindung an den Träger (Immobilisierung) des Antikörpers bzw. von B12 erfolgt nach den dem Fachmann geläufigen Methoden durch adsorptive oder chemische Bindung oder durch Bindung über ein spezifisches Bindungspaar. In diesem Falle ist ein Partner des Bindungspaares immobilisiert, während der andere Partner chemisch an B12 bzw. den Antikörper gebunden ist. Über dieses Bindungspaar kann dann der Antikörper bzw. B12 vor oder während der immunologischen Bestimmungsreaktion immobilisiert werden. Beispiele für derartige Bindungspaare sind Biotin-Streptavidin/Avidin, Hapten-Antikörper, Antigen-Antikörper, Concavalin-Antikörper, Zucker-Lectin, Hapten-Bindeprotein. The binding to the carrier (immobilization) of the antibody or of B12 is carried out according to those skilled in the art Methods by adsorptive or chemical bonding or by binding through a specific binding pair. In this case, a partner of the binding pair immobilized while the other partner chemically B12 or the antibody is bound. About this binding pair can then the antibody or B12 before or immobilized during the immunological determination reaction become. Examples of such binding pairs are biotin-streptavidin / avidin, hapten-antibodies, Antigen-antibody, concavalin-antibody, sugar-lectin, Hapten-binding protein.  

Als Trägermaterialien zur Immobilisierung der erfindungsgemäßen Antikörper bzw. zur Immobilisierung von B12 können Materialien verwendet werden, wie z. B. Röhrchen (tubes), Mikrotiterplatten, Kugeln (beads) oder Mikrocarrier aus Kunststoffen, wie Polystyrol, Vinylpolymere, Polypropylen, Polycarbonat, Polysaccharide, Silicone, Gummi, oder auch behandeltes Glas (vgl. z. B. E.T. Maggio, "Enzyme Immunoassay" CAC Press, Florida, 1980, insbesondere Seiten 175 bis 178; EP-A-063 064; Bioengineering 16 [1974], 997-1003; C.J. Sanderson und D.V. Wilson, Immunology 20 [1971], 1061-1065). Insbesondere wird als Trägermaterial ein mit Avidin oder Streptavidin beschichtetes Trägermaterial, insbesondere Polystyrol, vorzugsweise hergestellt wie in EP-A 02 69 092 beschrieben, verwendet.As support materials for the immobilization of the invention Antibody or for the immobilization of B12 can be used materials such. B. tubes (tubes), microtiter plates, beads or microcarriers from plastics such as polystyrene, vinyl polymers, Polypropylene, polycarbonate, polysaccharides, silicones, Rubber, or even treated glass (cf., for example, E.T. Maggio, "Enzyme Immunoassay" CAC Press, Florida, 1980, in particular Pages 175 to 178; EP-A-063,064; Bioengineering 16 [1974], 997-1003; C.J. Sanderson and D.V. Wilson, Immunology 20 [1971], 1061-1065). In particular, as Support material coated with avidin or streptavidin Support material, in particular polystyrene, preferably prepared as described in EP-A 02 69 092, used.

Rezeptor R₂ enthält ebenfalls entweder Vitamin B12 oder ein Analogon davon oder einen spezifisch mit Vitamin B12 bindefähigen, monoklonalen Antikörper und ist markiert. Zur Markierung eignen sich die für die jeweilige Bestimmungsmethode üblichen Mittel. So werden bei einem Radio-Immuno-Assay Radioisotope, beispielsweise ⁵⁷Co, zur Markierung verwendet. Für einen Enzym-Immuno-Assay sind sämtliche, hierfür üblicherweise eingesetzten Enzyme, beispielsweise Peroxidase oder β-Galactosidase, geeignet. Für einen Fluoreszenz-Immuno-Assay sind die üblichen fluoreszierenden Gruppen als Marker brauchbar. Einzelheiten dieser verschiedenen Testmethoden und Verfahrensvarianten sind dem Fachmann bekannt. In analoger Weise wie bei der Bindung an die Festphase kann auch die Bindung der Markierung an B12 bzw. den Antikörper über ein spezifisches Bindungspaar erfolgen.Receptor R₂ likewise contains either vitamin B12 or an analogue thereof or a monoclonal antibody which is specifically bindable with vitamin B12 and is labeled. For labeling are the usual means for each determination method means. Thus radioisotopes, for example ⁵⁷Co, are used for labeling in a radioimmunoassay. For an enzyme immunoassay, all enzymes customarily used for this purpose, for example peroxidase or β- galactosidase, are suitable. For fluorescence immunoassay, the usual fluorescent groups are useful as markers. Details of these various test methods and method variants are known to the person skilled in the art. In an analogous manner as in the binding to the solid phase, the binding of the label to B12 or the antibody can be carried out via a specific binding pair.

Die Bindung des Antikörpers bzw. von B12 an einen der obengenannten Bindungspartner erfolgt nach den dem Fachmann geläufigen Methoden, beispielsweise über Carbodiimid und Hydroxysuccinimid. The binding of the antibody or B12 to one of the abovementioned binding partner takes place after the Expert common methods, for example about Carbodiimide and hydroxysuccinimide.  

Bei Markierung von B12 mit einem Enzym wird vorzugsweise ein B12-Konjugat der Formel (I)When labeling B12 with an enzyme becomes preferably a B12 conjugate of the formula (I)

verwendet, worin B12 den aus Cyanocobalamin (Vitamin B12) durch Abspaltung einer -CONH₂-Gruppe gebildeten Rest und R eine Verknüpfungsgruppierung (Spacer) bedeutet, und x 0 oder 1 ist, und GP den Rest eines glykosylgrupppenhaltigen Markerenzyms darstellt, das über einen Glykosylrest an die -NH-N=-Gruppierung gebunden ist. In der Formel (I) steht die -CONH-Gruppierung vorzugsweise in d-Stellung des B12-Restes, und in erster Linie werden B12-d-CO-NH-N=Gp, und insbesonderewherein B12 is the radical formed from cyanocobalamin (vitamin B12) by cleavage of a -CONH₂ group and R is a linking moiety (spacer), and x is 0 or 1, and GP is the residue of a glycosyl-containing marker enzyme linked via a glycosyl radical the -NH-N = grouping is bound. In the formula (I), the -CONH moiety is preferably in the d position of the B12 moiety, and especially B12-d-CO-NH-N = Gp, and especially

B12-d-CO-NH-NH-CO-CH₂ (O-CH₂-CH₂)₃ O-CH₂-CO-NH-N=GPB12-d-CO-NH-NH-CO-CH₂ (O-CH₂-CH₂) ₃O-CH₂-CO-NH-N = GP

verwendet. Als Markierungsenzym (GP) wird vorzugsweise Peroxidase (POD) verwendet.used. As a labeling enzyme (GP) is preferably Peroxidase (POD) used.

Die B12-Konjugate der Formel (I) sind Gegenstand der deutschen Patentanmeldung P          (Titel: neue Cobalamin-Säurehydrazide und davon abgeleitete Cobalamin- Konjugate) der gleichen Anmelderin mit dem gleichen Anmeldetag. Sie lassen sich durch Kupplung (Kondensation) der Cobalamin-Säurehydrazide der FormelThe B12 conjugates of the formula (I) are the subject of German patent application P (Title: new Cobalamin acid hydrazides and cobalamin derived therefrom Conjugates) of the same applicant with the same Filing. They can be controlled by coupling (condensation) the cobalamin acid hydrazides of the formula

(worin B12, R und x die vorstehend genannte Bedeutung besitzen), die ebenfalls Gegenstand der vorstehend genannten gleichzeitig eingereichten deutschen Patentanmeldung P          sind, mit den OH-Gruppen von Glykosylresten der Glykoproteine nach deren Oxidation und Ausbildung der Hydrazongruppierung -NH-N=CH-Glykoprotein unter an sich bekannten Bedingungen herstellen. (in which B12, R and x have the abovementioned meaning), which are likewise the subject of the aforementioned simultaneously filed German patent application P, with the OH groups of glycosyl residues of the glycoproteins after their oxidation and formation of the hydrazone moiety -NH-N = CH- Produce glycoprotein under conditions known per se.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Probelösung zur Ablösung des Vitamins B12 von den Bindeproteinen in herkömmlicher Weise vorbereitet, indem die Bindeproteine durch Zusatz eines SH-Gruppen spaltenden Thiols, Dithiothreitol (DTT) im alkalischen Bereich (pH <13,5), oder aber durch 30- bis 60minütiges Kochen und nachfolgende Zentrifugation zerstört werden.In a preferred embodiment of the invention Procedure, the sample solution for replacement of vitamin B12 from the binding proteins in conventional Be prepared by adding the binding proteins by adding an SH group-cleaving thiol, dithiothreitol (DTT) in the alkaline range (pH <13.5), or else by boiling for 30-60 minutes and then Centrifugation be destroyed.

Vorzugsweise wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Vitamin-B12-Bestimmung die Probenvorbereitung (Abspaltung des Bindeproteins) mit Liponsäure (Liponic acid, LA) oder einem Homologen davon der Formel (II)Preferably, in the method according to the invention for vitamin B12 determination the sample preparation (Cleavage of the binding protein) with lipoic acid (Liponic acid, LA) or a homologue thereof of the formula (II)

durchgeführt, worin n 1 bis 8, und insbesondere 3 bis 5 bedeutet, wobei die Liponsäure (Formel II, n=4) beson­ ders bevorzugt ist.wherein n is 1 to 8, and especially 3 to 5, wherein the lipoic acid (formula II, n = 4) is particularly preferred.

Dieses Verfahren zur Probenvorbereitung ist Gegenstand der deutschen Patentanmelung P          (Titel: Verfahren zur Ablösung eines Analyten von seinem Binde­ protein) der gleichen Anmelderin mit dem gleichen Anmeldetag. Nach diesem Verfahren kann die Inkubation der Probe bei Raumtemperatur im alkalischen Bereich (pH-Wert 10 bis 14; unter vorzugsweiser Verwendung von Natriumhydroxid als alkalisches Medium, mit einer Konzentration von 0,05 bis 1 mmol/l) in weniger als 15 Minuten erfolgen.This procedure for sample preparation is the subject German patent application P (title: Method for detaching an analyte from its bandage protein) of the same applicant with the same Filing. After this procedure, the incubation the sample at room temperature in the alkaline range (pH 10 to 14, preferably using Sodium hydroxide as alkaline medium, with a Concentration of 0.05 to 1 mmol / L) in less than 15 Minutes.

Die Säure der Formel (II) wird dabei (für Liponsäure mit n=4 berechnet) vorzugsweise in einem Bereich von 1 bis 20 mg/ml, und insbesondere im Bereich von 4 bis 10 mg/ml eingesetzt. The acid of the formula (II) is used here (calculated for lipoic acid with n = 4), preferably in a range of 1 to 20 mg / ml, and in particular in the range of 4 to 10 mg / ml.

Das erfindungsgemäße Verfahren liefert sehr genaue und reproduzierbare Werte, was vor allem darauf zurückzufüh­ ren ist, daß ein monoklonaler Antikörper gegen Vitamin B12 verwendet wird, der eine sehr hohe Affinitätskon­ stante gegenüber Vitamin B12 aufweist. Diese Antikörper sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Derartig spe­ zifische monoklonale Antikörper mit einer derartig hohen Affinitätskonstante sind bisher noch nicht bekannt.The inventive method provides very accurate and reproducible values, which is mainly due to this is that a monoclonal antibody to vitamin B12 is used, which has a very high affinity cons has constant resistance to vitamin B12. These antibodies are also the subject of the invention. Such spe cif monoclonal antibodies of such high Affinity constants are not yet known.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines mit B12 spezifisch bindefähigen, monoklonalen Antikörpers, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Inzuchtmäuse mit Vitamin-B12-d-Säure, an die über einen Spacer, insbesondere 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimid ein immunogenes Träger­ material gekuppelt ist, immunisiert, B-Lymphocyten der immunisierten Tiere gewinnt und mit transformierenden Agentien mit Myelomzellen fusioniert, die so gebildeten Hybridzellen kloniert und kultiviert und den monoklonalen Antikörper aus diesen Zellen isoliert.Another object of the invention is a method for producing a B12-specifically bindable, monoclonal antibody characterized is that one inbred mice with vitamin B12-d-acid, to which via a spacer, in particular 1-ethyl-3- (3 dimethylaminopropyl) carbodiimide is an immunogenic carrier material is coupled, immunized, B lymphocytes of the immunized animals wins and transforms Agents fused with myeloma cells so formed Hybrid cells are cloned and cultured and the monoclonal Antibody isolated from these cells.

Zur Gewinnung der erfindungsgemäßen monoklonalen Anti­ körper wird B12 zunächst mit einem immunogenen Träger­ material verknüpft. Als immunogene Trägermaterialien eignen sich alle üblicherweise für diesen Zweck verwen­ deten Stoffe, beispielsweise Albumine, wie Rinderserum- Albumin, Edestin usw. Die Verknüpfung von B12 mit dem Trägermaterial erfolgt nach an sich bekannten Methoden.To obtain the monoclonal anti B12 initially undergoes an immunogenic carrier material linked. As immunogenic carrier materials All are commonly used for this purpose substances, such as albumins, such as bovine serum, Albumin, edestin, etc. Linking B12 with the Support material is carried out by methods known per se.

Anschließend werden Versuchstiere, beispielsweise Mäuse, mit dem immunogenen Konjugat immunisiert. Zur Immunisierung wird das Immunogen beispielsweise in Kom­ bination mit dem Adjuvans in üblicher Weise verabreicht. Bevorzugt wird als Adjuvans komplettes oder inkomplet­ tes Freundsches Adjuvans eingesetzt. Die Immunisierung erfolgt vorzugsweise über mehrere Monate mit mindestens vier Immunisierungen in vier- bis sechswöchigem Abstand (Injektion intraperitoneal). Subsequently, experimental animals, for example Mice immunized with the immunogenic conjugate. to Immunization is the immunogen, for example in Kom administration with the adjuvant in the usual way. Preference is given as adjuvant complete or incomplete tes Freunds adjuvant used. The immunization is preferably carried out over several months with at least four immunizations four to six weeks apart (Injection intraperitoneally).  

Aus so immunisierten Tieren werden B-Lymphozyten gewon­ nen, die mit einer permanenten Myelomzellinie fusioniert werden. Die Fusionierung erfolgt nach dem bekannten Verfahren von Köhler und Milstein (Nature 256, 1975, Seiten 495 bis 497). Die hierbei gebildeten Primärkul­ turen von Hybridzellen werden in üblicher Weise, z. B. unter Verwendung eines handelsüblichen Zellorters oder durch "limiting dilution", kloniert. Es werden jeweils die Kulturen weiterverarbeitet, die in einem geeigneten Testverfahren, beispielsweise einem Enyzm-Immuno-Assay (ELISA-Verfahren), positiv gegen B12 sind und die genannten Kreuzreaktivitäten zeigen. Man erhält so mehrere Hybridoma-Zellinien, die die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper produzieren. Nach bekannten Methoden können diese Zellinien kultiviert und die von ihnen produzierten monoklonalen Antikörper isoliert werden.From thus immunized animals B lymphocytes are won which fuses with a permanent myeloma cell line become. The fusion takes place according to the known one Method of Köhler and Milstein (Nature 256, 1975, Pages 495 to 497). The hereby formed Primärkul Structures of hybrid cells are in the usual way, for. B. using a commercial Zellorters or by "limiting dilution", cloned. There will be each the crops processed in a suitable Test method, for example, an enzyme immunoassay (ELISA method), are positive against B12 and the show cross-reactivity mentioned. You get like that several hybridoma cell lines containing the inventive produce monoclonal antibody. After known Methods can cultured these cell lines and those of they isolated monoclonal antibodies isolated become.

Auf diese Weise können die erfindungsgemäß verwendeten Antikörper erhalten werden, insbesondere Antikörper mit einer Affinitätskonstante von <5×10⁹ l/mol, vorzugsweise größer 10¹⁰ l/mol, besonders bevorzugt größer 5×10¹⁰ l/mol sowie eine Kreuzreaktivität gegen Methylcobalamin und Cyanocobalamin von 100% gegen Cobinamid von <0,05%, gegen Purinylcobinamid von 1,1%, gegen Cobryrinsäure­ diamid von <0,05%, gegen 2-Hydroxy-5,6-dimethylbenzimid­ azolylcobamid von 1,5% und gegen (Carboxy(2-cyanamino- 4,5-dimethylphenyl)amino)cobamid von 0,07% aufweist. Antikörper, die eine so hohe Spezifität zeigen, werden z. B. von den auf diese Weise gewonnenen Zellinien ECACC 88101301 und ECACC 88101302 produziert.In this way, the inventively used Antibodies are obtained, in particular antibodies with an affinity constant of <5 x 10⁹ l / mol, preferably greater than 10¹⁰ l / mol, more preferably greater than 5 × 10¹⁰ l / mol and a cross-reactivity against methylcobalamin and Cyanocobalamin of 100% against cobinamide of <0.05%, against Purinylcobinamide of 1.1%, against Cobryrinsäure diamide of <0.05%, against 2-hydroxy-5,6-dimethylbenzimide azolylcobamide of 1.5% and against (carboxy (2-cyanamino) 4,5-dimethylphenyl) amino) cobamide of 0.07%. Antibodies that show such high specificity z. B. from the thus obtained cell lines ECACC 88101301 and ECACC 88101302.

Die Zellinien sind unter der jeweils angegebenen Nummer bei der Hinterlegungsstelle ECACC (European Collection of Animal Cell Cultures, Proton Down, GB) hinterlegt. The cell lines are below the given number at the depository ECACC (European Collection of Animal Cell Cultures, Proton Down, UK).  

Die so gewonnenen monoklonalen Antikörper zeichen sich dadurch aus, daß sie eine sehr hohe Affinität (Affini­ tätskonstante größer 5×10-9) für B12 und die genannten Kreuzreaktivitäten besitzen. Vorzugsweise liegt die Affinität der monoklonalen Antikörper über 10¹⁰ l/mol, besonders bevorzugt über 5×10¹⁰ l/mol.The monoclonal antibodies thus obtained are characterized by the fact that they have a very high affinity (affinity constant greater than 5 × 10 -9 ) for B12 and the mentioned cross-reactivities. Preferably, the affinity of the monoclonal antibodies is above 10¹⁰ l / mol, more preferably above 5 × 10¹⁰ l / mol.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper eignen sich hervorragend dazu, in einer Probe, beispielsweise Serum oder Plasma, das B12 spezifisch zu bestimmen. Für diese Bestimmungsverfahren können die monoklonalen Antikörper als solche chimäre Antikörper oder Fragmente hiervon, welche die entsprechenden immunologischen Eigenschaften aufweisen, beispielsweise Farb-Fragmente, verwendet werden. Unter dem Begriff "monoklonale Anti­ körper" werden daher sowohl vollständige Antikörper als auch die Fragmente verstanden.The monoclonal antibodies of the invention are suitable excellently, in a sample, for example Serum or plasma to specifically determine the B12. For These determination methods can be monoclonal Antibodies as such are chimeric antibodies or fragments of which, the corresponding immunological Have properties, for example color fragments, be used. Under the term "monoclonal anti Therefore, both full antibodies and also understood the fragments.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie darauf zu beschränken. Unter Raum­ temperatur (RT) wird eine Temperatur von 25°C±2°C verstanden. Prozentangaben beziehen sich auf Gewichts­ prozent.The following examples are intended to illustrate the invention in more detail explain without limiting it. Under space Temperature (RT) becomes a temperature of 25 ° C ± 2 ° C Roger that. Percentages are by weight percent.

Fig. 1 zeigt eine Standardkurve für eine Vitamin- B12-Bestimmung nach Beispiel 4 mit verschie­ denen MAK-Konzentrationen: Fig. 1 shows a standard curve for a vitamin B12 determination according to Example 4 with various concentrations which MAK:

Kurve 1:  85 ng/ml MAK,
Kurve 2:  90 ng/ml MAK,
Kurve 3:  95 ng/ml MAK,
Kurve 4: 100 ng/ml MAK.
Curve 1: 85 ng / ml MAK,
Curve 2: 90 ng / ml MAK,
Curve 3: 95 ng / ml MAK,
Curve 4: 100 ng / ml MAK.

Fig. 2 zeigt einen Vergleich einer Bestimmung nach Beispiel 4 (Kurve 2) mit einer Bestimmung unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern (Kurve 1). Fig. 2 shows a comparison of a determination according to Example 4 (curve 2) with a determination using polyclonal antibodies (curve 1).

Beispiel 1Example 1 Gewinnung von monoklonalen Antikörpern gegen Vitamin B12Obtaining Monoclonal Antibodies to Vitamin B12 Herstellung des ImmunogensPreparation of the immunogen

Vitamin-B12-d-Säure (hergestellt nach JACS 102 (1980) 2215) wird über 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-Car­ bodiimid (EDC) an Edestin gekuppelt.Vitamin B12-d-acid (manufactured according to JACS 102 (1980) 2215) is converted via 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) car bodiimide (EDC) coupled to edestin.

Immunisierung von Mäusen mit Vitamin-B12-KonjugatImmunization of mice with vitamin B12 conjugate

Balb/c-Mäuse, 8 bis 12 Wochen alt, wurden mit 100 µg Immunogen in komplettem Freundschen Adjuvans intraperi­ toneal erstimmunisiert. Nach sechs Wochen wurden drei weitere Immunisierungen in vierwöchigen Abständen durchgeführt. Dabei wurden 100 µg Immunogen in inkom­ plettem Freundschen Adjuvans intraperitoneal verab­ reicht. 4 Tage, 3 Tage und 2 Tage vor der Fusion wurde noch einmal mit 100 µg Immunogen in vitro immunisiert.Balb / c mice, 8 to 12 weeks old, were given 100 μg Immunogen in complete Freunds adjuvant intraperi tonal first. Three weeks later, after six weeks further immunizations at four-week intervals carried out. In this case, 100 ug immunogen in inc administer Freund's adjuvant intraperitoneally enough. 4 days, 3 days and 2 days before the merger was immunized again with 100 μg immunogen in vitro.

Fusionfusion

Milzzellen einer immunisierten Maus wurden mit P3×63Ag8-653 Myelomzellen (ATCC-CRL 8375) im Verhältnis 1 : 5 gemischt und zentrifugiert (10 Minuten, 300 g, 4°C). Die Zellen wurden noch einmal mit BSS (Balanced Salt Solution)-Puffer gewaschen und bei 400 g in einem 50-ml-Spitzröhrchen zentrifugiert. Der Überstand wurde abgekippt, das Zellsediment aufgelockert, 1 ml PEG (MG 4000, Merck) dazugegeben und durchpipettiert. Nach einer Minute im Wasserbad wurden bei Raumtemperatur 5 ml RPMI 1640-Medium (RPMI = Rosewell Parker Memory Institut) ohne FKS (fötales Kälberserum) in einem Zeit­ raum von 4 bis 5 Minuten zugetropft, durchgemischt, auf 50 ml mit Medium aufgefüllt und anschließend 10 Minuten bei 400 g, 4°C zentrifugiert. Die sedimentierten Zellen wurden in RPMI 1640-Medium +10% FKS aufgenommen und je 5×10⁴ bis 1×10⁵ Milzzellen oder 5×10⁴ Peritoneal-Exu­ dat-Zellen als "Futterzellen" zugefügt. Am nächsten Tag wurde Hypoxanthin-Azaserin-Selektionsmedium (100 mmol/l Hypoxanthin, 1 µg/ml Azaserin) zugegeben.Spleen cells of an immunized mouse were used with P3 × 63Ag8-653 myeloma cells (ATCC-CRL 8375) in proportion Mixed 1: 5 and centrifuged (10 minutes, 300 g, 4 ° C). The cells were resuspended with BSS (Balanced Salt Solution) buffer and 400 g in one Centrifuge 50 ml tip tubes. The supernatant was dumped, the cell pellet fanned, 1 ml of PEG (MG 4000, Merck) added and pipetted. To one minute in a water bath were at room temperature 5 ml RPMI 1640 medium (RPMI = Rosewell Parker Memory Institute) without FCS (fetal calf serum) at a time dropped from 4 to 5 minutes, mixed, on  50 ml filled with medium and then 10 minutes centrifuged at 400 g, 4 ° C. The sedimented cells were taken up in RPMI 1640 medium + 10% FCS and 5 x 10⁴ to 1 x 10⁵ spleen cells or 5 x 10⁴ peritoneal exu dat cells added as "feed cells". The next day hypoxanthine-azaserine selection medium (100 mmol / l Hypoxanthine, 1 μg / ml azaserine).

Circa 7 bis 10 Tage nach der Fusion waren bereits viele Klone sichtbar. Der Überstand der Primärkulturen wurde nach einem in Beispiel 2 beschriebenen ELISA-Verfahren getestet. Primärkulturen, welche die gewünschte Kreuz­ reaktion zeigten, wurden mittels FACS (Fluorescence activated cell sorter) in 96-well-Zellkulturplatten kloniert. Als "Futterzellen" wurden 1×10⁴ Peritoneal-Exu­ dat-Zellen oder 2×10⁴ Milzzellen pro "well" zugegeben. Auf diese Weise konnten beispielsweise die beiden Hybridoma-ZellinienAbout 7 to 10 days after the merger were already many Clones visible. The supernatant of the primary cultures was according to an ELISA method described in Example 2 tested. Primary cultures containing the desired cross were shown by FACS (Fluorescence activated cell sorter) in 96-well cell culture plates cloned. As "food cells" were 1 × 10⁴ peritoneal exu dat cells or 2x10⁴ spleen cells per well. In this way, for example, the two could Hybridoma cell lines

ECACC 88101301 und
ECACC 88101302
ECACC 88101301 and
ECACC 88101302

isoliert werden, die bei der Hinterlegungsstelle ECACC unter der jeweils angegebenen Hinterlegungsnummer hin­ terlegt worden sind.be deposited with the depositary ECACC under the respectively specified deposit number have been submitted.

Induktion von AscitesInduction of ascites

5×10⁶ Hybridzellen wurden i. p. in ein- bis zweimal mit 0,5 ml Pristan vorbehandelte Mäuse gespritzt. Ascites mit einer IgG-Konzentration von 5 bis 20 mg/ml konnte 1 bis 3 Wochen danach gewonnen werden. Hieraus können in üblicher Weise die Antikörper isoliert werden. Diese monoklonalen Antikörper sind spezifisch gegen Vitamin B12 gerichtet und zeigen die gewünschte Kreuzreaktivität. Die monoklonalen Antikörper werden mit MAK 1 (von ECACC 88101301) bzw. MAK 2 (von ECACC 88101302) bezeichnet. 5 × 10⁶ hybrid cells were i. p. in once or twice with 0.5 ml of pristane pre-treated mice injected. ascites with an IgG concentration of 5 to 20 mg / ml, 1 be won until 3 weeks later. This can be in usually the antibodies are isolated. These Monoclonal antibodies are specific to vitamin B12 directed and show the desired cross-reactivity. The monoclonal antibodies are probed with MAK 1 (from ECACC 88101301) or MAK 2 (from ECACC 88101302).  

Beispiel 2example 2 Screening-Test auf Antikörper gegen Vitamin B12Screening test for antibodies to vitamin B12

Um die Anwesenheit und Spezifität von Antikörpern gegen Vitamin B12 im Serum immunisierter Mäuse oder in dem Kulturüberstand der Hybridzellen oder in Ascites zu er­ kennen, wird ein ELISA-Verfahren als Testprinzip ver­ wendet: Mikrotiterplatten werden mit 1 µg/ml B12-Kon­ jugat (B12-d-Säure gekoppelt an Rinderserumalbumin über EDC) Beschichtungspuffer (0,2 mol/l Natriumcarbonat/ Bicarbonat, pH 9,3 bis 9,5) bei 37°C eine Stunde lang beschichtet. Es wird 10 Minuten mit 0,9% Natriumchlo­ ridlösung und 1% Albuminlösung nachbehandelt. An­ schließend wird mit 0,9% Natriumchloridlösung ge­ waschen. Danach wird bei 37°C eine Stunde mit 100 µl Probe inkubiert und erneut mit 0,9% Natrumchloridlö­ sung gewaschen. Um die Kreuzreaktion zu prüfen, werden der Probelösung 50, 500 und 5000 µg/ml des zu prüfenden Vitamin-B12-Derivats zugesetzt. Eine Erniedrigung des Meßsignals in Gegenwart der Derivate bedeutet Kreuz­ reaktion. Es folgt eine weitere Inkubation (eine Stunde, 37°C) mit 450 U/ml eine Schaf-Fab-anti-Maus- Fcγ-Peroxidase-Konjugats. Nach einem erneuten Wasch­ schritt mit 0,9% Natriumchlorid wird die Peroxidaseak­ tivität in üblicher Weise bestimmt (beispielsweise mit 2,2′-Azino-di-[3-ethylbenzthiazolin-sulfonat (6)] (ABTS®), 30 Minuten bei Raumtemperatur, abgelesen wird die Ex­ tinktionsdifferenz, ∆mE, bei 422 nm). In order to know the presence and specificity of antibodies against vitamin B12 in the serum of immunized mice or in the culture supernatant of the hybrid cells or in ascites, an ELISA method is used as test principle: microtiter plates are incubated with 1 μg / ml B12 conjugate (B12 acid-coupled to bovine serum albumin over EDC) coating buffer (0.2 M sodium carbonate / bicarbonate, pH 9.3 to 9.5) at 37 ° C for one hour. It is aftertreated for 10 minutes with 0.9% sodium chloride solution and 1% albumin solution. At closing is washed with 0.9% sodium chloride solution ge. Thereafter, incubated at 37 ° C for one hour with 100 ul of sample and washed again with 0.9% Natrumchloridlö solution. To test the cross-reaction, 50, 500 and 5000 μg / ml of the vitamin B12 derivative to be tested are added to the sample solution. A reduction of the measurement signal in the presence of the derivatives means cross reaction. Another incubation (one hour, 37 ° C) with 450 U / ml of a sheep Fab anti-mouse Fcγ-peroxidase conjugate follows. After a new washing step with 0.9% sodium chloride, the Peroxidaseak activity is determined in a conventional manner (for example, with 2,2'-azino-di- [3-ethylbenzthiazolin-sulfonate (6)] (ABTS®), 30 minutes at room temperature , read the Ex inkktionsdifferenz, Δ mE , at 422 nm).

Beispiel 3example 3 Bestimmung der KreuzreaktionDetermination of the cross reaction

Der Test wird, wie im Beispiel 2 beschrieben, durchge­ führt.The test is, as described in Example 2, Runaway leads.

Zu dem monoklonalen Antikörper wird jeweils das auf Kreuzreaktion zu prüfende Antigen in steigender Konzen­ tration (50 µg, 500 µg, 5000 µg/ml) zugegeben. Die Kreuzreaktion wird anschließend nach folgender Formel berechnet:The monoclonal antibody is in each case on Cross-reaction to antigen to be tested in increasing concentrations tration (50 μg, 500 μg, 5000 μg / ml). The Cross reaction is then according to the following formula calculated:

C = Konzentration des Antigens, die zur Erreichung von 50% des max. Signals erforderlich ist. C = Concentration of the antigen to reach 50% of the max. Signal is required.

In der folgenden Tabelle sind die ermittelten Werte, die identisch für die monoklonalen Antikörper MAK 1 und MAK 2 sind, zusammengestellt.The following table shows the determined values, the same for the monoclonal antibodies MAK 1 and MAK 2 are, put together.

kreuzreagierendes Antigencross-reacting antigen Kreuzreaktioncross reaction Methyl-cobalaminMethyl-cobalamin 100100 Cyano-cobalaminCyano-cobalamin 10001000 Cobinamidcobinamide <0,05<0.05 PurinylcobinamidPurinylcobinamid 1,11.1 Cobryinsäure-diamidCobryinsäure diamide <0,05<0.05 2-Hydroxy-5,6-dimethyl-benzimidazolylcobamid2-hydroxy-5,6-dimethyl-benzimidazolylcobamid 1,51.5 (Carboxy(2-cyanamino-4,5-dimethylphenyl)aminocobamid(Carboxy (2-cyanamino-4,5-dimethylphenyl) aminocobamid 0,070.07

Beispiel 4example 4 Bestimmung von Vitamin B12Determination of vitamin B12 a) Probenvorbereitunga) Sample preparation

250 µl Humanserum werden mit 125 µl Ablösereagenz (bestehend aus 8 mg/ml Liponsäure, 1 mg/ml Kalium­ cyanid, gelöst in 0,5 mol/l NaOH) gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend werden 125 µl, 200 mmol/l Phosphatpuffer, pH 4,1 zugegeben.250 μL of human serum is mixed with 125 μL of the separation reagent (consisting of 8 mg / ml lipoic acid, 1 mg / ml potassium cyanide dissolved in 0.5 mol / l NaOH) and 15 Incubated for a few minutes at room temperature. Subsequently 125 μl, 200 mmol / l phosphate buffer, pH 4.1 added.

b) Reagenzienb) Reagents

Polystyrolröhrchen, beschichtet mit Thermo-RSA Streptavidin (hergestellt nach EP-A 02 69 092).Polystyrene tubes coated with Thermo-RSA Streptavidin (prepared according to EP-A 02 69 092).

Reagenz 1reagent 1

95 ng/ml biotinylierter MAK 1 oder MAK 2 (Biotiny­ lierung nach JACS 100 (1978) 3585 bis 3590).95 ng / ml biotinylated MAK 1 or MAK 2 (Biotiny lation according to JACS 100 (1978) 3585 to 3590).

Reagenz 2reagent 2

B12-d-CO-NH-NH-CO-CH₂-(-O-CH₂-CH₂-)₃-O-CH₂-CO-NH- N=POD) (Aktivität ca. 60 mU/ml).
40 mmol/l Phosphatpuffer pH 7,2.
B12-d-CO-NH-NH-CO-CH₂ - (- O-CH₂-CH₂-) ₃-O-CH₂-CO-NH-N = POD) (activity about 60 mU / ml).
40 mmol / l phosphate buffer pH 7.2.

Reagenz 3reagent 3

100 mmol/l Phosphat-Citratpuffer, pH 4,4
1,9 mmol/l ABTS®,
3,2 mmol/l Natriumperborat.
100 mmol / l phosphate citrate buffer, pH 4.4
1.9 mmol / l ABTS®,
3.2 mmol / l sodium perborate.

c) Durchführung der Bestimmungc) implementation of the provision

Zur Durchführung der Bestimmung werden 200 µl vor­ behandelte Probe mit 800 µl Reagenz 1 in ein Streptavidin-tube gegeben und 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird mit Waschlösung gewaschen und 1000 µl Reagenz 2 zuge­ geben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Es wird mit Waschlösung gewaschen und 1000 µl Reagenz 3 zugegeben, für 30 Minuten bei Raumtempe­ ratur inkubiert und die gebildete Farbe als Maß für den Vitamin-B12-Gehalt bei 422 nm gemessen.To carry out the determination, 200 .mu.l ago treated sample with 800 μl reagent 1 in Given streptavidin-tube and added for 60 minutes Room temperature incubated. Subsequently, with Washed washing solution and 1000 .mu.l of reagent 2 added and incubate for 30 minutes at room temperature. It is washed with washing solution and 1000 .mu.l Reagent 3 added, for 30 minutes at room temp Incubation and the formed color as a measure measured for the vitamin B12 content at 422 nm.

d) Analoge Ergebnisse werden erhalten, wenn anstelle von biotinyliertem komplettem MAK 1 biotinylierte Fab-Fragmente eingesetzt werden. Fab-Fragmente werden folgendermaßen hergestellt:d) Analogous results are obtained if instead of biotinylated from biotinylated complete MAK 1 Fab fragments are used. Fab fragments are made as follows:

Mit MAK 1 wird, wie in Biochem. J. 73 (1959) 119 bis 126, eine Papainspaltung durchgeführt. Die hierbei entstandenen Fab-Fragmente werden mittels Gelfiltration über Sephadex G 100 und Ionenaus­ tauscherchromatographie über DEAE Cellulose nach Meth. in Enzymology 73 (1981) 418 bis 459 abge­ trennt.With MAK 1, as in Biochem. J. 73 (1959) 119 to 126, performed a papain splitting. The resulting Fab fragments are by means of Gel filtration over Sephadex G 100 and Ionenaus exchange chromatography on DEAE cellulose Meth. In Enzymology 73 (1981) 418 to 459 abge separates.

Beispiel 5example 5 Vergleich mit einem bekannten Radioimmunoassay für B12Comparison with a known radioimmunoassay for B12

Als Standard wurde Cyanocobalamin in 40 mmol/l Phos­ phatpuffer, pH 7,2 mit 0,9% Natriumchlorid, 0,9% Crotein C und 0,1% Kaliumcyanid verwendet. Zum Ver­ gleich wurde der von Becton Dickinson vertriebene Test (Simultaneous No Boil SNB-B12/Folat-Radioassay) ver­ wendet. Bei diesem Test wird immobilisierter Intrinsic Factor und radioaktiv markiertes B12 (⁵⁷Co B12) verwen­ det. Zur Probenvorbereitung wird bei diesem Test Dithio­ threitol (DTT) in alkalischer Lösung verwendet. Die Korrelation zwischen diesem Radioimmunoassay und dem erfindungsgemäßen Verfahren ist im Bereich einer Vita­ min-B12-Konzentration zwischen 100 und 1400 pg/ml<0,98.As a standard, cyanocobalamin in 40 mmol / l Phos phosphate buffer, pH 7.2 with 0.9% sodium chloride, 0.9% Crotein C and 0.1% potassium cyanide used. To Ver the same was the test sold by Becton Dickinson  (Simultaneous No Boil SNB-B12 / folate radioassay) ver applies. In this test, immobilized intrinsic Factor and radioactively labeled B12 (⁵⁷Co B12) use det. For sample preparation Dithio Threitol (DTT) used in alkaline solution. The Correlation between this radioimmunoassay and the inventive method is in the field of a Vita min-B12 concentration between 100 and 1400 pg / ml <0.98.

Beispiel 6example 6 Vitamin-B12-Bestimmung mit polyklonalem Antikörper gegen B12 (Vergleichsbeispiel)Vitamin B12 determination with polyclonal antibody against B12 (comparative example) a) Gewinnung des Antiserumsa) Obtaining the antiserum

10 Schafe werden mit dem im Beispiel 1 beschriebe­ nen Immunogen (0,5 ng/ml in komplettem Freundschen Adjuvans) in vierwöchigem Abstand über 6 Monate immunisiert. Anschließend wird das Antiserum gewonnen und affinitätschromatographisch gereinigt.10 sheep are described in Example 1 immunogen (0.5 ng / ml in complete Freund's Adjuvant) at four-week intervals over 6 months immunized. Subsequently, the antiserum recovered and purified by affinity chromatography.

b) Herstellung von biotinylierten Fab-Fragmenten des polyklonalen Antikörpers gegen B12 (Fab-Biotinb) Preparation of biotinylated Fab fragments of polyclonal antibody against B12 (Fab biotin

Mit den polyklonalen Antikörpern wird, wie in Biochem. J. 73 (1959) 119-126 beschrieben, eine Papainspaltung durchgeführt. Die hierbei entstan­ denen Fragmente werden mittels Gelfiltration über Sephadex G100 und Ionenaustauscher-Chromatographie über DEAE-Cellulose nach Meth. in Enzymology 73 (1981) 418-459 abgetrennt. Die Biotinylierung erfolgt wie in JACS 100 (1978) 3585-3590 beschrieben. With the polyclonal antibodies, as in Biochem. J. 73 (1959) 119-126, a Papain splitting performed. The entstan which fragments are transformed by gel filtration Sephadex G100 and Ion Exchange Chromatography on DEAE-cellulose after Meth. in Enzymology 73 (1981) 418-459 separated. The biotinylation is carried out as described in JACS 100 (1978) 3585-3590.  

c) Durchführung der Bestimmungc) implementation of the provision

Die Durchführung der Bestimmung erfolgt, wie im Beispiel 4 beschrieben, wobei anstelle von 95 ng/ml biotinyliertem MAK 1 95 ng/ml Fab-Biotin eingesetzt werden.The execution of the determination takes place, as in Example 4, wherein instead of 95 ng / ml biotinylated MAK 1 95 ng / ml Fab-biotin be used.

Fig. 2 zeigt den Vergleich zwischen einer B12-Be­ stimmung über polyklonale und monoklonale Antikörper. Danach zeigt sich, daß mit den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern eine wesentlich steilere Eichkurve erhalten wird. Fig. 2 shows the comparison between a B12 Be mood over polyclonal and monoclonal antibodies. It then turns out that a much steeper calibration curve is obtained with the monoclonal antibodies according to the invention.

Claims (16)

1. Verfahren zur Bestimmung von Vitamin B12 durch Inkubation einer Probelösung mit mindestens zwei Rezeptoren R₁ und R₂, von denen R₁ die Bindung an die feste Phase vermittelt und R₂ markiert ist, Trennung der beiden Phasen und Messung der Mar­ kierung in einer der beiden Phasen, dadurch gekennzeichnet, daß man als einen der beiden Rezeptoren R₁ oder R₂ einen Rezeptor verwendet, der einen spezifisch mit B12 bindefähigen, monoklonalen Antikörper, der für B12 eine Affinitätskonstante von mindestens 5×10⁹ l/mol hat, enthält und als anderen Rezep­ tor R₂ oder R₁ einen Rezeptor verwendet, der B12 oder ein Analogon davon enthält.1. A method for the determination of vitamin B12 by incubation of a sample solution having at least two receptors R₁ and R₂, of which R₁ imparts the binding to the solid phase and R₂ is marked, separation of the two phases and measurement of Mar kierung in one of the two phases, characterized in that one uses as one of the two receptors R₁ or R₂ a receptor containing a specifically bindable with B12, monoclonal antibody having an affinity constant of at least 5 × 10⁹ l / mol for B12, and as another recipe R₂ or R₂ R₁ uses a receptor containing B12 or an analogue thereof. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als spezifisch mit B12 bindefähigen monoklonalen Antikörper einen Antikörper verwen­ det, der eine Kreuzreaktivität gegen Methylcobala­ min und Cyanocobalamin von 100%; gegen Cobinamid von 0,05%; gegen Purinylcobinamid von 1,1%; gegen Cobryrinsäure-diamid von 0,05%; gegen 2-Hydroxy-5,6-dimethylbenzimidazolyl-cobamid von 1,5% und gegen (Carboxy(2-cyanamino-4,5-dimethyl­ phenyl)-amino)-cobamid von 0,07% aufweist.2. The method according to claim 1, characterized, that one is capable of binding with B12 monoclonal antibodies use an antibody det, which has a cross-reactivity to methylcobal min and cyanocobalamin of 100%; against cobinamide of 0.05%; against purinylcobinamide of 1.1%; against cobryric acid diamide of 0.05%; against 2-hydroxy-5,6-dimethylbenzimidazolyl cobamide of 1.5% and against (carboxy (2-cyanamino-4,5-dimethyl phenyl) -amino) -cobamide of 0.07%. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als monoklonalen Antikörper einen von der Zellinie ECACC 88101301 oder ECACC 88101302 pro­ duzierten Antikörper verwendet. 3. The method according to claim 1 or 2, characterized, that as a monoclonal antibody one of the Cell line ECACC 88101301 or ECACC 88101302 pro used reduced antibody.   4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Rezeptor R₁ ein Konjugat aus Biotin und einem spezifisch mit B12 bindefähigen monoklo­ nalen Antikörper verwendet, wobei als Festphase ein mit Streptavidin beschichtetes Trägermaterial verwendet wird.4. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that as a receptor R₁ a conjugate of biotin and a monoclonal B12 capable of binding specifically with B12 used as the solid phase a streptavidin-coated carrier material is used. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Rezeptor R₂ ein B12-Konjugat der folgenden Formel: verwendet wird, worin B12 den aus Cyanocobalamin durch Abspaltung einer CONH₂-Gruppe gebildeten Rest und R einen Spacer bedeutet, x 0 oder 1 ist und GP den Rest eines glykosylgruppenhaltigen Markerenzyms darstellt, das über einen Glykosylrest an die NH-N=-Gruppierung gebunden ist.5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that as receptor R₂ a B12 conjugate of the following formula: wherein B12 is the radical formed from cyanocobalamin by cleavage of a CONH₂ group and R is a spacer, x is 0 or 1, and GP is the residue of a glycosyl-containing marker enzyme linked to the NH-N = moiety via a glycosyl radical , 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als B12-Konjugat B12-d-CO-NH-NH-CO-CH₂ (O-CH₂-CH₂)₃ -O-CH₂-CO- NH-N=GPverwendet, worin GP den Peroxi­ daserest bedeutet.6. The method according to claim 5, characterized characterized in that as B12 conjugate B12-d-CO-NH-NH-CO-CH₂ (O-CH₂-CH₂) ₃ -O-CH₂-CO-NH-N = GP used, wherein GP is the peroxy that means first. 7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probelösung vor Inkubation mit den beiden Rezeptoren R₁ und R₂ durch Zugabe einer Säure der allgemeinen Formel (I): vorbehandelt, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 8 bedeutet.7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the sample solution before incubation with the two receptors R₁ and R₂ by adding an acid of the general formula (I): pretreated in which n is an integer from 1 to 8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Vorbehandlung Liponsäure verwendet.8. The method according to claim 7, characterized characterized in that one Pretreatment lipoic acid used. 9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein monoklonaler Antikörper verwendet wird, dessen Affinitätskonstante für B12 größer als 10¹⁰ l/mol ist.9. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that a monoclonal antibody is used, its affinity constant for B12 is greater than 10¹⁰ l / mol. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß ein mono­ klonaler Antikörper verwendet wird, dessen Affini­ tätskonstante für B12 größer als 5×10¹⁰ l/mol ist.10. The method according to claim 9, characterized characterized in that a mono clonal antibody is used, whose affin constant for B12 greater than 5 × 10¹⁰ l / mol. 11. Verfahren zur Herstellung eines mit B12 spezifisch bindefähigen, monoklonalen Antikörpers, dadurch gekennzeichnet, daß man Inzuchtmäuse mit Vitamin-B12-d-Säure, an die über einen Spacer, insbesondere 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimid ein immunogenes Trägermaterial gekuppelt ist, immunisiert, B-Lympho­ cyten der immunisierten Tiere gewinnt und mit trans­ formierenden Agentien mit Myelomzellen fusioniert, die so gebildeten Hybridzellen kloniert und kulti­ viert und den monoklonalen Antikörper aus diesen Zellen isoliert. 11. Method of Making One Specific to B12 bindable, monoclonal antibody, characterized, that inbred mice with vitamin B12-d-acid, to which via a spacer, in particular 1-ethyl-3- (3 dimethylaminopropyl) carbodiimide an immunogenic Carrier material is coupled, immunized, B-lympho cyten of the immunized animals wins and trans forming agents fused with myeloma cells, the hybrid cells thus formed are cloned and cultivated fourth and the monoclonal antibody from these Isolated cells.   12. Zellinie ECACC 88101301.12. Cell line ECACC 88101301. 13. Zellinie ECACC 88101302.13. Cell line ECACC 88101302. 14. Reagenz zur Bestimmung von B12, enthaltend einen die Bindung an die Festphase vermittelnden Rezep­ tor R₁ und einen markierten Rezeptor R₂, dadurch gekennzeichnet, daß es als einen der beiden Rezeptoren R₁ oder R₂ einen Rezeptor, der einen spezifisch mit B12 bindefähigen monoklonalen Antikörper, der für B12 eine Affinitätskonstante von mindestens 5×10⁹ l/mol aufweist, enthält und als anderen Rezeptor R₂ oder R₁ einen Rezeptor enthält, der B12 oder ein Analo­ gon davon enthält sowie gegebenenfalls ein Nach­ weissystem für die Markierung.14. A reagent for the determination of B12, containing one the binding to the solid phase mediating recipe tor R₁ and a labeled receptor R₂, characterized, that it is one of the two receptors R₁ or R₂ a receptor that is specific to B12 bindable monoclonal antibody suitable for B12 an affinity constant of at least 5 x 10⁹ l / mol contains, and as another receptor R₂ or R₁ contains a receptor, the B12 or an analogue gon thereof and, where appropriate, an after white system for marking. 15. Reagenz nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es als Festphase eine mit Avidin oder Streptavidin be­ schichtete Matrix, als Rezeptor R₁ ein Konjugat aus Biotin und einem mit B12 spezifisch bindefähi­ gen, monoklonalen Antikörper, als R₂ eine Verbin­ dung der Fomel B12-CO-NH (NH-R-NH) x N=GP, worin B12 den aus Cyanocobalamin durch Abspaltung einer CONH₂-Gruppe gebildeten Rest, R einen Spacer, x 0 oder 1 und GP den Rest eines glykosylgruppen­ haltigen Markerenzyms darstellt, das über einen Glykosylrest an die NH-N=-Gruppierung gebunden ist sowie ein für das Markerenzym geeignetes Nachweis­ system enthält. 15. A reagent according to claim 14, characterized in that it as a solid phase coated with avidin or streptavidin matrix, as a receptor R₁ a conjugate of biotin and a B12 specifically bindefähi conditions, monoclonal antibody, as R₂ a connec tion of the Fomel B12- CO-NH (NH-R-NH) x N = GP, where B12 is the residue formed from cyanocobalamin by cleavage of a CONH₂ group, R is a spacer, x is 0 or 1 and GP is the residue of a glycosyl-containing marker enzyme which has a Glykosylrest is bound to the NH-N = moiety and contains a suitable for the marker enzyme detection system. 16. Reagenz nach einem der Ansprüche 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich eine Verbindung der Formel worin n 1 bis 8 bedeutet, enthält.16. A reagent according to any one of claims 15 or 16, characterized in that it additionally comprises a compound of formula wherein n is 1 to 8 contains.
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