DE3842125A1 - Immunoassay method and apparatus for carrying out the method - Google Patents

Immunoassay method and apparatus for carrying out the method

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DE3842125A1
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Hiroko Makiguchi
Yasushi Nomura
Kyoko Imai
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Hitachi Ltd
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Abstract

A substance to be determined in a sample is reacted, in a heterogeneous method using a solid-phase method, with an antibody which is able to enter into specific binding with the substance and which is labelled with an enzyme or fine particles. The resulting antigen-antibody complex is analysed by photoacoustic spectroscopy, with quantitative determination of the substance to be determined being possible within a short time and with higher sensitivity.

Description

Die Erfindung betrifft ein Immunoassay-Verfahren und eine Vor­ richtung zur Durchführung des Verfahrens, die insbesondere zur Bestimmung von biologisch aktiven Bestandteilen in einer Pro­ be durch photoakustische Spektroskopie geeignet sind.The invention relates to an immunoassay method and a pre direction for performing the method, in particular for Determination of biologically active components in a pro be suitable by photoacoustic spectroscopy.

Wenn eine zu bestimmende Substanz in einer Probe, z.B. ein Antigen, Antikörper, Hapten, Hormon oder dergl., mit einem Antigen oder Antikörper, der mit der Substanz spezifisch rea­ gieren kann, umgesetzt wird, entsteht ein Immunkomplex. Seit längerer Zeit wird ein Verfahren angewandt, bei dem das Agglu­ tinationsmuster, die Trübung oder die Intensität der Licht­ streuung des Komplexes gemessen werden und dadurch die Konzen­ tration der zu bestimmenden Substanz ermittelt wird. Dieses Verfahren ist jedoch in Bezug auf die Empfindlichkeit begrenzt und erlaubt keine Testdurchführung, wenn die Konzentration der zu bestimmenden Substanz nieder (10-8 m oder weniger) ist.When a substance to be determined in a sample, for example an antigen, antibody, hapten, hormone or the like, is reacted with an antigen or antibody that can react specifically with the substance, an immune complex is formed. A method has been used for a long time in which the agglutination pattern, the turbidity or the intensity of the light scattering of the complex are measured and the concentration of the substance to be determined is thereby determined. However, this method is limited in sensitivity and does not allow testing when the concentration of the substance to be determined is low (10 -8 m or less).

Zur Bestimmung von derart niedrigen Konzentrationen der zu be­ stimmenden Substanz wird daher das RIA-Verfahren (Radioimmuno­ assay) unter Verwendung eines Radioisotops als Markierung an­ gewandt. Da derartige Isotopen jedoch schwierig handzuhaben sind, hat man ein Verfahren unter Verwendung einer fluoreszie­ renden Substanz oder eines Enzyms als Markierung anstelle von Isotopen entwickelt ("Koso Men-eki Sokuteiho (Enzym-Immuno­ assay)", Igakushoin, 1978). Insbesondere gilt der Enzym- Immunoassay (EIA) als ein zukunftsträchtiges Verfahren, das das RIA-Verfahren ablösen soll. EIA-Verfahren lassen sich grob in zwei Gruppen einteilen. Bei einer Gruppe handelt es sich um homogene EIA-Verfahren, die keine sogenannte B/F-Trennung erfordern, d.h. die Trennung zwischen einem gebundenen Komplex eines markierten Antigens und eines Antikörpers (gebunden) und von in nicht-umgesetztem Zustand verbliebenen markierten Anti­ gen (frei). Die homogenen EIA-Verfahren zeichnen sich dadurch aus, daß sie keine B/F-Trennung erforderlich machen, haben je­ doch im allgemeinen den Nachteil, daß sich keine große Nach­ weisempfindlichkeit erreichen läßt. Bei der anderen Gruppe handelt es sich um heterogene EIA-Verfahren. Ein typisches Bei­ spiel für ein heterogenes EIA-Verfahren ist das ELISA-Verfah­ ren, das eine B/F-Trennung erforderlich macht und daher in der Durchführung aufwendig und zeitraubend ist. Daher sind hete­ rogene EIA-Verfahren für routinemäßige klinische Untersuchun­ gen unzweckmäßig, weisen aber den Vorteil auf, daß sie im Ver­ gleich zu den vorerwähnten homogenen EIA-Verfahren eine höhere Empfindlichkeit ermöglichen. Unter den heterogenen EIA-Verfah­ ren, bei denen eine B/F-Trennung erforderlich ist, hat in letzter Zeit das Festphasen-Verfahren weite Verbreitung gefun­ den. Beim Festphasen-Verfahren wird eine zu bestimmende Sub­ stanz gemessen, indem man als feste Reaktionsphase einen festen Träger, z.B. inerte Kügelchen (Perlen) mit einem relativ großen Durchmesser in der Größenordnung von einigen Millimetern, oder die Innenwand eines Reaktors verwendet. Das Festphasen-Verfah­ ren wird nachstehend näher erläutert.To determine such low concentrations of be the RIA method (radioimmuno assay) using a radioisotope as a label agile. Because such isotopes are difficult to handle you have a method using fluorescence substance or an enzyme as a label instead of Isotopes developed ("Koso Men-eki Sokuteiho (Enzyme Immuno assay) ", Igakushoin, 1978). In particular, the enzyme Immunoassay (EIA) as a promising procedure that to replace the RIA process. EIA procedures can be rough divide into two groups. It is a group to homogeneous EIA processes that do not have a so-called B / F separation require, i.e. the separation between a bound complex a labeled antigen and an antibody (bound) and of labeled anti remaining in unreacted condition  gene (free). The homogeneous EIA processes are characterized by this that they do not require a B / F separation have ever but generally the disadvantage that there is no great aftermath can achieve sensitivity to wisdom. The other group are heterogeneous EIA procedures. A typical case The ELISA procedure is a game for a heterogeneous EIA procedure ren, which requires a B / F separation and therefore in the Implementation is complex and time consuming. Therefore hete rogene EIA procedures for routine clinical examinations Inappropriate, but have the advantage that they are in Ver a higher one than the homogeneous EIA processes mentioned above Enable sensitivity. Among the heterogeneous EIA procedures that require B / F separation has in Recently, the solid phase process has been widely used the. In the solid phase method, a sub punch measured by using a fixed reaction phase Carriers, e.g. inert beads (pearls) with a relatively large Diameter on the order of a few millimeters, or used the inner wall of a reactor. The solid phase process ren is explained in more detail below.

Zunächst wird ein Antikörper an der Innenwand eines Glasröhr­ chens immobilisiert, und anschließend wird ein unmarkiertes Antigen, (ein Standard-Antigen oder eine Probe, z.B. ein anti­ genhaltiges Patientenserum) zugesetzt. Dadurch wird die Anti­ gen-Antikörper-Reaktion ausgelöst, wobei das Antigen in der Probe eine Bindung mit dem immobilisierten Antikörper eingeht. Anschließend wird der Überstand entfernt. Sodann wird ein mit einem Enzym markierter Antikörper zugesetzt, wobei die Antigen- Antikörper-Reaktion mit dem vorher an den immobilisierten Antikörper gebundenen Antigen und dem enzymmarkierten Antikörper erfolgt. Der enzymmarkierte Antikörper geht dabei eine Bindung mit dem Antigen unter Bindung mit dem immobili­ sierten Antikörper ein. Sodann wird der Überstand, d.h. der restliche, enzymmarkierte Antikörper, der nicht an das Antigen gebunden ist, entfernt (B/F-Trennung). Hierauf wird eine enzy­ matische Reaktion unter Verwendung eines Substrats durchge­ führt. In diesem Fall hängt die enzymatische Aktivität von der Menge des enzymmarkierten, an das Antigen gebundenen Anti­ körpers ab, die wiederum von der Menge des am immobilisierten Antikörper gebundenen Antigens abhängig ist. Insgesamt ist die enzymatische Aktivität ein Maß für die Menge des ursprünglich in der Probe vorliegenden Antigens. Die enzymatische Aktivität wird gemessen, indem man die Abnahme der Substratmenge auf­ grund der enzymatischen Reaktion, die Menge des enzymatischen Reaktionsprodukts oder die Veränderung eines kuppelnden Co­ enzyms mißt.First, an antibody is placed on the inside wall of a glass tube immobilized, and then an unmarked Antigen, (a standard antigen or a sample, e.g. an anti Genetic patient serum) added. This will make the anti gene antibody reaction triggered, the antigen in the Sample binds with the immobilized antibody. The supernatant is then removed. Then a with added to an enzyme-labeled antibody, the antigen Antibody reaction with the one previously immobilized on Antibody-bound antigen and the enzyme-labeled Antibody occurs. The enzyme-labeled antibody works binding with the antigen with binding with the immobili Antibodies. Then the supernatant, i.e. the remaining, enzyme-labeled antibody that does not adhere to the antigen bound, removed (B / F separation). Then an enzy  matic reaction using a substrate leads. In this case the enzymatic activity depends on the amount of enzyme labeled anti bound to the antigen body, which in turn depends on the amount of immobilized Antibody-bound antigen is dependent. Overall, that is enzymatic activity a measure of the amount of originally antigen present in the sample. The enzymatic activity is measured by looking at the decrease in the amount of substrate due to the enzymatic reaction, the amount of the enzymatic Reaction product or the change of a coupling Co enzyme measures.

Das Festphasen-Verfahren hat in letzter Zeit weite Verbreitung gefunden, da die Handhabung eines festen Trägers einfach ist. Das Festphasen-Verfahren ist empfindlicher als die vorerwähn­ ten homogenen EIA-Verfahren. Da man sich bei herkömmlichen Festphasen-Verfahren der Absorption oder Fluoreszenzintensität als Nachweismittel bedient, beträgt die Grenze der Nachweis­ empfindlichkeit für diese Verfahren etwa 10-12 m.The solid phase method has become widespread recently because handling a solid support is easy. The solid phase method is more sensitive than the aforementioned homogeneous EIA methods. Since conventional solid-phase methods use absorption or fluorescence intensity as a means of detection, the limit of detection sensitivity for these methods is approximately 10 -12 m.

Andererseits offenbart die JP-A 60-1 59 648 einen Festphasen- Immunoassay, bei dem eine zu bestimmende Substanz in einer Probe mit einem unmarkierten, an einer festen Phase immobili­ sierten Antikörper oder Antigen umgesetzt wird, der erhaltene Antigen-Antikörper-Komplex aus der festen Phase durch eine Freisetzungslösung freigesetzt wird, und anschließend die den Komplex enthaltende Freisetzungslösung durch photoakustische Spektroskopie bestimmt wird, so daß insgesamt eine Bestimmung der Substanz in der Probe erfolgt. Dieses Verfahren ist jedoch insofern nachteilig, als es noch eine geringe Nachweisempfind­ lichkeit aufweist und eine lange Testdauer erforderlich macht.On the other hand, JP-A 60-1 59 648 discloses a solid phase Immunoassay, in which a substance to be determined in a Sample with an unlabelled, immobilized on a solid phase based antibody or antigen is implemented, the obtained Antigen-antibody complex from the solid phase through a Release solution is released, and then the Release solution containing complex by photoacoustic Spectroscopy is determined so that a total determination of the substance in the sample. However, this procedure is disadvantageous in that it still has a low detection sensitivity and requires a long test period.

Wie vorstehend erwähnt, sind die herkömmlichen Festphasen- Verfahren insofern nachteilig, als sie aufgrund der Nachweis­ grenze eine geringe Nachweisempfindlichkeit aufweisen und eine lange Zeitspanne bis zur Erzielung der Ergebnisse erfor­ derlich machen.As mentioned above, the conventional solid phase Procedures disadvantageous in that they are based on the detection have a low detection sensitivity and a long period of time to obtain the results make such a thing.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Immunoassay-Verfahren und eineVorrichtung hierfür bereitzustellen, die eine Verringe­ rung der Bestimmungszeit und eine Erhöhung der Nachweisempfind­ lichkeit ermöglichen. Diese Aufgabe läßt sich durch ein Immunoassay-Verfahren lösen, bei dem es sich um ein heteroge­ nes Festphasen-Immunoassay-Verfahren unter Verwendung eines Enzyms oder von feinen Ttilchen als Markierungsmittel handelt und bei dem die photoakustische Spektroskopie anstelle der Mes­ sung der Absorption oder Fluoreszenzintensität als Nachweismit­ tel für den Immunoassay eingesetzt wird.The object of the invention is an immunoassay method and to provide a device therefor which has a ring determination time and an increase in detection sensitivity enable possibility. This task can be done by Solve immunoassay procedure, which is a heterogeneous one a solid phase immunoassay method using a Enzyme or fine particles as a marker and where photoacoustic spectroscopy instead of measurement absorption or fluorescence intensity as detection tel is used for the immunoassay.

Gegenstand der Erfindung ist ein Immunoassay-Verfahren, das gekennzeichnet ist durchThe invention relates to an immunoassay method that is characterized by

  • - Durchführen einer kompetitiven oder nicht-kompetitiven Reak­ tion auf der Grundlage eines heterogenen Verfahrens unter Verwendung einer festen Phase und unter Einsatz einer Kombination einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe, eines Antigens oder Antikörpers, die eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz eingehen, und eines mit einem Enzym oder feinen Teilchen markierten Antigens oder Antikörpers, wobei dieses Antigen oder dieser Antikör­ per in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu be­ stimmenden Substanz einzugehen; oder
    einer Kombination einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe, der gleichen Substanz wie die zu bestimmende Substanz, die mit einem Enzym oder feinen Teilchen markiert ist, und eines Antigens oder Antikörpers, die eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz eingehen; oder
    einer Kombination einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe, eines mit einem Enzym oder feinen Teilchen markierten Antigens oder Antikörpers, wobei dieses Antigen oder dieser Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen, und der gleichen Sub­ stanz wie die zu bestimmende Substanz;    Performing a competitive or non-competitive reaction on the basis of a heterogeneous method using a solid phase and using a combination of a substance to be determined in a sample, an antigen or an antibody, which form a specific binding with the substance to be determined, and an antigen or antibody labeled with an enzyme or fine particles, said antigen or antibody being able to bind specifically to the substance to be determined; or
    a combination of a substance to be determined in a sample, the same substance as the substance to be determined that is labeled with an enzyme or fine particles, and an antigen or antibody that specifically bind with the substance to be determined; or
    a combination of a substance to be determined in a sample, an antigen or antibody labeled with an enzyme or fine particles, which antigen or antibody is capable of binding specifically with the substance to be determined, and the same substance as that substance to be determined;
  • - Messen der Aktivität des erhaltenen, mit dem Enzym oder den feinen Teilchen markierten und an der festen Phase immobili­ sierten Antigen-Antikörper-Komplexes durch photoakustische Spektroskopie; und- Measure the activity of the obtained, with the enzyme or fine particles marked and immobilized on the solid phase antigen-antibody complex by photoacoustic  Spectroscopy; and
  • - Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aufgrund des gemessenen Aktivitätswerts.- Determine the amount of the substance to be determined in the Sample based on the measured activity value.

Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Vorrichtung zur Durchführung von Immunoassay-Verfahren, die gekennzeichnet ist durchThe invention further relates to a device for Perform immunoassay procedures that are labeled is through

  • - einen Reaktor, an dem ein Antigen oder Antikörper, die eine spezifische Bindung mit einer zu bestimmenden Substanz ein­ gehen, oder die gleiche Substanz wie die zu bestimmende Substanz immobilisiert sind oder einen Reaktor mit einem Gehalt an unlöslichen Kügelchen, an denen das Antigen oder der Antikörper oder die gleiche Substanz wie die zu bestim­ mende Substanz immobilisiert sind;- a reactor on which an antigen or antibody carrying a specific binding with a substance to be determined go, or the same substance as the one to be determined Are immobilized or a reactor with a Content of insoluble beads on which the antigen or the antibody or the same substance as that to be determined immobilizing substance are immobilized;
  • - eine Einrichtung zum Einspritzen einer Probe, die eine zu bestimmende Substanz enthält, in den Reaktor;- A device for injecting a sample, the one too contains determining substance in the reactor;
  • - eine Einrichtung zum Einspritzen eines mit einem Enzym oder feinen Teilchen markierten Antigens oder Antikörpers in den Reaktor, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage sind, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Sub­ stanz einzugehen, oder zum Einspritzen der gleichen Sub­ stanz wie die zu bestimmende Substanz, die mit einem Enzym oder feinen Teilchen markiert ist, in den Reaktor;a device for injecting an enzyme or fine particles of labeled antigen or antibody in the Reactor capable of carrying the antigen or antibody are a specific bond with the sub to be determined die, or to inject the same sub punch like the substance to be determined using an enzyme or fine particles is marked in the reactor;
  • - eine Einrichtung zum Einspritzen eines Substrats für das Enzym oder einer Freisetzungslösung zum Freisetzen des am Re­ aktor immobilisierten und mit den feinen Teilchen markier­ ten Antigen-Antikörper-Komplexes in den Reaktor;- A device for injecting a substrate for the Enzyme or a release solution to release the Re Actuator immobilized and marked with the fine particles antigen-antibody complex in the reactor;
  • - eine photoakustische Zelle, in die Enzym-Substrat-Komplex- Lösung oder die Freisetzungslösung, die den mit den feinen Teilchen markierten Antigen-Antikörper-Komplex ent­ hält, eingeführt wird;- a photoacoustic cell, in the enzyme-substrate complex- Solution or the release solution that the with the fine particles labeled antigen-antibody complex ent holds, is introduced;
  • - eine Einrichtung zum Bestrahlen der Reaktionslösung oder Freisetzungslösung in der Zelle mit intermittierendem Licht;- A device for irradiating the reaction solution or Release solution in the cell with intermittent light;
  • - eine Einrichtung zum Nachweisen einer durch die Bestrahlung mit intermittierendem Licht erzeugten akustischen Welle; und- A device for detecting radiation exposure acoustic wave generated with intermittent light; and
  • - eine Einrichtung zur Berechnung der Menge der zu bestimmen­ den Substanz aus der akustischen Welle.- a device for calculating the amount of determined the substance from the acoustic wave.

Nachstehend wird die Erfindung auch unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:The invention is also described below with reference to FIG Drawing explained in more detail. Show it:

Fig. 1 ein Fließdiagramm zur Erläuterung einer Ausfüh­ rungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Immunoassay- Verfahrens; und Fig. 1 is a flow chart for explaining an embodiment of an inventive device for performing the immunoassay method according to the invention; and

Fig. 2-11 jeweils Diagramme mit Eichkurven, die für das er­ findungsgemäße Immunoassay-Verfahren angewandt werden. Fig. 2-11 each have diagrams with calibration curves which are used for the immunoassay method according to the invention.

Die erste bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht in einem Immunoassay-Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:The first preferred embodiment of the invention consists in an immunoassay method comprising the following steps:

  • - Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe mit einem an einer festen Phase immobilisierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der La­ ge sind, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;- Implementing a substance to be determined in a sample with an antigen immobilized on a solid phase or Antibodies, where the antigen or the antibody in the La are a specific bond with the one to be determined To take substance;
  • - Umsetzen des erhaltenen, an der festen Phase immobolisierten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einem enzymmarkierten Anti­ gen oder Antikörper, wobei dieses Antigen oder dieser Anti­ körper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;- Implementation of the solid phase obtained Antigen-antibody complex with an enzyme-labeled anti gene or antibody, this antigen or anti is able to establish a specific bond with the body determining substance;
  • - Umsetzen eines Substrats mit dem erhaltenen, enzymmarkierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper- Komplex; und- Reacting a substrate with the enzyme-labeled one obtained and antigen-antibody immobilized on the solid phase Complex; and
  • - Bestrahlen der erhaltenen Reaktionslösung mit intermittieren­ dem Licht, Messen der dadurch erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge des zu bestimmenden Substrats in der Probe.- Intermittent irradiate the reaction solution obtained the light, measuring the acoustic wave generated thereby and Determine the amount of substrate to be determined in the Sample.

Bei diesem Immunoassay-Verfahren handelt es sich um ein hetero­ genes Festphasen-Verfahren, bei dem ein Enzym als Markierungs­ mittel verwendet wird, eine nicht-kompetive Reaktion auf der Basis eines heterogenen Verfahrens unter Verwendung einer festen Phase durchgeführt wird und die Menge der zu bestimmenden Sub­ stanz in einer Probe durch photoakustische Spektroskopie er­ mittelt wird.This immunoassay method is a hetero Genes solid-phase method in which an enzyme as a marker medium is used, a non-competitive response based a heterogeneous process using a fixed Phase is carried out and the amount of sub to be determined  punch in a sample by photoacoustic spectroscopy is averaged.

Konkret wird dieses Verfahren auf die nachstehend beschriebe­ ne Weise durchgeführt. Ein Antikörper oder ein Antigen, das eine spezifische Bindung mit einer zu bestimmenden Substanz eingeht, wird an einer festen Phase immobilisiert, z.B. an inerten Kügelchen (Perlen) mit einem relativ großen Durchmes­ ser in der Größenordnung von einigen Millimetern oder an der Innenwand eines Reaktors. Eine die zu bestimmende Substanz enthaltende Probe wird zugesetzt, um einen an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper-Komplex zu erhalten. An­ schließend werden ein Antigen oder ein Antikörper, die dazu in der Lage sind, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmen­ den Substanz einzugehen, und die mit einem Enzym markiert sind, mit dem Komplex umgesetzt. Bei dieser Reaktion reagiert die zu bestimmende Substanz im Antigen-Antikörper-Komplex mit dem enzymmarkierten Antigen oder Antikörper und es ergibt sich schließlich ein Antigen-Antikörper-Komplex, der an der festen Phase immobilisiert und mit dem Enzym markiert ist. Nicht-um­ gesetztes, enzymmarkiertes Antigen oder Antikörper werden entfernt (B/F-Trennung), wonach ein Substrat zum erhaltenen Antigen-Antikörper-Komplex zur Durchführung einer enzymati­ schen Reaktion zugesetzt wird. Die erhaltene Reaktionslösung wird durch photoakustische Spektroskopie analysiert, wobei die Menge der zu bestimmenden Substanz ermittelt wird.Specifically, this method is described below ne way done. An antibody or an antigen that a specific bond with a substance to be determined is immobilized on a solid phase, e.g. at inert beads (pearls) with a relatively large diameter in the order of a few millimeters or at the Inner wall of a reactor. A substance to be determined containing sample is added to a solid phase to obtain immobilized antigen-antibody complex. On In conclusion, an antigen or an antibody that is used in are able to determine a specific link with the enter the substance and which are labeled with an enzyme, implemented with the complex. With this reaction the reacts substance to be determined in the antigen-antibody complex with the enzyme labeled antigen or antibody and it results finally an antigen-antibody complex that is attached to the solid Phase is immobilized and labeled with the enzyme. Not around set, enzyme-labeled antigen or antibody removed (B / F separation), after which a substrate to be obtained Antigen-antibody complex for performing an enzymati reaction is added. The reaction solution obtained is analyzed by photoacoustic spectroscopy, the Amount of the substance to be determined is determined.

Als Enzyme für das vorerwähnte Immonoassay-Verfahren kommen beliebige Enzyme in Frage, sofern sie für übliche Enzym- Immunoassay-Verfahren geeignet sind. Beispiele für derartige Enzyme sind alkalische Phosphatase, Peroxidase, Glukoamylase und β-Galactosidase.Any enzymes can be used as enzymes for the aforementioned immunoassay method, provided that they are suitable for conventional enzyme immunoassay methods. Examples of such enzymes are alkaline phosphatase, peroxidase, glucoamylase and β- galactosidase.

Fig. 1 zeigt ein Fließdiagramm zur Erläuterung einer Ausfüh­ rungsform einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungs­ gemäßen Immunoassay-Verfahrens gemäß der ersten bevorzugten Ausführungsform. Diese Ausführungsform wird nachstehend unter Bezugnahme auf Fig. 1 näher erläutert. Fig. 1 shows a flow chart for explaining an embodiment of an apparatus for performing the immunoassay method according to the invention according to the first preferred embodiment. This embodiment is explained in more detail below with reference to FIG. 1.

Eine Probennehmerdüse 2 ist mit einer automatischen Probenneh­ mervorrichtung 1, in der sich eine Vielzahl von Proben befin­ det, und mit einem Reaktor 4 verbunden. Ein Antikörper 3 ist an der Innenwand des Reaktors 4 immobilisiert. Eine Reaktions­ lösung 11 befindet sich im Reaktor 4. Der Reaktor 4 ist über einzelne Schläuche mit einer Flasche 5 für Pufferlösung, einer Flasche 8 für enzymmarkierten Antikörper, einer Flasche 9 für Substrat und einer Flasche 10 für Beendigungslösung verbunden. Der Reaktor 4 befindet sich in einer Inkubationsvorrichtung 6. Der Reaktor 4 ist über eine Leitung 30 mit einer photoakustischen Zelle 12 verbunden. Ferner ist der Reaktor 4 durch eine Leitung mit einer Entleerungs­ flasche 7 verbunden. Die Entleerungflasche 7 ist mit der photoakustischen Zelle 12 verbunden.A sampling nozzle 2 is connected to an automatic sampling device 1 , in which a large number of samples are located, and to a reactor 4 . An antibody 3 is immobilized on the inner wall of the reactor 4 . A reaction solution 11 is in the reactor 4th The reactor 4 is connected via individual tubes to a bottle 5 for buffer solution, a bottle 8 for enzyme-labeled antibody, a bottle 9 for substrate and a bottle 10 for termination solution. The reactor 4 is located in an incubation device 6 . The reactor 4 is connected to a photoacoustic cell 12 via a line 30 . Furthermore, the reactor 4 is connected by a line with an emptying bottle 7 . The emptying bottle 7 is connected to the photoacoustic cell 12 .

Die photoakustische Zelle 12 ist mit einem Drucksensor 16 aus­ gerüstet. Der Drucksensor 16 ist mit einem Verstärker 17 ver­ bunden. Der Verstärker 17 ist einzeln mit einer Datenverarbei­ tungsvorrichtung 18 und einem Transmitter 19 verbunden.The photoacoustic cell 12 is equipped with a pressure sensor 16 . The pressure sensor 16 is connected to an amplifier 17 . The amplifier 17 is individually connected to a data processing device 18 and a transmitter 19 .

Ferner sind eine Laserlichtquelle 13 sowie ein Zerhacker 14 und eine Linse 15 vorgesehen. Der Zerhacker 14 ist mit dem Transmitter 19 verbunden. Nachstehend wird die Funktionsweise der Vorrichtung näher erläutert.Furthermore, a laser light source 13 as well as a chopper 14 and a lens 15 are provided. The chopper 14 is connected to the transmitter 19 . The operation of the device is explained in more detail below.

Die einzelnen, in der automatischen Probennehmervorrichtung 1 befindlichen Proben werden durch die Probennehmerdüse 2 ange­ saugt und in den Reaktor 4, an dessen Innenwand vorher der Antikörper 3 immobilisiert worden ist, gebracht. Ferner wird eine Pufferlösung 5 in den Reaktor 4 gebracht, wonach der Re­ aktor 4 in der Schüttelinkubationsvorrichtung 6 inkubiert wird. Sodann wird die Pufferlösung 5 in den Reaktor 4 gebracht, um die feste Phase damit zu waschen. Diese Pufferlösung wird anschließend in das Entleerungsgefäß 7 abgesaugt und sodann aus dem System entfernt. The individual samples located in the automatic sampling device 1 are sucked through the sampling nozzle 2 and brought into the reactor 4 , on the inner wall of which the antibody 3 has previously been immobilized. Further, a buffer solution is introduced into the reactor 4 5, after which the actuator 4 Re is incubated in the Schüttelinkubationsvorrichtung. 6 The buffer solution 5 is then brought into the reactor 4 in order to wash the solid phase with it. This buffer solution is then sucked off into the emptying vessel 7 and then removed from the system.

Hierauf wird der enzymmarkierte Antikörper 8 in den Reaktor 4 gebracht. Eine erneute Inkubation wird durchgeführt. Sodann wird wieder Pufferlösung 5 in den Reaktor 4 gegeben, um die feste Phase zu waschen. Anschließend wird die Pufferlösung in das Entleerungsgefäß 7 entleert. Sodann wird ein Substrat 9 zugesetzt, um die enzymatische Reaktion einzuleiten. Nach Durchführung einer Inkubation wird die Reaktion durch eine Be­ endigungslösung 10 beendet. Die Reaktionslösung 11 wird nach Beendigung der Reaktion in die photoakustische Zelle 12 ge­ saugt. Licht aus der Laserlichtquelle 13 wird mittels des Zer­ hackers 14, der ein Signal vom Transmitter 19 empfangen hat, in intermittierendes Licht umgewandelt. Das intermittierende Licht wird durch die Linse 15 auf die photoakustische Zelle 12 geworfen. In der Zelle absorbiert die Probe das durchtretende Licht unter Erzeugung eines akustischen Signals, das mittels des Drucksensors 26 nachgewiesen wird. Das nachgewiesene Sig­ nal erfährt im Verstärker 17 eine Verbesserung des Rauschab­ stands, wird der Datenverarbeitungseinrichtung 18 zugeführt und sodann ausgegeben.The enzyme-labeled antibody 8 is then brought into the reactor 4 . A new incubation is carried out. Buffer solution 5 is then added to reactor 4 again to wash the solid phase. The buffer solution is then emptied into the emptying vessel 7 . A substrate 9 is then added to initiate the enzymatic reaction. After an incubation has been carried out, the reaction is terminated by a termination solution 10 . The reaction solution 11 is sucked into the photoacoustic cell 12 after completion of the reaction. Light from the laser light source 13 is converted into intermittent light by means of the chopper 14 , which has received a signal from the transmitter 19 . The intermittent light is projected through the lens 15 onto the photoacoustic cell 12 . In the cell, the sample absorbs the light passing through, producing an acoustic signal, which is detected by means of the pressure sensor 26 . The detected signal experiences an improvement in the signal-to-noise ratio in the amplifier 17 , is fed to the data processing device 18 and then output.

Obgleich im vorstehenden Beispiel die Bestimmung durch Immobi­ lisierung eines Antikörpers an der Innenwand des Reaktors 4 durchgeführt wird, kann dies auch auf die vorstehend beschrie­ bene Weise vorgenommen werden, indem man anstelle des Anti­ körpers ein Antigen, das eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz eingeht, verwendet.Although in the above example the determination is carried out by immobilizing an antibody on the inner wall of the reactor 4 , this can also be carried out in the manner described above by using an antigen instead of the antibody which has a specific binding with the substance to be determined incoming, used.

Nachstehend wird die in diesem Beispiel eingesetzte photoakusti­ sche Spektroskopie näher erläutert.The photoacoustic used in this example is shown below cal spectroscopy explained.

Wenn eine durch die enzymatische Reaktion in der Reaktionslö­ sung erzeugte Substanz Licht absorbiert, nimmt sie Lichtener­ gie auf, und die die Substanz bildenden Atome oder Moleküle werden angeregt. Aufgrund der von den Atomen oder Molekülen aufgenommenen Lichtenergie setzen die Atome oder Moleküle bei der Rückkehr in ihren Grundzustand Energie frei (Fluoreszenz, sichtbares Licht oder Wärme). Bei diesem Vorgang wird eine akustische Welle erzeugt. Dieses akustische Signal wird durch den Verstärker 17 verstärkt und zur Ausgabe an die Datenver­ arbeitungseinrichtung 18 gesendet. Das photoakustische Signal wird durch den Drucksensor 16, z.B. ein akustischer Sensor, wie ein Mikrophon, nachgewiesen. Bei Proben für klinische Untersuchungen, d.h. Proben von lebenden Organismen, handelt es sich im allgemeinen um Flüssigkeiten, wie Blut oder Serum. Im Fall der Untersuchung dieser flüssigen Proben durch photo­ akustische Spektroskopie, wird eine photoakustische Zelle für die flüssige Probe eingesetzt. Dabei dient als photoakusti­ sche Zelle 12 ein kleiner, luftdichter Behälter, in dem ein Gas eingeschlossen ist. Eine Probe wird in den Behälter gege­ ben, und die in der Probe erzeugte Wärme wird in eine Druck­ änderung des Gases umgewandelt, die mittels eines hochempfind­ lichen Mikrophons nachgewiesen wird. Eine hochempfindliche Bestimmung kann auch durchgeführt werden, indem man eine Probe selbst als Druckmedium verwendet und die in der Probe erzeugte Wärme in eine Druckänderung umwandelt, wobei man ein kerami­ sches Druckelement auf Zirkon-Blei-Titanat-Basis (PTZ) oder dergl. als Detektor verwendet.When a substance generated by the enzymatic reaction in the reaction solution absorbs light, it absorbs light energy and the atoms or molecules constituting the substance are excited. Due to the light energy absorbed by the atoms or molecules, the atoms or molecules release energy when they return to their basic state (fluorescence, visible light or heat). An acoustic wave is generated during this process. This acoustic signal is amplified by the amplifier 17 and sent to the data processing device 18 for output. The photoacoustic signal is detected by the pressure sensor 16 , for example an acoustic sensor such as a microphone. Samples for clinical studies, ie samples from living organisms, are generally liquids, such as blood or serum. In the case of examining these liquid samples by photo acoustic spectroscopy, a photoacoustic cell is used for the liquid sample. A small, airtight container in which a gas is enclosed serves as the photoacoustic cell 12 . A sample is placed in the container, and the heat generated in the sample is converted into a pressure change in the gas, which is detected using a highly sensitive microphone. A highly sensitive determination can also be performed by using a sample itself as a pressure medium and converting the heat generated in the sample into a pressure change using a zircon-lead titanate-based (PTZ) ceramic pressure element or the like as a detector used.

Wenn Licht aus der Lichtquelle 13 als einfallendes Licht oder als Streulicht durch ein Fenstermaterial oder die Innenwand der Zelle absorbiert wird, ergibt sich dadurch ebenfalls ein photoakustisches Signal. Daher ist insbesondere bei der Be­ stimmung von Proben, die einen niedrigen Absorptionskoeffizien­ ten aufweisen und in optischer Hinsicht stark verdünnt sind, darauf zu achten, Hintergrundrauschen zu beseitigen. Ein Hin­ tergrundrauschen, das auf von der Probe abweichende Substan­ zen zurückzuführen ist, sollte ebenfalls vom photoakustischen Signal abgezogen werden. In einem derartigen Fall wird die Be­ stimmung nicht nur in Gegenwart, sondern auch in Abwesenheit der Probe durchgeführt. Die Differenz der beiden Meßwerte wird mittels der Datenverarbeitungseinrichtung 18 ermittelt, wo­ durch man ein nur auf die Probe zurückzuführendes photoakusti­ sches Spektrum erhält. Ein photoakustisches Spektrometer vom Doppelstrahl-Typ wird nicht nur dann verwendet, wenn sich die Intensität der Lichtquelle mit der Zeit verändert, sondern auch, wenn ein geringer Unterschied von Spektren von zwei ver­ schiedenen Proben (eine davon als Kontrollprobe) innerhalb kurzer Zeit gemessen werden soll. Diesbezüglich ist die glei­ che Situation wie bei einem herkömmlichen Doppelstrahl-Spektro­ photometer gegeben.If light from the light source 13 is absorbed as incident light or as scattered light through a window material or the inner wall of the cell, this also results in a photoacoustic signal. Therefore, especially when determining samples that have a low absorption coefficient and are visually very dilute, care must be taken to eliminate background noise. Background noise due to substances that differ from the sample should also be subtracted from the photoacoustic signal. In such a case, the determination is carried out not only in the presence but also in the absence of the sample. The difference between the two measured values is determined by means of the data processing device 18 , where a photoacoustic spectrum which can only be attributed to the sample is obtained. A double beam type photoacoustic spectrometer is used not only when the intensity of the light source changes with time, but also when a small difference in spectra of two different samples (one of them as a control sample) is to be measured within a short time . In this regard, the situation is the same as in a conventional double-beam spectrophotometer.

Bei Verwendung eines Lasers als Lichtquelle bei der photo­ akustischen Spektroskopie ergibt die Spektroskopie ein hoch­ empfindliches Nachweisverfahren. Infolgedessen wird ein Nach­ weis von hoher Empfindlichkeit entsprechend einer Absorption von 10-5 bis 10-6 möglich.When using a laser as a light source in photo acoustic spectroscopy, spectroscopy results in a highly sensitive detection method. As a result, a detection of high sensitivity corresponding to an absorption of 10 -5 to 10 -6 is possible.

Nachstehend folgt ein konkretes Ausführungsbeispiel, das sich auf die Bestimmung von Ferritin in Serum bezieht.The following is a concrete embodiment that is relates to the determination of ferritin in serum.

In einem Behälter, der daran immobilisierten anti-Ferrritin- Antikörper enthält, werden 0,05 ml einer Humanserumprobe und 0,1 ml 0,01 m Natriumphosphatpuffer pH-Wert 7,0) mit einem Gehalt an 0,1% Rinderserumalbumin, 0,1% NaN3, 1 millimolar MgCl2 und 0,1 m NaCl (nachstehend als Pufferlösung A) be­ zeichnet, gegeben und 10 Minuten bei 37°C geschüttelt. Sodann wird 1 ml Pufferlösung A zu der Reaktionslösung gegeben und durch Saugen entfernt. Dieser Waschvorgang wird dreimal wie­ derholt. Nach dem wiederholten Waschen werden 150 µl mit alka­ lischer Phosphatase markierter anti-Ferritin-Antikörper, der mit Pufferlösung A auf 1970 Einheiten/15 µl verdünnt ist, zu­ gesetzt. Das erhaltene Gemisch wird 15 Minuten bei 37°C ge­ schüttelt. Sodann werden der Waschvorgang mit der Pufferlösung A und der Absaugvorgang auf die vorstehend beschriebene Weise wiederholt. Nach Durchführung der wiederholten Waschung werden 50 µl 2 millimolare p-Nitrophenylphosphorsäure als Substrat zur Einleitung der enzymatischen Reaktion zugesetzt. Anschließend wird 10 Minuten bei 30°C geschüttelt. 0.05 ml of a human serum sample and 0.1 ml of 0.01 M sodium phosphate buffer (pH 7.0), containing 0.1% bovine serum albumin, are placed in a container which contains anti-ferrritin antibodies immobilized thereon. 1% NaN 3 , 1 millimolar MgCl 2 and 0.1 M NaCl (hereinafter referred to as buffer solution A ), added and shaken at 37 ° C. for 10 minutes. Then 1 ml of buffer solution A is added to the reaction solution and removed by suction. This washing process is repeated three times. After repeated washing, 150 μl of alkaline phosphatase-labeled anti-ferritin antibody, which is diluted to 1970 units / 15 μl with buffer solution A , are added. The resulting mixture is shaken at 37 ° C for 15 minutes. Then the washing process with the buffer solution A and the suction process are repeated in the manner described above. After the repeated washing, 50 μl of 2 millimolar p-nitrophenylphosphoric acid are added as a substrate to initiate the enzymatic reaction. The mixture is then shaken at 30 ° C. for 10 minutes.

Sodann wird die Reaktion unter Verwendung von 2,5 ml einer 0,1 m EDTA-Lösung beendet. Die das enzymatische Reaktionspro­ dukt enthaltende Reaktionslösung wird in eine photoakustische Zelle gesaugt und einer Messung mittels eines photoakustischen Spektrometers unterworfen. In Fig. 2 ist eine Eichkurve für Ferritin dargestellt, die unter Verwendung von Eichproben auf die vorstehend beschriebene Weise erhalten worden ist. Die Nachweisgrenze beim herkömmlichen Absorptionsverfahren beträgt etwa 0,25 ng/ml, wogegen das vorstehend beschriebene Verfahren eine Bestimmung bei niedrigeren Konzentrationen von beispiels­ weise 0,001 ng/ml oder darunter ermöglicht.The reaction is then terminated using 2.5 ml of a 0.1 M EDTA solution. The reaction solution containing the enzymatic reaction product is sucked into a photoacoustic cell and subjected to measurement by means of a photoacoustic spectrometer. Fig. 2 shows a calibration curve for ferritin which has been obtained using calibration samples in the manner described above. The detection limit in the conventional absorption method is about 0.25 ng / ml, whereas the method described above enables determination at lower concentrations, for example 0.001 ng / ml or below.

Der bei dieser Bestimmung verwendete anti-Ferritin-Antikörper weist eine ausreichend hohe Spezifität auf, so daß mit anderen Serumproteinen überhaupt keine Kreuzreaktionen beobachtet wer­ den.The anti-ferritin antibody used in this determination has a sufficiently high specificity so that with others Serum proteins no cross reactions observed at all the.

Die zweite bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht in einem Immunoassay-Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:The second preferred embodiment of the invention is in an immunoassay procedure comprising the following steps:

  • - Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe mit einem an einer festen Phase immobilisierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmen­ den Substanz einzugehen;- Implementing a substance to be determined in a sample with an antigen immobilized on a solid phase or antibody, wherein the antigen or the antibody in is able to determine a specific link with that to enter the substance;
  • - Umsetzen des erhaltenen, an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einem mit feinen Teilchen markierten Antigen oder Antikörper, wobei dieses Antigen oder dieser Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bin­ dung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;- Implementation of the immobilized on the solid phase obtained Antigen-antibody complex with a fine particle labeled antigen or antibody, this antigen or this antibody is capable of a specific bin to deal with the substance to be determined;
  • - Behandeln des auf diese Weise hergestellten, mit feinen Teil­ chen markierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einer Freisetzungslösung, um den Antigen-Antikörper-Komplex von der festen Phase frei­ zusetzen; und- Treat the part produced in this way with fine part marked and immobilized on the solid phase Antigen-antibody complex with a release solution, to free the antigen-antibody complex from the solid phase clog; and
  • - Bestrahlen der auf diese Weise erhaltenen, den Antigen-Anti­ körper-Komplex enthaltenden Freisetzungslösung mit intermit­ tierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Wel­ le und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.- Irradiation of the antigen anti obtained in this way Release complex containing body complex with intermit  light, measuring the acoustic world generated le and determining the amount of the substance to be determined in the sample from the acoustic wave.

Bei diesem Immunoassay-Verfahren handelt es sich um ein hete­ rogenes Festphasen-Immunoassay-Verfahren, bei dem feine Teil­ chen als Markierungsmittel verwendet werden, eine nicht-kompe­ titive Reaktion gemäß einem heterogenen Verfahren an einer festen Phase durchgeführt wird und die Menge der zu bestimmen­ den Substanz in einer Probe durch photoakustische Spektrosko­ pie bestimmt wird.This immunoassay method is a hete rogen solid phase immunoassay method in which the fine part Chen used as a marker, a non-compe titive reaction according to a heterogeneous process on a solid phase is carried out and to determine the amount of the substance in a sample by photoacoustic spectroscopy pie is determined.

Bei dieser Ausführungsform wird eine Probe mit einem Gehalt an der zu bestimmenden Substanz mit einem Antigen oder einem Anti­ körper, die in der Lage sind, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen und die an einer festen Phase immobilisiert worden sind, umgesetzt, wobei man einen an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper-Kompex erhält. Anschließend wird ein vorher mit feinen Teilchen mar­ kiertes Antigen oder Antikörper zugesetzt, wodurch eine weitere Antigen-Antikörper-Reaktion abläuft. Sodann wird das mit den feinen Teilchen markierte, nicht-umgesetzte Antigen oder Anti­ körper aus dem Reaktionssystem entfernt (B/F-Trennung). Hier­ auf wird der erhaltene, mit feinen Teilchen markierte und an der festen Phase immobilisierte Antigen-Antikörper-Komplex von der festen Phase unter Verwendung einer Freisetzungslösung frei­ gesetzt. Die auf diese Weise erhaltene Freisetzungslösung mit einem Gehalt an dem Komplex wird in eine photoakustische Zelle gebracht und mit einfallendem Licht bestrahlt. Eine in der Pro­ be hervorgerufene Druckänderung (ein photoakustisches Signal) wird mittels eines piezoelektrischen keramischen Materials in ein elektrisches Signal (Erzeugung von Spannung) umgewandelt. Aufgrund einer vorher aufgestellten Eichkurve, bei der bekann­ te Konzentrationen der zu bestimmenden Substanz eingesetzt und die Beziehung zwischen der Konzentration der Substanz und dem photoakustischen Signal zugrunde gelegt wird, wird der Anti­ gen-Antikörper-Komplex quantitativ durch photoakustische Spektroskopie gemessen, was eine quantitative Bestimmung der Substanz ermöglicht. Da die Menge des von der festen Phase freigesetzten, mit den feinen Teilchen markierten Antigen- Antikörper-Komplexes je nach Konzentration der zu bestimmenden Substanz in der Probe variiert, entspricht die Intensität des photoakustischen Signals der Konzentration der zu bestimmenden Substanz in der Probe.In this embodiment, a sample containing the substance to be determined with an antigen or an anti bodies that are able to bind specifically to the body substance to be determined and that on a solid Phase have been immobilized, implemented, one antigen-antibody complex immobilized on the solid phase receives. Then a mar with fine particles added antigen or antibody, causing another Antigen-antibody reaction is in progress. Then it will be with the fine particles of labeled, unreacted antigen or anti body removed from the reaction system (B / F separation). Here is the obtained, marked with fine particles and on the solid phase immobilized antigen-antibody complex of the solid phase using a release solution set. The release solution obtained in this way with containing the complex is placed in a photoacoustic cell brought and irradiated with incident light. One in the pro be induced pressure change (a photoacoustic signal) is made using a piezoelectric ceramic material converted an electrical signal (generation of voltage). Based on a previously established calibration curve where te concentrations of the substance to be determined and the relationship between the concentration of the substance and the The photoacoustic signal is used as the anti  gene-antibody complex quantitatively by photoacoustic Spectroscopy measured what a quantitative determination of the Substance enables. Because the amount of from the solid phase released antigen labeled with the fine particles Antibody complex depending on the concentration of the to be determined Substance in the sample varies, corresponding to the intensity of the photoacoustic signal of the concentration of the to be determined Substance in the sample.

Gemäß dieser Ausführungsform lassen sich geringe Mengen von Be­ standteilen, die bisher in der Praxis nur durch RIA meßbar wa­ ren, quantitativ messen und zwar rascher und mit höherer Empfindlichkeit als mit RIA.According to this embodiment, small amounts of Be components that were previously only measurable by RIA in practice measure quantitatively, faster and with higher Sensitivity than with RIA.

Als feine Teilchen eignen sich erfindungsgemäß Teilchen mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,01 bis 100 µm, wobei inerte feine Teilchen mit einem durchschnittli­ chen Teilchendurchmesser von 0,1 bis 10 µm besonders bevorzugt sind. Wird das Antigen oder der Antikörper mit derartigen feinen Teilchen markiert, so steigert dies den Wirkungsgrad der Reaktion erheblich, was zu einem raschen Verlauf der Be­ stimmung führt. Um eine zu bestimmende Probe durch das erfin­ dungsgemäße Verfahren unter hoher Empfindlichkeit rasch quan­ titativ zu ermitteln, wird vorzugsweise ein mit inerten feinen Teilchen, wie Latex-Teilchen, markiertes Antigen oder Antikörper in Kontakt mit der die zu bestimmende Substanz in hohen Konzen­ trationen enthaltenden Probe gebracht. Eine Antigen-Antikörper- Reaktion wurde unter Verwendung von feinen Teilchen mit jeweils unterschiedlichen Teilchendurchmessern zur quantitativen Be­ stimmung von humanem IgG verwendet. Dabei wurde festgestellt, daß bei Einsatz von feinen Teilchen mit einem durchschnittli­ chen Teilchendurchmesser von 100 µm oder weniger humanes IgG quan­ titativ innerhalb einer Reaktionszeit von 1 Stunde bestimmt werden konnte. Ferner wurde festgestellt, daß insbesondere bei Verwendung von inerten feinen Teilchen mit einem durchschnitt­ lichen Teilchendurchmesser von 10 µm oder weniger humanes IgG quantitativ innerhalb einer Reaktionszeit von 15 Minuten be­ stimmt werden konnte. Da bei der Analyse einer biologischen Probe eine annehmbare Reaktionszeit im allgemeinen höchstens 1 Stunde und vorzugsweise höchstens 15 Minuten betragen soll, ist die Verwendung von inerten feinen Teilchen mit einem durch­ schnittlichen Teilchendurchmesser von 10 µm oder weniger be­ vorzugt. Es wurde ein Vergleich unter Berücksichtigung der Nachweisempfindlichkeit und des Rauschabstands durchgeführt, wobei festgestellt wurde, daß feine Teilchen mit einem durch­ schnittlichen Teilchendurchmesser von 0,01 µm oder mehr und vorzugsweise von 0,1 µm oder mehr geeignet sind. Aus den vorste­ henden Ergebnissen ergibt sich, daß inerte feine Teilchen mit einem Teilchendurchmesser von 100 µm oder weniger und insbe­ sondere von 0,1 bis 10 µm geeignet sind.According to the invention, particles with are suitable as fine particles an average particle diameter of 0.01 to 100 µm, inert fine particles with an average Chen particle diameter of 0.1 to 10 microns is particularly preferred are. If the antigen or the antibody with such marked fine particles, this increases the efficiency the reaction significantly, which leads to a rapid course of loading mood leads. In order to determine a sample to be determined by the inventor method according to the invention with high sensitivity quickly quan to determine titatively, one with inert fine is preferably Particles such as latex particles, labeled antigen or antibodies in contact with the substance to be determined in high concentrations trations containing sample brought. An antigen-antibody Reaction was carried out using fine particles with each different particle diameters for quantitative loading mood of human IgG used. It was found that when using fine particles with an average chen particle diameter of 100 microns or less human IgG quan determined titatively within a reaction time of 1 hour could be. It was also found that in particular Use of inert fine particles with an average particle diameter of 10 µm or less human IgG  be quantitative within a reaction time of 15 minutes could be voted. Because when analyzing a biological Generally, try an acceptable response time at most Should be 1 hour and preferably at most 15 minutes, is the use of inert fine particles with a through average particle diameter of 10 µm or less prefers. A comparison was made taking into account the Detection sensitivity and signal-to-noise ratio carried out, it was found that fine particles with a through average particle diameter of 0.01 µm or more and preferably 0.1 µm or more are suitable. From the previous one Results show that inert fine particles with a particle diameter of 100 µm or less and esp from 0.1 to 10 µm are particularly suitable.

Als inerte feine Teilchen werden vorzugsweise feine Teilchen aus polymeren organischen Substanzen verwendet, die in einem flüssigen Medium, das im allgemeinen für den Test einer Kör­ perflüssigkeit verwendet wird, im wesentlichen unlöslich sind und die die vorstehend erwähnten durchschnittlichen Teilchen­ durchmesser aufweisen. Zu derartigen Teilchen gehören bei­ spielsweise feine Latex-Teilchen aus organischen Polymeren, wie Polystyrol und dgl.; Zellen; feine Teilchen von anorgani­ schen Oxiden, wie Siliciumdioxid, Siliciumdioxid-Aluminiumoxid, Aluminiumoxid und dgl.; mineralische Pulver; und feine Metall­ teilchen.Fine particles are preferably used as inert fine particles from polymeric organic substances used in one liquid medium, which is generally used for testing a body perfluid is used, are essentially insoluble and the average particles mentioned above have diameter. Such particles include for example fine latex particles made of organic polymers, such as polystyrene and the like; Cells; fine particles of inorganic oxides, such as silicon dioxide, silicon dioxide-aluminum oxide, Alumina and the like; mineral powder; and fine metal particles.

Zur Freisetzung des mit den feinen Teilchen markierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper-Komplexes von der festen Phase wird eine wäßrige Natriumhydroxidlösung als Freisetzungslösung verwendet. Es können auch verschiedene andere Freisetzungslösungen eingesetzt werden, beispielsweise wäßrige Lösungen mit einem Gehalt an caotropic Ionen, wie eine wäßrige Natriumthiocyanatlösung und dgl.To release the marked with the fine particles and on the solid phase immobilized antigen-antibody complex from the solid phase becomes an aqueous sodium hydroxide solution used as a release solution. It can also be different other release solutions are used, for example aqueous solutions containing caotropic ions, such as an aqueous sodium thiocyanate solution and the like.

Das Verfahren zur Analyse der den Antigen-Antikörper-Komplex enthaltenden Freisetzungslösung durch photoakustische Spektros­ kopie ist das gleiche wie bei der ersten Ausführungsform. Die vorstehend beschriebene zweite Ausführungsform kann im wesent­ lichen mit der gleichen Vorrichtung wie bei der ersten Ausfüh­ rungsform durchgeführt werden, mit der Abänderung, daß eine Einrichtung zum Einspritzen des mit den feinen Teilchen markier­ ten Antigens oder Antikörpers und eine Einrichtung zum Ein­ spritzen der Freisetzungslösung vorgesehen sind.The method of analysis of the antigen-antibody complex  containing release solution by photoacoustic Spectros copy is the same as in the first embodiment. The The second embodiment described above can essentially with the same device as in the first version tion form, with the modification that a Device for injecting the marker with the fine particles ten antigen or antibody and a device for on inject the release solution are provided.

Nachstehend wird ein spezielles Beispiel für diese Ausführungs­ form angegeben.The following is a specific example of this embodiment form specified.

10 ml 0,1 m Glycinpuffer (pH-Wert 6,5) mit einem Gehalt an anti-Human-α-fötoprotein (AFP)-Antikörper wird mit 1 ml Poly­ styrol-Latex-Teilchen mit einem durchschnittlichen Teilchen­ durchmesser von 0,22 µm (Feststoffkonzentration: 10 Gew.-%) versetzt. Das erhaltene Gemisch wird 3 Stunden bei Raumtempera­ tur gerührt und anschließend unter Kühlung auf 2 bis 4°C 40 Mi­ nuten bei 12 000 U/min zentrifugiert. Der erhaltene Nieder­ schlag wird in 10 millimolarem Phosphatpuffer (pH-Wert 6,5) mit einem Gehalt an 0,5% Rinderserumalbumin, 0,1 m NaCl und 2 millimolar MgCl2 suspendiert, wodurch man mit Latexteilchen markierten anti-AFP-Antikörper mit einer Konzentration der Latexteilchen von 1 Gew.-% erhält.10 ml of 0.1 m glycine buffer (pH 6.5) containing anti-human α- fetoprotein (AFP) antibody is mixed with 1 ml of polystyrene latex particles with an average particle diameter of 0.22 µm (solid concentration: 10% by weight). The mixture obtained is stirred for 3 hours at room temperature and then centrifuged under cooling at 2 to 4 ° C. for 40 minutes at 12,000 rpm. The precipitate obtained is suspended in 10 millimolar phosphate buffer (pH 6.5) containing 0.5% bovine serum albumin, 0.1 M NaCl and 2 millimolar MgCl 2 , whereby anti-AFP antibodies labeled with latex particles are used a concentration of the latex particles of 1 wt .-%.

Auf den Boden eines Polystyrolröhrchens werden 20 ml anti-AFP- Antikörper gegeben und zur Immobilisierung 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Sodann werden 0,5 ml 0,5% Rinderserumalbumin zuge­ setzt. Nach einer Standzeit bei 37°C von 30 Minuten wird das Medium im Röhrchen durch Dekantieren entfernt. Die Innenwand des Röhrchens wird mit 1 ml 10 millimolarem Phosphatpuffer (pH-Wert 6,5) mit einem Gehalt an 0,5% Rinderserumalbumin ge­ waschen.20 ml of anti-AFP are placed on the bottom of a polystyrene tube. Antibodies and immobilized at 37 ° C for 1 hour incubated. Then 0.5 ml of 0.5% bovine serum albumin are added puts. After standing at 37 ° C for 30 minutes, it will Medium in the tube removed by decanting. The inner wall the tube with 1 ml of 10 millimolar phosphate buffer (pH 6.5) containing 0.5% bovine serum albumin to wash.

In das auf diese Weise hergestellte Röhrchen werden 100 µl einer Probenlösung gegeben. Die Umsetzung wird 10 Minuten bei 37°C durchgeführt. Sodann werden 100 µl des mit den Latexteil­ chen markierten anti-Human-AFP-Antikörpers zugesetzt. Die Um­ setzung wird 10 Minuten bei 37°C durchgeführt. Hierauf wird die Innenwand des Röhrchens 2mal mit 1 ml des vorerwähnten Phosphatpuffers gewaschen, um den mit den Latexteilchen mar­ kierten, nicht-umgesetzten anti-Human-AFP-Antikörper zu ent­ fernen. Nach dem Waschen werden in das Röhrchen 300 µl 4 n NaOH gegeben. Die Umsetzung wird 5 Minuten bei 37°C durchge­ führt, um den mit Latexteilchen markierten Antigen-Antikörper- Komplex von der festen Phase des Röhrchens freizusetzen.100 µl are added to the tube produced in this way given a sample solution. The implementation will take 10 minutes  37 ° C carried out. Then 100 ul with the latex part Chen labeled anti-human AFP antibody added. The order Settlement is carried out at 37 ° C for 10 minutes. This will the inner wall of the tube twice with 1 ml of the aforementioned Phosphate buffers washed to mar with the latex particles ent, unreacted anti-human AFP antibody ent distant. After washing, 300 µl of 4 n Given NaOH. The reaction is carried out at 37 ° C for 5 minutes leads to the latex particle-labeled antigen-antibody Release complex from the solid phase of the tube.

Die Freisetzungslösung wird in eine photoakustische Durchfluß­ zelle eingeführt, und ein photoakustisches Signal wird gemes­ sen. Als Lichtquelle wird ein Argonionenlaser verwendet. Eine zur Bestimmung von Human-AFP aufgestellte Eichkurve ist in Fig. 3 dargestellt. Aus Fig. 3 ist ersichtlich, daß Human-AFP quantitativ in einem niedrigen Konzentrationsbereich von 10 ng/ml oder darunter gemessen werden kann, während dies nach einem herkömmlichen Verfahren nicht möglich ist.The release solution is introduced into a photoacoustic flow cell, and a photoacoustic signal is measured. An argon ion laser is used as the light source. A calibration curve set up to determine human AFP is shown in FIG. 3. From Fig. 3 it can be seen that human AFP can be measured quantitatively in a low concentration range of 10 ng / ml or below, whereas this is not possible by a conventional method.

Im vorliegenden Beispiel ist aufgrund der Verwendung einer photoakustischen Durchflußzelle eine kontinuierliche photo­ metrische Messung möglich, so daß der Durchsatz erhöht werden kann.In the present example, due to the use of a Photoacoustic flow cell a continuous photo metric measurement possible, so that the throughput can be increased can.

Bei der dritten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Immunoassay-Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:In the third preferred embodiment of the present Invention is an immunoassay method that includes the following steps:

  • - Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe mit einem enzymmarkierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifi­ sche Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;- Implementing a substance to be determined in a sample with an enzyme-labeled antigen or antibody, the Antigen or the antibody is capable of a specific enter into a binding relationship with the substance to be determined;
  • - Umsetzen des enzymmarkierten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einem an einer festen Phasen immobilisierten Antigen oder Antikörper, wobei dieses Antigen oder dieser Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu be­ stimmenden Substanz einzugehen; - Implementation of the enzyme-labeled antigen-antibody complex with an antigen immobilized on a solid phase or antibody, this antigen or antibody is able to be a specific bond with the enter into tuning substance;  
  • - Umsetzen eines Substrats mit dem auf diese Weise herge­ stellten enzymmarkierten und an der festen Phase immobili­ sierten Antigen-Antikörper-Komplexes; und- Implementing a substrate with the Herge in this way provided enzyme-labeled and immobilized on the solid phase based antigen-antibody complex; and
  • - Bestrahlen der erhaltenen Reaktionslösung mit intermittieren­ dem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.- Intermittent irradiate the reaction solution obtained the light, measuring the acoustic wave generated and Determine the amount of the substance to be determined in the Sample from the acoustic wave.

Dieses Immunoassay-Verfahren entspricht einer Modifikation der ersten Ausführungsform, wobei aber die Reihenfolge der Reak­ tionen verändert ist.This immunoassay procedure corresponds to a modification of the first embodiment, but the order of the reak tion is changed.

Gemäß diesem Verfahren wird eine zu bestimmende Substanz in einer Probe vorher mit einem Antigen oder einem Antikörper, der dazu in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen und mit einem Enzym markiert ist, umgesetzt, um einen mit dem Enzym markierten Antigen- Antikörper-Komplex zu erhalten. Anschließend wird der Komplex zu einem Antigen oder einem Antikörper, die dazu in der Lage sind, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Sub­ stanz einzugehen und an einer festen Phase, z.B. an der Innen­ wand eines Reaktors, an unlöslichen Kügelchen oder dgl., immobilisiert worden sind, zugesetzt, um eine weitere Antigen- Antikörper-Reaktion zwischen der zu bestimmenden Substanz im Komplex mit dem an der festen Phase immobilisierten Antigen oder Antikörper durchzuführen, wodurch man einen mit dem Enzym markierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen- Antikörper-Komplex erhält. Das nicht-umgesetzte Reagens wird entfernt (B/F-Trennung) wonach ein Substrat zugesetzt und die Reaktionslösung durch photoakustische Spektroskopie auf die gleiche Weise wie bei der ersten Ausführungsform analysiert wird.According to this method, a substance to be determined is in a sample beforehand with an antigen or an antibody, who is able to establish a specific bond with the determining substance and labeled with an enzyme is implemented to produce an antigen labeled with the enzyme Obtain antibody complex. Then the complex to an antigen or an antibody capable of doing so are a specific bond with the sub to be determined punching and on a fixed phase, e.g. on the inside wall of a reactor, on insoluble beads or the like, have been immobilized to add another antigen Antibody reaction between the substance to be determined in the Complex with the antigen immobilized on the solid phase or perform antibodies, making one with the enzyme labeled and immobilized on the solid phase Obtains antibody complex. The unreacted reagent will removed (B / F separation) after which a substrate is added and the Reaction solution by photoacoustic spectroscopy on the analyzed in the same way as in the first embodiment becomes.

Beim Enzym, der festen Phase und dgl., die bei diesem Immuno­ assay-Verfahren verwendet werden, handelt es sich um die glei­ chen Produkte wie bei der ersten Ausführungsform. Es wird die gleiche Vorrichtung, wie für die erste Ausführungsform ver­ wendet, mit der Abänderung, daß eine Einrichtung vorgesehen ist, um vorher die in einer Probe zu bestimmende Substanz mit dem enzymmarkierten Antigen oder Antikörper, die dazu in der Lage sind, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen, umzusetzen.In the enzyme, the solid phase and the like, which in this immuno assay method used, it is the same Chen products as in the first embodiment. It will be the  same device as ver for the first embodiment applies, with the modification that a facility is provided is to use the substance to be determined in a sample beforehand the enzyme-labeled antigen or antibody, which is in the Are able to establish a specific link with the one to be determined To take substance, to implement.

Nachstehend folgt ein Beispiel für diese Ausführungsform.An example of this embodiment follows below.

0,1 ml einer Probe oder eines Standardserums mit einer defi­ nierten AFP-Menge werden mit 0,1 ml anti-AFP-Antikörper, der mit alkalischer Phosphatase markiert ist, gegeben. Das erhalte­ ne Gemisch wird 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wird 1 ml 0,9%NaCl zugesetzt und sodann durch Absaugen ent­ fernt. Dieser Waschvorgang wird dreimal wiederholt. Nach Durchführung der wiederholten Waschung wird 0,1 g p-Nitrophe­ nylphosphat als Substrat in 100 ml 0,05 m Carbonatpuffer (pH-Wert 9,8) mit einem Gehalt an 1 millimolar MgCl2 gelöst. 1 ml der Substratlösung werden in den Behälter gegeben und 15 Minuten bei 25°C inkubiert. Die Umsetzung wird durch Zugabe von 0,5 ml 0,2 n NaOH beendet. Die das enzymatische Reaktions­ produkt enthaltende Reaktionslösung wird in eine photoakusti­ sche Zelle gesaugt und mittels eines photoakustischen Spektro­ meters gemessen.0.1 ml of a sample or a standard serum with a defined AFP amount are given with 0.1 ml anti-AFP antibody, which is labeled with alkaline phosphatase. The mixture obtained is incubated at 37 ° C. for 15 minutes. Then 1 ml 0.9% NaCl is added and then removed by suction. This washing process is repeated three times. After the repeated washing, 0.1 g of p-nitrophenyl phosphate as the substrate is dissolved in 100 ml of 0.05 m carbonate buffer (pH 9.8) containing 1 millimolar MgCl 2 . 1 ml of the substrate solution is added to the container and incubated for 15 minutes at 25 ° C. The reaction is terminated by adding 0.5 ml of 0.2N NaOH. The reaction solution containing the enzymatic reaction product is sucked into a photoacoustic cell and measured by means of a photoacoustic spectrometer.

In Fig. 4 ist eine Eichkurve für Standardseren mit einem Ge­ halt an definierten AFP-Mengen angegeben.In FIG. 4 is a calibration curve for standard sera with a Ge is dependent on defined AFP amounts specified.

Bei der vierten bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um ein Immunoassay-Verfahren, das folgende Stufen umfaßt:The fourth preferred embodiment is an immunoassay method comprising the following steps:

  • - Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe in einem mit feinen Teilchen markierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper dazu in der Lage sind, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;- Implementing a substance to be determined in a sample in an antigen or antibody labeled with fine particles, the antigen or antibody being able to a specific bond with the substance to be determined enter into;
  • - Umsetzen des mit den feinen Teilchen markierten Antigen- Antikörper-Komplexes mit einem an einer festen Phase immobi­ lisierten Antigen oder Antikörper, wobei dieses Antigen oder dieser Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;- reacting the antigen marked with the fine particles -  Antibody complex with an immobi on a solid phase lized antigen or antibody, this antigen or this antibody is capable of specific binding to deal with the substance to be determined;
  • - Behandeln des auf diese Weise erhaltenen, mit feinen Teil­ chen markierten und an der festen Phase immobilisierten Anti­ gen-Antikörper-Komplexes mit einer Freisetzungslösung, um den Antigen-Antikörper-Komplex von der festen Phase freizu­ setzen; und- Treat the part obtained in this way with a fine part marked anti-immobilized on the solid phase gene-antibody complex with a release solution to to release the antigen-antibody complex from the solid phase put; and
  • - Bestrahlen der auf diese Weise erhaltenen Freisetzungslösung, die den Antigen-Antikörper-Komplex enthält, mit intermittie­ rendem Licht, Messen der dadurch erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.Irradiation of the release solution obtained in this way, which contains the antigen-antibody complex, with intermittent light, measuring the acoustic wave generated thereby and determining the amount of the substance to be determined in the Sample from the acoustic wave.

Dieses Immunoassay-Verfahren stellt eine Modifikation der drit­ ten Ausführungsform dar, wobei als Markierungsmittel feine Teilchen anstelle des beim letztgenannten Verfahren verwende­ ten Enzyms eingesetzt werden. Ferner stellt diese Ausführungs­ form eine Modifikation der zweiten Ausführungsform dar, wobei die Reihenfolge der Reaktionen verändert ist.This immunoassay procedure represents a modification of the third th embodiment, fine as a marker Use particles instead of that in the latter method ten enzyme can be used. This also provides execution form a modification of the second embodiment, wherein the order of the reactions is changed.

Somit handelt es sich bei den feinen Teilchen, der Freisetzungs­ lösung und dgl., die bei der vorliegenden Ausführungsform ver­ wendet werden, um die gleichen Produkte wie bei der zweiten Ausführungsform. Es kann die gleiche Vorrichtung wie bei der ersten Ausführungsform verwendet werden, mit der Abänderung, daß eine Einrichtung zum Einspritzen des mit den feinen Teil­ chen markierten Antigens oder Antikörpers anstelle der Einrich­ tung zum Einspritzen des mit einem Enzym markierten Antigens oder Antikörpers vorgesehen ist und daß eine Einrichtung zum Einspritzen der Freisetzungslösung anstelle der Einrichtung zum Einspritzen des Substrats vorhanden ist.So it is the fine particles, the release solution and the like. ver in the present embodiment be applied to the same products as the second Embodiment. It can be the same device as the first embodiment can be used with the modification, that a device for injecting the with the fine part Chen labeled antigen or antibody instead of the device device for injecting the antigen labeled with an enzyme or antibody is provided and that a device for Inject the release solution instead of the device for injecting the substrate.

Nachstehend wird diese Ausführungsform anhand eines Beispiels näher erläutert. Hereinafter, this embodiment will be exemplified explained in more detail.  

0,1 ml einer Probe oder eines Standardserums mit einem Ge­ halt an einer definierten AFP-Menge werden mit 0,1 ml mit La­ texteilchen markiertem anti-AFP-Antikörper, der gemäß dem Ver­ fahren der zweiten Ausführungsform hergestellt worden ist, ver­ setzt. Das erhaltene Gemisch wird 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wird die Reaktionslösung in ein Röhrchen mit einem Gehalt an anti-AFP-Antikörper, der auf die gleiche Weise wie bei der zweiten Ausführungsform an der Innenwand immobili­ siert ist (ein Behälter mit einem Gehalt an daran immobilisier­ tem anti-AFP-Antikörper), gebracht. Das erhaltene Gemisch wird 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wird die Innenwand des Röhrchens dreimal mit 1 ml 10 millimolarem Phosphatpuffer (pH-Wert 6,5) mit einem Gehalt an 0,5 % Rinderserumalbumin, 0,1 m NaCl und 2 millimolar MgCl2 gewaschen, um nicht-umgesetz­ ten, mit Latex-Teilchen markierten anti-AFP-Antikörper zu ent­ fernen. In das gewaschene Röhrchen werden 0,3 ml 4 n NaOH ge­ geben, und 5 Minuten bei 37°C inkubiert, um einen mit Latex- Teilchen markierten Antigen-Antikörper-Komplex freizusetzen. Die Freisetzungslösung wird in eine photoakustische Zelle ge­ saugt und der Messung mittels eines photoakustischen Spektro­ meters unterzogen.0.1 ml of a sample or a standard serum containing a defined amount of AFP is mixed with 0.1 ml of anti-AFP antibody labeled with latex particles, which has been prepared according to the method of the second embodiment. The resulting mixture is incubated at 37 ° C for 20 minutes. The reaction solution is then placed in a tube containing anti-AFP antibody immobilized on the inner wall in the same manner as in the second embodiment (a container containing anti-AFP antibody immobilized thereon), brought. The resulting mixture is incubated at 37 ° C for 20 minutes. The inner wall of the tube is then washed three times with 1 ml of 10 millimolar phosphate buffer (pH 6.5) containing 0.5% bovine serum albumin, 0.1 M NaCl and 2 millimolar MgCl 2 to prevent unreacted To remove latex particles labeled anti-AFP antibody. 0.3 ml of 4N NaOH is added to the washed tube and incubated for 5 minutes at 37 ° C to release an antigen-antibody complex labeled with latex particles. The release solution is sucked into a photoacoustic cell and subjected to the measurement by means of a photoacoustic spectrometer.

Eine mit dem Standardserum gebildete Eichkurve mit einem Ge­ halt an einer definierten AFP-Menge ist in Fig. 5 dargestellt.A calibration curve formed with the standard serum and containing a defined amount of AFP is shown in FIG. 5.

Bei der fünften bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um ein Immunoassay-Verfahren, das folgende Stufen umfaßt:In the fifth preferred embodiment of the invention is an immunoassay method, the following Levels include:

  • - kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestimmende Probe, die mit einem Enzym markiert ist, mit einem an einer festen Phase immobilisierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spe­ zifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;- Competitive implementation of a substance to be determined in a sample and the same substance as the one to be determined Sample labeled with an enzyme with one on one solid phase immobilized antigen or antibody, where the antigen or the antibody is capable of a specific enter into a binding relationship with the substance to be determined;
  • - Umsetzen eines Substrats mit dem erhaltenen, enzymmarkierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper- Komplex; und- Reacting a substrate with the enzyme-labeled one obtained  and antigen-antibody immobilized on the solid phase Complex; and
  • - Bestrahlen der erhaltenen Reaktionslösung mit intermittie­ rendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.- Irradiate the reaction solution obtained with intermittent light, measuring the acoustic wave generated and determining the amount of the substance to be determined in the Sample from the acoustic wave.

Bei diesem Immunoassay-Verfahren handelt es sich um einem Enzym-Immunoassay, bei dem ein Enzym als Markierungsmittel verwendet wird, eine kompetitive Reaktion gemäß einem hetero­ genen Verfahren unter Verwendung einer festen Phase durchge­ führt wird und die Menge der zu bestimmenden Substanz durch photoakustische Spektroskopie ermittelt wird.This immunoassay procedure is one Enzyme immunoassay using an enzyme as a labeling agent is used a competitive reaction according to a hetero gene method using a solid phase is carried out and the amount of the substance to be determined photoacoustic spectroscopy is determined.

Bei diesem Immunoassay-Verfahren werden eine zu bestimmende Substanz in einer Probe und die gleiche Substanz wie die zu bestimmende Substanz, die mit einem Enzym markiert ist, kompetitiv mit einem Antigen oder Antikörper, die dazu in der Lage sind, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen, und die an einer festen Phase, z.B. an der Innenwand eines Reaktors, immobilisiert sind, umgesetzt. Bei dieser Reaktion nimmt mit steigender Menge der zu bestim­ menden Substanz in der Probe die Menge der enzymmarkierten Substanz, die mit dem an der festen Phase immobilisierten Anti­ gen oder Antikörper reagiert, ab. Nach der kompetitiven Reak­ tion wird das nicht-umgesetzte Reagens entfernt (B/F-Trennung), und ein Substrat wird zum erhaltenen, mit dem Enzym markierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper- Komplex gegeben. Anschließend wird die Reaktionslösung durch photoakustische Spektroskopie analysiert, wobei die Menge der zu bestimmenden Substanz ermittelt wird.In this immunoassay method, one to be determined Substance in a sample and the same substance as that of determining substance that is labeled with an enzyme, competitively with an antigen or antibody that does so in the Are able to establish a specific link with the one to be determined Substance and which is based on a solid phase, e.g. at the inner wall of a reactor, are immobilized, implemented. In this reaction, the amount increases as the amount increases the amount of enzyme-labeled substance in the sample Substance with the anti. Immobilized on the solid phase gene or antibody reacts. After the competitive reak tion, the unreacted reagent is removed (B / F separation), and a substrate becomes the obtained one labeled with the enzyme and antigen-antibody immobilized on the solid phase Given complex. The reaction solution is then passed through photoacoustic spectroscopy analyzed, the amount of substance to be determined is determined.

Bei der festen Phase, dem Enzym und dgl., die bei dieser Aus­ führungsform verwendet werden, handelt es sich um die gleichen Produkte wie bei der ersten Ausführungsform. Die für diese Aus­ führungsform verwendete Vorrichtung entspricht im wesentlichen der bei der ersten Ausführungsform verwendeten Vorrichtung, mit der Abänderung, daß sie eine Einrichtung zum Einspritzen der gleichen Substanz wie die in der Probe zu bestimmende Substanz, die mit einem Enzym markiert ist, aufweist.In the solid phase, the enzyme and the like are used, they are the same Products as in the first embodiment. The one for this out device used essentially corresponds  the device used in the first embodiment, with the change that they are a device for injecting the same substance as the substance to be determined in the sample, which is labeled with an enzyme.

Nachstehend wird diese Ausführungsform anhand eines Beispiels näher erläutert.Hereinafter, this embodiment will be exemplified explained in more detail.

0,1 ml einer Probe oder eines Standardserums mit einem Gehalt an thyroidstimulierendem Hormon (TSH), 0,1 ml Phosphatpuffer mit einem Gehalt an 0,5% Rinderserumalbumin und 0,1 ml mit alkalischer Phosphatase markiertes TSH werden in einen Behäl­ ter gegeben, an dessen Innenwand anti-TSH-Antikörper immobili­ siert ist, und 60 Minuten bei 4°C inkubiert. Nach beendeter Umsetzung wird das nicht-umgesetzte, mit alkalischer Phosphata­ se markierte TSH durch dreimaliges Waschen mit 1 ml des vor­ stehenden Phosphatpuffers entfernt. Nach dem Waschen werden 1,5 ml einer Lösung von Dinatriumphenylphosphat und 4-Amino­ antipyrin als Substrat-Puffer-Lösung in den Behälter gegeben und 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Sodann werden 1,5 ml des farbbildenden Reagens Kaliumhexacyanoferrat(III) zugesetzt. Nach 10 Minuten wird die Reaktionslösung in eine photoakusti­ sche Zelle gesaugt und einer Messung mittels eines photoakusti­ schen Spektrometers unterworfen.0.1 ml of a sample or standard serum containing on thyroid stimulating hormone (TSH), 0.1 ml phosphate buffer containing 0.5% bovine serum albumin and 0.1 ml Alkaline phosphatase labeled TSH are placed in a container ter given on the inner wall of anti-TSH antibody immobili is, and incubated at 4 ° C for 60 minutes. After finished Implementation is the unreacted, with alkaline phosphates se marked TSH by washing three times with 1 ml of the standing phosphate buffer removed. After washing 1.5 ml of a solution of disodium phenyl phosphate and 4-amino antipyrine was added to the container as a substrate buffer solution and incubated at 37 ° C for 45 minutes. Then 1.5 ml of the color-forming reagent potassium hexacyanoferrate (III) added. After 10 minutes the reaction solution is in a photoacoustic cal cell sucked and a measurement by means of a photoacoustic subject to spectrometers.

Eine mit dem TSH enthaltenden Standardserum erhaltene Eichkurve ist in Fig. 6 dargestellt.A calibration curve obtained with the standard serum containing TSH is shown in FIG. 6.

Bei der sechsten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um ein Immunoassay-Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:In the sixth preferred embodiment of the invention is an immunoassay method, the following Steps include:

  • - kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestimmende Substanz, die mit feinen Teilchen markiert ist, mit einem an einer festen Phase immobilisierten Antigen oder Anti­ körper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Sub­ stanz einzugehen;- Competitive implementation of a substance to be determined in a sample and the same substance as the one to be determined Substance marked with fine particles with a antigen or anti immobilized on a solid phase body where the antigen or antibody is capable of  is a specific bond with the sub to be determined to punch;
  • - Behandeln des erhaltenen, mit feinen Teilchen markierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper- Komplexes mit einer Freisetzungslösung, um den Antigen- Antikörper-Komplex aus der festen Phase freizusetzen; und- Treating the obtained, marked with fine particles and antigen-antibody immobilized on the solid phase Complex with a release solution to remove the antigen Release antibody complex from the solid phase; and
  • - Bestrahlen der auf diese Weise erhaltenen, den Antigen- Antikörper-Komplex enthaltenden Freisetzungslösung mit intermittierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akusti­ schen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.Irradiation of the antigen Release solution containing antibody complex with intermittent light, measuring the generated acousti wave and determining the amount of to be determined Substance in the sample from the acoustic wave.

Dieses Immunoassay-Verfahren entspricht einer Modifikation des Verfahrens der fünften Ausführungsform, wobei der Test unter Verwendung von feinen Teilchen als Markierungsmittel anstelle des im letztgenannten Verfahren verwendeten Enzyms durchgeführt wird.This immunoassay procedure corresponds to a modification the method of the fifth embodiment, wherein the test using fine particles as a marker instead of the enzyme used in the latter method is carried out.

Bei den feinen Teilchen, der Freisetzungslösung und dgl., die in der vorliegenden Ausführungsform verwendet werden, handelt es sich um die gleichen Produkte wie bei der zweiten Ausfüh­ rungsform. Die bei dieser Ausführungsform verwendete Vorrich­ tung entspricht der Vorrichtung der fünften Ausführungsform, mit der Abänderung, daß sie eine Einrichtung zum Einspritzen der gleichen Substanz wie die zu bestimmende Substanz, die mit feinen Teilchen markiert ist, und eine Einrichtung zum Ein­ spritzen der Freisetzungslösung aufweist.In the fine particles, the release solution, and the like, the used in the present embodiment the same products as the second version form. The device used in this embodiment device corresponds to the device of the fifth embodiment, with the modification that it is an injection device the same substance as the substance to be determined, with fine particles is marked, and a device for one inject the release solution.

Die vorliegende Ausführungsform wird durch das folgende Bei­ spiel näher erläutert.The present embodiment is illustrated by the following game explained in more detail.

In einen Behälter, der an der Innenwand immobilisierten anti- TSH-Antikörper enthält, werden 100 µl Probe- oder Standard­ serum mit einem Gehalt an TSH und 100 µl mit Latex-Teilchen markierter anti-TSH-Antikörper gegeben. Sodann wird 60 Minuten bei 4°C inkubiert, um die Antigen-Antikörper-Reaktionen in kompetitiver Weise durchzuführen. Sodann werden die nicht-um­ gesetzten, mit Latexteilchen markierten anti-TSH-Antikörper durch dreimaliges Waschen mit 1 ml Phosphatpuffer mit einem Gehalt an 0,5% Rinderserumalbumin entfernt. Nach dem Waschen wird der mit den Latex-Teilchen markierte Antigen-Antikörper- Komplex unter Verwendung von 0,3 ml 4 n NaOH freigesetzt. Die Freisetzungslösung wird in eine photoakustische Zelle ge­ saugt und der Messung mit einem photoakustischen Spektrometer unterworfen.In a container that is immobilized on the inner wall Contains TSH antibody, 100 µl sample or standard serum containing TSH and 100 µl with latex particles labeled anti-TSH antibody given. Then it will be 60 minutes incubated at 4 ° C to monitor the antigen-antibody reactions  to perform competitively. Then they won't be around set anti-TSH antibody labeled with latex particles by washing three times with 1 ml of phosphate buffer with a Removed 0.5% bovine serum albumin. After washing the antigen-antibody labeled with the latex particles Complex released using 0.3 ml of 4N NaOH. The Release solution is placed in a photoacoustic cell sucks and the measurement with a photoacoustic spectrometer subject.

Eine mit dem Standardserum mit einem Gehalt an TSH erhaltene Eichkurve ist in Fig. 7 dargestellt.A calibration curve obtained with the standard serum containing TSH is shown in FIG. 7.

Bei der siebten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um ein Immunoassay-Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:In the seventh preferred embodiment of the invention is an immunoassay method, the following Steps include:

  • - kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestimmende Substanz, die an einer festen Phase immobilisiert ist, mit einem enzymmarkierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen,- Competitive implementation of a substance to be determined in a sample and the same substance as the one to be determined Substance immobilized on a solid phase with an enzyme-labeled antigen or antibody, the Antigen or the antibody is capable of a specific one To bind with the substance to be determined,
  • - Umsetzen eines Substrats mit dem enzymmarkierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper-Komplex und Bestrahlen der erhaltenen Reaktionslösung mit intermittieren­ dem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.- Implementing a substrate with the enzyme-labeled and on the solid phase immobilized antigen-antibody complex and Irradiate the reaction solution obtained with intermittent the light, measuring the acoustic wave generated and Determine the amount of the substance to be determined in the Sample from the acoustic wave.

Bei diesem Immunoassay-Verfahren werden eine zu bestimmende Substanz in einer Probe und die gleiche Substanz wie die zu bestimmende Substanz, die an einer festen Phase immobilisiert ist, kompetitiv mit einem Antigen oder Antikörper, die in der Lage sind, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen, und die mit einem Enzym markiert ist, umgesetzt. In this immunoassay method, one to be determined Substance in a sample and the same substance as that of determining substance that immobilizes on a solid phase is competitive with an antigen or antibody found in the Are able to establish a specific link with the one to be determined Enter substance and which is labeled with an enzyme, implemented.  

Bei dem Enzym, der festen Phase und dgl., die bei diesem Ver­ fahren verwendet werden, handelt es sich um die gleichen Produkte wie bei der ersten Ausführungsform.In the enzyme, the solid phase and the like, which in this ver drive are used, they are the same Products as in the first embodiment.

Die bei dieser Ausführungsform eingesetzte Vorrichtung ent­ spricht im wesentlichen der Vorrichtung der ersten Ausführungs­ form, mit der Abänderung, daß ein Reaktor vorliegt, an dem die gleiche Substanz, wie die zu bestimmende Substanz immobili­ siert ist.The device used in this embodiment ent essentially speaks of the device of the first embodiment form, with the modification that there is a reactor on which the same substance as the substance to be determined immobili is.

Das nachstehende Beispiel dient der näheren Erläuterung die­ ser Ausführungsform.The example below serves to explain the This embodiment.

150 µl einer Probe oder einer gereinigten Ferritin-Antigen-Lösung werden mit 150 µl anti-Ferritin-Antikörper, der mit alka­ lischer Phosphatase markiert ist, und mit 0,1 ml Phosphatpuf­ fer mit einem Gehalt an 0,1% Rinderserumalbumin vermischt. In die Reaktionslösung wird ein Silikonteil, an dem Ferritin immobilisiert ist, getaucht. Das erhaltene Gemisch wird 60 Mi­ nuten bei 37°C geschüttelt, um die kompetitiven Reaktionen durchzuführen. Anschließend wird das Siliconteil dreimal mit dem vorerwähnten Puffer gewaschen. Nach dem Waschvorgang wird 1 ml p-Nitrophenylphosphat als Substrat zugesetzt. Das Gemisch wird 15 Minuten bei 25°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,5 ml 0,1 m NaOH beendet. Die das enzymatische Reaktionsprodukt enthaltende Lösung wird in eine photoakusti­ sche Zelle gesaugt und der Messung mit einem photoakustischen Spektrometer unterworfen.150 µl of a sample or a purified ferritin-antigen solution are treated with 150 µl anti-ferritin antibody, which with alka lian phosphatase is marked, and with 0.1 ml phosphate puf fer containing 0.1% bovine serum albumin. In the reaction solution becomes a silicone part on which ferritin immobilized, submerged. The mixture obtained is 60 Mi grooved at 37 ° C to avoid the competitive reactions perform. Then the silicone part with three times the aforementioned buffer. After the washing process 1 ml of p-nitrophenyl phosphate was added as a substrate. The mixture is incubated at 25 ° C for 15 minutes. The reaction is through Addition of 0.5 ml of 0.1 M NaOH ended. The the enzymatic Solution containing reaction product is in a photoacoustic sucked cell and measuring with a photoacoustic Subjected to spectrometer.

Eine mit der gereinigten Ferritin-Antigen-Lösung erhaltene Eichkurve ist in Fig. 8 dargestellt.A calibration curve obtained with the purified ferritin-antigen solution is shown in FIG. 8.

Bei der achten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung han­ delt es sich um ein Immunoassay-Verfahren, das folgende Stufen umfaßt:In the eighth preferred embodiment of the invention han If it is an immunoassay procedure, the following stages includes:

  • - kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestim­ mende Substanz, die an einer festen Phase immobilisiert ist, mit einem mit feinen Teilchen markierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;- Competitive implementation of a substance to be determined in a sample and the same substance as that to be determined  substance that immobilizes on a solid phase is, with an antigen labeled with fine particles or Antibody, where the antigen or antibody in the Is able to establish a specific link with the one to be determined To take substance;
  • - Behandeln des erhaltenen, mit den feinen Teilchen markierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper- Komplexes mit einer Freisetzungslösung, um den Antigen- Antikörper-Komplex aus der festen Phase freizusetzen; und- Treat the obtained, marked with the fine particles and antigen-antibody immobilized on the solid phase Complex with a release solution to remove the antigen Release antibody complex from the solid phase; and
  • - Bestrahlen der auf diese Weise erhaltenen, den Antigen- Antikörper-Komplex enthaltenden Freisetzungslösung mit intermittierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akusti­ schen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.Irradiation of the antigen Release solution containing antibody complex with intermittent light, measuring the generated acousti wave and determining the amount of to be determined Substance in the sample from the acoustic wave.

Dieses Immunoassay-Verfahren entspricht einer Modifikation des Verfahrens der siebten Ausführungsform, wobei als Markie­ rungsmittel anstelle des im letztgenannten Verfahren verwen­ deten Enzyms feine Teilchen eingesetzt werden.This immunoassay procedure corresponds to a modification the method of the seventh embodiment, wherein as Markie use instead of in the latter procedure fine enzyme can be used.

Bei den feinen Teilchen, der Freisetzungslösung und dgl., die in der vorliegenden Ausführungsform verwendet werden, handelt es sich um die gleichen Produkte wie bei der zweiten Ausfüh­ rungsform.In the fine particles, the release solution, and the like, the used in the present embodiment the same products as the second version form.

Die in dieser Ausführungsform verwendete Vorrichtung ent­ spricht im wesentlichen der Vorrichtung der siebten Ausfüh­ rungsform, mit der Abänderung, daß eine Einrichtung zum Ein­ spritzen des mit den feinen Teilchen markierten Antigens oder Antikörpers vorgesehen ist.The device used in this embodiment ent essentially speaks of the device of the seventh embodiment rungsform, with the modification that a device for Ein inject the antigen marked with the fine particles or Antibody is provided.

Nachstehend wird die vorliegende Ausführungsform anhand eines Beispiels näher erläutert.Hereinafter, the present embodiment will be explained using a Example explained in more detail.

150 µl einer Probe oder einer gereinigten Ferritin-Antigen- Lösung werden mit 150 µl anti-Ferritin-Antikörper, der mit Latex-Teilchen markiert ist, und mit 0,1 ml Phosphatpuffer mit einem Gehalt an 0,1% Rinderserumalbumin vermischt. Ein Siliconteil mit daran immobilisiertem Ferritin wird in die Reaktionslösung getaucht. Nach 60minütigem Schütteln bei 37°C wird das Siliconteil zweimal mit 1 ml des vorgenannten Phosphatpuffers gewaschen, um die nicht-umgesetzten, mit Latex- Teilchen markierten anti-Ferritin-Antikörper zu entfernen. Sodann werden 300 µl 4 n NaOH zum Siliconteil gegeben. Das erhaltene Gemisch wird 5 Minuten bei 37°C inkubiert, um einen mit Latex-Teilchen markierten Antigen-Antikörper-Komplex von der festen Phase, d.h. dem Siliconteil, freizusetzen. Die Freisetzungslösung wird in eine photoakustische Zelle gesaugt und der Messung mit einem photoakustischen Spektrometer unter­ worfen.150 µl of a sample or a purified ferritin antigen Solution with 150 µl anti-ferritin antibody, which with  Latex particles is marked, and with 0.1 ml of phosphate buffer mixed with 0.1% bovine serum albumin. A silicone part with immobilized ferritin is in the reaction solution is immersed. After shaking for 60 minutes 37 ° C, the silicone part twice with 1 ml of the above Phosphate buffers washed to the unreacted, with latex Remove particle labeled anti-ferritin antibody. Then 300 μl of 4 N NaOH are added to the silicone part. The The mixture obtained is incubated at 37 ° C. for 5 minutes to obtain a latex particle labeled antigen-antibody complex of the solid phase, i.e. the silicone part to release. The Release solution is sucked into a photoacoustic cell and measurement with a photoacoustic spectrometer throw.

Eine mit der gereinigten Ferritin-Antigen-Lösung erhaltene Eichkurve ist in Fig. 9 dargestellt.A calibration curve obtained with the purified ferritin-antigen solution is shown in FIG. 9.

Bei der neunten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um ein Immunoassay-Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:In the ninth preferred embodiment of the invention is an immunoassay method, the following Steps include:

  • - kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestim­ mende Substanz, die mit einem Enzym markiert ist, mit einem Antikörper, der eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz eingeht;- Competitive implementation of a substance to be determined in a sample and the same substance as that to be determined substance labeled with an enzyme an antibody that binds specifically to the substance to be determined;
  • - Umsetzen des erhaltenen, enzymmarkierten Antigen-Antikörper- Komplexes mit einem zweiten, an einer festen Phase immobi­ lisierten Antikörper, wobei der zweite Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit dem vorgenannten Antikörper einzugehen;- Implementation of the enzyme-labeled antigen-antibody obtained Complex with a second immobilized on a solid phase lized antibody, the second antibody in the Is capable of a specific bond with the aforementioned To enter antibodies;
  • - Umsetzen eines Substrats mit dem auf diese Weise herge­ stellten, enzymmarkierten und an der festen Phase immobili­ sierten Antigen-Antikörper-Komplex; und- Implementing a substrate with the Herge in this way provided, enzyme-labeled and immobilized on the solid phase based antigen-antibody complex; and
  • - Bestrahlen der erhaltenen Reaktionslösung mit intermittie­ rendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Welle, Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.- Irradiate the reaction solution obtained with intermittent light, measuring the acoustic wave generated, Determine the amount of the substance to be determined in the Sample from the acoustic wave.

Bei diesem Verfahren wird eine zu bestimmende Substanz in einer Probe und die gleiche Substanz wie die zu bestimmende Substanz, die mit einem Enzym markiert ist, kompetitiv mit einem Anti­ körper, der dazu in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen, umgesetzt, um einen mit dem Enzym markierten Antigen-Antikörper-Komplex zu erhalten. Dieser Komplex wird ferner mit einem zweiten Anti­ körper (einem Antikörper gegen den erstgenannten Antikörper), der an der Innenwand eines Reaktors oder dgl. immobilisiert ist, umgesetzt, wonach das nicht-umgesetzte Reagens entfernt wird. Anschließend wird ein Substrat zugesetzt und der Test durchgeführt.In this method, a substance to be determined is in a Sample and the same substance as the substance to be determined, which is labeled with an enzyme, competitively with an anti body that is capable of a specific bond to deal with the substance to be determined, implemented to an antigen-antibody complex labeled with the enzyme receive. This complex is further enhanced with a second anti body (an antibody against the former antibody), which is immobilized on the inner wall of a reactor or the like is implemented, after which the unreacted reagent is removed becomes. Then a substrate is added and the test carried out.

Beim Enzym und dgl., die in der vorliegenden Ausführungsform verwendet werden, handelt es sich um die gleichen Produkte wie bei der ersten Ausführungsform. Die bei dieser Ausführungs­ form verwendete Vorrichtung ist im wesentlichen die gleiche wie bei der ersten Ausführungsform, mit der Abänderung, daß beispielsweise ein Reaktor, an dem der zweite Antikörper immobilisiert ist, und eine Einrichtung zum Einspritzen der gleichen Substanz wie die zu bestimmende Substanz, die mit einem Enzym markiert ist, vorgesehen sind.In the enzyme and the like, which are in the present embodiment used, they are the same products as in the first embodiment. The execution of this The device used is essentially the same as in the first embodiment, with the modification that for example a reactor on which the second antibody is immobilized, and a device for injecting the same substance as the substance to be determined, with an enzyme is marked, are provided.

Nachstehend wird diese Ausführungsform anhand eines Beispiels näher erläutert.Hereinafter, this embodiment will be exemplified explained in more detail.

Ein Gemisch aus 10 µl einer Probe oder einer Standardlösung mit einem Gehalt an humanem Choriongonadotropin (hCG), 0,1 ml 200 000-fach verdünnter Kaninchen-anti-hCG-Antikörper, 10 µl 40-fach verdünnte Lösung von mit β-Galactosidase verdünntem hCG und 80 µl eines 0,02 m Phosphatpuffers (pH-Wert 7,0) mit einem Gehalt an 0,1% Rinderserumalbumin, 1 millimolar Magne­ siumchlorid, 0,1 m Natriumchlorid und 0,1% Natriumnitrid wer­ den 60 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Reaktionslösung wird in einen Behälter, an dessen Innenwand anti-Kaninchen-γ-Globulin- Antikörper (ein zweiter Antikörper) immobilisiert ist, ge­ bracht und 20 Minuten bei 40°C inkubiert. Anschließend wird die Innenwand dreimal mit 2 ml des vorerwähnten Phosphatpuf­ fers gewaschen. Sodann werden 100 µl 4-Methylumbelliferyl-β- D-galactopyranosid in den Behälter gegeben und 15 Minuten bei 25°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,5 ml 0,2 n NaOH beendet. Die das enzymatische Reaktionsprodukt ent­ haltende Reaktionslösung wird in eine photoakustische Zelle gesaugt und der Messung mit einem photoakustischen Spektro­ meter unterworfen.A mixture of 10 µl of a sample or standard solution containing human chorionic gonadotropin (hCG), 0.1 ml of rabbit anti-hCG antibody 200,000 times diluted, 10 µl solution of β- galactosidase diluted 40 times hCG and 80 µl of a 0.02 m phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1% bovine serum albumin, 1 millimolar magnesium chloride, 0.1 m sodium chloride and 0.1% sodium nitride are used for 60 minutes at 4 ° C incubated. The reaction solution is placed in a container on the inner wall of which anti-rabbit γ- globulin antibody (a second antibody) is immobilized and incubated at 40 ° C. for 20 minutes. The inner wall is then washed three times with 2 ml of the aforementioned phosphate buffer. 100 .mu.l of 4-methylumbelliferyl- β -D-galactopyranoside are then added to the container and incubated at 25 ° C. for 15 minutes. The reaction is terminated by adding 0.5 ml of 0.2N NaOH. The reaction solution containing the enzymatic reaction product is sucked into a photoacoustic cell and subjected to the measurement with a photoacoustic spectrometer.

Eine mit dem Standardserum mit einem Gehalt an hCG erhaltene Eichkurve ist in Fig. 10 dargestellt.A calibration curve obtained with the standard serum containing hCG is shown in FIG. 10.

Bei der zehnten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um ein Immunoassay-Verfahren, das folgende Stufen umfaßt:In the tenth preferred embodiment of the invention is an immunoassay method, the following Levels include:

  • - kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestimmen­ de Substanz, die mit feinen Teilchen markiert ist, mit einem Antikörper, der eine spezifische Bindung mit der zu­ bestimmenden Substanz eingeht;- Competitive implementation of a substance to be determined in a sample and the same substance as that de substance marked with fine particles with an antibody that binds specifically to the determining substance;
  • - Umsetzen des erhaltenen, mit den feinen Teilchen markier­ ten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einem zweiten, an einer festen Phase immobilisierten Antikörper, wobei der zweite Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit dem vorgenannten Antikörper einzugehen;- Implement the obtained, marked with the fine particles antigen-antibody complex with a second, at one solid phase immobilized antibody, the second Antibody is able to bind specifically to the antibody the aforementioned antibodies;
  • - Behandeln des auf diese Weise hergestellten, mit den feinen Teilchen markierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einer Freisetzungslösung, um den Antigen-Antikörper-Komplex von der festen Phase frei­ zusetzen; und- Treat the manufactured in this way with the fine Particles marked and immobilized on the solid phase Antigen-antibody complex with a release solution, to free the antigen-antibody complex from the solid phase clog; and
  • - Bestrahlen der auf diese Weise erhaltenen, den Antigen- Antikörper-Komplex enthaltenden Freisetzungslösung mit intermittierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akusti­ schen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.Irradiation of the antigen Release solution containing antibody complex with intermittent light, measuring the generated acousti wave and determining the amount of to be determined Substance in the sample from the acoustic wave.

Dieses Immunoassay-Verfahren stellt eine Modifikation des Verfahrens der neunten Ausführungsform dar, wobei als Markie­ rungsmittel feine Teilchen anstelle des im letztgenannten Verfahren verwendeten Enzyms eingesetzt werden. Bei den feinen Teilchen, der Freisetzungslösung und dgl., die in dieser Aus­ führungsform verwendet werden, handelt es sich um die gleichen Produkte wie bei der ersten Ausführungsform. Die in dieser Ausführungsform eingesetzte Vorrichtung entspricht im wesentli­ chen der Vorrichtung der neunten Ausführungsform, mit der Ab­ änderung, daß sie eine Einrichtung zum Einspritzen der gleichen Substanz wie die zu bestimmende Substanz, die mit feinen Teil­ chen markiert ist, enthält.This immunoassay procedure is a modification of the Method of the ninth embodiment, wherein as Markie fine particles instead of the latter Process used enzyme can be used. With the fine Particles, the release solution and the like., Which in this Aus are used, they are the same Products as in the first embodiment. The one in this Embodiment used essentially corresponds to chen the device of the ninth embodiment, with the Ab Change that they have a device for injecting the same Substance like the substance to be determined, with fine part chen is marked.

Nachstehend wird die vorliegende Ausführungsform anhand eines Beispiels näher erläutert.Hereinafter, the present embodiment will be explained using a Example explained in more detail.

Ein Gemisch aus 10 µl einer Probe oder eines Standardserums mit einem Gehalt an hCG, 0,1 ml 200 000-fach verdünntem Kanin­ chen-anti-hCG-Antikörper, 10 µl mit Latex-Teilchen markiertem hCG und 80 µl 0,02 m Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) mit einem Ge­ halt an 0,1% Rinderserumalbumin, 1 millimolar Magnesiumchlo­ rid, 0,1 m Natriumchlorid und 0,1% Natriumnitrid wird 60 Mi­ nuten bei 4°C inkubiert. Anschließend wird die Reaktionslösung in einen Behälter gegeben, an dessen Innenwand anti-Kaninchen­ γ-Globulin-Antikörper immobilisiert ist. Sodann wird 20 Minu­ ten bei 37°C inkubiert. Hierauf wird die Innenwand zweimal mit 1 ml des vorerwähnten Phosphatpuffers gewaschen, um das nicht- umgesetzte, mit Latex-Teilchen markierte hCG zu entfernen. Nach dem Waschen werden 300 µl 4 n NaOH zugesetzt, um einen mit den Latex-Teilchen markierten Antigen-Antikörper-Komplex freizusetzen. Die Freisetzungslösung wird in eine photoakusti­ sche Zelle gesaugt und der Messung mit einem photoakustischen Spektrometer unterzogen. Eine mit dem hCG enthaltenden Standard­ serum erhaltene Eichkurve ist in Fig. 11 dargestellt.A mixture of 10 µl of a sample or standard serum containing hCG, 0.1 ml rabbit anti-hCG antibody 200,000 times diluted, 10 µl of hCG labeled with latex particles and 80 µl of 0.02 M phosphate buffer (pH 7.0) with a Ge content of 0.1% bovine serum albumin, 1 millimolar magnesium chloride, 0.1 M sodium chloride and 0.1% sodium nitride is incubated for 60 minutes at 4 ° C. The reaction solution is then placed in a container on the inner wall of which anti-rabbit γ- globulin antibody is immobilized. The mixture is then incubated at 37 ° C. for 20 minutes. The inner wall is then washed twice with 1 ml of the aforementioned phosphate buffer in order to remove the unreacted hCG labeled with latex particles. After washing, 300 µl of 4N NaOH are added to release an antigen-antibody complex labeled with the latex particles. The release solution is sucked into a photoacoustic cell and subjected to the measurement with a photoacoustic spectrometer. A calibration curve obtained with the standard serum containing hCG is shown in FIG. 11.

Claims (15)

1. Immunoassay-Verfahren, gekennzeichnet durch
  • - Durchführen einer kompetitiven oder nicht-kompetitiven Reaktion auf der Grundlage eines heterogenen Verfahrens unter Verwendung einer festen Phase und unter Einsatz einer Kombination einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe, eines Antigens oder Antikörpers, die eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz eingehen, und eines mit einem Enzym oder feinen Teilchen markierten Antigens oder Antikörpers, wobei dieses Anti­ gen oder dieser Antikörper in der Lage ist, eine spezfi­ sche Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen; oder
    einer Kombination einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe, der gleichen Substanz wie die zu bestimmende Sub­ stanz, die mit einem Enzym oder feinen Teilchen markiert ist, und eines Antigens oder Antikörpers, die eine spe­ zifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einge­ hen; oder
    einer Kombination einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe, eines mit einem Enzym oder feinen Teilchen markier­ ten Antigens oder Antikörpers wobei dieses Antigen oder dieser Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen, und der gleichen Substanz wie die zu bestimmende Substanz;
  • - Messen der Aktivität des erhaltenen, mit dem Enzym oder den feinen Teilchen markierten Antigen-Antikörper-Kom­ plexes durch photoakustische Spektroskopie; und
  • - Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aufgrund des gemessenen Aktivitätswerts.
1. Immunoassay method, characterized by
  • Performing a competitive or non-competitive reaction based on a heterogeneous method using a solid phase and using a combination of a substance to be determined in a sample, an antigen or an antibody, which form a specific binding with the substance to be determined, and an antigen or antibody labeled with an enzyme or fine particles, said antigen or antibody being able to bind specifically to the substance to be determined; or
    a combination of a substance to be determined in a sample, the same substance as the substance to be determined, which is labeled with an enzyme or fine particles, and an antigen or antibody which form a specific binding with the substance to be determined; or
    a combination of a substance to be determined in a sample, an antigen or antibody labeled with an enzyme or fine particles, said antigen or antibody being able to bind specifically with the substance to be determined and the same substance as that determining substance;
  • - Measuring the activity of the obtained, labeled with the enzyme or the fine particles antigen-antibody complex by photoacoustic spectroscopy; and
  • - Determine the amount of the substance to be determined in the sample based on the measured activity value.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erhaltene Antigen-Antikörper-Komplex, der mit dem Enzym markiert und an der festen Phase immobilisiert ist, mit einer Substanz umgesetzt wird, und die erhaltene Reaktions­ lösung mit intermittierendem Licht bestrahlt wird, wonach die dadurch erzeugte akustische Welle gemessen und die Men­ ge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle ermittelt wird.2. The method according to claim 1, characterized in that the Obtained antigen-antibody complex with the enzyme marked and immobilized on the solid phase with a substance is implemented, and the reaction obtained solution is irradiated with intermittent light, after which the acoustic wave generated by this is measured and the men of the substance to be determined in the sample from the acoustic wave is determined. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erhaltene Antigen-Antikörper-Komplex, der mit feinen Teilchen markiert und an der festen Phase immobilisiert ist, mit einer Freisetzungslösung behandelt wird, um den Antigen-Antikörper-Komplex von der festen Phase freizuset­ zen, und die den Antigen-Antikörper-Komplex enthaltende Freisetzungslösung mit intermittierendem Licht bestrahlt wird, wonach die dabei erzeugte akustische Welle gemessen und die Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle bestimmt wird.3. The method according to claim 1, characterized in that the antigen-antibody complex obtained with fine Particles marked and immobilized on the solid phase is treated with a release solution to remove the Antigen-antibody complex to be released from the solid phase zen, and those containing the antigen-antibody complex Release solution irradiated with intermittent light after which the acoustic wave generated is measured and the amount of the substance to be determined in the sample is determined from the acoustic wave. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den feinen Teilchen um Latexteilchen mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,01 bis 100 µm handelt.4. The method according to claim 1, characterized in that it the fine particles around latex particles with a average particle diameter from 0.01 to 100 µm acts. 5. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch
  • - Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe mit einem an einer festen Phase immobilisierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu be­ stimmenden Substanz einzugehen;
  • - Umsetzen des erhaltenen, an der festen Phase immobili­ sierten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einem enzym­ markierten Antigen oder Antikörper, wobei dieses Antigen oder dieser Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;
  • - Umsetzen einer Substanz mit dem erhaltenen, enzymmarkier­ ten und an der festen Phase immobilisierten Antigen- Antikörper-Komplex; und
  • - Bestrahlen der erhaltenen Reaktionslösung mit inter­ mittierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akusti­ schen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.
5. The method according to claim 1, characterized by
  • - Reacting a substance to be determined in a sample with an antigen or antibody immobilized on a solid phase, the antigen or the antibody being able to form a specific bond with the substance to be determined;
  • - Implementation of the antigen-antibody complex immobilized on the solid phase with an enzyme-labeled antigen or antibody, which antigen or antibody is able to form a specific bond with the substance to be determined;
  • - Reacting a substance with the obtained, enzyme-labeled and immobilized on the solid phase antigen-antibody complex; and
  • - Irradiation of the reaction solution obtained with intermittent light, measuring the acoustic wave generated thereby and determining the amount of the substance to be determined in the sample from the acoustic wave.
6. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch
  • - Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe mit einem an einer festen Phase immobilisierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;
  • - Umsetzen des erhaltenen, an der festen Phase immobili­ sierten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einem mit feinen Teilchen markierten Antigen oder Antikörper, wobei die­ ses Antigen oder dieser Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz ein­ zugehen;
  • - Behandeln des auf diese Weise hergestellten, mit feinen Teilchen markierten und an der festen Phase immobilisier­ ten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einer Freisetzungs­ lösung, um den Antigen-Antikörper-Komplex von der festen Phase freizusetzen; und
  • - Bestrahlen der auf diese Weise erhaltenen, den Antigen- Antikörper-Komplex enthaltenden Freisetzungslösung mit intermittierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestim­ menden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.
6. The method according to claim 1, characterized by
  • - Reacting a substance to be determined in a sample with an antigen or antibody immobilized on a solid phase, the antigen or the antibody being able to form a specific bond with the substance to be determined;
  • - Reacting the antigen-antibody complex immobilized on the solid phase with an antigen or antibody labeled with fine particles, said antigen or antibody being able to form a specific bond with the substance to be determined;
  • - Treating the antigen-antibody complex produced in this way, labeled with fine particles and immobilized on the solid phase, with a release solution in order to release the antigen-antibody complex from the solid phase; and
  • - Irradiation of the thus obtained, containing the antigen-antibody complex containing release solution with intermittent light, measuring the acoustic wave generated and determining the amount of substance to be determined in the sample from the acoustic wave.
7. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch
  • - Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe mit einem enzymmarkierten Antigen oder Antikörper, wo­ bei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;
  • - Umsetzen des enzymmarkierten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einem an einer festen Phasen immobilisierten Antigen oder Antikörper, wobei dieses Antigen oder dieser Anti­ körper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;
  • - Umsetzen eines Substrats mit dem auf diese Weise herge­ stellten enzymmarkierten und an der festen Phase immobi­ lisierten Antigen-Antikörper-Komplex; und
  • - Bestrahlen der erhaltenen Reaktionslösung mit intermittie­ rendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Wel­ le und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.
7. The method according to claim 1, characterized by
  • - reacting a substance to be determined in a sample with an enzyme-labeled antigen or antibody, where the antigen or the antibody is able to bind specifically with the substance to be determined;
  • - Implementation of the enzyme-labeled antigen-antibody complex with an antigen or antibody immobilized on a solid phase, this antigen or this body being able to form a specific bond with the substance to be determined;
  • - Implementing a substrate with the enzyme-labeled and in this way manufactured and immobilized on the solid phase antigen-antibody complex; and
  • - Irradiation of the reaction solution obtained with intermittent light, measuring the resulting acoustic Wel le and determining the amount of substance to be determined in the sample from the acoustic wave.
8. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch
  • - Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe mit einem enzymmarkierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper mit feinen Teilchen mar­ kiert ist, und wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu be­ stimmenden Substanz einzugehen;
  • - Umsetzen des erhaltenen, mit den feinen Teilchen markier­ ten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einem an einer festen Phase immobilisierten Antigen oder Antikörper, wo­ bei dieses Antigen oder Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz ein­ zugehen;
  • - Behandeln des auf diese Weise hergestellten, mit feinen Teilchen markierten und an der festen Phase immobilisier­ ten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einer Freisetzungs­ lösung, um den Antigen-Antikörper-Komplex aus der festen Phase freizusetzen; und
  • - Bestrahlen der auf diese Weise erhaltenen, den Antigen- Antikörper-Komplex enthaltenden Freisetzungslösung mit intermittierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestim­ menden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.
8. The method according to claim 1, characterized by
  • - Reacting a substance to be determined in a sample with an enzyme-labeled antigen or antibody, the antigen or the antibody being marked with fine particles, and the antigen or the antibody being able to bind specifically to the substance to be determined enter into;
  • - Reacting the obtained antigen-antibody complex marked with the fine particles with an antigen or antibody immobilized on a solid phase, where this antigen or antibody is able to form a specific bond with the substance to be determined;
  • - Treating the antigen-antibody complex produced in this way, labeled with fine particles and immobilized on the solid phase, with a release solution in order to release the antigen-antibody complex from the solid phase; and
  • - Irradiation of the thus obtained, containing the antigen-antibody complex containing release solution with intermittent light, measuring the acoustic wave generated and determining the amount of substance to be determined in the sample from the acoustic wave.
9. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch
  • - kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestim­ mende Probe, die mit einem Enzym markiert ist, mit einem an einer festen Phase immobilisierten Antigen oder Anti­ körper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der La­ ge ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;
  • - Umsetzen eines Substrats mit dem erhaltenen, enzymmar­ kierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen- Antikörper-Komplex; und
  • - Bestrahlen der erhaltenen Reaktionslösung mit intermittie­ rendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Wel­ le und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.
9. The method according to claim 1, characterized by
  • - Competitive implementation of a substance to be determined in a sample and the same substance as the sample to be determined, which is labeled with an enzyme, with an antigen or antibody immobilized on a solid phase, the antigen or the antibody being in the position is to form a specific bond with the substance to be determined;
  • - Implementation of a substrate with the obtained, enzyme-labeled and immobilized on the solid phase antigen-antibody complex; and
  • - Irradiation of the reaction solution obtained with intermittent light, measuring the resulting acoustic Wel le and determining the amount of substance to be determined in the sample from the acoustic wave.
10. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch
  • - kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestim­ mende Substanz, die mit feinen Teilchen markiert ist, mit einem an einer festen Phase immobilisierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;
  • - Behandeln des erhaltenen, mit feinen Teilchen markierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikör­ per-Komplexes mit einer Freisetzungslösung, um den Anti­ gen-Antikörper-Komplex aus der festen Phase freizuset­ zen; und
  • - Bestrahlen der auf diese Weise erhaltenen, den Antigen- Antikörper-Komplex enthaltenden Freisetzungslösung mit intermittierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge der zu be­ stimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Wel­ le.
10. The method according to claim 1, characterized by
  • - competitive reaction of a substance to be determined in a sample and the same substance as the substance to be determined, which is marked with fine particles, with an antigen or antibody immobilized on a solid phase, the antigen or the antibody being able to enter into a specific relationship with the substance to be determined;
  • - Treating the antigen-antibody complex obtained, which is labeled with fine particles and immobilized on the solid phase, with a release solution in order to release the anti-gene-antibody complex from the solid phase; and
  • - Irradiate the release solution obtained in this way, containing the antigen-antibody complex with intermittent light, measuring the acoustic wave generated thereby and determining the amount of the substance to be determined in the sample from the acoustic wave le.
11. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch
  • - kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestim­ mende Substanz, die an einer festen Phase immobilisiert ist, mit einem enzymmarkierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz einzugehen;
  • - Umsetzen eines Substrats mit dem enzymmarkierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen-Antikörper- Komplex; und
  • - Bestrahlen der erhaltenen Reaktionslösung mit intermit­ tierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Sub­ stanz in der Probe aus der akustischen Welle.
11. The method according to claim 1, characterized by
  • - Competitive reaction of a substance to be determined in a sample and the same substance as the substance to be determined, which is immobilized on a solid phase, with an enzyme-labeled antigen or antibody, the antigen or the antibody being able to bind specifically to deal with the substance to be determined;
  • - Implementing a substrate with the enzyme-labeled and immobilized on the solid phase antigen-antibody complex; and
  • - Irradiation of the reaction solution obtained with intermittent light, measuring the acoustic wave generated thereby and determining the amount of the substance to be determined in the sample from the acoustic wave.
12. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch
  • - kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestim­ mende Substanz, die an einer festen Phase immobilisiert ist, mit einem mit feinen Teilchen markierten Antigen oder Antikörper, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit der zu be­ stimmenden Substanz einzugehen;
  • - Behandeln des erhaltenen, mit den feinen Teilchen mar­ kierten und an der festen Phase immobilisierten Antigen- Antikörper-Komplexes mit einer Freisetzungslösung, um den Antigen-Antikörper-Komplex aus der festen Phase frei­ zusetzen; und
  • - Bestrahlen der auf diese Weise erhaltenen, den Antigen- Antikörper-Komplex enthaltenden Freisetzungslösung mit intermittierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge der zu be­ stimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.
12. The method according to claim 1, characterized by
  • - Competitive reaction of a substance to be determined in a sample and the same substance as the substance to be determined, which is immobilized on a solid phase, with an antigen or antibody labeled with fine particles, the antigen or the antibody being able to enter into a specific relationship with the substance to be determined;
  • - Treating the antigen-antibody complex obtained, marked with the fine particles and immobilized on the solid phase, with a release solution in order to release the antigen-antibody complex from the solid phase; and
  • - Irradiate the release solution obtained in this way, containing the antigen-antibody complex with intermittent light, measuring the acoustic wave generated thereby and determining the amount of the substance to be determined in the sample from the acoustic wave.
13. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch
  • - kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in der Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestim­ mende Substanz, die mit einem Enzym markiert ist, mit einem Antikörper, der eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz eingeht;
  • - Umsetzen des erhaltenen, enzymmarkierten Antigen-Anti­ körper-Komplexes mit einem zweiten, an einer festen Pha­ se immobilisierten Antikörper, wobei der zweite Anti­ körper in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit dem vorgenannten Antikörper einzugehen;
  • - Umsetzen eines Substrats mit dem auf diese Weise herge­ stellten, enzymmarkierten und an der festen Phase immo­ bilisierten Antigen-Antikörper-Komplex; und
  • - Bestrahlen der erhaltenen Reaktionslösung mit intermit­ tierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.
13. The method according to claim 1, characterized by
  • - Competitive implementation of a substance to be determined in the sample and the same substance as the substance to be determined, which is labeled with an enzyme, with an antibody which forms a specific bond with the substance to be determined;
  • - Implementation of the enzyme-labeled antigen-antibody complex obtained with a second antibody immobilized on a solid phase, the second antibody being able to form a specific bond with the aforementioned antibody;
  • - Implementing a substrate with the enzyme-labeled antigen-antibody complex produced in this way and immobilized on the solid phase; and
  • - Irradiation of the reaction solution obtained with intermittent light, measuring the acoustic wave generated thereby and determining the amount of the substance to be determined in the sample from the acoustic wave.
14. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch
  • - kompetitives Umsetzen einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe und der gleichen Substanz wie die zu bestim­ mende Substanz, die mit feinen Teilchen markiert ist, mit einem Antikörper, der eine spezifische Bindung mit der zu bestimmenden Substanz eingeht;
  • - Umsetzen des erhaltenen, mit den feinen Teilchen markier­ ten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einem zweiten, an einer festen Phase immobilisierten Antikörper, wobei der zweite Antikörper in der Lage ist, eine spezifische Bin­ dung mit dem vorgenannten Antikörper einzugehen;
  • - Behandeln des auf diese Weise hergestellten, mit den feinen Teilchen markierten und an der festen Phase immo­ bilisierten Antigen-Antikörper-Komplexes mit einer Frei­ setzungslösung, um den Antigen-Antikörper-Komplex von der festen Phase freizusetzen; und
  • - Bestrahlen der auf diese Weise erhaltenen, den Antigen- Antikörper-Komplex enthaltenden Freisetzungslösung mit intermittierendem Licht, Messen der dabei erzeugten akustischen Welle und Ermitteln der Menge der zu bestim­ menden Substanz in der Probe aus der akustischen Welle.
14. The method according to claim 1, characterized by
  • - Competitive implementation of a substance to be determined in a sample and the same substance as the substance to be determined, which is marked with fine particles, with an antibody which forms a specific bond with the substance to be determined;
  • - reacting the antigen-antibody complex labeled with the fine particles with a second antibody immobilized on a solid phase, the second antibody being able to form a specific binding with the abovementioned antibody;
  • - Treating the antigen-antibody complex produced in this way, labeled with the fine particles and immobilized on the solid phase, with a release solution in order to release the antigen-antibody complex from the solid phase; and
  • - Irradiation of the thus obtained, containing the antigen-antibody complex containing release solution with intermittent light, measuring the acoustic wave generated and determining the amount of substance to be determined in the sample from the acoustic wave.
15. Vorrichtung zur Durchführung eines Immunoassay, gekenn­ zeichnet durch
  • - einen Reaktor, an dem ein Antigen oder Antikörper, die eine spezifische Bindung mit einer zu bestimmenden Sub­ stanz eingehen, oder die gleiche Substanz wie die zu be­ stimmende Substanz immobilisiert sind oder einen Reaktor mit einem Gehalt an unlöslichen Kügelchen, an denen das Antigen oder der Antikörper oder die gleiche Substanz wie die zu bestimmende Substanz immobilisiert sind;
  • - eine Einrichtung zum Einspritzen einer Probe, die eine zu bestimmende Substanz enthält, in den Reaktor;
  • - eine Einrichtung zum Einspritzen eines mit einem Enzym oder feinen Teilchen markierten Antigens oder Antikörpers in den Reaktor, wobei das Antigen oder der Antikörper in der Lage sind, eine spezifische Bindung mit der zu be­ stimmenden Substanz einzugehen, oder zum Einspritzen der gleichen Substanz wie die zu bestimmende Substanz, die mit einem Enzym oder feinen Teilchen markiert ist, in den Reaktor;
  • - eine Einrichtung zum Einspritzen eines Substrats für das Enzym oder einer Freisetzungslösung zum Freisetzen des am Reaktor immobilisierten und mit den feinen Teilchen markierten Antigen-Antikörper-Komplexes in den Reaktor;
  • - eine photoakustische Zelle, in die Enzym-Substrat-Kom­ plex-Lösung oder die Freisetzungslösung, die den mit den feinen Teilchen markierten Antigen-Antikörper-Komplex enthält, eingeführt wird;
  • - eine Einrichtung zum Bestrahlen der Reaktionslösung oder der Freisetzungslösung in der Zelle mit intermittieren­ dem Licht;
  • - eine Einrichtung zum Nachweisen einer durch die Bestrah­ lung mit intermittierendem Licht erzeugten akustischen Welle; und
  • - eine Einrichtung zur Berechnung der Menge der zu bestim­ menden Substanz aus der akustischen Welle.
15. Device for carrying out an immunoassay, characterized by
  • - A reactor on which an antigen or antibody which binds specifically to a substance to be determined, or the same substance as the substance to be determined, or a reactor containing insoluble beads to which the antigen or the antibody or the same substance as the substance to be determined are immobilized;
  • a device for injecting a sample containing a substance to be determined into the reactor;
  • a device for injecting an antigen or antibody labeled with an enzyme or fine particles into the reactor, the antigen or the antibody being able to form a specific bond with the substance to be determined, or for injecting the same substance as that substance to be determined, which is labeled with an enzyme or fine particles, into the reactor;
  • a device for injecting a substrate for the enzyme or a release solution for releasing the antigen-antibody complex immobilized on the reactor and labeled with the fine particles into the reactor;
  • - A photoacoustic cell into which the enzyme-substrate complex solution or the release solution containing the antigen-antibody complex labeled with the fine particles is introduced;
  • means for irradiating the reaction solution or the release solution in the cell with intermittent light;
  • - A device for detecting an acoustic wave generated by irradiation with intermittent light; and
  • - A device for calculating the amount of substance to be determined from the acoustic wave.
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