DE3834233A1 - METHOD FOR DETERMINING THE ACTIVITY OF TRANSGLUTAMINASES - Google Patents

METHOD FOR DETERMINING THE ACTIVITY OF TRANSGLUTAMINASES

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Eberhard Dr Selmayr
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Abstract

In order to determine the activity of transglutaminases, a solution of a physiological substrate of the transglutaminase to be determined marked with a marking substance is incubated with a solid-phase substrate of the enzyme in the presence of the specimen to be examined, the phases are separated and the amount of the marking susbtance present in the solid or in the liquid phase is taken as a measure of the transglutaminase activity.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Transglutaminasen in Plasma, Zellen und Geweben durch Quervernetzung spezifischer markierter Proteinsubstrate und Verfahren zur Herstel­ lung der markierten Substrate. Das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren kann angewendet werden, um bestimm­ te Erkrankungen zu erkennen, einen Krankheitsverlauf zu überwachen oder eine Therapie zu kontrollieren.The invention relates to a method for determining the enzymatic activity of transglutaminases in plasma, Cells and tissues more specific through cross-linking labeled protein substrates and method of manufacture the marked substrates. The invention Determination method can be used to determine To recognize te diseases, a course of the disease monitor or control therapy.

Als Transglutaminasen werden die Mitglieder einer Familie von Enzymen bezeichnet, von welchen bekannt ist, daß sie extrazellulär und intrazellulär Moleküle von verschiedenen Strukturproteinen durch enzymatische Knüpfung einer ε-(γ-Glutamyl)Lysyl-Bindung kovalent vernetzen (Übersichten: a. Lorand L. und Conrad, S. M., Transglutaminases, Molecular and Cellular Biochemistry 58: 9-35 (1984); b. Folk, J. E. und Finlayson, J. S., The ε-(γ-glutamyl)lysine crosslink and the catalytic role of transglutaminases, Advances in Protein Chemistry 31: 1-33 (1977).Transglutaminases are the members of a family of enzymes that are known to covalently cross-link extracellularly and intracellularly molecules of different structural proteins by enzymatic formation of an ε - ( γ- glutamyl) lysyl bond (reviews: a. Lorand L. and Conrad, SM, Transglutaminases, Molecular and Cellular Biochemistry 58: 9-35 (1984); b.Folk, JE and Finlayson, JS, The ε - ( γ- glutamyl) lysine crosslink and the catalytic role of transglutaminases, Advances in Protein Chemistry 31: 1-33 (1977).

Das wichtigste Enzym der Transaminasenfamilie ist der Blutgerinnungsfaktor XIII. Als Substrate sind bekannt: Fibrin, Fibronectin, alpha 2Plasmininhibitor, Thrombos­ pondin, Collagen, alpha 2-Makroglobulin, von Willebrand- Faktor, Faktor V, Aktin und Myosin.The most important enzyme in the transaminase family is blood coagulation factor XIII. Known substrates are: fibrin, fibronectin, alph a 2 plasmin inhibitor, thrombopondin, collagen, alph a 2 macroglobulin, von Willebrand factor, factor V, actin and myosin.

Transglutaminasen sind beteiligt bei Blutgerinnung, Thrombosen, Regulation der Fibrinolyse, Verbrauchsko­ agulopathie, Wundheilung, Tumormetastasierung, Arte­ riosklerose, kongenitaler Faktor XIII-Mangel, Spontan­ aborten, Rheuma, entzündlichen und immunologischen Erkrankungen. Daher besteht ein Bedarf an einer schnel­ len und genauen Bestimmung dieser Enzyme.Transglutaminases are involved in blood clotting, Thrombosis, regulation of fibrinolysis, consumption co agulopathy, wound healing, tumor metastasis, Arte riosclerosis, congenital factor XIII deficiency, spontaneous abortion, rheumatism, inflammatory and immunological  Diseases. There is therefore a need for a quick len and exact determination of these enzymes.

Mehrere Verfahren zur Bestimmung von Faktor XIII sind bekannt:There are several methods for determining factor XIII known:

  • a) Bestimmung der Löslichkeit von Fibrin-Testgerinnseln durch verdünnte Säuren oder Harnstoff (Übersicht: Rasche, H., Blutgerinnungsfaktor XIII und Fibrinsta­ bilisierung. Klinische Wochenschrift 53: 1137-1145 (1975)). Diese Methoden jedoch messen nur semiquan­ titativ und sind daher nur zur Diagnose bei ausge­ prägtem Faktor XIII-Mangel anwendbar.a) Determination of the solubility of fibrin test clots due to dilute acids or urea (overview: Rasche, H., coagulation factor XIII and fibrinsta accounting. Clinical Weekly Bulletin 53: 1137-1145 (1975)). However, these methods measure only semi-quantitatively titative and are therefore only for diagnosis at Embossed factor XIII deficiency applicable.
  • b) Inkorporation von radioaktiven oder fluoreszierenden Aminen in Casein. Faktor XIII activity using dansyl­ cadavenin incorporation and gel filtration. Thrombo­ sis Research 36: 123-131 (1984); b) Muscbeck, L., Polgar, J., Fusus, L., Kinetic determination of blood-coagulation Faktor XIII in plasma. Clinical Chemistry 31: 35-40 (1985)).b) incorporation of radioactive or fluorescent Amines in casein. Factor XIII activity using dansyl Cadavenin incorporation and gel filtration. Thrombo sis Research 36: 123-131 (1984); b) Muscbeck, L., Polgar, J., Fusus, L., Kinetic determination of blood coagulation factor XIII in plasma. Clinical Chemistry 31: 35-40 (1985)).

Diese Methoden messen präzise, sind aber sehr aufwendig, langwierig und nur für kleine Probenzahlen anwendbar.These methods measure precisely, but are very complex, lengthy and only applicable for small numbers of samples.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Reagenz bzw. Verfahren zu entwickeln, um die enzymati­ sche Aktivität von Transglutaminasen und insbesondere Faktor XIII spezifisch und quantitativ zu bestimmen. Der Test sollte einfach und schnell durchführbar sein und eine große Anzahl von Proben mit großer Genauigkeit parallel erfassen können.The invention is therefore based on the object Develop reagent or method to the enzymati cal activity of transglutaminases and in particular Determine factor XIII specifically and quantitatively. The test should be easy and quick to perform and a large number of samples with great accuracy can capture in parallel.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Transglutami­ nasen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Lösung eines physiologischen Substrates der zu bestim­ menden Transglutaminase, welches eine Markierung trägt, mit einem in fester Phase vorliegenden Substrat des Enzyms in Gegenwart der zu untersuchenden Probe inku­ biert, die Phasen trennt und die in der festen oder in der flüssigen Phase vorliegende Markierung als Maß der Transglutaminase-Aktivität bestimmt.According to the invention, this object is achieved by a Procedure for determining the activity of transglutami  noses, which is characterized in that one Solution of a physiological substrate to be determined emitting transglutaminase, which carries a label, with a substrate of the solid phase Enzyme in the presence of the sample to be examined beers that separate the phases and those in the fixed or in the present liquid mark as a measure of Transglutaminase activity determined.

Als Transglutaminasesubstrat kann im Rahmen der Erfin­ dung jedes physiologische Substrat der jeweils interes­ sierenden Transglutaminase verwendet werden. Für die Bestimmung der physiologisch besonders wichtigen Trans­ aminase Blutgerinnungsfaktor XIII eignen sich die oben erwähnten Substrate Fibrin, Fibronectin, alpha 2Plasmin­ inhibitor, Thrombospondin, Collagen, alpha 2-Makroglobu­ lin, von Willebrand-Faktor, Faktor V, Aktin und Myosin. Besonders bevorzugt wird Fibrin als in situ-Substrat in Form von Fibrinogen, aus dem während der Bestimmung durch Thrombineinwirkung Fibrin entsteht, verwendet.As a transglutaminase substrate, any physiological substrate of the respective transglutaminase of interest can be used in the context of the invention. The substrates fibrin, fibronectin, alph a 2 plasmin inhibitor, thrombospondin, collagen, alph a 2 macroglobulin, von Willebrand factor, factor V, actin and myosin are suitable for determining the physiologically particularly important trans aminase blood coagulation factor XIII. Fibrin is particularly preferably used as an in situ substrate in the form of fibrinogen, from which fibrin is formed during the determination by the action of thrombin.

In der flüssigen wie in der festen Phase wird vorzugs­ weise das gleiche Enzymsubstrat verwendet, obwohl dies nicht erfindungswesentlich ist und es allein darauf ankommt, daß das Substrat von dem jeweils zu bestimmen­ den Enzym überhaupt als Substrat verwendet wird. Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verknüpft das Enzym in einer Art Vernetzungsreaktion die beiden Substrate, das in der flüssigen Phase vorliegende markierte Substrat und das an der festen Phase gebun­ dene Substrat, miteinander. Nach Trennung der Phasen kann das durch die Vernetzungsreaktion an die feste Phase gebundene markierte Substrat anhand seiner Mar­ kierung bestimmt werden. Die Menge an vernetztem mar­ kiertem Substrat korreliert dabei der gesuchten Enzym­ aktivität. Setzt man dabei eine bekannte Menge an markiertem gelöstem Substrat ein, so kann auch die in Lösung verbliebene Substratmenge als Maß für die Be­ stimmung der Enzymaktivität herangezogen werden. Zur Markierung geeignet sind beispielsweise radioaktive Isotope wie z.B. Jodisotope, Farbstoffe, Fluoreszenz­ farbstoffe, Enzyme, sowie die Partner von physiologi­ schen Bindungspaaren wie z.B. Biotin/Streptavidin oder Antigen/Antikörper. Bevorzugt wird im Rahmen der Erfin­ dung als Markierung einer der Partner des Bindepaares Biotin/Streptavidin. Der Nachweis kann dann in an sich bekannter Weise mit dem anderen Bindepartner, der in eine bestimmbare Form gebracht wird, erfolgen, bei­ spielsweise durch Kupplung an ein bestimmbares Enzym wie Peroxidase. Daher wird bevorzugt im Rahmen der Faktor XII-Bestimmung als markiertes lösliches Substrat Biotin/Fibrinogen verwendet und mit einem Peroxidase- Streptavidin-Konjugat unter Anwendung der üblichen Peroxidase-Bestimmungsmethode nachgewiesen. Die Bestim­ mung von Peroxidase über Farbreaktionen ist dem Fach­ mann geläufig und bedarf hier keiner näheren Beschrei­ bung.Preference is given to the liquid and solid phases wise used the same enzyme substrate, though this is not essential to the invention and it alone arrives to determine the substrate of each the enzyme is used as a substrate at all. in the This links within the scope of the method according to the invention Enzyme in a kind of crosslinking reaction the two Substrates that are in the liquid phase marked substrate and that on the solid phase their substrate. After separation of the phases can do that through the crosslinking reaction to the solid Phase bound labeled substrate based on its mar be determined. The amount of networked mar The substrate in question correlates with the enzyme sought  activity. Assume a known amount marked dissolved substrate, the in Solution remaining amount of substrate as a measure of the loading enzyme activity. To Radioactive markings are suitable, for example Isotopes such as Iodine isotopes, dyes, fluorescence dyes, enzymes, and the partners of physiologi binding pairs such as Biotin / streptavidin or Antigen / antibody. Is preferred in the context of the Erfin dung as a marker of one of the partners of the binding pair Biotin / streptavidin. The evidence can then be in itself known manner with the other binding partner, which in a definable form is brought about for example by coupling to a determinable enzyme like peroxidase. It is therefore preferred in the context of Factor XII determination as labeled soluble substrate Biotin / fibrinogen used and with a peroxidase Streptavidin conjugate using the usual Peroxidase determination method detected. The determinations Peroxidase via color reactions is the subject familiar and requires no further description here exercise.

Zur Markierung der gelösten Substrate mittels Biotin hat sich besonders Biotin-ε-Aminocapronsäure-N-hydroxy­ succinimid-Ester (B-X-NHS) als vorteilhaft erwiesen, da es die biologische Aktivität der empfindlichen Substrate wie z.B. Fibrinogen aufrecht erhält. Für die Verwendung als Substrat wird Fibrinogen zweckmäßig in gereinigter Form verwendet. Zur Reinigung eignet sich insbesondere das Verfahren gemäß Mahn, I. und Müller-Berghaus, G., Studies on catabolism of 125-1-labelled fibrinogen in normal rabbits and in rabbits with indwelling intra­ venous catheters: Methodologic aspects. Haemostasis 4: 40-50 (1975)). Biotin- ε- aminocaproic acid-N-hydroxy succinimide ester (BX-NHS), in particular, has proven to be advantageous for labeling the dissolved substrates with biotin, since it maintains the biological activity of the sensitive substrates, such as fibrinogen. Fibrinogen is expediently used in a purified form for use as a substrate. The method according to Mahn, I. and Müller-Berghaus, G., Studies on catabolism of 125-1-labeled fibrinogen in normal rabbits and in rabbits with indwelling intra venous catheters: Methodologic aspects is particularly suitable for cleaning. Haemostasis 4: 40-50 (1975)).

Wird beim Verfahren der Erfindung die an die feste Phase durch die Vernetzungsreaktion gebundene Markie­ rung bestimmt, so hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die feste Phase mit einer gepufferten Lösung einer chaotropen Substanz, insbesondere mit einer Harnstoff­ lösung oder mit verdünnter Säure von nicht gebundenem löslichem Substrat zu reinigen.Is in the method of the invention to the fixed Markie bound by the crosslinking reaction determined, it has proven to be advantageous the solid phase with a buffered solution chaotropic substance, especially with a urea solution or with dilute acid from unbound to clean soluble substrate.

Als feste Phase und Träger des in fester Phase vorlie­ genden Substrates eignen sich die üblicherweise für Enzymreaktionen geeigneten Substrate wie z.B. Träger­ material auf Basis von Kohlenhydraten wie Agarose, Cellulose, Stärke oder dgl. oder auf Basis von Kunst­ stoffen, wie sie insbesondere für Mikrotiterplatten verwendet werden. Die Bindung des Substrates an den festen Träger kann adsorptiv, durch Ausbildung einer kovalenten Bindung mit dem Substrat oder durch Vernet­ zung des Substrats auf der Trägeroberfläche erfolgen. Aufgrund der Einfachheit der Herstellung und der unmit­ telbaren Anwendbarkeit für das erfindungsgemäße Verfah­ ren eignet sich besonders die adsorptive Bindung an Mikrotiterplatten.As a solid phase and carrier of the solid phase The usual substrates are usually suitable for Substrates suitable for enzyme reactions, e.g. Carrier material based on carbohydrates such as agarose, Cellulose, starch or the like or based on art substances such as those used in particular for microtiter plates be used. The binding of the substrate to the solid carriers can be adsorptive, by forming a covalent bond with the substrate or by Vernet tion of the substrate on the support surface. Because of the simplicity of manufacture and the immit applicable applicability for the inventive method The adsorptive bond is particularly suitable Microtiter plates.

Um unspezifische Bindungen von löslichem Substrat zu unterdrücken, wird die Trägeroberfläche vorteilhaft mit einem nicht quervernetzbaren unspezifischen Protein wie Rinderserumalbumin oder Milchprotein behandelt bzw. beschichtet.To make non-specific bindings of soluble substrate suppress, the carrier surface is advantageous with a non-cross-linkable non-specific protein such as Bovine serum albumin or milk protein treated or coated.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zur Bestimmung der Aktivität von Transglutaminasen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein festpha­ sengebundenes physiologisches Transglutaminasesubstrat und ein wasserlösliches markiertes physiologisches Transglutaminasesubstrat enthält. Another object of the invention is a reagent to determine the activity of transglutaminases, which is characterized in that it is a festpha Sen-bound physiological transglutaminase substrate and a water soluble labeled physiological Contains transglutaminase substrate.  

Das festphasengebundene Substrat wird zweckmäßigerweise hergestellt unter Verwendung einer Lösung, die etwa 0,1 bis 10 mg/l Substrat enthält und mit dem festen Träger kontaktiert wird unter Bindung des Substrats. Bei adsorptiver Bindung am Träger führt dies zu einer ausreichenden Beladung desselben. Bei Mikrotiterplatten als Träger und adsorptiver Bindung ergaben 0,5 bis 5 g Substrat/ Napf (well) gute Ergebnisse. Das lösliche markierte Substrat wird allgemein in einer Konzentration von 0,05 bis 10 mg/ml, vorzugsweise 0,5 bis 2 mg/ml eingesetzt.The solid-phase-bound substrate is expediently prepared using a solution that is about 0.1 contains up to 10 mg / l substrate and with the solid carrier is contacted with binding of the substrate. At This leads to an adsorptive bond on the carrier sufficient loading of the same. For microtiter plates as a carrier and adsorptive bond gave 0.5 to 5 g Substrate / bowl (well) good results. The soluble labeled substrate is generally in a concentration from 0.05 to 10 mg / ml, preferably 0.5 to 2 mg / ml used.

Ein bevorzugtes Reagenz, welches für die Aktivitätsbe­ stimmung von Faktor XIII geeignet ist, enthält an eine feste Phase gebundenes Fibrinogen, markiertes lösliches Fibrinogen und Thrombin.A preferred reagent which is used for the activity factor XIII is suitable, contains on a solid phase bound fibrinogen, labeled soluble Fibrinogen and thrombin.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält dieses Reagenz als lösliches Substrat Biotin-Fibrinogen, sowie, vor Gebrauch davon getrennt, Streptavidin-Peroxi­ dase-Konjugat und ein Nachweissystem für Peroxidase.In a particularly preferred embodiment, contains this reagent as soluble substrate biotin fibrinogen, and, separately before use, streptavidin-Peroxi dase conjugate and a detection system for peroxidase.

Durch die Erfindung wird eine einfache, rasch durchführ­ bare Bestimmung der Transglutaminasen-Aktivität ermög­ licht, die für die Diagnose und die Therapie einer mit den Transglutaminasen verbundenen Erkrankungen vorteil­ haft angewendet werden kann.The invention is simple, quick to perform bare determination of transglutaminase activity enables light for the diagnosis and therapy of a diseases associated with transglutaminases can be applied.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung in Verbindung mit der beigefügten Zeichnung weiter. In dieser stellen dar:The following examples illustrate the invention in Continue with the attached drawing. In these represent:

Fig. 1 eine graphische Darstellung der im Peroxidase­ substrat gemessenen Adsorption gegen die Zeit bei der in Beispiel 1 beschriebenen Bestimmung der Faktor XIII-Aktivität, Fig. 1 is a graphical representation of the peroxidase substrate adsorption measured against time in the manner described in Example 1 Determination of factor XIII activity,

Fig. 2 eine Eichkurve zur Bestimmung der Faktor XIII- Aktivität in Plasmaproben gemäß Beispiel 2, bei der die Faktor XIII-Aktivität als Prozent bezogen auf 100% Poolplasma angegeben ist. Fig. 2 is a calibration curve for the determination of factor XIII activity is expressed in plasma samples according to Example 2, wherein the factor XIII activity related as a percentage to 100% pooled plasma.

Beispiel 1example 1

Bestimmung der Faktor XIII-AktivitätDetermination of factor XIII activity

  • A) Herstellung eines Biotin-Fibrinogen-Konjugates als lösliches Substrat
    B-X-NHS wird in 30% Dimethylformamid gelöst. Die Fibrinogenlösung hat eine Konzentration von 2 mg/ml.    A) Preparation of a biotin-fibrinogen conjugate as a soluble substrate
    BX-NHS is dissolved in 30% dimethylformamide. The fibrinogen solution has a concentration of 2 mg / ml.
  • Gleiche Volumenteile der beiden Lösungen werden zusam­ mengegeben und reagieren 4 Stunden bei 21°C. In dieser Zeit erfolgt die Verknüpfung von Biotin-X-Molekülen mit den Aminogruppen des Fibrinogens. Die Lösung biotini­ lierten Fibrinogens wird anschließend bei 4°C über Nacht gegen einen phosphathaltigen Puffer dialysiert. Nicht konjugiertes B-X-NHS wird durch Gelfiltration auf Sephadex G 25 entfernt.The same volume parts of the two solutions are combined given and react for 4 hours at 21 ° C. In this The linkage of biotin X molecules takes place over time the amino groups of fibrinogen. The biotini solution gated fibrinogen is then over at 4 ° C. Dialyzed overnight against a phosphate-containing buffer. Unconjugated B-X-NHS is broken down by gel filtration Sephadex G 25 removed.
  • Das eingesetzte molare Verhältnis Biotin : Fibrinogen beträgt 5 : 1 während der Konjugation. Nach 4 Stunden Reaktionszeit sind 60% des B-X-NHS gekoppelt, d.h. ein Fibrinmolekül trägt 2 bis 3 Biotinmoleküle.The molar ratio of biotin: fibrinogen used is 5: 1 during conjugation. After 4 hours Response time is coupled to 60% of the B-X-NHS, i.e. a Fibrin molecule carries 2 to 3 biotin molecules.
  • Niedere oder höhere Konjugationszeiten sowie Veränderun­ gen des molaren Verhältnisses Biotin:Fibrinogen haben sich als weniger günstig erwiesen. Lower or higher conjugation times and changes have the biotin: fibrinogen molar ratio turned out to be less favorable.  
  • B) Herstellung des in fester Phase vorliegenden Sub­ strats
    Pro Testansatz werden 20:1 einer Fibrinogenlösung mit 1 mg/ml für 2 Std. auf Mikrotiterplatten adsorbiert. Nach einem Waschschritt mit Kalzium-haltigem Puffer werden freie Bindungsstellen mit 5% Rinder-Serum-Albu­ min für 2 Stunden abgesättigt und dann nochmals gewa­ schen.    B) Preparation of the present in the solid phase sub strate
    For each test batch, 20: 1 of a fibrinogen solution with 1 mg / ml is adsorbed on microtiter plates for 2 hours. After a washing step with calcium-containing buffer, free binding sites are saturated with 5% bovine serum albumin for 2 hours and then washed again.
  • C) Durchführung der Aktivitätsbestimmung
    100 µl Probelösung (Plasma, Zellysate, Gewebeextrakte) werden in jede Vertiefung der nach B hergestellten Mikrotiterplatte vorgelegt, 100 µl Biotin-Fibrinogen zugegeben, gemischt und die Transamidierung durch Zugabe von 50 µl Rinderthrombin (5 NIHU ml in 20 mM CaCl2) gestartet. Nach 5minütiger Inkubationszeit werden alle nicht kovalent gebundenen Biotin-Fibrin- Moleküle durch einen 4 M Harnstoffpuffer ausgewaschen. Zu Detektierung der verbliebenen Biotin-Fibrin-Moleküle wird eine Streptavidin-konjugierte Peroxidase in bekann­ ter Weise am Biotin-Fibrin gebunden und die Änderung der optischen Dichte einer Lösung von Peroxidasesubstrat gemessen.    C) Carrying out the activity determination
    100 µl sample solution (plasma, cell lysates, tissue extracts) are placed in each well of the microtiter plate prepared according to B, 100 µl biotin fibrinogen added, mixed and the transamidation started by adding 50 µl bovine thrombin (5 NIHU ml in 20 mM CaCl 2 ). After an incubation period of 5 minutes, all non-covalently bound biotin-fibrin molecules are washed out with a 4 M urea buffer. To detect the remaining biotin-fibrin molecules, a streptavidin-conjugated peroxidase is bound to the biotin-fibrin in a known manner and the change in the optical density of a solution of peroxidase substrate is measured.
Beispiel 2Example 2 Faktor XIII-Bestimmung in humanen PlasmaprobenFactor XIII determination in human plasma samples

Auf der gleichen Mikrotiterplatte, auf der auch die zu untersuchenden Plasmaproben gemessen werden, erfolgt zunächst die Bestimmung der Faktor XIII-Aktivität von Poolplasmaproben in unterschiedlichen Verdünnungsstufen (molares Verhältnis Poolplasma : Verdünnungspuffer 1 : 10, 1 : 15, 1 : 20 und 1 : 30). Trägt man die Extinktionswerte der Proben gegen die Meßzeit in einem Diagramm auf, ergeben sich Kurvenverläufe, deren Absolutwert umso höher ist, je konzentrierter das jeweils verwendete Poolplasma war (Fig. 1). Zur Gewinnung einer Eichkurve werden in einem weiteren Diagramm die Extinktionswerte zum Zeitpunkt 120 Minuten gegen das Verdünnungsverhält­ nis der Proben aufgetragen (Fig. 2). Durch Ablesen der 120 Minuten-Werte der im molaren Verhältnis Plasmapro­ be : Verdünnungspuffer 1 : 10 verdünnten Plasmaproben erhält man Prozentwerte der in der jeweiligen Probe enthaltenen Thrombin-induzierbaren Faktor XIII-Aktivi­ tät bezogen auf das verwendete Poolplasma.The factor XIII activity of pool plasma samples is first determined in different dilution levels (molar ratio pool plasma: dilution buffer 1:10, 1:15, 1:20 and 1:30) on the same microtiter plate on which the plasma samples to be examined are also measured ). If the extinction values of the samples are plotted against the measuring time in a diagram, curve profiles are obtained whose absolute value is higher the more concentrated the pool plasma used was ( FIG. 1). To obtain a calibration curve, the extinction values at 120 minutes are plotted against the dilution ratio of the samples in a further diagram ( FIG. 2). By reading the 120 minute values of the plasma samples diluted 1:10 in the molar ratio of plasma sample: dilution buffer, percentages of the thrombin-inducible factor XIII activity contained in the respective sample are obtained based on the pool plasma used.

Claims (9)

1. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Trans­ glutaminasen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung eines physiologischen Substra­ tes der zu bestimmenden Transglutaminase, welches eine Markierung trägt, mit einem in fester Phase vorliegenden Substrat des Enzyms in Gegenwart der zu untersuchenden Probe inkubiert, die Phasen trennt und die in der festen oder in der flüssigen Phase vorliegende Markierung als Maß der Trans­ glutaminase-Aktivität bestimmt.1. A method for determining the activity of trans glutaminases, characterized in that a solution of a physiological substrate of the transglutaminase to be determined, which carries a label, is incubated with a solid phase of the enzyme in the presence of the sample to be examined, the Separates phases and determines the mark present in the solid or in the liquid phase as a measure of the trans glutaminase activity. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in flüssiger und in fester Phase das gleiche Enzymsubstrat verwendet.2. The method according to claim 1, characterized, that in the liquid and in the solid phase same enzyme substrate used. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Substrat für die Transglutaminase Faktor XIII Fibrinogen verwendet und in Gegenwart von Thrombin inkubiert.3. The method according to claim 1 or 2, characterized, that as a substrate for transglutaminase Factor XIII fibrinogen used and in the presence incubated by thrombin. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Markierung einen Partner des Bindepaa­ res Biotin/Streptavidin verwendet und die Markie­ rung mit einem Konjugat aus dem anderen Bindungs­ partner und einem nachweisbaren Enzym bestimmt. 4. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that as a marker a partner of the Bindepaa res biotin / streptavidin used and the markie tion with a conjugate from the other binding partner and a detectable enzyme.   5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Markierungsenzym Peroxidase verwendet.5. The method according to claim 4, characterized, that one uses peroxidase as the labeling enzyme. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die an die feste Phase gebundene Markierung bestimmt und nicht kovalent gebundenes markiertes Substrat durch eine gepufferte Lösung chaotroper Substanzen, insbesondere eine Harnstofflösung oder verdünnte Säure von der festen Phase entfernt.6. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that the label bound to the solid phase determined and not covalently bound labeled Substrate chaotroped by a buffered solution Substances, especially a urea solution or dilute acid removed from the solid phase. 7. Reagenz zur Bestimmung der Aktivität von Transglut­ aminasen, dadurch gekennzeichnet, daß es ein festphasengebundenes physiologisches Transglutaminasesubstrat und ein wasserlösliches markiertes physiologisches Transglutaminasesub­ strat enthält.7. Reagent for determining the activity of transglut aminases, characterized, that it's a solid-state physiological Transglutaminase substrate and a water soluble labeled physiological transglutaminase sub strat contains. 8. Reagenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es zum Nachweis von Faktor XIII an eine feste Phase gebundenes Fibrinogen, markiertes lösliches Fibrinogen und Thrombin enthält.8. reagent according to claim 7, characterized, that it is for the detection of factor XIII on a fixed Phase bound fibrinogen, labeled soluble Contains fibrinogen and thrombin. 9. Reagenz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das lösliche markierte Fibrinogen ein Fibrino­ gen-Biotin-Konjugat ist und getrennt davon Strept­ avidin-konjugierte Peroxidase und Peroxidasesub­ strat enthält.9. Reagent according to claim 8, characterized, that the soluble labeled fibrinogen is a fibrino is a gene-biotin conjugate and is Strept separately avidin-conjugated peroxidase and peroxidase sub strat contains.
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