DE3827477A1

DE3827477A1 - Process for the isolation and cultivation alone of human corneal endothelial cells (HCEC)

Info

Publication number: DE3827477A1
Application number: DE19883827477
Authority: DE
Inventors: Peter Dr Friedl; Katrin Dr Engelmann
Original assignee: GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 3300 BRAUNSCHWEIG DE
Current assignee: GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 3300 BRAUNSCHWEIG DE
Priority date: 1988-08-12
Filing date: 1988-08-12
Publication date: 1990-02-22

Abstract

The invention relates to a process for the isolation and cultivation alone of human corneal endothelial cells (HCEC).

Description

Das Endothel der menschlichen Hornhaut besteht aus Zellen, die in vivo keine oder nur geringe Teilungsaktivität zeigen. Die optimale Dichte der Endothelialzellen ist jedoch Voraus setzung für die Funktionstüchtigkeit der Hornhaut und damit der Sehfähigkeit des Auges. Dadurch kommt dem Endothel in der Klinik bei Erkrankungen und Verletzungen der Hornhaut, bei Operationen am Auge und insbesondere bei Hornhauttransplanta tionen (Keratoplastiken) eine große Bedeutung zu, da sinkende Zelldichten des Endothels unbedingt vermieden werden müssen. Zudem wurde im letzten Jahrzehnt zunehmend deutlich, daß Zel len des gleichen Typs, nämlich corneale Endothelialzellen, die jedoch aus Rinderaugen isoliert wurden, eine große Bedeu tung für die zellbiologische und biochemische Forschung er halten haben, da diese Zellen eine sehr starke subendo theliale Matrix bilden, die auf andere Zellen einen stark wachstumsfördernden Effekt zeigt, wobei die Charakterisierung der Matrix erst teilweise gelungen ist; zum wachstumsfördern den Effekt vgl. beispielsweise J. Clin. Invest., 65 (1980) 1351.The endothelium of the human cornea consists of cells which show little or no division activity in vivo. However, the optimal density of the endothelial cells is ahead setting for the functionality of the cornea and thus the eyesight. This brings the endothelium in the Clinic for diseases and injuries to the cornea, at Operations on the eye and especially on the corneal transplant tion (keratoplasty) are of great importance, as sinking Endothelial cell densities must be avoided at all costs. In addition, it has become increasingly clear in the past decade that Zel len of the same type, namely corneal endothelial cells, which, however, were isolated from cattle eyes, a great concern for cell biological and biochemical research hold because these cells have a very strong subendo form the thelial matrix, which is strong on other cells shows growth-promoting effect, the characterization the matrix was only partially successful; to promote growth the effect cf. for example J. Clin. Invest., 65 (1980) 1351.

Aus den vorstehenden Ausführungen ergibt sich, daß die Iso lierung und Züchtung von Endothelialzellen der menschlichen Hornhaut ein großes Anliegen ist, dessen Realisierung erst mals 1979 beschrieben wurde, sich jedoch noch immer als äußerst schwierig erweist; vgl. Arch. Ophthalmol., 97 (1979) 1136. Insbesondere konnten bisher noch keine geeigneten Iso lations- und Kulturbedingungen gefunden werden, die eine Ver mehrung dieser Zellen über einen längeren Zeitraum in vitro ermöglichen. Weiterhin wurde die Etablierung von Zell-Rein kulturen durch die Koisolierung von fibroblasten-ähnlichen Zellen verhindert, die ein deutlich besseres Wachstum zeigen.It follows from the above that the Iso Formation and cultivation of human endothelial cells Cornea is a major concern, the realization of which is first was described in 1979, but still shows itself as proves extremely difficult; see. Arch. Ophthalmol., 97 (1979) 1136. In particular, no suitable Iso lation- and culture conditions can be found that a Ver proliferation of these cells over a longer period of time in vitro enable. Furthermore, the establishment of Zell-Rein cultures by co-isolating fibroblast-like Prevents cells that show significantly better growth.

Da eine typische Eigenschaft cornealer Endothelialzellen in vivo ihre feste Anheftung auf Basalmembranen ist, erforderte die Isolierung der Zellen für die Etablierung von Primärkul turen bisher den Einsatz sehr drastischer Maßnahmen, bei spielsweise eine mechanische Isolierung oder Einsatz hochkonzentrierter Enzymlösungen. Dadurch wird die Lebens fähigkeit der Zellen jedoch so herabgesetzt, daß eine Vermeh rung in vitro nur in Ausnahmefällen möglich ist, nämlich bei Zellen, die von Hornhäuten junger Spender oder von Embryonen isoliert wurden; vgl. beispielsweise J. Cell. Sci., 66 (1984) 343.Because a typical property of corneal endothelial cells in vivo their firm attachment to basement membranes is required the isolation of the cells for the establishment of primary cul hitherto the use of very drastic measures for example mechanical insulation or insert highly concentrated enzyme solutions. This will make life ability of the cells, however, so reduced that a Vermeh in vitro is only possible in exceptional cases, namely at Cells from corneas of young donors or from embryos were isolated; see. for example J. Cell. Sci., 66 (1984) 343.

Aufgabe der Erfindung ist es, den Stand der Technik zu verbessern. Diese Aufgabe wird gemäß einer Ausführungsform der Erfindung durch ein Verfahren zur Isolierung von Endothelialzellen der menschlichen Hornhaut (HCEC) gelöst, bei dem man die Hornhaut mit einer Collagenase-Lösung behandelt.The object of the invention is to improve the prior art improve. This task is accomplished according to one embodiment the invention by a method for isolating Endothelial cells of the human cornea (HCEC) dissolved, in which the cornea is treated with a collagenase solution treated.

Man kann dabei mit einer Lösung einer Collagenase-Konzentra tion von 0,02 bis 0,5, vorzugsweise 0,01 bis 0,1 und insbe sondere 0,04 bis 0,02% (Gewichtsbasis) 10 bis 30, vorzugs weise 15 bis 20 und insbesondere 16 bis 17 h lang behandeln.You can do this with a solution of a collagenase concentration tion of 0.02 to 0.5, preferably 0.01 to 0.1 and esp especially 0.04 to 0.02% (weight basis) 10 to 30, preferably Treat for 15 to 20 hours, especially 16 to 17 hours.

Man kann aber auch zuerst mit einer Lösung einer Collagenase- Konzentration von 0,1 bis 1, vorzugsweise 0,2 bis 0,8 und insbesondere etwa 0,5% (Gewichtsbasis) 0,5 bis 2 und vor zugsweise etwa 1 h behandeln und danach zusätzlich eine vor stehend beschriebene Behandlung vorsehen. But you can also first with a solution of a collagenase Concentration from 0.1 to 1, preferably 0.2 to 0.8 and especially about 0.5% (weight basis) 0.5 to 2 and above Treat for about 1 hour and then add one before Provide treatment as described above.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht erstmals die scho nende Isolierung von Endothelialzellen. Nur die erfindungsge mäße Langzeitinkubation ermöglicht die Isolierung einer genü genden Anzahl von Zellen (bis etwa 200 000 pro Hornhaut), um eine Primärkultur anlegen zu können. Außerdem bleibt durch die erfindungsgemäße Behandlung die Vitalität der Zellen er halten, so daß erstmals eine mehrfache Subkultivierung der Zellen möglich wird.The method according to the invention enables scho for the first time Isolation of endothelial cells. Only the fiction moderate long-term incubation enables the isolation of a gen number of cells (up to about 200,000 per cornea) to be able to create a primary culture. It also remains the treatment according to the invention the vitality of the cells hold so that for the first time multiple subcultivation of the Cells becomes possible.

Die Wahl der Collagenase stellt einen glücklichen Griff dar, da beispielsweise mit Trypsin die Lebens- und Proliferations fähigkeit so stark vermindert wird, daß eine Subkultivierung kaum möglich ist (die Zellen zeigen stark verlängerte Genera tionszeiten) oder unmöglich wird.The choice of the collagen nose is a happy touch, because with trypsin, for example, life and proliferation ability is reduced so much that sub-cultivation is hardly possible (the cells show greatly elongated genera times) or becomes impossible.

Die Kontamination von Primärkulturen durch Fibroblasten ist ein bekanntes Problem der Zellzüchtung. Man kann diesem Problem dadurch begegnen, daß man Kulturmedien einsetzt, in denen die für das Wachstum von Fibroblasten essentielle Aminosäure L-Valin durch D-Valin ersetzt wird; vgl. bei spielsweise Cell, 5 (1975) 11. Die Wirksamkeit dieses Kultur systems wird allerdings dadurch eingeschränkt, daß für die Züchtung von menschlichen Zellen Serum zugesetzt werden muß, das sowohl L-Valin als auch Wachstumsfaktoren enthält, die die Proliferation von Fibroblasten fördern, beispielsweise den Plateled-Derived-Growth-Factor.The contamination of primary cultures by fibroblasts is a well-known problem of cell growth. You can do this Counter problem by using culture media in those that are essential for the growth of fibroblasts Amino acid L-valine is replaced by D-valine; see. at for example Cell, 5 (1975) 11. The effectiveness of this culture systems is limited by the fact that for the Cultivation of human cells must be added to serum that contains both L-valine and growth factors that promote fibroblast proliferation, for example the plateled derived growth factor.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird nun ein Verfahren zur alleinigen Züchtung von Endothelialzellen der menschlichen Hornhaut (HCEC) vorgesehen, bei dem man ein Medium, das verunreinigende Zellen (insbesondere Fibro blasten) eliminiert und frei von Fibroblasten-Proliferation fördernden Wachstumsfaktoren ist, mit einem Gehalt an Serum verwenden,According to a further embodiment of the invention a method for the sole cultivation of endothelial cells the human cornea (HCEC), where one Medium containing contaminating cells (especially fibro blasts) eliminated and free of fibroblast proliferation is promoting growth factors, containing serum use,

(a) aus dem L-Valin und(a) from the L-valine and

(b) die Wachstumsfaktoren entfernt worden sind. Beispiele sind Medien auf Basis von Ham-F12, Medium-199, Minimum Essential-Medium (MED), Isove′s-Modified-MEM und/oder RPMI 1640. Diese Medien bieten optimales Zellwachstum mit Zell dichten von 4 bis 6 x 10⁴ und Generationszeiten von 24 bis 50 h, wobei sich eine Mischung (1:1) von Ham-F12 mit Medium-199 als besonders geeignet erwies.(b) the growth factors have been removed. Examples are media based on Ham-F12, Medium-199, Minimum Essential-Medium (MED), Isove's Modified MEM and / or RPMI 1640. These media offer optimal cell growth with cell densities of 4 to 6 x 10 ⁴ and generation times of 24 to 50 hours, a mixture (1: 1) of Ham-F12 with Medium-199 proving particularly suitable.

Beispielsweise kann man ein Medium mit einem Gehalt an Serum verwenden, aus dem L-Valin durch Dialyse entfernt worden und ggf. ein Großteil gleichzeitig entfernter niedermolekularer Substanzen durch Rückdialyse rückgeführt worden ist. Die Ent fernung von L-Valin läßt sich beispielsweise durch mehrmalige Dialyse gegen Wasser und die Rückführung niedermolekularer Substanzen beispielsweise durch Rückdialyse gegen ein von L- Valin freies Medium erreichen.For example, you can use a medium containing serum use, has been removed from the L-valine by dialysis and possibly a large part of simultaneously removed low molecular weight Substances have been recycled through reverse dialysis. The Ent Removal of L-valine can be done, for example, by repeated Dialysis against water and the return of low molecular weight Substances, for example, by back dialysis against one of L- Reach valine free medium.

Ferner kann man ein Medium mit einem Gehalt an Serum verwen den, aus dem die Wachstumsfaktoren durch Adsorption an einer Adsorbersubstanz entfernt worden sind. Beispiele für derartige Adsorbersubstanzen sind die verschiedenen Chromatographiematerialien, wie Sephadexe, wie Carboxymethyl- Sephadex (CM-Sephadex), beispielsweise Carboxymethyl- Sephadex-C50 (etwa vom pH 6,0, beispielsweise bei Pufferung mit Natriumphosphat). Die Verwendung von Medien mit einem Ge halt an erfindungsgemäß vorbehandelten Seren reduziert die Wachstumsbedingungen für Fibroblasten so stark, daß diese Zellen nach 4 bis 6 Passagen aus den Endothelialzell-Kulturen eliminiert sind. Was die Teilungsaktivität der Endothelial zellen betrifft, so sind die erfindungsgemäß vorbehandelten Seren in Konzentrationen von 10 bis 30 Gew.-% (auf Basis des Mediums) besonders förderlich.A medium containing serum can also be used the from which the growth factors by adsorption on a Adsorber substance have been removed. examples for such adsorbent substances are the different Chromatography materials, such as Sephadexe, such as carboxymethyl Sephadex (CM-Sephadex), for example carboxymethyl Sephadex-C50 (around pH 6.0, e.g. when buffering with sodium phosphate). The use of media with a Ge holding on sera pretreated according to the invention reduces the Growth conditions for fibroblasts so strong that they Cells after 4 to 6 passages from the endothelial cell cultures are eliminated. As for the division activity of the endothelial cells, the pretreated according to the invention Sera in concentrations of 10 to 30 wt .-% (based on the Medium) is particularly beneficial.

Beispiele für Seren sind NCS, FCS und Humanseren, wobei NCS/FCS-Gemische bevorzugt werden, beispielsweise in einer Menge von jeweils 7,5 Gew.-%. Auch Humanserum wirkt prolife rationsfördernd, jedoch erweisen sich die beiden anderen Seren und deren Gemische bei der Begutachtung der Zellen nach morphologischen Kriterien als bevorzugt. Examples of sera are NCS, FCS and human sera NCS / FCS mixtures are preferred, for example in a Amount of 7.5% by weight. Human serum also has a prolife effect ration-promoting, but the other two prove to be Sera and mixtures thereof when the cells are examined morphological criteria as preferred.

Weiterhin wird das Wachstum der Endothelialzellen durch Zugabe von Fibroblasten-Wachstumsfaktor, DMSO, Chondroitin sulfat, konditioniertem Tumorzellen-Medium (frei von L-Valin) und/oder Gentamycin gefördert. Als Fibroblasten-Wachstums faktor eignet sich beispielsweise eine aus Schweinehirn iso lierte Fraktion mit einem Gehalt an Fibroblasten-Wachstums faktor (FGF), deren Optimum bei etwa 0,4 µg/ml Kulturmedium liegt; vgl. auch J. Biol. Chem., 253 (1978) 1222, DMSO kann man beispielsweise in einer Menge von 0,004 Gew.-% zusetzen. Der Zusatz von Chondroitinsulfat zum Medium kann beispielsweise im Bereich von 0,03 bis 0,1 Gew.-% liegen. Bei dem konditionierten Tumorzellen-Medium kann es sich um ein Hepatoma-Zell-Medium in einer Menge von beispielsweise etwa 10 Gew.-% handeln.Furthermore, the growth of the endothelial cells is carried out Add fibroblast growth factor, DMSO, chondroitin sulfate, conditioned tumor cell medium (free of L-valine) and / or gentamycin promoted. As fibroblast growth For example, a factor made of pig brain iso is suitable gated fraction containing fibroblast growth factor (FGF), its optimum at around 0.4 µg / ml culture medium lies; see. also J. Biol. Chem., 253 (1978) 1222, DMSO to add, for example, in an amount of 0.004% by weight. The addition of chondroitin sulfate to the medium can for example in the range from 0.03 to 0.1% by weight. At the conditioned tumor cell medium can be a Hepatoma cell medium in an amount of about, for example Trade 10 wt .-%.

Es hat sich gezeigt, daß sich nach vollständiger Eliminierung der Fibroblasten durch die Selektionierung und ferner ggf. klonale Aussaat der Endothelialzellen (4 bis 6 Passagen) die Kulturbedingungen durch einen Wechsel auf ein Medium mit einem Gehalt an L-Valin (gegebenenfalls frei von D-Valin) noch weiter verbessern lassen. So läßt sich eine Langzeitkultivierung von mehr als 10 Passagen mit einer hohen Verdünnung der Zellen bei ihrer Aussaat erreichen.It has been shown that after complete elimination the fibroblasts through the selection and, if necessary, clonal seeding of the endothelial cells (4 to 6 passages) Culture conditions by changing to a medium with containing L-valine (possibly free of D-valine) let it improve even further. So one can Long-term cultivation of more than 10 passages with a high Dilute the cells as they are sown.

Interessanterweise läßt sich die Endothelialzellen-Prolifera tion unter Ausbildung der typischen morphologischen Zellmerk male noch weiter dadurch fördern, daß man die Kulturgefäße, die vorzugsweise aus Plastikmaterial bestehen, mit Substraten beschichtet, beispielsweise mit aus Basalmatrizes von Zellen isolierten Substraten, beispielsweise Collagen (wie Typ IV), Laminin und/oder Chondroitinsulfat, beispielsweise durch ein Laminin/Chondroitinsulfat-Gemisch, beispielsweise in einer Menge von etwa 1 µg/500 µg/cm².Interestingly, endothelial cell proliferation can be further promoted by forming the typical morphological cell characteristics by coating the culture vessels, which are preferably made of plastic material, with substrates, for example with substrates isolated from basal matrices of cells, for example collagen (such as type IV ), Laminin and / or chondroitin sulfate, for example by a laminin / chondroitin sulfate mixture, for example in an amount of about 1 µg / 500 µg / cm ² .

Für die unter erfindungsgemäßen Bedingungen in vitro kulti vierten Endothelialzellen lassen sich nach etwa 7 bis 8 Passagen Zelldichten entsprechend einer Zellmenge von 7 bis 10 x 10⁸ Zellen (auf Basis einer einzigen Spenderhornhaut) erreichen.For the fourth endothelial cells cultivated in vitro under the conditions according to the invention, cell densities corresponding to a cell quantity of 7 to 10 × 10 ⁸ cells (based on a single donor cornea) can be achieved after about 7 to 8 passages.

Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläu tert.The invention is explained in more detail below by examples tert.

Example 1: Isolation of HCEC and establishment of a primary culture in a selection medium

Die exzidierte Spenderhornhaut eines 45-jährigen Verstorbenen wird nach etwa zweiwöchiger Organkultur (MEM, angereichert mit 10% FCS und 1% Chondroitinsulfat; inkubiert bei 32°C) wie folgt präpariert. Die Hornhaut wird mit einer isotoni schen Pufferlösung (beispielsweise PBS) abgespült und in ein Loch einer 24-Loch-Gewebekultur-Platte (Greiner) überführt, wobei die Endothelseite nach oben gerichtet ist. Auf das Endothel wird für 1 h eine 0,5-proz. Collagenase-Lösung in PBS gegeben; das Endothel der Hornhaut wird dann mit dem im folgenden näher spezifizierten Selektionsmedium mit einer 20 ml-Spritze abgespült, die mit einer dünnen Kanüle (z.B. Nr. 14) versehen ist. Nach erneutem Spülen in PBS wird das Endo thel nun für 16 bis 17 h mit einer 0,04-proz. Collagenase- Lösung behandelt und entsprechend den vorstehenden Angaben wiederholt mit Medium gespült. Die nach jedem Spülen gewon nenen Zellen werden 5 min lang bei 800 bis 900 U/min ab zentrifugiert und geerntet, wonach man den Überstand absaugt und die Zellen in Selektionsmedium resuspendiert (F12/Iscove′s-Modified-MEM-Gemisch (1:1) frei von L-Valin (= IF; Seromed), jeweils 7,5 Gew.-% dialysiertes und mit CM- Sephadex behandeltes NCS und FCS, 0,08 Gew.-% Chondroitinsul fat, 52,3 mg D-Valin/l, 0,4 µl rohes FGF/ml, 50 µl Genta mycin/ml, 0,04 Gew.-% DMSO und 10 Gew.-% L-Valin freies konditioniertes Hepatoma-Zell-Medium). Die Zellen jedes Präparationsschrittes werden in einem Loch (2 cm²) einer 24- Loch-Platte ausgesät. Die Platte wurde vorher mit einem Lami nin/Chondroitinsulfat-Gemisch in Selektionsmedium (1 µg/500 µg/cm²) beschichtet, 0,5 h lang bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend einmal mit PBS gespült. Die Zellen werden in einem Kohlendioxidbrutschrank bei Kohlendioxidsättigung (5%) und 37°C inkubiert. Das Medium wird alle zwei bis drei Tage gewechselt. Nach vier bis fünf Tagen ist ein dichter, ein schichtiger Zellrasen entstanden; die Primärkultur kann nun subkultiviert werden. Die ko-isolierten Fibroblasten wachsen unter den selektiven Kulturbedingungen nicht, wobei das Ab sterben dieser Zellen mikroskopisch verfolgt werden kann.The excised donor cornea of a 45-year-old deceased is prepared as follows after about two weeks of organ culture (MEM, enriched with 10% FCS and 1% chondroitin sulfate; incubated at 32 ° C). The cornea is rinsed off with an isotonic buffer solution (for example PBS) and transferred into a hole in a 24-hole tissue culture plate (Greiner), with the endothelial side facing upwards. A 0.5 percent is placed on the endothelium for 1 h. Collagenase solution added to PBS; The endothelium of the cornea is then rinsed off with the selection medium specified in more detail below using a 20 ml syringe which is provided with a thin cannula (eg No. 14). After rinsing again in PBS, the Endo thel is now for 16 to 17 h with a 0.04 percent. Collagenase solution treated and repeatedly rinsed with medium according to the information above. The cells obtained after each rinsing are centrifuged and harvested at 800 to 900 rpm for 5 min, after which the supernatant is suctioned off and the cells are resuspended in selection medium (F12 / Iscove's Modified MEM mixture (1: 1 ) free of L-valine (= IF; Seromed), each 7.5% by weight dialyzed and treated with CM-Sephadex NCS and FCS, 0.08% by weight chondroitin sulphate, 52.3 mg D-valine / 0.4 ml of crude FGF / ml, 50 ml of gentamycin / ml, 0.04% by weight of DMSO and 10% by weight of L-valine-free conditioned hepatoma cell medium). The cells of each preparation step are sown in a hole (2 cm ² ) in a 24-hole plate. The plate was previously coated with a lamine / chondroitin sulfate mixture in selection medium (1 ug / 500 ug / cm ² ), incubated for 0.5 h at room temperature and then rinsed once with PBS. The cells are incubated in a carbon dioxide incubator with carbon dioxide saturation (5%) and 37 ° C. The medium is changed every two to three days. After four to five days, a dense, layered cell lawn has developed; the primary culture can now be subcultivated. The co-isolated fibroblasts do not grow under the selective culture conditions, and the death of these cells can be monitored microscopically.

Example 2: Obtaining cell supernatants from HCEC

Es werden HCEC von in Organkultur gehaltenen Spenderhorn häuten gemäß Beispiel 1 isoliert und in Selektionsmedium kul tiviert. Die Primärkulturen werden folgendermaßen subkulti viert. Das Medium wird von den Zellen abgesaugt und der Zell rasen einmal mit PBS gespült. Danach wird ein Film einer 0,05-proz. Trypsin-Lösung (mit 0,02% EDTA) auf die Zellen gegeben und nach einigen Sekunden abgesaugt. Man inkubiert 5 min lang, nimmt die abgelösten Zellen in 2 ml Selektionsme dium auf und sät erneut in einem beschichteten Kulturgefäß (10 cm²; 6-Loch-Platte; Greiner) aus. Nach Konfluenz der Zellen (3 bis 6 Tage) wird erneut subkultiviert; die Zellen werden in einem Verhältnis von 1:4 bis 1:10 in neuen Kulturgefäßen ausgesät. Die Subkultivierung erfolgt bis zur vierten bis sechsten Passage in Selektionsmedium, danach wird auf normales L-Valin enthaltendes Wachstumsmedium umgestellt (M199/F12- bzw. M199/F99-Gemisch (1:1), angereichert mit 10% NCS, 0,08% Chondroitinsulfat, 0,4 µl FGF/ml und 50 µg Genta mycin/ml. Durch die beschriebene Subkultivierung kann man nach etwa 6 Passagen 3 bis 6 x 10⁷ Zellen von einer einzigen Hornhaut isolieren. Diese Zellen werden in Wachstumsmedium in Kulturflaschen (175 cm²) ausgesät. Nach Konfluenz der Zellen (3 bis 4 x 10⁶ Zellen/Flasche) wird das Medium abgesaugt, der Zellrasen einmal mit PBS gespült und serumfreies F99 (40 ml) auf die Zellen gegeben (angereichert mit 0,08 Gew.-% Chondroitinsulfat, 50 µg Gentamycin/ml und 5 µg Transferrin/ml). Die Zellen können so 48 bis 72 h serumfrei gehalten werden, bis die Überstände abgenommen, gesammelt und bei -20°C eingefroren werden. Diese Prozedur kann 4 bis 5 mal wiederholt werden, wenn die Zellen nach dem "Hungern" 4 bis 6 Tage lang erneut mit Wachstumsmedium inkubiert werden.HCEC are isolated from donor corneas kept in organ culture according to Example 1 and cultivated in selection medium. The primary cultures are subcultivated as follows. The medium is aspirated from the cells and the cell lawn is rinsed once with PBS. Then a film of 0.05 percent. Trypsin solution (with 0.02% EDTA) was added to the cells and aspirated after a few seconds. The mixture is incubated for 5 min, the detached cells are taken up in 2 ml of selection medium and sown again in a coated culture vessel (10 cm ² ; 6-hole plate; Greiner). After the confluence of the cells (3 to 6 days), subculturing is carried out again; the cells are sown in a ratio of 1: 4 to 1:10 in new culture vessels. Subculturing takes place in the selection medium up to the fourth to sixth passage, after which the medium is changed to normal L-valine (M199 / F12 or M199 / F99 mixture (1: 1), enriched with 10% NCS, 0.08% Chondroitin sulfate, 0.4 µl FGF / ml and 50 µg Genta mycin / ml. The subcultivation described enables 3 to 6 x 10 ⁷ cells to be isolated from a single cornea after about 6 passages. These cells are grown in growth medium in culture bottles (175 cm ² ) After confluence of the cells (3 to 4 x 10 ⁶ cells / bottle), the medium is suctioned off, the cell lawn is rinsed once with PBS and serum-free F99 (40 ml) is added to the cells (enriched with 0.08% by weight). % Chondroitin sulfate, 50 µg gentamycin / ml and 5 µg transferrin / ml). The cells can be kept serum-free for 48 to 72 h until the supernatants are removed, collected and frozen at -20 ° C. This procedure can be carried out 4 to 5 times to be repeated when the cells are hungry 4 be incubated again with growth medium for up to 6 days.

Abkürzungen:Abbreviations:

HCEC humane corneale Endothelialzellen
FCS fötales Kälberserum
NCS Serum von frisch geborenem Kalb
FGF Fibroblasten-Wachstumsfaktor
DMSO Dimethylsulfoxid
F12 Ham-F12 (Medium)
M199 Medium 199
MEM Minimum-Essential-Medium
RPMI-1640 Medium RPMI-1640
PBS Phosphat-Pufferlösung
EDTA EthylendiamintetraessigsäureHCEC human corneal endothelial cells
FCS fetal calf serum
NCS serum from freshly born calf
FGF fibroblast growth factor
DMSO dimethyl sulfoxide
F12 Ham-F12 (Medium)
M199 Medium 199
MEM minimum essential medium
RPMI-1640 medium RPMI-1640
PBS phosphate buffer solution
EDTA ethylenediaminetetraacetic acid

Claims

1. A method for the isolation of endothelial cells of the human cornea (HCEC), characterized in that the cornea is treated with a collagenase solution.

2. The method according to claim 1, characterized in net that one with a solution of a collagenase concentration tration from 0.002 to 0.5, preferably 0.01 to 0.1 and ins special 0.04 to 0.2% (weight basis) 10 to 30, preferred treated for 15 to 20 and in particular 16 to 17 hours.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that
(a) first treated with a solution of a collagenase concentration of 0.1 to 1, preferably 0.2 to 0.8 and in particular about 0.5% (weight basis) for 0.5 to 2 and preferably about 1 hour and
(b) then treated with a collagenase solution according to claim 2.

4. Process for the sole cultivation of endothelial cells of the human cornea (HCEC), characterized in that a medium containing serum is used which eliminates contaminating cells (in particular fibroblasts) and is free of growth factors which promote fibroblast proliferation,
(a) from the L-valine and
(b) the waxcloth factors have been removed.

5. The method according to claim 4, characterized in net that a medium based on Ham-F12, Medium-199, Minimum Essential Medium (MED), Iscove's Modified MEM and / or RPMI-1640 used.

6. The method according to claim 4 or 5, characterized indicates that a medium containing Serum used to remove L-valine by dialysis has been.

7. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized in that a medium with a Serum content used, from which L-valine ent by dialysis has been removed and much of it removed at the same time low molecular weight substances returned by dialysis has been.

8. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized in that a medium with a Serum content used to determine the growth factors according to claim 4 by adsorption on an adsorbent substance have been removed, for example one Chromatography material like Sephadex and especially CM- Sephadex-C50.

9. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized in that a medium with a Content of NCS, FCS treated according to claim 5, 6 and / or 7 and / or human serum is used.

10. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that a medium with an additional content of fibroblast growth factor, DMSO, chondroitin sulfate, conditioned tumor cell medium (free of L-valine) and / or gentamycin.

11. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that according to Eliminie contaminating cells in a medium containing L-valine cultivated with any untreated serum.

12. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that with synthetic or derived from natural material Substrates, for example with basal matrices of cells isolated substrates such as laminin, collagen and / or Chondroitin sulfate-treated culture vessels are used.