DE3821077A1 - METHOD FOR DETERMINING THE OXYGEN CONTENT IN BIOLOGICAL LIQUID SUBSTRATES AND DEVICE FOR IMPLEMENTING THE METHOD - Google Patents

METHOD FOR DETERMINING THE OXYGEN CONTENT IN BIOLOGICAL LIQUID SUBSTRATES AND DEVICE FOR IMPLEMENTING THE METHOD

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DE3821077A1
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    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase

Abstract

A process and apparatus for determining the oxygen content in a substance, more particularly a biological fluid such as blood. The process employs an oxidoreductase. These enzymes use oxygen as a hydrogen acceptor in the following reaction system which results in the production of hydrogen peroxide: AH2+O2@A+H2O2 (I) The rate of appearance of the products is directly proportionate to the oxygen concentration. The rate of reaction for the products may be measured, for example, by analytical colorimetric techniques. By comparing the rate of appearance of the reaction product(s) in Reaction I against a reaction rate for the appearance of the same in at least one standard of known oxygen concentration, it is possible to determine the oxygen concentration of the substance being tested.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen des Sauerstoffgehaltes eines biologischen Flüssigsubstrats. Insbesondere schafft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des Sauerstoffgehaltes in Flüssigkeiten, wie Blut, und schließt eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in einem Verfahren der trockenen Chemie ein.The invention relates to a method for determining the Oxygen content of a biological liquid substrate. In particular, the invention provides a method for determination the oxygen content in liquids, such as Blood, and includes a device for performing the The inventive method in a dry process Chemistry.

Es ist in der Biologie und damit verwandten Wissenschaften bekannt, daß Sauerstoff wesentlich ist, um den Mitochondrienprozeß der oxidativen Phosphorylierung anzutreiben, wodurch Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP) gespeichert wird. Die Sauerstoffgehalte im Blut schwanken je nach dem Vorrat, der aus den Lungen aufgenommen wird, und nach dem Bedarf der Gewebe. Der größte Teil des Sauerstoffs im Blutstrom wird durch Hämoglobin in den Erythrocyten getragen. Irgendwelche negativen Einflüsse auf einen oder mehrere dieser Parameter können den Gehalt von Blutsauerstoff ändern. Wenn beispielsweise der Blutstrom durch die Lungen gehemmt wird, wie dies bei einer Lungenembolie der Fall ist, kann der Sauerstoffgehalt des Blutes, gemessen durch seinen Partialdruck, entsprechend vermindert sein. Somit ist die Bestimmung von Blutsauerstoffgehalten (sowie des pH-Wertes und des Gehaltes an Kohlendioxid) für ein Bild des Stoffwechsels/respiratorischen Zustands des Körpers bedeutsam.It is in biology and related sciences known that oxygen is essential to the mitochondrial process to drive oxidative phosphorylation, whereby energy in the form of adenosine triphosphate (ATP) is saved. The oxygen levels in the blood fluctuate depending on the supply that is taken from the lungs, and according to the needs of the tissues. Most of the oxygen in the bloodstream is due to hemoglobin in the erythrocytes carried. Any negative influences on you or more of these parameters can reduce the level of blood oxygen to change. For example, if the blood flow through the lungs are inhibited, as is the case with pulmonary embolism the case is, the oxygen content of the blood can be measured be reduced accordingly by its partial pressure. Thus the determination of blood oxygen levels (as well of the pH value and the content of carbon dioxide) for a Image of the metabolism / respiratory status of the body significant.

Bei gegenwärtigen Technologien werden die Blutgase am häufigsten durch ein polarographisches Instrument auf Laboratoriumsbasis bestimmt, das von einer bestimmten Membranelektrode Gebrauch macht. Ein derartiges Verfahren, das bei der richtigen Anwendung ziemlich genau ist, hat den Nachteil, daß ein schneller Transport der Probe in Eis zum Laboratorium zur Analyse durch einen hochqualifizierten Techniker, sowie sorgfältig wiederholte Kalibrierungen benötigt werden und hohe Kosten für die Instrumentierung auftreten.With current technologies, blood gases are the most common through a laboratory-based polarographic instrument determined by a particular membrane electrode Makes use of. Such a process that is fairly accurate when used correctly Disadvantage that a quick transport of the sample in ice to  Laboratory for analysis by a highly qualified Technician, as well as carefully repeated calibrations are needed and high cost of instrumentation occur.

Soweit Versuche auf arteriellen Blutsauerstoff haufig in Notsituationen angeordnet werden, besteht ein kritischer Bedarf in der Heilkunst für ein einfaches, genaues und billiges Verfahren, das am Bett des Patienten mit einem Minimum von Manipulationen durchführbar ist, um wenigstens einen halbquantitativen Wert zu erreichen, wobei ein detaillierteres Testen im Laboratorium zu einer späteren Zeit erfolgen kann.As far as attempts at arterial blood oxygen are common in Emergency situations are arranged, there is a critical one Need in the art of healing for a simple, accurate and cheap procedure that is on the patient's bed with a Minimum manipulation is feasible to at least to reach a semi-quantitative value, where a more detailed testing in the laboratory for a later one Time can be done.

Dementsprechend ist Gegenstand der Erfindung die Schaffung eines genauen, aber nicht aufwendigen Verfahrens zur Bestimmung von Sauerstoffgehalten im Blut und anderen biologischen Flüssigsubstraten am Bett eines Patienten.Accordingly, the object of the invention is to provide a precise, but not complex, method of determination of oxygen levels in the blood and other biological Liquid substrates on a patient's bed.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist, daß ein derartiges Verfahren zur Bestimmung von Sauerstoffgehalten im Blut in der Lage ist, in Lösung sowie in trockener Phase durchgeführt zu werden, wobei ein Trockenphasenverfahren besonders bevorzugt ist, weil es wirtschaftlich und geeignet zur Verwendung von sehr kleinen Mengen vorweg abgemessener Reagentien ist.Another object of the invention is that such Method for determining blood oxygen levels in is capable of being carried out in solution as well as in the dry phase to be, with a dry phase method being particularly preferred is because it is economical and suitable for use of very small amounts of premeasured reagents.

Es ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, des gestattet, einen Sauerstoffgehalt durch visuelle Mittel zu bestimmen und das weiterhin leicht auf existierende Instrumente übertragbar ist und dadurch weiterhin wirtschaftliche und zweckmäßige Anwendungsbedingungen erlaubt.It is still another object of the invention to provide a method to create an oxygen level by visual Means to determine and continue to easily adapt to existing ones Instruments is transferable and therefore continues economic and appropriate conditions of use allowed.

Andere Ziele und damit verbundene Vorteile der Erfindung sind dem Fachmann geläufig. Other objects and related advantages of the invention are familiar to the expert.  

Die vorstehenden und damit verbundenen Ziele der Erfindung werden durch das erfindungsgemäße Verfahren erreicht, das wenigstens ein Enzym (E) einer Gruppe von etwa 55 Enzymen (die Teil einer größeren Gruppe von Enzymen sind, die als Oxidoreduktasen bekannt sind) verwendet, die gegenwärtig bekannt sind, unter Verwendung von Sauerstoff als Wasserstoffakzeptor im folgenden Reaktionssystem, das in der Bildung von Wasserstoffperoxid resultiert:The above and related objects of the invention are achieved by the method according to the invention, the at least one enzyme (E) from a group of about 55 enzymes (which are part of a larger group of enzymes, known as oxidoreductases) currently used are known using oxygen as Hydrogen acceptor in the following reaction system, which in The formation of hydrogen peroxide results in:

Beispiele von potentiell geeigneten Enzymen sind Glucoseoxidase, Ceruloplasmin, Oxalatoxidase und L-Aminosäureoxi­ dase.Examples of potentially suitable enzymes are glucose oxidase, Ceruloplasmin, oxalate oxidase and L-amino acid oxi that.

Obwohl dies offensichtlich nach dem Stand der Technik nicht bekannt ist, kann man das vorstehende Reaktionssystem verwenden, um den Sauerstoffgehalt in einer vorgegebenen Probe zu bestimmen, wobei anfangs die Mengen an Oxidase und Reaktionsteilnehmer fixiert werden. Ein zusätzlicher Vorteil eines derartigen Reaktionssystemys besteht darin, daß das Peroxidprodukt nach der bekannten Trinder-Reaktion über das Mittel der Peroxidase gemessen werden kann, wobei ein Chinonimin-Chromogen verwendet wird. Die Intensität der sichtbaren Färbung, die gebildet wird, ist proportional der Menge von vorhandenem Wasserstoffperoxid. Dieser Wert würde im Falle einer Oxidasereaktion wiederum ein direktes Maß für die Sauerstoffmenge sein, die unter den oben aufgeführten Reaktionsbedingungen vorhanden ist. Es ist bekannt, daß die Konzentration von gelöstem Sauerstoff proportional zu dessen Partialdruck ist.Although obviously not according to the state of the art is known, you can use the above reaction system, the oxygen content in a given sample to determine, starting with the amounts of oxidase and reactants be fixed. An additional benefit of such a reaction system is that Peroxide product according to the well-known Trinder reaction Means of peroxidase can be measured using a quinonimine chromogen is used. The intensity of the visible Coloring that is formed is proportional to the amount of hydrogen peroxide present. This would be the case an oxidase reaction is a direct measure of the amount of oxygen be under the reaction conditions listed above is available. It is known that concentration of dissolved oxygen proportional to its partial pressure is.

Obwohl viele Oxidasen diesem Zweck dienen können, ist es wünschenswert, eine solche auszuwählen, die im Handel verfügbar ist und deren Reaktionsteilnehmer gewöhnlich in sehr niedriger Konzentration im Blut vorliegen, so daß nicht da­ mit verbundenen physiologische Prozesse nicht den grundsätzlichen Zweck der Sauerstoffmessung des Testsystems ändern. Zusätzlich sollte eines oder mehrere der Reaktionsprodukte quantifizierbar sein mittels einer gekoppelten Reaktion, die eine sichtbare Farbe in Proportion zur primären Reaktionsgeschwindigkeit ergibt.Although many oxidases can serve this purpose, it is desirable to select one that is commercially available and their reactants are usually very low concentration in the blood, so that not there  with associated physiological processes not the basic ones Purpose of measuring the oxygen of the test system to change. In addition, one or more of the reaction products should be quantifiable using a coupled Reaction that is a visible color in proportion to the primary Reaction speed results.

Zur Erläuterung des Untersuchungsverfahrens der vorliegenden Erfindung wird ein Beispiel für ein typisches analytisches System unter Verwendung von Sarcosinoxidase (EC 1.5.3.1) ausführlicher beschrieben. Es sollte jedoch festgehalten werden, daß das folgende Beispiel nur zur Erläuterung dient und nicht als Beschränkung des Erfindungsgedankens dienen soll, da viele ähnliche Oxidasen verwendet werden können, die eine ähnliche Brauchbarkeit haben:To explain the examination procedure of the present Invention becomes an example of a typical analytical System using sarcosine oxidase (EC 1.5.3.1) described in more detail. However, it should be noted that the following example is only for explanation and should not serve as a limitation of the inventive concept, since many similar oxidases can be used, one have similar usability:

Während die Chemie von dieser und von anderen Oxidasen bereits einige Zeit bekannt ist, gab es scheinbar bisher keinen Versuch, die Sauerstoffabhängigkeiten in einer quantitativen analytischen Weise nutzbar zu machen oder gar diese Eigenschaft auszunutzen, um Sauerstoffgehalte in biologischen Systemen zu messen. Es war allgemeine Praxis von Biochemikern und anderen Fachleuten, die Reaktion von Oxidasen aus verschiedenen Quellen an der Zimmerluft durchzuführen. Somit führt der Stand der Technik weg von der methodischen Ausführung der vorliegenden Erfindung, indem die Verwendung von sättigenden Mengen Sauerstoff gefordert wird. Der Stand der Technik lehrt auch nicht und gibt keine Anregung für die Anwendung der vorstehenden Prinzipien auf eine quantitative Bestimmung von Sauerstoff in biologischen Flüssig­ substraten, wie Ganzblut, Blutplasma, Blutserum, Rücken­ marksflüssigkeit, Urin, Speichel, Tränen, Magenflüssigkeit usw. While the chemistry of this and other oxidases already is known for some time, apparently there was none Attempt to quantify the oxygen dependencies analytically or harness them Property to exploit to oxygen levels in biological Systems to measure. It was common practice of Biochemists and other professionals, the reaction of oxidases from different sources in the air. Thus the state of the art leads away from the methodical Carrying out the present invention by using of saturating amounts of oxygen is required. The state of the art also does not teach and gives no suggestion for applying the above principles to a quantitative determination of oxygen in biological liquid substrates such as whole blood, blood plasma, blood serum, back medullary fluid, urine, saliva, tears, gastric fluid etc.  

Wie oben erwähnt, kann das als Nebenprodukt aus der Reaktion (I) erhaltene Peroxid quantitiziert werden durch Verwendung von Peroxidase und einem Indikator (In) gemäß dem folgenden Reaktionssystem:As mentioned above, this can be a by-product from the reaction (I) Peroxide obtained can be quantified by use of peroxidase and an indicator (In) according to the following reaction system:

Alternativ kann man Formaldehyd (HCHO) als Produkt der Reaktion (I) analysieren mit Hilfe der Formaldehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.46) in Gegenwart von Nicotinamid-adenin­ dinucleotid (NAD). Die Menge des reduzierten NAD-Produkts (NADH) wird durch ein gekoppeltes Reaktionssystem bestimmt, wobei die Reduktion von Nitrotetrazoliumblau (NTB) oder Jodo­ nitrotetrazoliumviolett (INT) in Gegenwart von Phenazinmethosulfat (PMS) oder Diaphorase (EC 1.6.4.3) miteingeschlossen ist. Die Menge von gefärbtem Formazan, die gebildet wird, wird visuell oder colorimetrisch gemessen und ist proportional zu der Sauerstoffmenge, die in der ursprünglichen Versuchsprobe enthalten war:Alternatively, formaldehyde (HCHO) can be used as the product of the reaction (I) analyze using formaldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.46) in the presence of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). The amount of reduced NAD product (NADH) is determined by a coupled reaction system where the reduction of nitrotetrazolium blue (NTB) or iodo nitrotetrazolium violet (INT) in the presence of phenazine methosulfate (PMS) or diaphorase (EC 1.6.4.3) included is. The amount of colored formazan that is formed is measured visually or colorimetrically and is proportional to the amount of oxygen in the original test sample was included:

Weiterhin erläuternd für das analytische Verfahren der Erfindung wird das folgende Reagentiensystem beschrieben. Es sollte jedoch deutlich sein, daß die Erfindung in ihrem Erfindungsgedanken nicht allein auf das folgende System beschränkt ist.Also illustrative of the analytical method of the invention the following reagent system is described. It however, it should be clear that the invention is in the spirit of the invention not limited to the following system alone is.

Beispielexample

Die folgenden Reagentienlösungen werden hergestellt:The following reagent solutions are made:

  • 1) Sarcosinoxidase (aus Arthrobacter Species mit K-Gluconat und EDTA) - 25 Einheiten/1 ml Wasser.1) Sarcosine oxidase (from Arthrobacter species with K-gluconate and EDTA) - 25 units / 1 ml of water.
  • 2) Peroxidas (aus Meerrettich; EC 1.11.1.7) - 320 Einheiten/ml Wasser.2) Peroxidas (from horseradish; EC 1.11.1.7) - 320 units / ml Water.
  • 3) 4-Aminoantipyrin - 6 mg/4 ml 0,2 Mol Tris-Puffer (pH 7,4)+1 Tropfen N,N-Dimethylanilin.3) 4-aminoantipyrine - 6 mg / 4 ml 0.2 mol Tris buffer (pH 7.4) +1 drop of N, N-dimethylaniline.
  • 4) Sarcosin (freie Base) - 5 mg/2 ml Wasser.4) Sarcosine (free base) - 5 mg / 2 ml water.

Es wurden gleiche Teile von 50 Mikroliter der Lösungen 1, 2 und 3 nach der Sauerstoffentfernung in einer anaeroben Umgebung mit 25 Mikroliter Testserum vermischt und anschließend 50 Mikroliter Lösung Nr. 4 zugegeben. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur 1 Minute lang wurden 3 ml 0,1 n Salzsäure zugegeben und die optische Dichte bei 565 nm gemessen. Die Ergebnisse werden mit den Versuchsproben bekannter Konzentration, die parallel durchgeführt werden, in Beziehung gesetzt. Daß die Anwendung einer Oxidasereaktion für die Messung von Sauerstoff nicht auf Sarcosinoxidase beschränkt ist, kann durch parallele Reaktionssysteme gezeigt werden, bei denen Pyruvat-Oxidase (EC 1.4.3.6) verwendet werden.Equal parts of 50 microliters of solutions 1, 2 and 3 after oxygen removal in an anaerobic Environment mixed with 25 microliters of test serum and then 50 microliters of solution # 4 added. After incubation at room temperature for 1 minute, 3 ml of 0.1 n Hydrochloric acid added and the optical density measured at 565 nm. The results become known with the test samples Concentration that is done in parallel in relation set. That the application of an oxidase reaction for the Measurement of oxygen is not limited to sarcosine oxidase, can be shown by parallel reaction systems in which Pyruvate oxidase (EC 1.4.3.6) can be used.

Als Teil der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung geschaffen, mit der das vorstehend beschriebene System der Versuchsreaktion in einem Verfahren der Trockenchemie durchgeführt wird. Die Erfindung wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform einer solchen Vorrichtung durch beigefügte Zeichnung erläutert. As part of the present invention, an apparatus created with which the system of Experimental reaction carried out in a dry chemistry process becomes. The invention is according to a preferred embodiment such a device by the accompanying drawing explained.  

In der Zeichnung ist im Detail dargestellt, daß ein Filterpapier B mit einem Gemisch der Reagentien Nr. 1, Nr. 2 und Nr. 3 imprägniert und luftgetrocknet wird. Zur Verhütung einer vorzeitigen Reaktion wird die Sarcosinlösung Nr. 4 hergestellt, vorzugsweise in einem nicht wäßrigen Lösungsmittel anstelle von Wasser, und wird dann zum Imprägnieren des gleichen Filterpapiers verwendet, das erneut an der Luft getrocknet wird. Alternativ wird eine wäßrige Lösung von Sarcosin verwendet, jedoch muß das imprägnierte Papier dann in einer sauerstofffreien Umgebung getrocknet werden.In the drawing it is shown in detail that a filter paper B with a mixture of reagents No. 1, No. 2 and No. 3 is impregnated and air dried. For contraception The sarcosine solution becomes an early reaction No. 4 prepared, preferably in a non-aqueous Solvent instead of water, and then becomes impregnation the same filter paper that used again is air dried. Alternatively, one aqueous solution of sarcosine used, however, the impregnated Then paper in an oxygen-free environment be dried.

Der Boden des Filterpapiers oder des Bausches B hängt an einer klaren steifen Trägerschicht aus dünnem Kunststoff. Es ist zu bemerken, daß das Filterpapier oder der Bausch B aus jedem geeigneten saugfähigen Material bestehen kann, z. B. Glasfasern, Baumwolle, Wolle oder einem anderen synthetischen Material. Die Größe und Absorptionsfähigkeit des Bausches bestimmt das Volumen der zu prüfenden Probe und vermeidet somit das Pipettieren. Eine Lösung von Ethylcellulose in Benzol wird auf die Spitze des Bausches B aufgebracht und dann an der Luft getrocknet, so daß eine halbdurchlässige Barriere entsteht, die den Durchgang von Plasma und Gasen, aber nicht von Blutzellen erlaubt. Eine solche Barriere ist in der US-PS 32 98 789 beschrieben, wobei die maßgebenden Teile Teil der Beschreibung sein sollen. Das behandelte Filterpapier wird dann in einen klaren undurchlässigen Glaswürfel (A) aus Kunststoff oder Glas, der ein anaerobes Gas enthält, wie Stickstoff, Wasserstoff oder Helium, eingeschlossen.The bottom of the filter paper or pad B is attached a clear, stiff carrier layer made of thin plastic. Note that the filter paper or pad B can consist of any suitable absorbent material, e.g. B. glass fibers, cotton, wool or another synthetic material. The size and absorbency the volume determines the volume of the sample to be tested and thus avoids pipetting. A solution of ethyl cellulose in benzene is applied to the top of pad B. and then air dried so that a semipermeable Barrier arises, the passage of plasma and gases, but not allowed by blood cells. Such Barrier is described in US Pat. No. 3,298,789, the relevant parts should be part of the description. The treated filter paper will then turn into a clear impermeable Glass cube (A) made of plastic or glass, the one contains anaerobic gas, such as nitrogen, hydrogen or helium, locked in.

Auf dem umschlossenen Behälter A befindet sich ein Membran- verschlossener Behälter (C). Eine Spritze, die die zu prüfende Blutprobe enthält, wird auf C angewendet. Beim Herunterdrücken durchdringt oder verdrängt die Spitze der Spritze die Barriere D, die aus einem dünnen Kunststoffilm besteht. Dies gestattet den Durchgang der Versuchsprobe auf den Bausch B, während der Kontakt mit der Raumluft vermieden wird. Nach dem Inkubieren bei Raumtemperatur wird die Färbung, die durch die untere durchsichtige Schicht des Bausches B durchdringt, durch Anwendung eines Reflexionsphotometers oder durch visuellen Vergleich mit einer Standard-Farbkarte quantifiziert. Die Vorrichtung ist vorgesehen zum Wegwerfen nach vollständigem Versuchablauf.On the enclosed container A there is a membrane closed container (C). A syringe that is the one to be tested Contains blood sample is applied to C. When pressing down penetrates or displaces the tip of the syringe  the barrier D, which consists of a thin plastic film. This allows the test sample to be run on the B pad while in contact with the room air is avoided. After incubation at room temperature the coloration becomes transparent by the lower Penetrating layer of pad B, by using a Reflection photometer or by visual comparison with quantified using a standard color chart. The device is intended to be thrown away after the test is complete.

Alternativ könnte die Reaktionskammer in Form einer dünnen zylindrischen Säule vorliegen, wobei der behandelte Bausch auf der Spitze der Säule zu liegen kommt und im Säulenkörper ein inertes Absorptionsmittel vorhanden ist, um die erhaltene Färbung festzuhalten und zu zeigen, die durch den Reaktionsbausch erzeugt wird.Alternatively, the reaction chamber could be a thin one cylindrical column, the treated Bausch comes to rest on the top of the column and in Column body there is an inert absorbent, to capture and show the color obtained is generated by the reaction bulk.

Schließlich können in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit Hilfe der Papierphase rote Blutkörperchen und große Makromoleküle aus der Versuchsprobe dadurch entfernt werden, daß ein saugfähiges Material in eine Lösung von Ethylcellulose oder Celluloseacetat in Benzol oder ein ähnliches organisches Lösungsmittel eingetaucht wird. Danach wird das saugfähige Material aus dieser Lösung entfernt und anschließend luftgetrocknet, bevor das Testverfahren durchgeführt wird.Finally, in a preferred embodiment, the Invention using the paper phase and red blood cells this removes large macromolecules from the test sample be that an absorbent material in a solution of Ethyl cellulose or cellulose acetate in benzene or the like organic solvent is immersed. After that the absorbent material is removed from this solution and then air dried before performing the test procedure becomes.

Es ist ebenfalls offensichtlich, daß die in der vorliegenden Beschreibung genannte Methode auf jede Situation angewendet werden kann, bei der die Messung eines Sauerstoffgehaltes wichtig ist, wie bei der Herstellung von Nahrungsmitteln oder bei der Behandlung von Metallen. Weiterhin kann man gleichzeitig den pH-Wert und Kohlendioxid mit anschließenden Reaktionsbäuschen bestimmen, wobei colorimetrische Systeme verwendet werden, die für diese Analysenverfahren bereits bekannt sind, womit eine komplette Gasbestimmung im arteriellen Blut möglich gemacht wird. It is also obvious that those in the present Described method applied to every situation can be used in the measurement of an oxygen content is important, like in the production of food or in the treatment of metals. Furthermore can you simultaneously the pH and carbon dioxide with subsequent Determine reaction balls, being colorimetric Systems are used for these analytical procedures are already known, with which a complete gas determination in arterial blood is made possible.  

Während nur einige Ausführungsformen der Erfindung gezeigt und beschrieben worden sind, ist es dem Fachmann geläufig, daß viele Änderungen durchgeführt werden können, ohne vom Erfindungsgedanken abzuweichen.While only some embodiments of the invention are shown and have been described, it is the skilled person common that many changes can be made without deviating from the idea of the invention.

Claims (30)

1. Verfahren zum Bestimmen des Sauerstoffgehaltes in biologischen Flüssigsubstraten, gekennzeichnet durch folgende Stufen:
  • (a) Zugeben einer vorbestimmten Menge eines reduzierten Reaktionsmittels (AH₂), eines Oxidaseenzyms (E) und eines Puffers in einem Reaktionsgemisch für die enzymatische Reaktion I zu einer Probe des biologischen Flüssigsubstrats,
  • (b) Messen der Geschwindigkeit des Auftretens eines Reaktionsprodukts der Reaktion I, wobei diese Geschwindigkeit des Auftretens des Reaktionsprodukts direkt proportional der Konzentration von Sauerstoff in der Probe des biologischen Flüssigsubstrats ist, und
  • (c) Vergleichen der Geschwindigkeit des Auftretens des Reaktionsprodukts der Reaktion I mit der Reaktionsgeschwindigkeit für das Auftreten des gleichen Reaktionsprodukts in wenigstens einem Standard mit bekannter Sauerstoffkonzentration und Bestimmen der Sauerstoffkonzentration des biologischen Flüssigsubstrats aus der Differenz.
1. Method for determining the oxygen content in biological liquid substrates, characterized by the following stages:
  • (a) adding a predetermined amount of a reduced reactant (AH₂), an oxidase enzyme (E) and a buffer in a reaction mixture for the enzymatic reaction I. to a sample of the biological liquid substrate,
  • (b) measuring the rate of occurrence of a reaction product of reaction I, which rate of occurrence of the reaction product is directly proportional to the concentration of oxygen in the sample of the biological fluid substrate, and
  • (c) comparing the rate of occurrence of the reaction product of reaction I with the rate of reaction for the occurrence of the same reaction product in at least one standard with known oxygen concentration and determining the oxygen concentration of the biological liquid substrate from the difference.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das gemessene Reaktionsprodukt Formaldehyd ist. 2. The method according to claim 1, characterized in that that the measured reaction product Is formaldehyde.   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das gemessene Reaktionsprodukt Wasserstoffperoxid ist.3. The method according to claim 1, characterized in that the measured reaction product Is hydrogen peroxide. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Puffer ein Tris- Puffer ist.4. The method according to claim 1, characterized in that the buffer used is a tris Buffer is. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Sarcosin-Oxidase und das Reaktionsmittel Sarcosin ist.5. The method according to claim 1, characterized in that the enzyme sarcosine oxidase and the reactant is sarcosine. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufen (b) und (c) durch Vergleich der optischen Dichte einer resultierenden Färbung in einer gekoppelten Reaktion II durchgeführt werden, wobei In ein Chinonimin-Chromogen­ indikator ist.6. The method according to claim 1, characterized in that steps (b) and (c) by comparing the optical density of a resulting color in a coupled reaction II be carried out, wherein In is a quinonimine chromogen indicator. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die resultierende Farbe durch Transmissionsspektrophotometrie gemessen wird.7. The method according to claim 6, characterized in that that the resulting color through Transmission spectrophotometry is measured. 8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die resultierende Farbe durch visuellen Vergleich mit einer standardisierten Farbkarte gemessen wird.8. The method according to claim 6, characterized in that that the resulting color through visual comparison with a standardized color chart is measured. 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufen (b) und (c) durch Vergleich der optischen Dichte einer resultierenden Farbe in den gekoppelten Reaktionen III und IV bestimmt werden: worin:NAD Nicotinamid-adenin-dinucleotid ist;
NADH reduziertes NAD ist;
INT Jodonitrotetrazoliumviolett ist; und
PMS Phenazinmethosulfat ist.9. The method according to claim 1, characterized in that steps (b) and (c) are determined by comparing the optical density of a resulting color in the coupled reactions III and IV: wherein: NAD is nicotinamide adenine dinucleotide;
NADH is reduced NAD;
INT is iodonitrotetrazolium violet; and
PMS is phenazine methosulfate. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die erhaltene Farbe durch Transmissionsspektrophotometrie gemessen wird.10. The method according to claim 9, characterized in that the color obtained by transmission spectrophotometry is measured. 11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die erhaltene Farbe durch visuellen Vergleich mit einer standardisierten Farbkarte gemessen wird.11. The method according to claim 9, characterized in that the color obtained by visual Comparison with a standardized color card is measured. 12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Flüssigsubstrat Ganzblut, Blutplasma oder Blutserum ist.12. The method according to claim 1, characterized in that that the biological liquid substrate Whole blood, blood plasma or blood serum. 13. Verfahren zum Messen der Sauerstoffkonzentration eines biologischen Flüssigsubstrats mittels einer trockenen chemischen Verfahrensweise, gekennzeichnet durch folgende Stufen:
  • (a) Zugeben vorbestimmter Mengen von einer Oxidase und eines Puffers in einer wäßrigen Lösung,
  • (b) Zugeben eines Indikatorsystems für die quantitative colorimetrische Analyse der wäßrigen Lösung,
  • (c) Eintauchen eines saugfähigen Materials in die wäßrige Lösung,
  • (d) Entfernen des saugfähigen Materials aus der wäßrigen Lösung,
  • (e) Lufttrocknen des saugfähigen Materials nach dem Entfernen aus der wäßrigen Lösung,
  • (f) Eintauchen des saugfähigen Materials in eine wasserfreie organische Lösung eines reduzierten Reaktions­ teilnehmers,
  • (g) Entfernen des saugfähigen Materials aus der wasserfreien organischen Lösung des reduzierten Reaktionsteilnehmers,
  • (h) Lufttrocknen des saugfähigen Materials anschließend an Stufe (g),
  • (i) Aufbringen des biologischen Flüssigsubstrats, das untersucht werden soll, auf das saugfähige Material zur Einleitung einer enzymatischen Reaktion (I):
  • (j) Messen der Geschwindigkeit des Auftretens von wenigstens einem der Produkte der Reaktion (I) durch eine Farbquantität, die in einer quantitativen colorimetrischen Analyse erzeugt wird, und
  • (k) Vergleichen der Menge der hervorgebrachten Farbe mit wenigstens einem Standard einer bekannten Sauerstoffkonzentration, wodurch die gebildete Farbstoffmenge direkt proportional der Sauerstoffkonzentration des zu prüfenden biologischen Flüssigsubstrats ist.
13. A method for measuring the oxygen concentration of a biological liquid substrate by means of a dry chemical method, characterized by the following stages:
  • (a) adding predetermined amounts of an oxidase and a buffer in an aqueous solution,
  • (b) adding an indicator system for quantitative colorimetric analysis of the aqueous solution,
  • (c) immersing an absorbent material in the aqueous solution,
  • (d) removing the absorbent material from the aqueous solution,
  • (e) air drying the absorbent material after removal from the aqueous solution,
  • (f) immersing the absorbent material in an anhydrous organic solution of a reduced reaction participant,
  • (g) removing the absorbent material from the anhydrous organic solution of the reduced reactant,
  • (h) air drying the absorbent material subsequent to step (g),
  • (i) Applying the biological liquid substrate to be examined to the absorbent material to initiate an enzymatic reaction (I):
  • (j) measuring the rate of occurrence of at least one of the products of reaction (I) by a quantity of color generated in a quantitative colorimetric analysis, and
  • (k) comparing the amount of color produced with at least one standard of a known oxygen concentration, whereby the amount of dye formed is directly proportional to the oxygen concentration of the biological fluid substrate to be tested.
14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das saugfähige Material ein Streifen oder Bausch aus Papier ist. 14. The method according to claim 1, characterized in that that the absorbent material is a strip or bulk of paper.   15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das saugfähige Material aus einem Cellulosederivat oder einem synthetischen Material hergestellt ist.15. The method according to claim 13, characterized in that the absorbent material from a cellulose derivative or a synthetic material is made. 16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das saugfähige Material aus gesponnener Glasfaser besteht.16. The method according to claim 13, characterized in that the absorbent material from spun glass fiber. 17. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das saugfähige Material aus Baumwolle hergestellt ist.17. The method according to claim 13, characterized in that the absorbent material from Cotton is made. 17. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das saugfähige Material aus Wolle hergestellt ist.17. The method according to claim 13, characterized in that the absorbent material from Wool is made. 19. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das zu untersuchende biologische Flüssigsubstrat Ganzblut, Blutplasma oder Blutserum ist.19. The method according to claim 13, characterized in that the biological to be examined Liquid substrate whole blood, blood plasma or blood serum is. 20. Verfahren nach Anspruch 13, gekennzeichnet durch folgende, an Stufe (i) anschließende Stufen:
Entfernen der roten Blutkörperchen und großer Makromoleküle aus dem biologischen Flüssigsubstrat in dem Fall, daß dieses Substrat Blut ist, mittels Eintauchen des saugfähigen Materials in eine Lösung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ethylcellulose in Benzol und Celluloseacetat in Benzol,
Entfernen des saugfähigen Materials aus der Lösung, und
Lufttrocknen des saugfähigen Materials. 20. The method according to claim 13, characterized by the following stages following stage (i):
Removing the red blood cells and large macromolecules from the biological liquid substrate, in the event that this substrate is blood, by immersing the absorbent material in a solution selected from the group consisting of ethyl cellulose in benzene and cellulose acetate in benzene,
Removing the absorbent material from the solution, and
Air drying the absorbent material. 21. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Intensität der erzeugten Farbe durch Reflexionsspektrophotometrie quantifiziert wird.21. The method according to claim 13, characterized in that the intensity of the generated Color quantified by reflection spectrophotometry becomes. 22. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Intensität der erzeugten Farbe durch visuellen Vergleich mit einer standardisierten Farbkarte quantifiziert wird.22. The method according to claim 13, characterized in that the intensity of the generated Color by visual comparison with a standardized Color card is quantified. 23. Vorrichtung zur Messung der Sauerstoffkonzentration eines biologischen Flüssigsubstrats mittels eines trockenen chemischen Verfahrens, gekennzeichnet durch
einen Würfel oder eine Säule mit einer umschlossenen anaeroben Innenumgebung,
ein saugfähiges Material, das sich innerhalb des Würfels oder der Säule befindet, wobei das saugfähige Material mit vorbestimmten Mengen eine Oxidase, eines Puffers, eines reduzierten Reaktionsteilnehmers und eines Indikators für die colorimetrische Analyse imprägniert ist, und wobei das saugfähige Material eine Abdeckung von Cellulose oder einem Cellulosederivat hat,
einen mit einem Membranverschluß versehenen Behälter auf dem Würfel oder der Säule, wobei der mit diesem Verschluß versehene Behälter in der Lage ist, eine Spritze aufzunehmen, die eine Probe des zu prüfenden biologischen Flüssigsubstrats enthält,
eine Barriere, die in der Lage ist, von der Spritze durchbohrt oder versetzt zu werden, wobei diese Barriere zwischen dem mit Membranverschluß versehenen Aufnahmebehälter auf dem Würfel oder der Säule und dem Würfel oder der Säule angeordnet ist,
wobei nach dem Aufbringen des biologischen Flüssigsubstrats auf das saugfähige Material eine enzymatische Reaktion (I) eingeleitet wird: und die Geschwindigkeit des Auftretens von wenigstens einem der Produkte der Reaktion (I) durch die Farbintensität gemessen wird, die in der quantitativen colorimetrischen Analyse erzeugt wird, und die Menge dieser hervorgebrachten Färbung mit wenigstens einem Standard einer bekannten Sauerstoffkonzentration verglichen wird, wodurch die Farbmenge, die hervorgebracht wird, direkt proportional zu der Sauerstoffkonzentration des zu prüfenden biologischen Flüssigsubstrats ist.23. Device for measuring the oxygen concentration of a biological liquid substrate by means of a dry chemical process, characterized by
a cube or column with an enclosed anaerobic interior,
an absorbent material located within the cube or column, the absorbent material being impregnated with predetermined amounts of an oxidase, a buffer, a reduced reactant and an indicator for colorimetric analysis, and wherein the absorbent material is a cover of cellulose or a cellulose derivative,
a container provided with a membrane closure on the cube or column, the container provided with this closure being able to hold a syringe containing a sample of the biological liquid substrate to be tested,
a barrier capable of being pierced or displaced by the syringe, this barrier being located between the membrane-sealed receptacle on the cube or column and the cube or column,
an enzymatic reaction (I) being initiated after the application of the biological liquid substrate to the absorbent material: and the rate of occurrence of at least one of the products of reaction (I) is measured by the color intensity generated in the quantitative colorimetric analysis and the amount of this coloration is compared to at least one standard of a known oxygen concentration, whereby the amount of color, that is produced is directly proportional to the oxygen concentration of the biological liquid substrate to be tested. 24. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Würfel oder die Säule aus einem klaren undurchlässigen Kunststoff oder aus Glas hergestellt ist.24. The device according to claim 23, characterized in that that the cube or the pillar out a clear impervious plastic or glass is made. 25. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Würfel oder die Säule ein Gas enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Stickstoff, Wasserstoff, Helium und einer Kombination davon.25. The device according to claim 23, characterized in that the cube or the pillar Gas contains selected from the group consisting of Nitrogen, hydrogen, helium and a combination from that. 26. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das saugfähige Material mit einem Reaktionsgemisch imprägniert ist, das aus Sarcosin- Oxidase, Peroxidase, Tetramethylbenzidin und 0,2 M Tris-Puffer (pH 7,4) besteht und danach getrocknet und mit Sarcosin in einem nicht wäßrigen Lösungsmittel imprägniert und anschließend erneut getrocknet wird. 26. The apparatus according to claim 23, characterized in that the absorbent material with is impregnated with a reaction mixture consisting of sarcosine Oxidase, peroxidase, tetramethylbenzidine and 0.2 M Tris buffer (pH 7.4) and then dried and with sarcosine in a non-aqueous solvent impregnated and then dried again becomes.   27. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das saugfähige Material mit einem Reaktionsgemisch imprägniert ist, das aus Sarcosinoxidase, Formaldehyd-Dehydrogenase, Nicotinamidadenin- dinucleotid, Jodonitrotetrazoliumviolett, Phenazinmethosulfat und 0,2 M Tris-Puffer (pH 7,4) besteht, dann getrocknet, mit Sarcosin in einem nicht wäßrigen Lösungsmittel imprägniert und danach erneut getrocknet wird.27. The apparatus according to claim 23, characterized in that the absorbent material with is impregnated with a reaction mixture consisting of sarcosine oxidase, Formaldehyde dehydrogenase, nicotinamide adenine dinucleotide, iodonitrotetrazolium violet, phenazine methosulfate and 0.2 M Tris buffer (pH 7.4), then dried, with sarcosine in a non-aqueous Impregnated solvent and then dried again becomes. 28. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das saugfähige Material Filterpapier ist.28. The apparatus according to claim 23, characterized in that the absorbent material filter paper is. 29. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Barriere aus einem dünnen Kunststoffilm hergestellt ist.29. The device according to claim 23, characterized in that that the barrier from a thin Plastic film is made. 30. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Flüssigsubstrat Ganzblut, Blutplasma oder Blutserum ist.30. The device according to claim 23, characterized in that the biological liquid substrate Whole blood, blood plasma or blood serum.
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