DE3816534C2

DE3816534C2 -

Info

Publication number: DE3816534C2
Application number: DE19883816534
Authority: DE
Inventors: Ralf Dipl.-Biochemiker 3000 Hannover De Hass
Original assignee: Pharma Biotechnologie Hannover 3000 Hannover De GmbH
Current assignee: Pharma Biotechnologie Hannover 3000 Hannover De GmbH
Priority date: 1988-05-14
Filing date: 1988-05-14
Publication date: 1990-02-15
Also published as: DE3816534A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von natürlichem humanen Interleukin-lβ (IL-lβ) in Zell kultur.The invention relates to a process for the production of natural human interleukin-l β (IL-l β ) in cell culture.

Interleukine sind Substanzen, die eine Untergruppe der sogenannten Cytokine bilden. Cytokine sind Stoffe, die von Lymphozyten und Makrophagen produziert werden. Sie fungieren als Botenstoffe insbesondere zwischen ver schiedenen Zellspezies des Immunsystems. Dabei sind bislang die unterschiedlichen Wirkungsweisen und -mög lichkeiten nur sehr unvollständig bekannt. Interleukine werden nach heutigem Wissensstand von T-Zellen und Makrophagen produziert und auch in das die Zellen um gebende Milieu abgegeben. Interleukine sind Stoffe, die als Mediatoren wirken und als sogenannte "biological response modifiers" (BRM) von erheblichem wissenschaft lichen und therapeutischen Interesse sind.Interleukins are substances that are a subset of the form so-called cytokines. Cytokines are substances that are produced by lymphocytes and macrophages. they act as messenger substances especially between ver different cell species of the immune system. Are So far the different modes of operation and possible only very incompletely known. Interleukins according to the current state of knowledge of T cells and Macrophages are produced and also into which the cells turn giving environment. Interleukins are substances that act as mediators and as so-called "biological response modifiers "(BRM) of considerable science l are of therapeutic and interest.

Harris, P. und Ralph, P., "Journal of Leukoycte Bio logy" 37, 407-422 (1985) beschreiben in einem Über sichtsartikel die menschliche Monoblasten-Zellinie U 937 als Quelle für BRM. Diese Zellinie ist in der Fachwelt gut etabliert und beispielsweise bei der European Collection of Animal Cell Cultures unter der Nummer 8 80 70 704 erhältlich. In dem Übersichtsartikel wird ebenfalls beschrieben, daß die Zellen der Zellinie U 937 durch Gamma-Interferon zur Expression von bestimmten Enzymen angeregt werden kön nen, zum Beispiel zur Produktion von alkalischer und saurer Phosphatase, β-Glucuronidase und bestimmter Esterase, die durch Fluorid blockierbar ist. Es ist weiterhin bekannt, daß Gaben von Gamma-IFN neben einem die Zelldifferenzierung induzierenden Faktor DIF (dif ferentiation inducing factor) sehr stark die Abgabe von Thromboxan in das Medium bewirken. Harris, P. and Ralph, P., "Journal of Leukoycte Bio logy" 37, 407-422 (1985) describe the human monoblast cell line U 937 as a source of BRM in a review article. This cell line is well established in the professional world and is available, for example, from the European Collection of Animal Cell Cultures under number 8 80 70 704. The review article also describes that the cells of the U 937 cell line can be stimulated by gamma interferon to express certain enzymes, for example to produce alkaline and acidic phosphatase, β- glucuronidase and certain esterase which can be blocked by fluoride . It is also known that administration of gamma-IFN, in addition to a factor DIF (dif ferentiation inducing factor), has a strong effect on the release of thromboxane into the medium.

Die Herstellung von Wirkstoffen unter Verwendung von Zellkulturen ist in der Regel wirtschaftlich nicht von Interesse, da die Kultivierung der eukaryontischen Zel len extrem aufwendig ist und die Wirkstoffe nur in ge ringen Mengen gebildet werden. Interessant kann die Herstellung von Wirkstoffen durch Zellen in Zellkultur werden, wenn es gelingt, diese durch äußere Einflüsse zu stimulieren, den gewünschten Wirkstoff in erhöhter Konzentration zu bilden und freizusetzen.The manufacture of active ingredients using Cell cultures are usually not economically viable Interest because the cultivation of the eukaryotic cell len is extremely complex and the active ingredients only in ge wrestle sets are formed. It can be interesting Production of active substances by cells in cell culture if it succeeds, this through external influences to stimulate the desired active ingredient in increased Form and release concentration.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, um mit Zellen der Zellinie U 937 eine bessere IL-lβ-Produktion zu bekommen.The invention has for its object to provide a method to get better IL-1 β production with cells of the U 937 cell line.

Es wurde nun gefunden, daß die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe gelöst wird durch ein Verfahren zur Herstellung von natürlichem humanen Interleukin-lβ (IL-lβ) in Zellkultur, dadurch gekennzeichnet, daß die durch Tetramyristinphorbolacetat (TPA) differenzierten humanen Tumorzellen der Linie U 937 durch einmaligen Zusatz von humanem Gamma-Interferon (Gamma-IFN) induziert werden zur ge steigerten Produktion von IL-lβ und das gebildete IL-lβ in an sich bekannter Weise abgetrennt und gereinigt wird. Die Konzentration von Gamma-IFN liegt vorzugs weise bei 100 U/ml. Die untere Grenze ergibt sich naturgemäß durch den Wert der Interferonkonzentration, bei welchem die Zahl der In duktoren nicht mehr ausreicht, die erhöhte Bildung des Wirkstoffes IL-lβ zu erreichen.It has now been found that the object on which the invention is based is achieved by a process for the production of natural human interleukin-1 β (IL-1 β ) in cell culture, characterized in that the human tumor cells of the line differentiated by tetramyristinphorbol acetate (TPA) U 937 induced by a single addition of human gamma-interferon (gamma-IFN) to increase the production of IL-1 β and the IL-1 β formed is separated and purified in a manner known per se. The concentration of gamma-IFN is preferably 100 U / ml. The lower limit naturally results from the value of the interferon concentration, at which the number of inductors is no longer sufficient to achieve the increased formation of the active ingredient IL-1 β .

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich in einem kon tinuierlichen Betrieb durchführen, indem beispielsweise unter sterilen Bedingungen das Kulturmedium laufend ausgetauscht wird. Dabei kann es auch von Interesse sein, daß das Gamma-IFN abgetrennt und wieder der Kul turflüssigkeit zugefügt wird. Es kann jedoch auch in sogenannten "Batch"-Verfahren, also diskontinuierlich, gearbeitet werden.The inventive method can be in a con perform continuous operation by, for example the culture medium continuously under sterile conditions is exchanged. It can also be of interest be that the gamma IFN separated and again the Kul Turfluid is added. However, it can also be in so-called "batch" processes, i.e. discontinuous, be worked.

Die Verwendung von durch TPA differenzierten und Gamma-IFN induzierten Zellen der Zellinie U 937 ermöglicht die Herstellung von natürlichem humanen IL-lβ in Zellkultur. Geeignete Zellen sind er findungsgemäß erhältlich durch Differenzierung der Zel len einer Zellinie U 937 mit TPA und Induktion der IL-lβ-Produktion durch Gamma-IFN. Die Verwendung der auf diese Art und Weise hergestellten Zellen führt zur Gewinnung von IL-lβ.The use of cells of the U 937 cell line differentiated by TPA and gamma-IFN induced enables the production of natural human IL-1 β in cell culture. According to the invention, suitable cells can be obtained by differentiating the cells of a cell line U 937 with TPA and inducing IL-1 β production by gamma-IFN. The use of the cells produced in this way leads to the recovery of IL-1 β .

Die in den Abb. 1 und 2 dargestellten Histogram me zeigen die IL-lβ- und TNFα (tumor necrosis factor)- Produktion von TPA-differenzierten U 937 24 bzw. 48 Stunden nach erfolgter 24-stündiger Vorbehandlung mit Gamma-IFN. Zum Vergleich sind weiterhin abgebildet die Ergebnisse für die Bildung von IL-lβ und TNFα nach Vor inkubation mit Dexamethason (Dex) 10^-6 und 10^-7 M. Dexamethason ist bekannt als Inhibitor der m-RNA-Pro duktion von IL-l (Knudsen, P. J. et al., "Journal of Immunology" 139, 4129-4134, 1987) wie auch als Inhibi tor der TNFα-Synthese in U 937 (R. Hass, K. Resch; Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharm. 337, 337, 1988). Schließlich ist noch die IL-lβ- sowie TNFα-Produktion von nicht behandelten TPA-differenzierten Zellen als Kontrolle dargestellt. Die IL-lβ-Produktion ist bei den mit Gamma-IFN induzierten Zellen nach 24 Stunden etwa um den Faktor 10 und nach 48 Stunden noch um ungefähr den Faktor 6 erhöht. Die Menge des Tumornekrosefaktors in der Nährlösung ist dagegen unwesentlich verändert. Dies belegt die spezifische Induktion des Monokins IL-lβ durch Vorbehandlung der Zellen der Zellinie U 937 mit Gamma-IFN. Bei undifferenzierten Zellen der Zellinie U 937 konnte eine Stimulation der IL-lβ-Produktion nicht beobachtet werden.The histograms shown in Figs. 1 and 2 show the IL-1 β and TNF α (tumor necrosis factor) production of TPA-differentiated U 937 24 and 48 hours after 24-hour pretreatment with gamma-IFN. The results for the formation of IL-1 β and TNF α after pre-incubation with dexamethasone (Dex) 10 ^-6 and 10 ^-7 M are also shown for comparison. Dexamethasone is known as an inhibitor of m-RNA production of IL- l (Knudsen, PJ et al., "Journal of Immunology" 139, 4129-4134, 1987) as well as an inhibitor of TNF α synthesis in U 937 (R. Hass, K. Resch; Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharm . 337, 337, 1988). Finally, the IL-1 β and TNF α production of untreated TPA-differentiated cells is shown as a control. IL-1 β production in the cells induced with gamma-IFN is increased by a factor of 10 after 24 hours and by a factor of 6 after 48 hours. In contrast, the amount of tumor necrosis factor in the nutrient solution has changed insignificantly. This proves the specific induction of the monokine IL-1 β by pretreating the cells of the U 937 cell line with gamma-IFN. No stimulation of IL-1 β production could be observed in undifferentiated cells of the U 937 cell line.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.The following examples illustrate the invention explained.

example 1 Cultivation of cells from the U 937 cell line

Die U 937-Zellen wurden als Dauerkultur in RPMI 1640 Medium mit 5% fötalem Kälberserum (FKS), 50 U/ml Peni cillin, 50 µg/ml Streptomycin und 1% L-Glutamin kulti viert. Als Kulturbedingung wurde eine Atmosphäre mit 5% CO₂ und hoher Luftfeuchtigkeit gewählt.The U 937 cells were cultured as permanent culture in RPMI 1640 medium with 5% fetal calf serum (FKS), 50 U / ml peni cillin, 50 µg / ml streptomycin and 1% L-glutamine. An atmosphere with 5% CO ₂ and high air humidity was chosen as the culture condition.

Example 2 Differentiation from U 937

Die Differenzierung der U 937-Zellen zu makrophagen- ähnlichen Zellen wurde durch Zugabe des Phorbolester derivates 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) zum Kulturmedium in einer Endkonzentration von 5 × 10^-9 M induziert. Die Inkubation der Zellen mit TPA dauerte 3 Tage. Anschließend wurden die differenzierten Zellen mit Kulturmedium ohne TPA passagiert.Differentiation of the U 937 cells into macrophage-like cells was induced by adding the phorbol ester derivative 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) to the culture medium in a final concentration of 5 × 10 ^-9 M. The incubation of the cells with TPA lasted 3 days. The differentiated cells were then passaged with culture medium without TPA.

Example 3 Stimulation of U 937 for the specific production of IL-1 β

TPA-behandelte U 937 Zellen wurden nach der Differen zierung für 3 weitere Tage mit Medium kultiviert. Nach erneuter Zellpassage wurden die Zellen für 24 Stunden mit 100 U/ml rh-IFN-gamma (rekombinantes humanes Inter feron-gamma) im Kulturmedium inkubiert. Anschließend wurden die Zellen 2mal gewaschen, um überschüssiges rh-IFN-gamma zu entfernen und mit Kulturmedium inku biert. Nach 24 Stunden und nach 48 Stunden erfolgte die IL-l-Bestimmung im Überstand dieser Zellen.TPA-treated U 937 cells were differentiated Decoration cultivated with medium for a further 3 days. To Cell passage was repeated for 24 hours with 100 U / ml rh-IFN-gamma (recombinant human inter feron-gamma) incubated in the culture medium. Subsequently the cells were washed 2 times to remove excess remove rh-IFN-gamma and incubate with culture medium beer. After 24 hours and after 48 hours, the IL-1 determination in the supernatant of these cells.

Example 4 Determination of interleukin-l (IL-l)

Das Prinzip dieses IL-l-Testes besteht darin, mit Hilfe der IL-l enthaltenden Proben eine T-Lymphozyten-Linie zur Produktion von Interleukin-2 (IL-2) zu stimulieren. Der Überstand wird dann auf eine IL-2-sensitive zyto toxische T-Zell-Linie (CTLL) gegeben und hierbei durch Einbau von tritiiertem Thymidin die Proliferation ge messen.The principle of this IL-1 test is with help of the IL-1 containing samples a T-lymphocyte line to stimulate the production of interleukin-2 (IL-2). The supernatant is then transferred to an IL-2-sensitive cyto given toxic T cell line (CTLL) and by Incorporation of tritiated thymidine proliferation measure up.

Als IL-2-produzierende Zellen wurde die T-Lymphomzell- Linie EL4 des Mäusestammes C57BL/6 verwendet. Die Zel len wurden nach zweimaligem Waschen in einem 200 µl Testansatz in Mikrotiterplatten mit Rundboden in einer Endkonzentration von 5 × 10⁵ Zellen/ml in Medium und 10% FKS (RPMI 1640 mit 100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 45 µM β-Mercaptoethanol, 5 mM Hepes) gegeben. Die IL-2-Produktion der EL4-Zellen auf IL-l-Stimulus wurde erheblich verstärkt durch Iono phor A23187. Das Ionophor wurde deshalb in einer End konzentration von 2,5 × 10^-7 M dem Test beigefügt. Zur Quantifizierung der Menge IL-l in der Probe wurde diese im Test mit den EL4-Zellen austitriert. Anschließend erfolgt die Inkubation der EL4-Zellen für 24 Stunden bei 37°C/5% CO₂. Die Zellen in den Mikrotiterplatten wurden dann 10 Min./1400 rpm zentrifugiert und 100 µl Überstand in Mikrotiterplatten mit Flachboden übertra gen. Hierzu wurden 3 × gewaschene CTLL in einer End konzentration von 5 × 10⁴ Zellen/ml gegeben, so daß wiederum ein 200 µl Testansatz resultierte. Nach 20 Stunden Inkubation (37°C/5% CO₂) erfolgte die Bestim mung der Proliferation durch Einbau von 0,5 µCi ³H-Thy midin für 4 Stunden im CTLL-Test. Anschließend wurden die Zellen durch ein Filter gesaugt und die eingebaute Radioaktivität bestimmt. Die Einheit IL-l (U/ml) ist definiert als der reziproke Wert der halbmaximalen Kon zentration in der Verdünnungsreihe.The T-lymphoma cell line EL4 of the mouse strain C57BL / 6 was used as IL-2-producing cells. The cells were washed twice in a 200 μl test batch in round bottom microtiter plates in a final concentration of 5 × 10 ⁵ cells / ml in medium and 10% FCS (RPMI 1640 with 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 2 mM L-glutamine, 45 uM β- mercaptoethanol, 5 mM Hepes). The IL-2 production of the EL4 cells on IL-1 stimulus was considerably increased by Ionophore A23187. The ionophore was therefore added to the test in a final concentration of 2.5 × 10 ^-7 M. To quantify the amount of IL-1 in the sample, it was titrated in the test with the EL4 cells. The EL4 cells are then incubated for 24 hours at 37 ° C / 5% CO₂. The cells in the microtiter plates were then centrifuged for 10 min / 1400 rpm and 100 μl of supernatant were transferred to microtiter plates with a flat bottom. For this purpose, 3 × washed CTLL were added in a final concentration of 5 × 10 ⁴ cells / ml, so that again a 200 µl test batch resulted. After 20 hours of incubation (37 ° C / 5% CO ₂ ), the proliferation was determined by incorporating 0.5 µCi ³ H-thymidine for 4 hours in the CTLL test. The cells were then sucked through a filter and the built-in radioactivity was determined. The unit IL-1 (U / ml) is defined as the reciprocal of the half-maximum concentration in the dilution series.

Die Resultate dieses biologischen IL-l-Testsystems wur den durch einen IL-lβ RIA (Radioimmunoassay) überprüft. Die Methode für den IL-lβ RIA (P. J. Lisi et al., Lymph. Res. 6, 229, 1987) konnte vor allem für kinetische Un tersuchungen zur IL-l-Produktion bei U 937 verwendet werden, da Substanzen wie TPA oder Dexamethason den biologischen IL-l-Test entscheidend stören. Eine Kreuz reaktivität zu IL-lα konnte hier nicht nachgewiesen werden.The results of this biological IL-1 test system were checked by an IL-1 β RIA (radioimmunoassay). The method for the IL-l β RIA (PJ Lisi et al., Lymph. Res. 6, 229, 1987) could especially for kinetic Un investigations for IL-l production in U 937 to be used, since substances, such as TPA or Dexamethasone significantly disrupt the biological IL-1 test. A cross reactivity to IL-l α could not be demonstrated here.

Claims

1. A process for the production of natural human inter leukin-l β (IL-l β ) in cell culture, characterized in that the human tumor cells of the U 937 line differentiated by tetramyristinphorbol acetate (TPA) by the one-time addition of human gamma interferon ( Gamma-IFN) are induced to increase the production of IL-1 β and the IL-1 β formed is separated and purified in a manner known per se.

2. The method according to claim 1, characterized in that the IFN concentration used for the single dose Is 100 U / ml.

3. Cells obtained by differentiating the cells of the U 937 cell line with TPA and inducing IL-1 β production by adding human gamma-IFN once.