DE3811566A1 - Method for cell measurement - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Zellmessung, ins besondere ein Verfahren zur Zellmessung, das sich zur Un terscheidung von mehreren Typen von Zellen oder mehreren Typen von Antigenen unter Verwendung eines Blutausstrichs oder eines Zytopräparats oder zur Unterscheidung von mehreren Typen von Blutzellen oder Gewebezellen mittels eines Fließ zytometers eignet.The invention relates to a method for cell measurement, ins special a method for cell measurement, which is the Un Differentiation of several types of cells or several Types of antigens using a blood smear or one cytopreparation or to distinguish several Types of blood cells or tissue cells using a flow suitable for cytometers.
Herkömmliche Immunoassays bedienen sich verschiedener ana lytischer Verfahren unter Anwendung von unterschiedlichen Markierungssubstanzen. Hierzu gehören beispielsweise Radio immunoassays und Enzymimmunoassays. Viele dieser analyti schen Verfahren werden zur Analyse von unterschiedlichen Komponenten in Blut angewandt. Diese analytischen Verfah ren betreffen Substanzen, die an der sog. humoralen Immuni tät beteiligt sind. Andererseits wurden in letzter Zeit derartige hochempfindliche Immunoassaytechniken auf die Zellanalyse in Verbindung mit der sog. zellvermittelten Immunität angewandt, wobei Blutzellen, wie Lymphozyten und Erythrozyten, Gewebezellen und dergl., immunologisch untersucht werden. Beispielsweise gehören zu den Lympho zyten T-Zellen (T-Lymphozyten) und B-Zellen (B-Lymphozy ten). Beide stammen von einer gemeinsamen schmalen Stamm zelle ab. Sie wirken in Kooperation miteinander und verur sachen in Kooperation mit Makrophagen, Monozyten, mehr kernigen Leukozyten und dergl. Immunoreaktionen. Bei ver schiedenen immunologischen Erkrankungen stellt die Messung einer unnormalen Menge von T-Zellen, die eine wichtige Rolle bei der zellvermittelten Immunität spielen, oder von B-Zellen, die humorale Antikörper bilden, ein wert volles Mittel für die Diagnose oder das Verständnis der Pathologie dieser Krankheiten dar. Diese T-Zellen und B- Zellen werden derzeit auf folgende Weise gemessen. T-Zellen werden gemessen, indem man sich ihrer Eigenschaft zur Bil dung einer Rosette mit Schaferythrozyten (SRBC) in einem Teströhrchen bedient oder indem man sie durch Membran-Fluo reszenzantikörper-Technik unter Verwendung eines spezifisch mit T-Zellen reaktiven Antikörpers (anti-T-Zell-Antikör per) färbt. B-Zellen werden gemessen, indem man sich ihrer Eigenschaft zur Bildung einer Rosette mit Mäuseerythro zyten (MRBC) in einem Teströhrchen bedient. Da T-Zellen Immunoglobulin an ihrer Membranoberfläche aufweisen, be steht eine andere Methode zu ihrer Messung darin, daß man fluoreszierend markierte anti-human-Immunoglobulin antikörper aufbringt und positive Zellen unter einem Fluo reszenzmikroskop betrachtet (Nippon Rinsho (Japanese Cli nic), Bd. 40 (1982), Special Fall Number, S. 985).Conventional immunoassays use different ana lytic procedures using different Marking substances. This includes, for example, radio immunoassays and enzyme immunoassays. Many of these analyti procedures are used to analyze different Components applied in blood. This analytical procedure ren concern substances that participate in the so-called humoral immuno are involved. On the other hand, lately such highly sensitive immunoassay techniques to the Cell analysis in connection with the so-called cell-mediated Immunity applied to blood cells, such as lymphocytes and erythrocytes, tissue cells and the like, immunologically to be examined. For example, belong to the lympho Cytes T cells (T lymphocytes) and B cells (B lymphocytes ten). Both come from a common narrow trunk cell from. They work in cooperation with each other and cause things in cooperation with macrophages, monocytes, more nuclear leukocytes and the like. Immunoreactions. With ver different immunological diseases are measured an abnormal amount of T cells, which is an important one Role in cell-mediated immunity, or of B cells that produce humoral antibodies full tool for diagnosis or understanding of Pathology of these diseases. These T cells and B- Cells are currently measured in the following way. T cells are measured by looking at their properties for bil Formation of a rosette with sheep erythrocytes (SRBC) in one Operated test tubes or by passing them through membrane fluo Resection antibody technique using a specific antibody reactive with T cells (anti-T cell antibody per) colors. B cells are measured by looking at them Ability to form a rosette with mouse erythro cells (MRBC) served in a test tube. Because T cells Have immunoglobulin on their membrane surface, be Another method of measuring them is that fluorescent labeled anti-human immunoglobulin antibody and positive cells under a fluo Resence microscope viewed (Nippon Rinsho (Japanese Cli nic), Vol. 40 (1982), Special Fall Number, p. 985).
Jedoch sind bei den vorstehend beschriebenen Reaktionen unter Rosettenbildung zahlreiche aufwendige manuelle Ar beitsgänge erforderlich, z. B. eine Dichtezentrifugation. Außerdem besteht eine lange Wartezeit für die Rosettenbil dung. Schließlich muß eine mikroskopische Untersuchung unter Verwendung einer Zellkammer durchgeführt werden. Somit erfordert die Messung von T-Zellen oder B-Zellen einen hohen Arbeits- und Zeitaufwand. Demgegenüber kann die Membran-Fluoreszenzantikörper-Technik als ein zweck mäßiges Verfahren bezeichnet werden, bei dem sich auf grund der Verwendung eines spezifischen Antikörpers eine hohe Präzision des Meßwertes ergibt. Jedoch ist dieses Verfahren insofern nachteilhaft, als die Nachweisempfind lichkeit relativ nieder ist, da die Menge an markierender Verbindung (fluoreszierende Substanz), die an ein Anti körpermolekül angebracht werden kann, beschränkt ist. Außerdem lassen sich nur bestimmte, begrenzte Arten von fluoreszierenden Substanzen als markierende Verbindungen verwenden. Die meisten von ihnen weisen ähnliche Fluores zenzwellenlängen auf. Daher ist es schwierig, gleichzeitig eine optische Unterscheidung zwischen mehreren Typen von Zellen oder Zellantigenen unter Verwendung von mehreren Typen von fluoreszierenden Substanzen vorzunehmen.However, in the reactions described above numerous rosy manual works with rosette formation steps required, e.g. B. density centrifugation. There is also a long wait for the rosette bil dung. Finally, a microscopic examination is needed using a cell chamber. Thus, the measurement of T cells or B cells is required a lot of work and time. In contrast, can the membrane fluorescent antibody technique as a purpose moderate procedure, which refers to due to the use of a specific antibody results in high precision of the measured value. However, this is The method is disadvantageous in that the detection sensitivity is relatively low because of the amount of marking Compound (fluorescent substance) that acts on an anti body molecule can be attached is limited. In addition, only certain, limited types of fluorescent substances as labeling compounds use. Most of them have similar fluorescence wavelengths. Therefore, it is difficult at the same time an optical distinction between several types of Cells or cell antigens using multiple To make types of fluorescent substances.
Andererseits werden Enzymimmunoassay-Techniken zur Unter scheidung von Zellen oder Zellantigenen verwendet. Bei diesen Verfahren wird ein Antigen mit einem enzymmarkier ten Antikörper umgesetzt, und anschließend wird eine enzy matische Reaktion unter Farbentwicklung durchgeführt. Ferner stehen Verfahren zur Verfügung, bei dem mehrere Typen von Farbstoffen mit ein und derselben Zelle in Kontakt ge bracht werden, um eine Zellunterscheidung zu ermöglichen.On the other hand, enzyme immunoassay techniques become sub separation of cells or cell antigens. At This method uses an antigen with an enzyme label ten antibodies, and then an enzy Matic reaction carried out with color development. Further there are methods available in which several types of Dyes in contact with the same cell be brought to enable a cell differentiation.
Jedoch sind diese Verfahren insofern nachteilhaft, als sich farbgebende Substanzen oder bei der Farbentwicklungs reaktion gebildete Materialien häufig lediglich an der Zelloberfläche abscheiden und daher die Gefahr besteht, daß sie nach dem Färben wieder entfernt werden. Außerdem kann nur eine beschränkte Anzahl von Enzymarten bei der artigen Verfahren eingesetzt werden, und es ist schwierig, zwischen mehreren Arten von Zellen oder Zellantigenen op tisch auf der Basis der bei der enzymatischen Reaktion entwickelten Farbe zu unterscheiden. Außerdem sind mehr stufige Reaktionen für die Farbentwicklung erforderlich und die Wartezeit bis zum Vorliegen des Ergebnisses ist lang.However, these methods are disadvantageous in that coloring substances or in color development reaction-formed materials often only on the Deposit cell surface and therefore there is a risk that they are removed after dyeing. Furthermore can only have a limited number of enzyme types in the like procedures and it is difficult between several types of cells or cell antigens op table based on the enzymatic reaction to distinguish developed color. Besides, there are more staged reactions required for color development and the waiting time until the result is available long.
In der JP-OS 1 32 870/86 ist ein Verfahren beschrieben, bei dem mehrere Typen von Antikörpern individuell an Latexteil chen von unterschiedlichem Teilchendurchmesser haften. Unter Verwendung der Latexteilchen mit den daran haftenden individuellen Antikörpern und von mit einer fluoreszieren den Substanz markierten Antikörpern werden zu messende Immunoglobuline durch Fließzytometrie nachgewiesen. Je doch ist bei einem derartigen Verfahren die einsetzbare Menge an fluoreszierender Markierungssubstanz begrenzt, und es ist nicht möglich, mehrere Typen von Markierungs substanzen zu verwenden, da nur eine Lichtquelle, die eine einzige Wellenlänge emittiert, eingesetzt werden kann. Außerdem muß neben dem optischen Detektor ein Detektor zur Erfassung der Verteilung der Latexteilchen eingesetzt werden. Daher ist es schwierig, ein derartiges Verfahren zum optischen Nachweis von mehreren Zelltypen anzuwenden.In JP-OS 1 32 870/86 a method is described in which several types of antibodies individually on latex part surfaces of different particle diameters. Using the latex particles with those attached to them individual antibodies and fluoresce from with one Antibodies labeled with the substance are to be measured Immunoglobulins demonstrated by flow cytometry. Each however, the method can be used in such a method Limited amount of fluorescent labeling substance, and it is not possible to use multiple types of marker to use substances, since only one light source, the one single wavelength can be used. In addition to the optical detector, there must be a detector used to measure the distribution of the latex particles will. Therefore, such a method is difficult to be used for the optical detection of several cell types.
Die JP-OS 45 454/82 beschreibt ein Verfahren, bei dem mehrere Typen von Antikörpern mit einer Mehrzahl von unter schiedlichen spektral sensibilisierenden photographischen Farbstoffen markiert werden, die markierten Antikörper mit mehreren Typen von zu messenden Antigenen (z. B. Pep tiden) umgesetzt werden, die erhaltenen Reaktionsprodukte als Flecken auf eine ein Silberhalogenid enthaltende Schicht aufgebracht werden, die Reaktionsprodukte mit Licht von entsprechender spektral sensibilisierender Wellen länge zur Durchführung einer Entwicklung belichtet wird, die Schwärzungsdichte des belichteten Bereichs gemessen wird und dabei die mehreren Typen von Antigenen nachgewie sen werden. Auch ein derartiges Verfahren ist kompliziert, so daß damit ein Nachweis von mehreren Typen von Zellen nicht einfach durchgeführt werden kann.JP-OS 45 454/82 describes a method in which several types of antibodies with a plurality of under different spectral sensitizing photographic Dyes are labeled, the labeled antibodies with several types of antigens to be measured (e.g. Pep tiden) are implemented, the reaction products obtained as spots on a silver halide Layer are applied, the reaction products with Light from corresponding spectrally sensitizing waves length is exposed to carry out a development, measured the density of darkness of the exposed area and the various types of antigens are detected will be. Such a procedure is also complicated, making it a detection of several types of cells cannot be done easily.
In den letzten Jahren wurde der Nachweis von Antigenen auf einer Zelloberfläche durch das Goldkolloid-Antikörper- Verfahren durchgeführt. Jedoch liegt die Wellenlänge der maximalen Absorption von Goldkolloid im Bereich von 520 bis 540 nm. Daher eignet sich das Goldkolloid-Antikörper- Verfahren nicht zur gleichzeitigen Unterscheidung von meh reren Typen von Zellen oder Zellantigenen.In recent years, the detection of antigens on a cell surface by the gold colloid antibody Procedure carried out. However, the wavelength is maximum absorption of gold colloid in the range of 520 up to 540 nm. Therefore, the gold colloid antibody Method not for the simultaneous differentiation of meh Other types of cells or cell antigens.
Schließlich wurde in letzter Zeit versucht, ein Verfahren einzuführen, bei dem verschiedene Typen von Zellen klassi fiziert werden, indem man sich in freier Weise der Muster erkennungstechnik auf der Basis der Eigenschaften von Zellen, wie Färbbarkeit und Form, bedient. Jedoch ist diese Zellklassifizierung unter Anwendung dieser Mustererkennungs techniken noch unzureichend in der Unterscheidungspräzi sion. Es besteht ein Bedürfnis zur Entwicklung eines Ver fahrens zur Unterscheidung von Zellen, das mit hoher Spezi fität abläuft.Finally, a trial has recently been attempted introduce in which different types of cells classi be fished by looking at the pattern in a free manner detection technology based on the properties of Cells such as stainability and shape are served. However, this is Cell classification using this pattern recognition techniques still insufficient in the differentiation precision sion. There is a need to develop a ver driving to differentiate cells with high spec fity expires.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Zellmessung bereitzustellen, das in einfacher und rascher Weise den Nachweis, die Unterscheidung und die Messung nicht nur von T-Zellen oder B-Zellen, sondern auch von mehreren Typen von Zellen, wie Blutzellen, Gewebezellen und dergl., oder von mehreren Typen von Zellantigenen ermöglicht.The object of the invention is a method for cell measurement To provide that in a simple and quick manner Evidence, distinction and measurement not only of T cells or B cells, but also of several Types of cells such as blood cells, tissue cells and the like, or of several types of cell antigens.
Ein Weg zur Lösung dieser Aufgabe besteht darin, daß man mehrere Typen von zu testenden Zellen oder mehrere Typen von zu testenden Zellantigenen mit mehreren Typen von op tisch voneinander unterscheidbaren feinen Teilchen mit daran haftenden Antikörpern umsetzt, wobei die Antikör per spezifisch gegenüber den Zellen oder Zellantigenen reaktiv sind, und anschließend die mehreren Typen von Zellen oder Zellantigenen gleichzeitig mit einer optischen Einrichtung, die ein Sortieren bzw. eine Zuordnung der einzelnen feinen Teilchen ermöglicht, nachweist.One way to accomplish this is to: multiple types of cells to be tested or multiple types of cell antigens to be tested with several types of op fine particles that can be distinguished from each other antibodies attached to it, the antibody per specifically towards the cells or cell antigens are reactive, and then the several types of Cells or cell antigens simultaneously with an optical Facility that sorts or assigns the enables individual fine particles to be detected.
Ein weiterer Weg zur Lösung der genannten Aufgabe besteht darin, daß man mehrere Typen von zu testenden Zellen oder mehrere Typen von zu testenden Zellantigenen mit Antikör pern, die spezifisch gegenüber den Zellen oder den Zellanti genen reaktiv sind, umsetzt; anschließend damit Antikör per, die individuell an mehreren Arten von optisch vonein ander unterscheidbaren feinen Teilchen haften, umsetzt, wobei die Antikörper spezifisch gegenüber den vorerwähnten Antikörpern reaktiv sind; und anschließend die mehreren Typen von Zellen oder Zellantigenen gleichzeitig mit einer optischen Einrichtung, die ein Sortieren der einzelnen feinen Teilchen ermöglicht, nachweist.Another way to solve the above problem is in that you have several types of cells to be tested or several types of antibody-tested cell antigens pern that are specific to the cells or the cell anti genes are reactive; then antibody per, which is individual to several types of optically adhere to distinguishable fine particles, the antibodies being specific to the aforementioned Antibodies are reactive; and then the several Types of cells or cell antigens simultaneously with one optical device that sorting each allows fine particles to be detected.
Ein weiterer Weg zur Lösung der vorgenannten Aufgabe besteht darin, daß manAnother way to solve the above problem is in that one
- (a) einen Teil von mehreren Typen von zu testenden Zellen mit voneinander unterscheidbaren feinen Teilchen, an denen individuelle Antikörper haften, umsetzt, wobei die Antikörper spezifisch gegenüber diesen zu testen den Zellen reaktiv sind;(a) part of several types of to testing cells with distinguishable fine Particles to which individual antibodies adhere, testing the antibodies specifically against them the cells are reactive;
- (b) die restlichen zu testenden Zellen mit individuellen Antikörpern, die spezifisch ge genüber diesen zu testenden Zellen reaktiv sind, umsetzt und anschließend damit Antikörper umsetzt, die an feinen Teilchen haften, die optisch von den in (a) genannten feinen Teilchen unterscheidbar sind, wobei diese Antikörper gegen über den individuellen Antikörpern reaktiv sind; und(b) the rest to be tested Cells with individual antibodies that are specifically ge are reactive towards these cells to be tested and then uses it to convert antibodies that are on fine Particles adhere that optically of the fine mentioned in (a) Particles are distinguishable, these antibodies against are reactive over the individual antibodies; and
- (c) die mehreren Typen von zu testenden Zellen durch eine opti sche Einrichtung, die ein Sortieren der einzelnen feinen Teilchen ermöglicht, nachweist.(c) the multiple types of cells to be tested by an opti cal facility that sorting each fine Particle enables, demonstrates.
Nachstehend wird die Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigtThe invention will be described in more detail below with reference to the drawing explained. It shows
Fig. 1 ein Diagramm zur Erläuterung einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis von mehreren Typen von Zellantigenen; Fig. 1 is a diagram for explaining an embodiment of the inventive method for the detection of several types of cell antigens;
Fig. 2 ein Diagramm zur Erläuterung eines herkömmlichen Verfahrens zum Nachweis von mehreren Typen von Zellanti genen und Fig. 2 is a diagram for explaining a conventional method for the detection of several types of cell antigen and
Fig. 3 ein Diagramm zur Erläuterung des Aufbaus eines Fließ zytometers. Fig. 3 is a diagram for explaining the structure of a flow cytometer.
Die Art der erfindungsgemäß verwendeten feinen Teilchen ist nicht kritisch. Anders ausgedrückt, es können beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Zellmessung beliebige feine Teilchen verwendet werden, sofern sie optisch nach weisbar sind. Beispiele für derartige feine Teilchen sind synthetische polymere Substanzen, wie Latexteilchen, bei spielsweise aus Polystyrol und dergl.; Mikrokapseln, wie Liposomen und dergl.; anorganische Substanzen, z. B. Metall teilchen, wie Goldteilchen und dergl. Darunter werden Latex teilchen bevorzugt. Die Größe der feinen Teilchen beträgt 10-10 bis 10-6 m und vorzugsweise 10-7 bis 10-9 m. Eine derartige Größe eignet sich zur Unterscheidung von Zellen oder Zellantigenen. Was die Form der feinen Teilchen be trifft, können sie beispielsweise die Form von Kugeln, Würfeln, Sternen und dergl. aufweisen. Selbstverständlich besteht keine Beschränkung auf diese beispielhaft genann ten Formen.The type of fine particles used in the present invention is not critical. In other words, any fine particles can be used in the method for cell measurement according to the invention, provided that they are optically detectable. Examples of such fine particles are synthetic polymeric substances such as latex particles, for example made of polystyrene and the like; Microcapsules such as liposomes and the like; inorganic substances, e.g. B. metal particles such as gold particles and the like. Among them, latex particles are preferred. The size of the fine particles is 10 -10 to 10 -6 m, and preferably 10 -7 to 10 -9 m. Such a size is suitable for distinguishing cells or cell antigens. As for the shape of the fine particles, they may have the shape of spheres, cubes, stars and the like, for example. Of course, there is no limitation to these exemplary forms.
Mehrere Typen von Zellen oder mehrere Typen von Zellanti genen lassen sich gleichzeitig auf der Basis der unterschied lichen Größe oder Form der feinen Teilchen messen, indem man den Teilchendurchmesser oder die Form der feinen Teil chen je nach den Typen der zu messenden Zellen oder Zell antigene variiert. Eine andere Möglichkeit besteht darin, mehrere Typen von Zellen oder mehrere Typen von Zellanti genen gleichzeitig zu messen, indem man die Farbe der feinen Teilchen, die mit den Zellen oder Zellantigenen umgesetzt worden sind, nachweist, wenn die feinen Teilchen vonein ander aufgrund einer Variation ihrer Farbe je nach den Typen von Zellen oder Zellantigenen unterscheidbar sind. In den letzten Jahren sind gefärbte Teilchen mit unterschied lichen Teilchendurchmessern auf den Markt gekommen, die ebenfalls im erfindungsgemäßen Vefahren eingesetzt werden können. Ferner lassen sich Zellen oder Zellantigene mit hoher Empfindlichkeit nachweisen, indem man zwei oder mehr der Parameter Zelldurchmesser, Form und Farbe miteinander kombiniert.Multiple types of cells or multiple types of cell anti genes can be simultaneously based on the difference measure the size or shape of the fine particles by one the particle diameter or the shape of the fine part depending on the types of cells or cells to be measured antigens vary. Another option is multiple types of cells or multiple types of cell anti to measure genes simultaneously by looking at the color of fine Particles that are reacted with the cells or cell antigens has been detected when the fine particles of one due to a variation in their color depending on the Types of cells or cell antigens are distinguishable. In recent years, colored particles have been different particle diameters came onto the market can also be used in the process according to the invention can. Cells or cell antigens can also be used demonstrate high sensitivity by using two or more the parameters of cell diameter, shape and color with each other combined.
Der Grund dafür, warum eine ausreichende Nachweisempfind lichkeit mit den bisher allgemein üblichen Verfahren zur Markierung von Antikörpern nicht erreicht werden konnte, wird nachstehend anhand des Verfahrens unter Verwendung von Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) einem typischen fluores zierenden Farbstoff, und von anti-human-Albumin-Antikörper erläutert. Wird FITC zu einer gegebenen Menge an Antikörper gegeben, so läßt sich ein markierter Antikörper mit einem hohen Verhältnis von fluoreszierendem Farbstoff zu Pro teineinheit (F/P) erhalten, indem man die Menge an FITC erhöht. Im allgemeinen wird häufig ein mit fluoreszierendem Farbstoff markierter Antikörper mit einem F/P-Wert von etwa 2 eingesetzt. Ein markierter Antikörper mit einem F/P-Verhältnis von etwa 3 läßt sich herstellen, jedoch ist in diesem Fall die Antikörperaktivität häufig ver ringert. Somit ist die effektive Anzahl von fluoreszieren den Molekülen pro Antikörpermolekül beschränkt. Es gibt zahlreiche Fälle, in denen nur 1 Molekül markierter Anti körper an 1 Molekül Zellantigen angebracht werden kann. The reason why there is sufficient detection sensitivity with the usual methods for Labeling of antibodies could not be achieved is used below using the procedure of fluorescein isothiocyanate (FITC) a typical fluores ornamental dye, and anti-human albumin antibody explained. FITC becomes a given amount of antibody given, a labeled antibody with a high fluorescent dye to pro ratio unit (F / P) obtained by adjusting the amount of FITC elevated. In general, one with fluorescent Dye-labeled antibodies with an F / P value of about 2 used. A labeled antibody with a F / P ratio of about 3 can be established, however in this case the antibody activity is often ver wrestles. Thus the effective number of fluoresce the molecules per antibody molecule. There is numerous cases in which only 1 molecule of labeled anti can be attached to 1 molecule of cell antigen.
Daher ist es unmöglich, eine ausreichende Nachweisempfind lichkeit zu erreichen.Therefore, it is impossible to have sufficient detection sensitivity to achieve.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren unter Einsatz von op tisch unterscheidbaren feinen Teilchen, an denen Antikörper haften, eingesetzt. Selbstverständlich erlaubt dieses Verfah ren den Nachweis von Zellen mit einer im Vergleich zu her kömmlichen Verfahren, bei denen der Antikörper selbst mar kiert wird, höheren Empfindlichkeit. Was die gleichzeitige Messung von mehreren Typen von Zellen oder Zellantigenen betrifft, so ist die Art der markierenden Substanzen, die bei herkömmlichen Verfahren eingesetzt werden können, z. B. fluoreszierende Farbstoffe für Fluoreszenzimmunoassays und Enzyme für Enzymimmunoassays beschränkt. Daher besteht auch hinsichtlich der Art von Zellen oder Zellantigenen, die auf der Basis der Art der markierenden Substanzen gleich zeitig voneinander unterschieden werden können, eine Be schränkung. Demgegenüber können im Fall der im erfindungs gemäßen Verfahren eingesetzten feinen Teilchen Teilchen durchmesser, Form oder Farbe je nach Wunsch ausgewählt oder untereinander kombiniert werden, und es können zahl reiche Arten von optisch voneinander unterscheidbaren fei nen Teilchen eingesetzt werden. Somit läßt sich feststel len, daß das erfindungsgemäße Verfahren zur Zellmessung sich zur Unterscheidung und Messung von mehreren Typen von Zellen oder Zellantigenen eignet.According to the invention, a method using op table distinguishable fine particles on which antibodies stick, used. Of course, this procedure allows ren the detection of cells with a compared to conventional methods in which the antibody itself mar higher sensitivity. As for the simultaneous Measurement of several types of cells or cell antigens concerns, is the type of labeling substances that can be used in conventional processes, e.g. B. fluorescent dyes for fluorescence immunoassays and enzymes for enzyme immunoassays. Therefore there is also regarding the type of cells or cell antigens, the same based on the type of labeling substances can be differentiated in time, a Be limitation. In contrast, in the case of the fiction fine particles used according to the method diameter, shape or color selected as desired or combined with each other, and it can be number rich types of optically distinguishable fei NEN particles are used. Thus it can be determined len that the inventive method for cell measurement differentiate and measure several types of cells or cell antigens.
Außerdem ist beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Zell messung die bei herkömmlichen Verfahren erforderliche Farb bildungsreaktion nicht notwendig, was zu einer großen Zeit- und Arbeitsersparnis für das Zellmessungsverfahren führt. Somit wird erfindungsgemäß ein rasches und einfaches Verfahren zur Zellmessung bereitgestellt.In addition, in the method according to the invention for cell measurement the color required in conventional processes educational response is not necessary, resulting in a large Time and labor savings for the cell measurement process leads. Thus, according to the invention, it is quick and easy Methods for cell measurement provided.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Zellmessung können beliebige Blutzellen, Gewebezellen und dergl. gemessen werden. Insbesondere eignet sich das erfindungsgemäße Meßverfahren zur Messung von Blutzellen, wie Lymphozyten, Leukozyten, Erythrozyten, Blutplättchen und dergl.In the method for cell measurement according to the invention any blood cells, tissue cells and the like are measured will. The invention is particularly suitable Measuring method for measuring blood cells, such as lymphocytes, Leukocytes, erythrocytes, platelets and the like.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Zellmessung eignet sich insbesondere dann, wenn es sich bei der Testprobe um einen Blutausstrich oder ein Zytopräparat handelt. Durch entsprechende Wahl von Farbe, Form oder Teilchengröße der feinen Teilchen können die in Betracht kommenden Zellen oder die Anwesenheit von Antigen auf der Zelloberfläche ohne Beteiligung der Zellen nachgewiesen werden. Daher ist es auch möglich, verschiedene Zellen in einer Probe gleichzeitig auf der Basis der Form der Zellen oder auf der Basis der Information bei der Zellfärbung und dergl. zu klassifizieren, sowie die Anwesenheit des Antigens zu bestätigen. Für einen Nachweis von mehreren Typen von Zellen oder mehreren Typen von Zellantigenen war bei her kömmlichen Verfahren eine Mehrzahl von Präparaten von ein und derselben Probe erforderlich, während das erfindungsge mäße Verfahren die gleichzeitige Messung von mehreren Typen von Zellen oder mehreren Typen von Zellantigenen unter Verwendung von ein und demselben Präparat ermöglicht. Außerdem löst dieses Verfahren die Schwierigkeit, daß es bei einem der Farbbildung unterworfenen Farbstoff bei Mehrfachfärbung zu einer Entfärbung kommt.The method according to the invention is suitable for cell measurement especially if it is the test sample is a blood smear or a cytopreparation. By appropriate choice of color, shape or particle size The fine particles can be the cells in question or the presence of antigen on the cell surface can be detected without the involvement of the cells. Therefore it is also possible to have different cells in one sample at the same time based on the shape of the cells or on the basis of the information in cell staining and the like. to classify, as well as the presence of the antigen to confirm. For detection of multiple types of Cells or several types of cell antigens were present conventional methods a number of preparations from one and the same sample required, while the fiction method the simultaneous measurement of several Types of cells or multiple types of cell antigens using the same preparation. In addition, this method solves the problem that it with a dye subjected to color formation Multiple staining leads to discoloration.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Zellmessung lassen sich die feinen Teilchen leicht unter Verwendung eines Mikroskops, z. B. eines optischen oder eines elektrischen Mikroskops, unterscheiden. Insbesondere lassen sich mehrere Typen von Zellen oder Zellantigenen leicht und exakt nach weisen, indem man einen Blutausstrich oder ein Zytopräparat als Testprobe einsetzt und die feinen Teilchen unter Verwen dung eines Mikroskops unterscheidet.Leave in the method for cell measurement according to the invention the fine particles easily using a Microscope, e.g. B. an optical or an electrical Microscope. In particular, there are several Types of cells or cell antigens easily and exactly point by taking a blood smear or a cytopreparation is used as a test sample and the fine particles are used differs from a microscope.
Werden Teilchen, die sich in bezug auf Farbe und/oder Durch messer und/oder Form voneinander unterscheiden, als feine Teilchen eingesetzt, so lassen sich diese exakt mittels eines Fließzytometers voneinander unterscheiden. In diesem Fall wird üblicherweise eine Zellsuspension als Probe einge setzt. Are particles that differ in color and / or through differentiate knife and / or shape as fine If particles are used, they can be exactly of a flow cytometer. In this In this case, a cell suspension is usually used as a sample puts.
Eine Zellsuspension wird beispielsweise hergestellt, in dem man mehrere Typen von zu testenden Zellen mit mehreren Arten von feinen Teilchen, die sich in bezug auf Farbe und/oder Durchmesser und/oder Form voneinander unterschei den und an denen Antikörper haften, umgesetzt werden, wobei die Antikörper jeweils spezifisch gegenüber den Zellen reaktiv sind. Anschließend wird die Zellsuspension in das in Fig. 3 gezeigte Fließzytometer eingeführt.A cell suspension is produced, for example, by reacting several types of cells to be tested with several types of fine particles which differ from one another in terms of color and / or diameter and / or shape and to which antibodies adhere, the Antibodies are specifically reactive towards the cells. The cell suspension is then introduced into the flow cytometer shown in FIG. 3.
Werden mehrere Arten von feinen Teilchen, die sich in bezug auf die Farbe voneinander unterscheiden, verwendet, und wird die Unterscheidung aufgrund des Farbunterschieds vor genommen, so ist es nach der Antigen-Antikörper-Reaktion erforderlich, nicht-umgesetzte feine Teilchen von der Zell suspension, beispielsweise durch Zentrifugation, zu entfernen.There are several types of fine particles that are related to differentiate from each other, used, and the distinction is made based on the color difference taken, so it is after the antigen-antibody reaction required unreacted fine particles from the cell suspension, for example by centrifugation.
In Fig. 3 wird ein Strom von Zellen 1 in einer Kapillare 2 erzeugt und als Strom von Einzelzellen in eine Durchfluß zelle 4 geleitet. Eine Lichtquelle 3 ist seitlich neben der Durchflußzelle angeordnet. Auf der anderen Seite der Durchflußzelle befindet sich ein Schlitz 5. Durch den Schlitz 5 tretendes Licht gelangt in einen Detektor 6. Aus dem Detektor 6 wird ein Signal in den Signalprozessor 7 geleitet. Im Signalprozessor 7 erfolgt eine Aufarbeitung der Signale zum Nachweis und zur Unterscheidung der in Frage kommenden Zellen auf der Basis des absorbierten Licht anteils oder des Fluoreszenzanteils.In Fig. 3, a stream of cells 1 is generated in a capillary 2 and passed as a stream of single cells in a flow cell 4 . A light source 3 is arranged laterally next to the flow cell. There is a slot 5 on the other side of the flow cell. Light passing through the slit 5 reaches a detector 6 . A signal is passed from the detector 6 into the signal processor 7 . In the signal processor 7 , the signals are processed for the detection and differentiation of the cells in question on the basis of the absorbed light portion or the fluorescent portion.
Zu testende Zellen durchlaufen das enge Rohr (d. h. die Durchflußzelle) und werden aus der Lichtquelle 3 mit ei nem Laserstrahl bestrahlt. Ob es sich um die in Frage stehen den Zellen handelt oder nicht, kann bei der Laserbestrahlung aufgrund des Fluoreszenzanteils oder des Anteils an absor biertem Licht beurteilt werden. Außerdem kann auch eine quantitative Bestimmung der Zellen vorgenommen werden. Es ist auch möglich, eine qualitative und quantitative Zellmessung aufgrund von Lichtstreuung durchzuführen. Eine Zellsortiervorrichtung, d. h. ein Zellsortiergerät, kann dem in Fig. 3 gezeigten automatischen Zellanalysator hin zugefügt werden. Die in Frage stehenden Zellen gelangen mit einem Wasserstrahl nach unten. Genau dann, wenn die Zellen die Stelle erreichen, wo der Wasserstrahl in Wasser tröpfchen übergeführt wird, wird dem Wasserstrahl eine positive oder negative Ladung verliehen. Sind die Zellen negativ geladen, so bewegen sich Wassertropfen mit einem Gehalt an diesen Zellen während des Durchlaufens eines elektrischen Hochspannungsfelds 8 in Richtung zu einer positiven Elektrode, so daß die Fallrichtung der Wasser tropfen zur positiven Elektrode hin abgelenkt wird. Auf diese Weise lassen sich die in Frage stehenden Zellen in einem Probengefäß 9 sammeln.Cells to be tested pass through the narrow tube (ie the flow cell) and are irradiated from the light source 3 with a laser beam. Whether the cells in question are involved or not can be assessed in laser irradiation on the basis of the proportion of fluorescence or the proportion of absorbed light. A quantitative determination of the cells can also be carried out. It is also possible to carry out a qualitative and quantitative cell measurement based on light scattering. A cell sorting device, ie a cell sorting device, can be added to the automatic cell analyzer shown in FIG. 3. The cells in question come down with a water jet. Exactly when the cells reach the point where the water jet is converted into water droplets, the water jet is given a positive or negative charge. If the cells are negatively charged, water droplets containing these cells move in the direction of a positive electrode during the passage through a high-voltage electrical field 8 , so that the falling direction of the water droplets is deflected toward the positive electrode. In this way, the cells in question can be collected in a sample vessel 9 .
Werden die zu testenden Zellen mit Hilfe eines Fließzyto meters unter Verwendung von feinen Teilchen, die voneinander in bezug auf Teilchendurchmesser und/oder Form sowie in bezug auf die Farbe unterscheidbar sind, gemessen, so können neben Größe und Form der feinen Teilchen sowohl der Anteil der Lichtabsorption als auch der Lichtstreuung untersucht werden, so daß ein genauerer Nachweis der zu testenden Zellen möglich ist.Are the cells to be tested using a flow cyto meters using fine particles that differ from each other in terms of particle diameter and / or shape and in are distinguishable in terms of color, measured, so can next Size and shape of the fine particles both the proportion of Light absorption and light scattering are examined, so that more accurate detection of the cells to be tested is possible.
Selbstverständlich können feine Teilchen, die in bezug auf Farbe und/oder Durchmesser und/oder Form voneinander unterschiedlich sind, mit Hilfe eines Mikroskops unter schieden werden.Of course, fine particles that are related on color and / or diameter and / or shape of each other are different using a microscope under be divorced.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Zellmessung werden mehrere Typen von zu testenden Zellen mit feinen Teilchen , an denen Antikörper haften, umgesetzt, wobei die Antikör per spezifisch gegenüber den Zellen reaktiv sind, und an schließend werden die feinen Teilchen mit Hilfe eines Mikroskops oder eines Fließzytometers voneinander unter schieden, wobei die zu testenden Zellen nachgewiesen werden können.In the method according to the invention for cell measurement several types of cells to be tested with fine particles, to which antibodies adhere, the antibody are specifically reactive towards the cells, and on the fine particles are then closed using a Microscope or a flow cytometer from each other separated, whereby the cells to be tested are detected can.
Eine andere Nachweismöglichkeit für zu testende Zellen besteht darin, daß man zunächst mehrere Typen von zu testen den Zellen mit Antikörpern, die spezifisch gegenüber den Zellen reaktiv sind, umsetzt; anschließend das Reaktions produkt mit feinen Teilchen, an denen Antikörper haften, umsetzt, wobei diese Antikörper spezifisch gegenüber den vorerwähnten Antikörpern reaktiv sind; und eine Unterschei dung der so umgesetzten feinen Teilchen vornimmt.Another way of detecting cells to be tested is that you first have to test several types of the cells with antibodies that are specific to the Cells are reactive; then the reaction product with fine particles to which antibodies adhere, converts, these antibodies specific to the the aforementioned antibodies are reactive; and a difference of the fine particles thus converted.
Eine weitere Nachweismöglichkeit für zu testende Zellen besteht in einer Kombination dieser Verfahren. Das heißt, zu testende Zellen lassen sich auch durch eine Kombina tion von feinen Teilchen, an denen Antikörper gegen die zu testenden Zellen haften, und anderen feinen Teilchen, an denen Antikörper gegen die genannten Antikörper haften, nachweisen.Another possibility of detection for cells to be tested consists of a combination of these processes. This means, cells to be tested can also be combined tion of fine particles on which antibodies against the cells to be tested, and other fine particles, to which antibodies against the antibodies mentioned adhere, to prove.
Mehrere Typen von Antigenen auf der Zelloberfläche lassen sich ebenfalls auf die vorstehend beschriebene Weise nach weisen, indem man feine Teilchen, an denen Antikörper haften, verwendet, wobei diese Antikörper mit den Antigenen reak tiv sind. Auch hier können diese Teilchen und andere feine Teilchen, an denen Antikörper haften, wobei diese Antikör per gegenüber den vorerwähnten Antikörpern spezifisch reak tiv sind, kombiniert werden. Dieser Nachweis ermöglicht die Beobachtung unter Mehrfachmarkierung von ein und der selben Zelle.Leave several types of antigens on the cell surface also follow in the manner described above point by placing fine particles with antibodies attached to them used, these antibodies with the antigens reak are active. Again, these particles and others can be fine Particles to which antibodies adhere, these antibodies per specifically against the aforementioned antibodies tive are combined. This proof enables observation under multiple marking of one and the same cell.
Beim vorerwähnten erfindungsgemäßen Verfahren werden als Antikörper, die gegenüber den Antigenen spezifisch reaktiv sind, vorzugsweise monoklonale Antikörper verwendet.In the aforementioned method according to the invention, as Antibodies that are specifically reactive towards the antigens are preferably used monoclonal antibodies.
Blutzellen wurden bisher durch Mustererkennungstechniken mit Hilfe eines Computers auf der Basis verschiedener Infor mationen, z. B. Färbung, Form und dergl., klassifiziert. Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Zellmessung lassen sich Blutzellen klassifizieren, indem man die zu testenden Zellen mit mehreren Arten von optisch voneinander unterscheid baren feinen Teilchen, an denen Antikörper haften, umsetzt, wobei die Antikörper jeweils für die Zellen spezifisch sind, und die feinen Teilchen optisch nachweist.Blood cells have so far been used through pattern recognition techniques with the help of a computer based on various information mations, e.g. B. color, shape and the like. Classified. Leave in the method for cell measurement according to the invention classify blood cells by looking at the ones to be tested Cells with several types of optically differ from each other convertible fine particles to which antibodies adhere, the antibodies being specific for the cells are, and optically detects the fine particles.
Nachstehend werden ein herkömmlicher Enzymimmunoassay und das erfindungsgemäße Verfahren, bei dem sich mehrere Typen von Zellantigenen nachweisen lassen, unter Beschreibung der aufeinanderfolgenden Reaktionsstufen erläutert. Beim herkömmlichen Verfahren, beispielsweise beim Nachweis von zwei Typen von Zellantigenen gemäß Fig. 2, d. h. eines Antigens 3 und eines Antigens 4 auf einer Zelle 2, die sich auf einem Objektträger 1 befindet, werden enzymmarkier te Antikörper hergestellt, indem man die Antigene 3 und 4 mit zwei Enzymen, die nach der Farbreaktion eine unter schiedliche Färbung ergeben, färbt. Das heißt, zunächst wird ein mit dem Enzym A markierter Antikörper mit dem Antigen 3 umgesetzt, wonach ein Substrat A zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion zugesetzt wird. Das Antigen 3 wird durch Beobachten der gebildeten Farbe (d. h. rote Farbe 3′) nachgewiesen. Anschließend wird das Antigen 4 nachgewiesen, indem man es mit Antikörper, der mit dem Enzym B markiert ist, umsetzt, anschließend das Substrat B zusetzt und die gebildete Farbe beobachtet (z. B. die blaue Farbe 4′). Beim beschriebenen herkömmlichen Verfahren be steht eine Beschränkung hinsichtlich der Enzymarten, so daß die Anzahl der Typen von Antigenen, die gleichzeitig nachgewiesen werden kann, ebenfalls beschränkt ist. Außer dem treten zusätzliche Schwierigkeiten auf, z. B. eine Ent färbung im Stadium nach der Färbung.A conventional enzyme immunoassay and the method according to the invention, in which several types of cell antigens can be detected, are explained below, with the description of the successive reaction stages. In the conventional method, for example in the detection of two types of cell antigens according to FIG. 2, ie an antigen 3 and an antigen 4 on a cell 2 which is on a slide 1 , enzyme-labeled antibodies are produced by using the antigens 3 and 4 with two enzymes, which give a different color after the color reaction. That is, an antibody labeled with enzyme A is first reacted with antigen 3 , after which a substrate A is added to carry out an enzymatic reaction. The antigen 3 is detected by observing the color formed (ie red color 3 ' ). Subsequently, the antigen 4 is detected by reacting it with antibody which is labeled with the enzyme B, then adding the substrate B and observing the color formed (for example the blue color 4 ' ). In the conventional method described, there is a limitation on the types of enzymes, so that the number of types of antigens that can be detected at the same time is also limited. In addition, there are additional difficulties, e.g. B. a Ent staining in the stage after coloring.
Bei dem in Fig. 1 gezeigten erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Probe auf einen Objektträger 1 mit optisch von einander unterscheidbaren feinen Teilchen, an denen Anti körper haften, umgesetzt, wobei es sich um Antikörper gegen ein Antigen 3 und ein Antigen 4 auf der Oberfläche einer Zelle 3 in der Testprobe handelt (z. B. rote feine Teilchen mit einem daran haftenden Antikörper gegen das Antigen 3 und blaue feine Teilchen mit einem daran haftenden Antikör per gegen das Antigen 4. In the method according to the invention shown in Fig. 1, a sample is reacted on a slide 1 with optically distinguishable fine particles to which antibodies adhere, which are antibodies against an antigen 3 and an antigen 4 on the surface of a cell 3 is in the test sample (e.g. red fine particles with an antibody against the antigen 3 and blue fine particles with an antibody against the antigen 4 .
Anschließend werden die einzelnen Teilchen voneinander mit Hilfe einer optischen Einrichtung, die ein Sortieren (Zuordnen) der einzelnen Teilchen ermöglicht, voneinander unterschieden, beispielsweise mit einem Spektroskop 5 durch ein optisches Mikroskop. Gemäß diesem Verfahren lassen sich das Antigen 3 und das Antigen 4 gleichzeitig nachweisen. Eine Ausführungsform der spektralen Eigenschaften der roten Teilchen und der blauen Teilchen ist in Fig. 1 gezeigt.The individual particles are then distinguished from one another with the aid of an optical device which enables the individual particles to be sorted (assigned), for example with a spectroscope 5 through an optical microscope. According to this method, antigen 3 and antigen 4 can be detected simultaneously. An embodiment of the spectral properties of the red particles and the blue particles is shown in FIG. 1.
Nachstehend wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Zell messung anhand von Beispielen näher erläutert.The method according to the invention becomes a cell below measurement explained in more detail using examples.
Ein Dünnschichtausstrich von Blut eines Patienten wird hergestellt, getrocknet und sofort fixiert. Der fixierte Blutausstrich wird 30 Minuten bei 37°C mit einem Reagens aus blauen feinen Latexteilchen mit einem Teilchendurch messer von 0,03 µm, an denen anti-T-Zellen-Antikörper haften, und einem Reagens aus roten feinen Latexteilchen mit einem Teilchendurchmesser von 0,03 µm, an denen anti-B-Zellen- Antikörper haften, umgesetzt. Anschließend werden die Reaktionsprodukte ausreichend mit 0,1 m Phosphatpuffer (pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 1% Humanserumalbumin gewaschen, und überschüssige Reagentien werden entfernt. Sodann werden die prozentualen Anteile an T-Zellen und B-Zellen bestimmt, indem man mittels eines optischen Mikro skops Zellen mit daran haftenden blauen feinen Latexteilchen und Zellen mit daran haftenden roten feinen Latexteilchen mißt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.A thin-layer smear of a patient's blood will made, dried and fixed immediately. The fixed one Blood smear is 30 minutes at 37 ° C with a reagent made of fine blue latex particles with one particle 0.03 µm knife with anti-T cell antibodies attached to it and a red fine latex particle reagent with a Particle diameter of 0.03 µm, on which anti-B cell Antibodies stick, implemented. Then the Reaction products sufficient with 0.1 m phosphate buffer (pH 7.4) containing 1% human serum albumin washed and excess reagents removed. Then the percentages of T cells and B cells determined by using an optical micro skops cells with fine blue latex particles attached to them and cells with red fine latex particles attached to them measures. The results are summarized in Table I.
Die Ergebnisse in Tabelle I stimmen mit den Ergebnissen überein, die mit einem auf die gleiche Weise hergestellten und umgesetzten Blutausrichtpräparat erhalten werden, wobei man ein herkömmliches automatisches Hämatogramm-Sor tiergerät zum Sortieren von Zellen mit daran haftenden roten Teilchen und Zellen mit daran haftenden blauen Teil chen verwendet und die prozentualen Anteile an T-Zellen und B-Zellen ermittelt.The results in Table I are consistent with the results match that with one made in the same way and converted blood alignment preparation are obtained, using a conventional automatic hematogram sor animal device for sorting cells with attached red particles and cells with blue part attached to them Chen used and the percentages of T cells and B cells determined.
Ein Dünnschichtausstrich des Bluts eines Patienten wird hergestellt, getrocknet und sofort fixiert. Ein Reagens mit Mäuse-anti-T-Zellen-Antikörpern und ein Reagens mit Ratten-anti-B-Zellen-Antikörpern wird tropfenweise zum fixierten Blutausstrich gegeben. Die Umsetzung wird 30 Minuten bei 37°C durchgeführt. Anschließend werden die Reaktionsprodukte mit Phosphatpuffer mit einem Gehalt an 1% Albumin gewaschen. Anschließend werden ein Reagens von blauen feinen Latexteilchen mit einem Teilchendurch messer von 0,03 µm, an denen Kaninchen-anti-Maus-Antikörper haften, und ein Reagens von roten feinen Latexteilchen mit einem Teilchendurchmesser von 0,03 µm, an denen Kanin chen-anti-Ratten-Antikörper haften, tropfenweise zu den Reaktionsprodukten gegeben. Die Umsetzung wird 30 Minuten bei 37°C durchgeführt. Sodann werden die erhaltenen Produkte gewaschen, und die prozentualen Anteile an T-Zellen und B-Zellen werden bestimmt, indem man die Zellen mit daran haftenden blauen Teilchen und die Zellen mit daran haften den roten Teilchen mit Hilfe eines optischen Mikroskops mißt. Die Ergebnisse stimmen gut mit den bei einem her kömmlichen Verfahren erhaltenen Ergebnissen überein.A thin layer smear of a patient's blood will made, dried and fixed immediately. A reagent with mouse anti-T cell antibodies and a reagent with Rat anti-B cell antibodies dropwise become fixed blood smear. The implementation turns 30 Minutes at 37 ° C. Then the Reaction products with phosphate buffer containing 1% albumin washed. Then a reagent of blue fine latex particles with one particle through knife of 0.03 µm on which rabbit anti-mouse antibody stick, and a reagent of fine red latex particles with a particle diameter of 0.03 µm, on which rabbit fur chen anti-rat antibodies adhere dropwise to the Given reaction products. The implementation will take 30 minutes performed at 37 ° C. Then the products obtained washed, and the percentages of T cells and B cells are determined by placing the cells on them sticking blue particles and the cells stick to it the red particles with the help of an optical microscope measures. The results are in good agreement with those of one results obtained using conventional methods.
50 µl einer Suspension von Humanlymphozyten werden mit 50 µl eines Reagens von feinen roten Latexteilchen mit einem Teilchendurchmesser von 0,01 µm, an denen Human-Trans ferrin-Rezeptor-Antikörper haften, und 50 µl eines Reagens von blauen feinen Latexteilchen mit daran haftenden anti- human-T-Zellen-Antikörpern vermischt. Die Umsetzung wird 1 Stunde bei 37°C durchgeführt. Nach Hämolyse von kontami nierenden Erythrozyten werden die Zellen durch 10minütige Zentrifugation bei 300 g gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden zu einem Präparat verarbeitet. Zellen, an denen sowohl rote Teilchen als auch blaue Teilchen haften, werden unter einem Mikroskop betrachtet, wobei aktivierte T-Zellen identifiziert werden.50 µl of a suspension of human lymphocytes are mixed with 50 µl of a reagent of fine red latex particles with a particle diameter of 0.01 microns on which human trans ferrin receptor antibodies adhere, and 50 ul of a reagent of fine blue latex particles with anti-sticking human T cell antibodies mixed. The implementation will Performed for 1 hour at 37 ° C. After hemolysis of contami the erythrocytes are denominated by 10 minutes Centrifugation washed at 300 g. The washed cells are processed into a preparation. Cells on which both red particles and blue particles stick viewed under a microscope, showing activated T cells be identified.
Ein Gemisch aus 20 µl einer Suspension von Humanlymphozyten und 10 µl Mäuse-anti-T-Zellen-Antikörper wird 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Zum Waschen der Zellen wird 2 mal 5 Minuten bei 800 g zentrifugiert. Anschließend werden 20 µl eines Reagens von Goldteilchen mit einem Durchmesser von 30 nm, an denen Ziegen-anti-Maus-Antikörper haften, zum fertigen Präzipitat gegeben. Das erhaltene Gemisch wird 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach 5minütigem Waschen durch Zentrifugation bei 800 g werden 50 µl eines Reagens von feinen gelben Latexteilchen mit einem Teilchendurch messer von 0,8 µm, an denen Kaninchen-anti-B-Zellen-Anti körper haften, zu dem durch die Zentrifugation gebildeten Präzipitat gegeben. Die Reaktion wird 30 Minuten bei 37°C durchgeführt. Nach dem Waschen der Zellen wird eine Sus pension der Zellen auf einen Objektträger getropft, ausge strichen und fixiert. Das erhaltene Präparat wird unter einem optischen Mikroskop betrachtet. Es ist möglich, T- Zellen und B-Zellen in einer Lymphozytensuspension auf der Grundlage der Farbtöne der Zellen und des unterschied lichen Teilchendurchmessers der gefärbten Teilchen zu unter scheiden.A mixture of 20 µl of a suspension of human lymphocytes and 10 µl of mouse anti-T cell antibody is 15 minutes incubated at 4 ° C. The cells are washed twice 5 times Centrifuged at 800 g for minutes. Then 20 µl of a reagent of gold particles with a diameter of 30 nm to which goat anti-mouse antibodies adhere, added to the finished precipitate. The mixture obtained is incubated at 37 ° C for 30 minutes. After washing for 5 minutes by centrifugation at 800 g, 50 ul of a reagent of fine yellow latex particles with one particle through knife of 0.8 µm, on which rabbit anti-B cell anti adhere to the body formed by centrifugation Precipitate given. The reaction is 30 minutes at 37 ° C carried out. After washing the cells, a Sus Pension the cells dripped onto a slide, out painted and fixed. The preparation obtained is under viewed through an optical microscope. It is possible to T- Cells and B cells in a lymphocyte suspension the basis of the colors of the cells and the difference to the particle diameter of the colored particles divorce.
100 µl einer Lymphozytensuspension werden mit 50 µl eines Reagens von grün fluoreszierenden Latexteilchen mit daran haftenden anti-T-Zellen-Antikörpern und mit 50 µl eines Reagens von rot fluoreszierenden Latexteilchen mit daran haftenden Anti-B-Zellen-Antikörpern vermischt. Die Umsetzung wird 30 Minuten bei 37°C durchgeführt. Anschließend wird 2 mal 10 Minuten durch Zentrifugation gewaschen. Das end gültige Präzipitat wird mit einer Pufferlösung versetzt. Sodann wird die Analyse mit Hilfe eines Fließzytometers durchgeführt. In diesem Fall sind zwar 2 Arten von Lasern für die Bestrahlung erforderlich, da unterschiedlich ge färbte Latexteilchen verwendet werden, jedoch kann der Nachweis unter Verwendung von Lasern, wie sie üblicher weise bei Verfahren zur gleichzeitigen quantiativen Bestim mung von DNA und RNA verwendet werden, erfolgen.100 ul of a lymphocyte suspension with 50 ul one Reagent of green fluorescent latex particles with it adhering anti-T cell antibodies and with 50 ul one Reagent of red fluorescent latex particles with it adhering anti-B cell antibodies mixed. The implementation is carried out at 37 ° C for 30 minutes. Then will Washed twice by 10 minutes by centrifugation. The end valid precipitate is mixed with a buffer solution. The analysis is then carried out using a flow cytometer carried out. In this case there are 2 types of lasers necessary for the irradiation, because different ge colored latex particles can be used, however, the Detection using lasers as usual wise in procedures for simultaneous quantitative determination DNA and RNA are used.
In Tabelle II sind die prozentualen Anteile der Zellzahlen bei Bestimmung mittels Laserbestrahlung und durch Auszählen der Zellen ausgeführt.In Table II are the percentages of cell numbers when determined by means of laser radiation and by counting of cells running.
Die Ergebnisse von Tabelle II werden erhalten, indem man die fluoreszierenden Latexteilchen in haftende Verbindung mit den in Frage stehenden Zellen bringt und die Messung mit Hilfe eines Fließzytometers durchführt. Diese Ergeb nisse stimmen gut mit den gemäß einem herkömmlichen Ver fahren erhaltenen Ergebnissen überein.The results of Table II are obtained by the fluorescent latex particles in adhesive bond with the cells in question and the measurement with the help of a flow cytometer. This result nisse agree well with that according to a conventional ver drive results obtained.
Beim herkömmlichen Verfahren werden die T-Zellen und B-Zel len jeweils gefärbt und anschließend mit Hilfe eines opti schen Mikroskops gemessen. In the conventional method, the T cells and B cells len colored and then with the help of an opti microscope measured.
Liposomen werden auf herkömmliche Weise hergestellt. In den Liposomen werden jeweils die lichtabsorbierenden Sub stanzen TAMSMB (2-(2-Thiazolylazo)-4-methyl-5-sulfomethyl- aminobenzoesäure) und Amidoschwarz eingekapselt. Anti-T-Zellen-Antikörper und anti-B-Zellen-Antikörper werden auf herkömmliche Weise in haftende Verbindung mit den TAMSMB enthaltenden Liposomen bzw. mit den Amidoschwarz enthaltenden Liposomen gebracht. 100 µl einer Lymphozytensuspension werden mit jeweils 50 µl der Lösungen mit den markierten Antikörpern gebracht. Die Umsetzung wird 30 Minuten bei 37°C durchgeführt. Anschlie ßend wird 2mal durch 10minütiges Zentrifugieren gewa schen. Das endgültige Präzipitat wird mit einer Pufferlösung versetzt, wonach die Analyse mit Hilfe eines Fließzyto meters durchgeführt wird. In diesem Fall lassen sich die lichtabsorbierenden Substanzen nachweisen, indem man die zu messenden Zellen mit weißem Licht belichtet und das durchtretende Licht in seine spektralen Komponenten auf trennt.Liposomes are made in a conventional manner. In the light-absorbing sub punch TAMSMB (2- (2-thiazolylazo) -4-methyl-5-sulfomethyl- aminobenzoic acid) and Encapsulated in amido black. Anti-T cell antibodies and Anti-B cell antibodies are made in a conventional manner in adhesive association with the liposomes containing TAMSMB or brought with the liposomes containing amido black. 100 ul of a lymphocyte suspension with 50 ul each of the solutions with the labeled antibodies. The The reaction is carried out at 37 ° C for 30 minutes. Then ßend is washed twice by centrifugation for 10 minutes . The final precipitate is with a buffer solution , after which the analysis with the help of a flow cyt meters is carried out. In this case, the detect light-absorbing substances by using the exposed cells to be measured with white light and that passing light into its spectral components separates.
Die Anzahl der Signale bei den Wellenlängen 410 nm und 600 nm, die auf die in den Liposomen eingekapselten Sub stanzen zurückzuführen sind, wird ermittelt. Die prozen tualen Anteile der Zellzahlen sind in Tabelle III ange geben.The number of signals at the wavelengths 410 nm and 600 nm, which on the encapsulated in the liposomes Sub stamping are determined. The percent The actual proportions of the cell numbers are given in Table III give.
Die Ergebnisse des herkömmlichen Verfahrens beziehen sich auf eine mikroskopische Untersuchung. Die erfindungsge mäßen Ergebnisse beziehen sich auf die Zellmessung unter Verwendung der lichtabsorbierenden Substanzen als Markie rungssubstanzen. Die Ergebnisse stimmen gut mit den Ergeb nissen des herkömmlichen Verfahrens überein.The results of the conventional method relate for a microscopic examination. The fiction moderate results refer to the cell measurement below Use of the light-absorbing substances as a markie substances. The results are in good agreement with the results nissen of the conventional method.
Wie vorstehend erläutert, lassen sich erfindungsgemäß mehrere Typen von Zellen, wie Blutzellen, Gewebezellen und dergl., oder mehrere Typen von Zellantigenen gleichzeitig leicht und schnell mit hoher Empfindlichkeit unterschei den und messen.As explained above, according to the invention several types of cells, such as blood cells, tissue cells and the like, or several types of cell antigens at the same time differentiate easily and quickly with high sensitivity and measure it.
Claims (49)
- - mehrere Typen von zu testenden Zellen mit mehreren Ty pen von optisch voneinander unterscheidbaren feinen Teil chen, an denen Antikörper haften, umsetzt, wobei die Antikörper jeweils spezifisch gegenüber den zu testenden Zellen reaktiv sind, und
- - anschließend die mehreren Typen von zu testenden Zellen durch eine optische Einrichtung, die ein Sortieren der einzelnen feinen Teilchen ermöglicht, nachweist.
- - Reacts several types of cells to be tested with several types of optically distinguishable fine particles to which antibodies adhere, the antibodies being specifically reactive towards the cells to be tested, and
- - then the multiple types of cells to be tested by an optical device that allows sorting of the individual fine particles.
- - mehrere Typen von zu testenden Zellen mit mehreren Ar ten von Antikörpern, die spezifisch mit den zu testen den Zellen reaktiv sind, umsetzt,
- - anschließend Antikörper, die einzeln an mehreren Ar ten von optisch voneinander unterscheidbaren feinen Teil chen haften und die mit den vorerwähnten Antikörpern spezifisch reaktiv sind, umsetzt und
- - anschließend die mehreren Typen von zu testenden Zel len durch eine optische Einrichtung, die ein Sortieren der Zellen ermöglicht, nachweist.
- reacting several types of cells to be tested with several types of antibodies which are specifically reactive with the cells to be tested,
- - then antibodies, which individually adhere to several types of optically distinguishable fine particles and which are specifically reactive with the aforementioned antibodies, and
- - Then the multiple types of cells to be tested by an optical device that enables sorting of the cells is detected.
- - mehrere Typen von Antigenen der zu testenden Zellen mit mehreren Arten von optisch voneinander unterscheid baren feinen Teilchen, an denen Antikörper haften, um setzt, wobei die Antikörper jeweils spezifisch gegen über den zu testenden Zellen reaktiv sind,
- - die mehreren Typen von Zellantigenen durch eine opti sche Einrichtung, die ein Sortieren der feinen Teilchen ermöglicht, unterscheidet und
- - dabei die zu testenden Zellen nachweist.
- several types of antigens of the cells to be tested are reacted with several types of optically distinguishable fine particles to which antibodies adhere, the antibodies being specifically reactive towards the cells to be tested,
- - The several types of cell antigens by an opti cal device that allows sorting the fine particles, distinguishes and
- - Detects the cells to be tested.
- - mehrere Typen von Antigenen von zu testenden Zellen mit Antikörpern umsetzt, die spezifisch gegenüber den Antigenen reaktiv sind,
- - anschließend damit Antikörper umsetzt, die an mehreren Arten von optisch voneinander unterscheidbaren feinen Teilchen haften, wobei die Antikörper spezifisch gegen über den vorerwähnten Antikörpern reaktiv sind,
- - anschließend die mehreren Typen von Zellantigenen durch eine optische Einrichtung, die ein Sortieren der einzelnen feinen Teilchen ermöglicht, unterscheidet und
- - dabei die zu testenden Zellen nachweist.
- reacting several types of antigens from cells to be tested with antibodies which are specifically reactive towards the antigens,
- subsequently reacting therewith antibodies which adhere to several types of optically distinguishable fine particles, the antibodies being specifically reactive towards the above-mentioned antibodies,
- - then differentiates and distinguishes the several types of cell antigens by an optical device which enables sorting of the individual fine particles and
- - Detects the cells to be tested.
- (a) einen Teil von mehreren Typen von zu testenden Zellen mit voneinander unterscheidbaren feinen Teilchen, an denen individuelle Antikörper haften, umsetzt, wobei die Anti körper jeweils spezifisch gegenüber den zu testenden Zellen reaktiv sind,
- (b) die restlichen zu testenden Zellen mit individuellen Antikörpern, die spezifisch gegenüber diesen zu testenden Zellen reaktiv sind, umsetzt, anschließend damit an fei nen Teilchen haftende Antikörper umsetzt, wobei die Anti körper spezifisch gegenüber den individuellen Antikörpern reaktiv sind und wobei die feinen Teilchen optisch von den in (a) erwähnten feinen Teilchen unterscheidbar sind, und
- (c) die mehreren Arten von zu testenden Zellen durch eine optische Einrichtung, die ein Sortieren der individuellen feinen Teilchen ermöglicht, nachweist.
- (a) reacting a part of several types of cells to be tested with distinguishable fine particles to which individual antibodies adhere, the antibodies being specifically reactive towards the cells to be tested,
- (b) reacting the remaining cells to be tested with individual antibodies which are specifically reactive toward these cells to be tested, then reacting therewith with antibodies adhering to fine particles, the antibodies being specifically reactive with the individual antibodies and with the fine particles are optically distinguishable from the fine particles mentioned in (a), and
- (c) Detects the multiple types of cells to be tested by an optical device that enables the individual fine particles to be sorted.
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