DE3802367A1

DE3802367A1 - Process for the synthesis of nucleoside 5'-O-(1-thiotriphosphates) (NTP alpha S) and 2'-deoxynucleoside 5'-O-(1-thiotriphosphates) (dNTP alpha S)

Info

Publication number: DE3802367A1
Application number: DE3802367A
Authority: DE
Inventors: Fritz Prof Dipl Phys Eckstein; Janos Dr Ludwig
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1988-01-27
Filing date: 1988-01-27
Publication date: 1989-08-10

Abstract

The process is characterised in that a nucleoside derivative in which the NH2 groups of the base and the OH groups of the sugar, except in the 5' position, are provided with protective groups are reacted with 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one, the resulting reaction product is reacted with an alkylammonium salt of pyrophosphoric acid and then with sulphur, and the resulting reaction product is then hydrolysed and the protective groups are eliminated. The process represents an efficient and simple synthesis with which the nucleoside and deoxynucleoside 5'-thiotriphosphates can be obtained in very good yields, which are usually between 65 and 80 %. Use of an alkylammonium salt of phosphoric acid in place of the alkylammonium salt of pyrophosphoric acid, or of iodine in place of sulphur, results in the corresponding thiodiphosphates or the corresponding triphosphates or diphosphates.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von Nucleosid-5′-O-(1-thiotriphosphaten) (NTPα S) und 2′-Deoxynucleosid- 5′-O-(1-thiotriphosphaten) (dNTPa S), sowie auch der analogen 5′-O-(1-thiodiphosphate), und der analogen 5′-O-triphosphate und -diphosphate.The invention relates to a process for the synthesis of nucleoside-5'-O- (1-thiotriphosphates) (NTP α S) and 2'-deoxynucleoside-5'-O- (1-thiotriphosphates) (dNTP a S), and also analog 5'-O- (1-thiodiphosphate), and the analog 5'-O-triphosphate and diphosphate.

Nucleosid-5′-O-(1-thiotriphosphate) (NTPα S) und 2′-Deoxynucleosid- 5′-O-(1-thiotriphosphate) (dNTPα S) haben auf den Gebieten der Biochemie und Molekularbiologie eine wachsende Bedeutung erlangt als Substrate für RNA- und DNA-Polymerasen (vgl. F. Eckstein, Ann. Rev. Biochem. 54 (1985), 3676-402). Insbesondere die ³⁵S-markierten Verbindungen haben eine weitverbreitete Anwendung zur Markierung von RNA oder DNA erlangt, zur Verwendung zur Hybridisierung und zur Sequenzanalyse (vgl. M. D. Biggin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80 (1983), 3963-3965, A. T. Haase et. al., Science 227 (1985), 189-192, S. Bahmanyar et al., Science 237 (1987), 77-80, C. Dony und P. Gruss, The EMBO J. 6 (1987) 2965-2975, K. D. Croen et al., The New England Journal of Medicine 317 (1987), 1427-1432).Nucleoside-5′-O- (1-thiotriphosphate) (NTP α S) and 2′-deoxynucleoside-5′-O- (1-thiotriphosphate) (dNTP α S) have become increasingly important in the fields of biochemistry and molecular biology as substrates for RNA and DNA polymerases (cf. F. Eckstein, Ann. Rev. Biochem. 54 (1985), 3676-402). In particular, the ³⁵S-labeled compounds have found widespread use for labeling RNA or DNA, for use in hybridization and for sequence analysis (cf. MD Biggin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80 (1983), 3963-3965, AT Haase et al., Science 227 (1985), 189-192, S. Bahmanyar et al., Science 237 (1987), 77-80, C. Dony and P. Gruss, The EMBO J. 6 (1987) 2965-2975, KD Croen et al., The New England Journal of Medicine 317 (1987), 1427-1432).

Zur Synthese dieser Verbindungen sind verschiedene Verfahren beschrieben worden (vgl. F. Eckstein, Ann. Rev. Biochem. 54 (1985), 3676-402). Nach einer Methode wird das Nucleosid zuerst mit PSCl₃ umgesetzt und dann zum Nucleosid-phosphorothioat hydrolysiert. Dem folgt eine Aktivierung mit Diphenylphosphorochloridat und Behandlung mit Pyrophosphat, um die gewünschten NTPα S oder dNTPα S zu erhalten (vgl. F. Eckstein und R. S. Goody, Biochemistry 15 (1976) 1685-1691). Alternativ kann das Produkt der Thiophosphorylierungsreaktion direkt mit Pyrophosphat umgesetzt werden (vgl. R. S. Goody und M. Isakov, Tetrahedron Lett. 27 (1986) 3599-3602), wie dies ursprünglich für die Synthese unmodifizierter Nucleosid-5′-triphosphate beschrieben wurde (vgl. J. Ludwig, Acta Biochim. et Biophys. Acad. Sci. Hung. 16 (1981) 131-133). Diese Verfahren sind im Konzept ähnlich denen, worin die Thiophosphorylierung mit Triimidazoyl-phosphinsulfid durchgeführt wird, und dann direkt mit Pyrophosphat umgesetzt wird (vgl. F. Eckstein und H. Gindl, Biochimica et Biophysica Acta 149 (1967) 35-40). Eine weitere Entwicklung besteht in der Kondensation des Nucleosid-5′-phosphorothioats mit dem entsprechenden Nucleosid-5′-diphosphat (vgl. J. P. Richard und P. A. Frey, J. Am. Chem. Soc (1982) 104, 3476-3481). Die Diastereomeren dieser Reaktionsprodukte können aufgetrennt werden und nach Entfernung einer der Ribosen durch Oxidation können die individuellen Diastereomeren des Nucleosid-5′-O-(1-thiotriphosphates) erhalten werden. In einer etwas verschiedenen Weise wird das Nucleosid zum Nucleosid-5′-phosphit überführt, silyliert und dann mit Schwefel oxidiert, um das Nucleosid-5′-phosphorothioat zu ergeben. Dieses wird dann, wie oben beschrieben, durch Reaktion mit Diphenylphosphorochloridat aktiviert, und mit Pyrophosphat behandelt, um das dNTPα S zu ergeben (vgl. J. T. Chen und S. J. Benkovic, Nucleic Acids Res. 11 (1983), 3737-3751).Various methods have been described for the synthesis of these compounds (cf. F. Eckstein, Ann. Rev. Biochem. 54 (1985), 3676-402). According to one method, the nucleoside is first reacted with PSCl₃ and then hydrolyzed to the nucleoside phosphorothioate. This is followed by activation with diphenyl phosphorochloridate and treatment with pyrophosphate in order to obtain the desired NTP α S or dNTP α S (cf. F. Eckstein and RS Goody, Biochemistry 15 (1976) 1685-1691). Alternatively, the product of the thiophosphorylation reaction can be reacted directly with pyrophosphate (cf. RS Goody and M. Isakov, Tetrahedron Lett. 27 (1986) 3599-3602), as was originally described for the synthesis of unmodified nucleoside 5′-triphosphates (cf. J. Ludwig, Acta Biochim. Et Biophys. Acad. Sci. Hung. 16 (1981) 131-133). These processes are conceptually similar to those in which the thiophosphorylation is carried out with triimidazoylphosphine sulfide and then directly reacted with pyrophosphate (see F. Eckstein and H. Gindl, Biochimica et Biophysica Acta 149 (1967) 35-40). A further development is the condensation of the nucleoside 5'-phosphorothioate with the corresponding nucleoside 5'-diphosphate (cf. JP Richard and PA Frey, J. Am. Chem. Soc (1982) 104, 3476-3481). The diastereomers of these reaction products can be separated and after removal of one of the riboses by oxidation, the individual diastereomers of the nucleoside-5'-O- (1-thiotriphosphate) can be obtained. In a somewhat different way, the nucleoside is converted to the nucleoside 5'-phosphite, silylated and then oxidized with sulfur to give the nucleoside 5'-phosphorothioate. This is then activated as described above by reaction with diphenyl phosphorochloridate and treated with pyrophosphate to give the dNTP α S (see JT Chen and SJ Benkovic, Nucleic Acids Res. 11 (1983), 3737-3751).

Obgleich alle diese Methoden den Vorteil besitzen, daß sie an ungeschützten Nucleosiden durchgeführt werden können, besitzen sie den Nachteil, daß sie, mit der Ausnahme des Verfahrens von R. S. Goody und M. Isakov (Tetrahedron Lett. 27 (1986) 3599-3602), Vielstufenverfahren sind, und alle das gewünschte Reaktionsprodukt in wechselnden und im allgemeinen unbefriedigenden Ausbeuten ergeben. Although all of these methods have the advantage that they are performed on unprotected nucleosides can, they have the disadvantage that, with the Exception to R. S. Goody and M. Isakov's procedure (Tetrahedron Lett. 27 (1986) 3599-3602), multi-stage process are, and all the desired reaction product in changing and generally unsatisfactory Yields.

Alternativen hierzu sind semi-enzymatische Synthesen, in denen chemisch synthetisiertes Nucleosid-5′-O-(2- thiodiphosphat) enzymatisch zum Thiotriphosphat phosphoryliert wird. Eine vollkommen enzymatische Umwandlung des Nucleosid-5′-phosphorothioats zum Thiotriphosphat ist nach bekannten Verfahren nur möglich für dAMPS und AMPS (vgl. F. Eckstein, Ann. Rev. Biochem., 54 (1985), 3676-402).Alternatives to this are semi-enzymatic syntheses, in which chemically synthesized nucleoside-5′-O- (2- thiodiphosphate) phosphorylated enzymatically to the thiotriphosphate becomes. A completely enzymatic conversion of nucleoside 5'-phosphorothioate to thiotriphosphate is only possible for dAMPS using known methods and AMPS (see F. Eckstein, Ann. Rev. Biochem., 54 (1985), 3676-402).

Es besteht deshalb ein Bedürfnis für ein effektives Verfahren zur Synthese von Nucleosid-5′-O-(1-thiotriphosphaten) (NTPα S) und 2′-Deoxynucleosid-5′-O-(1-thiotriphosphaten) (dNTPα S).There is therefore a need for an effective method for the synthesis of nucleoside 5'-O- (1-thiotriphosphates) (NTP α S) and 2'-deoxynucleoside-5'-O- (1-thiotriphosphates) (dNTP α S) .

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Bereitstellung eines Verfahrens zur Synthese von Nucleosid-5′-O-(1-thiotriphosphaten) (NTPα S) und 2′-Deoxynucleosid-5′-O-(1-thiotriphosphaten) (dNTPα S), das einfach und reproduzierbar durchgeführt werden kann, und mit dem gute Ausbeuten erhalten werden können. Diese Aufgabe wird mit der vorliegenden Erfindung gelöst.The object of the present invention is therefore to provide a process for the synthesis of nucleoside-5'-O- (1-thiotriphosphates) (NTP α S) and 2'-deoxynucleoside-5'-O- (1-thiotriphosphates) (dNTP α S ) that can be carried out easily and reproducibly, and with which good yields can be obtained. This object is achieved with the present invention.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Synthese von Nucleosid-5′-O-(1-thiotriphosphaten) (NTPα S) und 2′-Deoxynucleosid-5′-O-(1-thiotriphosphaten) (dNTPα S), das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Nucleosidderivat, in dem die NH₂-Funktionen der Basen und die OH-Funktionen des Zuckers außer in der 5′-Stellung mit Schutzgruppen versehen sind, mit 2-Chlor-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on umsetzt, das so erhaltene Reaktionsprodukt mit einem Alkylammoniumsalz von Pyrophosphorsäure umsetzt, und danach mit Schwefel, und das so erhaltene Reaktionsprodukt dann hydrolysiert und die Schutzgruppen abspaltet. The invention relates to a process for the synthesis of nucleoside-5'-O- (1-thiotriphosphates) (NTP α S) and 2'-deoxynucleoside-5'-O- (1-thiotriphosphates) (dNTP α S), which thereby is characterized in that a nucleoside derivative in which the NH₂ functions of the bases and the OH functions of the sugar are provided with protective groups except in the 5'-position, with 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin- 4-one, the reaction product thus obtained is reacted with an alkylammonium salt of pyrophosphoric acid and then with sulfur, and the reaction product thus obtained is then hydrolyzed and the protective groups are split off.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung von Nucleosid-5′-O- (1-thiodiphosphaten) und Deoxynucleosid-5′-O-(1-thiodiphosphaten) neben den entsprechenden 1-Thiotriphosphaten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in dem vorstehend genannten erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der 1-Thiotriphosphate anstelle der Alkylammoniumsalze von Pyrophosphorsäure die Alkylammoniumsalze von Phosphorsäure verwendet.Another object of the present invention is also a process for the preparation of nucleoside-5'-O- (1-thiodiphosphates) and deoxynucleoside-5′-O- (1-thiodiphosphates) in addition to the corresponding 1-thiotriphosphates, which is characterized in that in the The aforementioned method for Preparation of the 1-thiotriphosphate instead of the alkylammonium salts of pyrophosphoric acid the alkylammonium salts of phosphoric acid used.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung der entsprechenden Triphosphate oder Mischung von Triphosphaten und Diphosphaten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in den beiden vorstehend genannten Verfahren zur Herstellung der 1-Thiotriphosphate oder einer Mischung von 1-Thiotriphosphaten und 1-Thiodiphosphaten den Schwefel durch eine Mischung von Wasser und Jod ersetzt, d. h., die Oxidation anstelle mit Schwefel mit Wasser/Jod durchführt.The invention also relates to a method for the preparation of the corresponding triphosphates or mixture of triphosphates and diphosphates, the is characterized in that in the two above mentioned processes for the preparation of 1-thiotriphosphates or a mixture of 1-thiotriphosphates and 1-thiodiphosphates the sulfur through a Mixture of water and iodine replaced, d. i.e., the oxidation instead of using sulfur with water / iodine.

Die Umsetzung der geschützten Nucleosidderivate mit dem Phosphitylierungsreagenz (2-Chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin- 4-on) erfolgt in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. in Dioxan/Pyridin. Vorzugsweise wird das Phosphitylierungsreagenz in einer äquivalenten Menge oder in einem leichten Überschuß davon eingesetzt.Implementation of the protected nucleoside derivatives with the Phosphitylation reagent (2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin 4-one) is carried out in a suitable solvent, e.g. B. in dioxane / pyridine. Preferably that is Phosphitylation reagent in an equivalent amount or used in a slight excess thereof.

Die Umsetzung des phosphitylierten Produktes mit dem Alkylammoniumpyrophosphat oder -phosphat und mit Schwefel erfolgt in einem dafür geeigneten Medium, vorzugsweise in Dimethylformamid. Die Umsetzung mit Schwefel findet vorzugsweise in dem gleichen Medium, wie es für die Umsetzung mit dem Alkylammoniumsalz verwendet wird, statt. Die Umsetzung mit Schwefel kann z. B. auch in Schwefelkohlenstoff/Pyridin durchgeführt werden, oder mit einer Suspension von Schwefel in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. in Dioxan.Implementation of the phosphitylated product with the Alkyl ammonium pyrophosphate or phosphate and with sulfur takes place in a suitable medium, preferably in dimethylformamide. The implementation with sulfur preferably takes place in the same medium as it is for the reaction with the alkylammonium salt is used, instead of. The reaction with sulfur can e.g. B. also in Carbon disulfide / pyridine are carried out, or with a suspension of sulfur in a suitable Solvents, e.g. B. in dioxane.

Als Alkylammoniumsalze von Pyrophosphorsäure oder Phosphorsäure werden vorzugsweise solche eingesetzt, in denen die Alkylgruppe 1 bis 8 Kohlenstoffatome besitzt, und insbesondere das Tri-n-butylammoniumsalz, also das Bis-tri-n-butylammoniumpyrophosphat oder Tri-n-butylammoniumphosphat.As alkylammonium salts of pyrophosphoric acid or phosphoric acid are preferably used in where the alkyl group has 1 to 8 carbon atoms, and especially the tri-n-butylammonium salt, that is Bis-tri-n-butylammonium pyrophosphate or tri-n-butylammonium phosphate.

Die Reaktionstemperatur liegt vorzugsweise bei Raumtemperatur oder schwach erhöhter Temperatur, z. B. zwischen Raumtemperatur und 60°C, wobei Raumtemperatur im allgemeinen bevorzugt ist. Zweckmäßig kann es auch sein, die Hydrolysebehandlung bei einer höheren Temperatur als der Temperatur der vorhergehenden Umsetzungen vorzunehmen, z. B. bei 60°C.The reaction temperature is preferably room temperature or slightly elevated temperature, e.g. B. between room temperature and 60 ° C, being room temperature is generally preferred. It can also be useful be the hydrolysis treatment at a higher temperature than the temperature of the previous reactions make, e.g. B. at 60 ° C.

Die für die erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Ausgangsprodukte (Nucleosidderivate, in denen die NH₂- Funktionen der Basen sowie die Hydroxyl-Funktionen des Zuckers mit Ausnahme der 5′-Stellung geschützt sind) können leicht nach gut bekannten und erprobten Verfahren hergestellt werden. Ein solches Verfahren ist die stufenweise Derivatisierung dieser Funktionen mittels der "Transient Protection Method" (vgl. G. S. Ti et al., J. Am. Chem. Soc. 104 (1982), 1316-1319). Eine Alternative hierzu ist die Dimethoxytritylierung mit nachfolgendem gleichzeitigem Schutz der NH₂- und Hydroxyl-Funktionen durch Acylierung, gefolgt von Entfernung der Dimethoxytritylgruppe. Dieser Weg wurde zum Schutz von Ribonucleosiden beschrieben (vgl. R. Lohrmann und H. G. Khorana, J. Am. Chem. Soc. 86 (1964) 4188-4194). Eine weitere Möglichkeit zur Synthese der Basen- und 2′,3′-OH-geschützten Ribonucleoside wird von V. J. Davisson et al., J. Org. Chem. 52 (1987) 1794-1801 beschrieben.Those used for the methods of the invention Starting products (nucleoside derivatives in which the NH₂- Functions of the bases as well as the hydroxyl functions of the Sugar with the exception of the 5'-position are protected) can easily be made using well known and proven methods getting produced. One such procedure is gradual derivatization of these functions by means of the "Transient Protection Method" (cf. G. S. Ti et al., J. Am. Chem. Soc. 104: 1316-1319 (1982)). An alternative this is the dimethoxytritylation with the following simultaneous protection of the NH₂ and hydroxyl functions by acylation followed by removal of the Dimethoxytrityl group. This path was used to protect Ribonucleosides described (see R. Lohrmann and H.G. Khorana, J. Am. Chem. Soc. 86 (1964) 4188-4194). Another way to synthesize the base and 2 ′, 3′-OH-protected ribonucleosides is used by V. J. Davisson et al., J. Org. Chem. 52 (1987) 1794-1801.

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt eine sehr effektive Synthesemöglichkeit insbesondere für die Nucleosid- und Deoxynucleosid-5′-O-(1-thiotriphosphate) dar, und besitzt gegenüber bekannten Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen einige Vorteile: so ist das Verfahren z. B. als Eintopfverfahren und in kurzer Zeit durchzuführen, weist keine Löslichkeitsprobleme auf und die Einbringung des Schwefels ist sehr einfach, wodurch sich auch eine effektive Verwendung von markiertem Schwefel ermöglicht. Die Ausbeuten sind hervorragend und liegen in der Regel zwischen 65 und 80%. Die Diastereomeren können durch Ionenaustauschchromatographie erhalten werden (vgl. J. T. Chen und S. J. Benkovic, Nucleic Acids Res. 11 (1983) 3737-3751), Medium Pressure Chromatography (R. S. Goody und M. Isakov, Tetrahedron Lett. 27 (1986) 3599-3602) oder präparative Reverse Phase HPLC.The method according to the invention is a very effective one Synthesis possibility especially for the nucleoside and deoxynucleoside-5′-O- (1-thiotriphosphate), and has compared to known methods of manufacture of these connections some advantages: that's the way it is Process z. B. as a one-pot process and in a short time has no solubility problems and the introduction of the sulfur is very easy, which makes effective use of marked Enables sulfur. The yields are excellent and are usually between 65 and 80%. The Diastereomers can be obtained by ion exchange chromatography can be obtained (cf. J. T. Chen and S. J. Benkovic, Nucleic Acids Res. 11 (1983) 3737-3751), Medium Pressure Chromatography (R. S. Goody and M. Isakov, Tetrahedron Lett. 27 (1986) 3599-3602) or preparative reverse HPLC phase.

Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Phosphitylierungsreagenz (2-Chlor-4H-1,3-2-benzodioxaphosphorin-4-on) ist es möglich, das Reaktionsprodukt mit dem Nucleosid direkt, ohne weitere Aktivierungsstufe, mit dem Pyrophosphat zu behandeln. Das 2-Chlor-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin- 4-on (vgl. J. A. Cade und W.Gerrard, J. Chem. Soc. (1960), 1249-1253) wurde früher zur Umsetzung mit Nucleosiden beschrieben, um nach Hydrolyse Nucleosid-H- phosphate zu ergeben, die zur Bildung von Phosphodiester- internucleotidischen Bindungen nach Aktivierung und Oxidation verwendet wurden (vgl. J. E. Marugg et al., Tetrahedron Lett 27 (1986) 2661-2664). By using the phosphitylation reagent according to the invention (2-chloro-4H-1,3-2-benzodioxaphosphorin-4-one) it is possible to use the reaction product with the nucleoside directly, with no further activation step, with the pyrophosphate to treat. The 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin 4-one (see J.A. Cade and W.Gerrard, J. Chem. Soc. (1960), 1249-1253) was previously used for implementation Nucleosides Described To Nucleoside H- After Hydrolysis to give phosphates which are used to form phosphodiester internucleotide bindings after activation and oxidation were used (cf. J.E. Marugg et al., Tetrahedron Lett 27 (1986) 2661-2664).

Die Fig. 1 zeigt die Reaktionsfolgen der erfindungsgemäßen Verfahren: . The Figure 1 shows the reaction effects of the methods of the invention:

Das ³¹P-NMR-Spektrum, das nach der Reaktion des phosphitylierten Nucleosids (2) mit Pyrophosphat aufgenommen wurde, ist einigermaßen komplex. Es besteht aus zwei Quartetts bei ca. -18 und -20 ppm und einem Triplett bei 105,5 ppm. Dieses Spektrum ist dem Nucleosid- 5′-(cyclisches Phosphit-phosphatanhydrid) (3) zuzuordnen. Nach Zugabe von Schwefel ändert sich das Triplett dieses Spektrums zu einem Triplett bei 44,9 ppm, während die zwei Quartetts im wesentlichen unverändert bleiben. Dies ist das erwartete Spektrum des intermediären Nucleosid-5′-(1-thiocyclotriphosphats) (4). Es wird durch Hydrolyse zum Nucleosid-5′-thiotriphosphat (5) geöffnet. Das korrespondierende Nucleosid-cyclisches Triphosphat, das sich aus einer Reaktion mit Jod ergibt, kann nicht festgestellt werden, weil es während der Oxidationsreaktion in dem wäßrigen Medium hydrolysiert. Die Existenz des cyclischen Phospit-Diphosphat- Zwischenprodukts (3) zeigt, daß das Nucleosid-phosphit (2) bifunktionell ist und zwei nachfolgende nucleophile Substitutionsreaktionen eingehen kann. Es wird angenommen, daß die austretende Gruppe in der ersten Reaktion mit Pyrophosphat die Carboxylgruppe ist, und daß die phenolische Gruppe in der intramolekularen zweiten Reaktion austritt.The 31 P NMR spectrum, which was recorded after the reaction of the phosphitylated nucleoside ( 2 ) with pyrophosphate, is somewhat complex. It consists of two quartets at around -18 and -20 ppm and a triplet at 105.5 ppm. This spectrum is assigned to the nucleoside 5 '- (cyclic phosphite-phosphate anhydride) ( 3 ). After adding sulfur, the triplet of this spectrum changes to a triplet at 44.9 ppm, while the two quartets remain essentially unchanged. This is the expected spectrum of the intermediate nucleoside 5 ′ - (1-thiocyclotriphosphate) ( 4 ). It is opened by hydrolysis to the nucleoside 5'-thiotriphosphate ( 5 ). The corresponding nucleoside cyclic triphosphate resulting from a reaction with iodine cannot be determined because it hydrolyzes in the aqueous medium during the oxidation reaction. The existence of the cyclic phosphite diphosphate intermediate ( 3 ) shows that the nucleoside phosphite ( 2 ) is bifunctional and can undergo two subsequent nucleophilic substitution reactions. It is believed that the leaving group in the first reaction with pyrophosphate is the carboxyl group and that the phenolic group is leaving in the intramolecular second reaction.

Das Verfahren ist auch geeignet zur Synthese von ³⁵S- markiertem NTPα S und dNTPα S. Das beste Verfahren ist wahrscheinlich die im Beispiel 2 beschriebene Methode B für die Synthese von TTPα S, bei dem der Schwefel in einem kleinen Überschuß als Suspension in DMF zugefügt wird. Nach Zufügung dieser Suspension zur Reaktionsmischung wird eine Lösung erhalten, und die Reaktion ist in zwei Minuten vervollständigt. Diese Umsetzung kann auch durchgeführt werden, indem man den Schwefel in einer Mischung aus CS₂/Pyridin löst, wie dies für die Synthese von Oligonucleotiden beschrieben wird (vgl. B. A. Conolly et al., 23 (1984) 3443-3453; J. Ott und F. Eckstein, Biochemistry (1987). Die Reaktion kann jedoch auch in einem großen Überschuß mit Schwefel in Suspension durchgeführt werden, wie dies für die Synthese von Dinucleosid-phosphorothioat beschrieben wird (vgl. P. M. J. Burgers und F. Eckstein, Tetrahedron Lett. (1978) 3835-3838).The method is also suitable for the synthesis of ³⁵S-labeled NTP α S and dNTP α S. The best method is probably the method B described in Example 2 for the synthesis of TTP α S, in which the sulfur is suspended in a small excess in DMF is added. After adding this suspension to the reaction mixture, a solution is obtained and the reaction is completed in two minutes. This reaction can also be carried out by dissolving the sulfur in a mixture of CS₂ / pyridine, as described for the synthesis of oligonucleotides (see. BA Conolly et al., 23 (1984) 3443-3453; J. Ott and F. Eckstein, Biochemistry (1987). However, the reaction can also be carried out in a large excess with sulfur in suspension, as is described for the synthesis of dinucleoside phosphorothioate (cf. PMJ Burgers and F. Eckstein, Tetrahedron Lett. ( 1978) 3835-3838).

Die Chromatographie an DEAE-Sephadex des nach Hydrolyse der Schutzgruppen erhaltenen Produktes zeigte zwei Nebenprodukte, die von den Nucleosid-thiotriphosphaten gut abgetrennt sind. Eines ist eine kleine Menge des Thiodiphosphats, das sich während der Abspaltung der Schutzgruppen bildet.Chromatography on DEAE-Sephadex after hydrolysis the product obtained from the protecting groups showed two by-products, that of the nucleoside thiotriphosphates are well separated. One is a small amount of the Thiodiphosphate, which is formed during the splitting off of the Forms protective groups.

Wenn das Verfahren in Gegenwart von Tri-n-butylammoniumphosphat durchgeführt wird, werden Nucleosid-5′-O-(1- thiodiphosphate) erhalten. Die Ausbeuten sind jedoch niedriger, und die entsprechenden Thiotriphosphate werden ebenfalls gebildet. Die Bildung des Thiodiphosphats ist nicht schwer zu erklären, wenn man annimmt, daß der durch die Substitutionsreaktion mit Phosphat gebildete Phenolester während der Aufarbeitung hydrolysiert wird. Der Mechanismus der Bildung des Nucleosidthiotriphosphats ist zur Zeit aber nicht klar.If the process is in the presence of tri-n-butylammonium phosphate is carried out, nucleoside-5′-O- (1- thiodiphosphate) obtained. However, the yields are lower, and the corresponding thiotriphosphates are also formed. The formation of the thiodiphosphate is not difficult to explain if you assume that by the substitution reaction with phosphate formed phenol esters hydrolyzed during workup becomes. The mechanism of formation of the nucleoside thiotriphosphate is currently not clear.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zur Synthese von Deoxynucleosid- und Nucleosid-5′-triphosphaten verwendet werden, wenn die Oxidationsstufe mit Wasser/Jod anstelle von Schwefel durchgeführt wird. Das kann von speziellem Interesse sein zur Synthese von Triphosphaten modifizierter Nucleoside, wie z. B. von Dideoxy-, 3′-Azido- und 3′-Fluoro-deoxynucleosiden. The method according to the invention can also be used for synthesis of deoxynucleoside and nucleoside 5'-triphosphates used if the oxidation level with water / iodine is carried out instead of sulfur. That can be from be of special interest for the synthesis of triphosphates modified nucleosides, such as. B. of dideoxy, 3'-azido and 3'-fluoro-deoxynucleosides.

Nachfolgend werden bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben.Preferred embodiments of the invention are described below Procedure described.

Die als Ausgangsprodukte verwendeten Nucleoside oder 2′-Deoxynucleoside, deren NH₂-Gruppen der Base und Hydroxyl-Gruppen des Zuckers, ausgenommen in der 5′-Stellung, geschützt sind, werden in Dioxan/Pyridin gelöst und zur Synthese von dATPα S und dGTPα S mit 1,3 Äquivalenten, und zur Herstellung von TTPα S und dCTPα S mit 1 Äquivalent des Phosphitylierungsreagenz umgesetzt. Nach einer Umsetzungsdauer von 5 Minuten werden 2,5 Äquivalente des Tri-n-butylammoniumsalzes der Pyrophosphorsäure in DMF zusammen mit etwas Tri-n- butylamin zugefügt. Nach 10 Minuten wird Schwefel zugefügt, gefolgt von einer Zugabe von Wasser. Nach weiteren 30 Minuten wird der Schwefel durch Filtration entfernt und das Filtrat zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in Wasser aufgenommen und die Schutzgruppen durch eine geeignete Behandlung entfernt. Die Acylgruppen werden z. B. durch Behandlung mit Ammoniak abgespalten, und 2′,3′-Methoxymethyliden mit verdünnter Säure. Diese Lösungen werden dann nach der entsprechenden Reaktionszeit zur Trockene verdampft und die Reaktionsmischung an einer DEAE-Sephadex-Säule chromatographiert, die mit Triethylammoniumbicarbonat (linearer Gradient ansteigender Konzentration) eluiert wird. Die Produkte werden in 65 bis 80%iger Ausbeute isoliert. Sie werden durch ³¹P-NMR-Spektroskopie und Reverse Phase HPLC durch Vergleich mit authentischem Material identifiziert. Die ³¹P-NMR-Spektren von TTPα S und dCTPα S, synthetisiert mit 1,3 Äquivalent des Phosphitylierungsreagenz, zeigten zusätzlich zu den erwarteten Signalen ein Triplett bei -21,82 ppm und ein Dublett bei -7,94 ppm. Dies wird einer Verunreinigung durch ein Tripolyphosphat zugeschrieben. Ein anderes Triplett bei 34,18 ppm und ein Dublett bei -21,83 ppm wird der Gegenwart eines 1-Thio-cyclotriphosphates zugeschrieben. Beide Produkte werden abgeleitet von einer Umsetzung zwischen dem Phosphitylierungsreagenz und Pyrophosphat. Bei Chromatographie an DEAE-Sephadex reinigen sie sich gegenseitig mit den Purin-Deoxynucleosid- 5′-thiotriphosphaten, aber nicht mit den Pyrimidin-deoxynucleosid-5′-thiotriphosphaten. Die Verringerung der Menge an Phosphitylierungsreagenz auf 1 Äquivalent und eine Änderung im Gradienten des Elutionspuffers schaltet diese Verunreinigungen aus.The nucleosides or 2'-deoxynucleosides used as starting products, whose NH₂ groups of the base and hydroxyl groups of the sugar are protected, except in the 5'-position, are dissolved in dioxane / pyridine and for the synthesis of dATP α S and dGTP α S with 1.3 equivalents, and to produce TTP α S and dCTP α S with 1 equivalent of the phosphitylation reagent. After a reaction time of 5 minutes, 2.5 equivalents of the tri-n-butylammonium salt of pyrophosphoric acid in DMF are added together with some tri-n-butylamine. After 10 minutes, sulfur is added, followed by the addition of water. After a further 30 minutes, the sulfur is removed by filtration and the filtrate is evaporated to dryness. The residue is taken up in water and the protective groups are removed by a suitable treatment. The acyl groups are e.g. B. split off by treatment with ammonia, and 2 ', 3'-methoxymethylidene with dilute acid. These solutions are then evaporated to dryness after the corresponding reaction time and the reaction mixture is chromatographed on a DEAE-Sephadex column which is eluted with triethylammonium bicarbonate (linear gradient of increasing concentration). The products are isolated in 65 to 80% yield. They are identified by 31 P NMR spectroscopy and reverse phase HPLC by comparison with authentic material. The 31 P NMR spectra of TTP α S and dCTP α S, synthesized with 1.3 equivalents of the phosphitylation reagent, showed a triplet at -21.82 ppm and a doublet at -7.94 ppm in addition to the expected signals. This is attributed to tripolyphosphate contamination. Another triplet at 34.18 ppm and a doublet at -21.83 ppm is attributed to the presence of a 1-thio-cyclotriphosphate. Both products are derived from a reaction between the phosphitylation reagent and pyrophosphate. When chromatography on DEAE-Sephadex, they purify each other with the purine deoxynucleoside 5′-thiotriphosphates, but not with the pyrimidine deoxynucleoside 5′-thiotriphosphates. Reducing the amount of phosphitylation reagent to 1 equivalent and changing the gradient of the elution buffer eliminates these contaminants.

Der Ersatz von Pyrophosphat durch Phosphat ergibt die Nucleosid-5′-O-(1-thiodiphosphate), allerdings in geringerer Ausbeute, und durch die entsprechenden Thiotriphosphate verunreinigt. Versuche, das Verhältnis von Thiodi-/Thiotriphosphat zu erhöhen durch Verwendung eines geringeren Überschusses an Phosphat waren nicht erfolgreich.Replacing pyrophosphate with phosphate gives the Nucleoside-5′-O- (1-thiodiphosphate), but in a smaller number Yield, and by the corresponding thiotriphosphate contaminated. Try the ratio of Increase thiodi / thiotriphosphate through use a smaller excess of phosphate were not successful.

Wenn die Oxidation mit Schwefel durch eine solche mit Jod/Wasser ersetzt wird, bilden sich die unmodifizierten Nucleosidtriphosphate in ähnlich guten Ausbeuten.If the oxidation with sulfur by such a When iodine / water is replaced, the unmodified form Nucleoside triphosphates in similarly good yields.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern nun die Erfindung näher, ohne sie darauf einzuschränken.The following examples illustrate the invention closer without restricting them to it.

Examples Materials and processes

Das Phosphitylierungsreagenz (2-Chlor-4H-1,3,2-benzodioxaphospharin- 4-on) wurde entweder von der Firma Aldrich gekauft oder nach Cade und Gerrard (J. Chem. Soc. (1960) 1249-1253) hergestellt, und unter Argon aufbewahrt. Schwefel (sublimiert) wurde von der Firma Merck, Darmstadt bezogen, und vor der Verwendung in einem Desikkator über P₂O₅ getrocknet. Trockenes Dioxan und Pyridin (mit weniger als 0,01% Wasser) wurden ebenfalls von der Firma Merck, Darmstadt bezogen und wie bezogen verwendet. DMF und Tri-n-butylamin wurden von der Firma Fluka bezogen. Alle Lösungsmittel wurden über 4 A-Molekularsieben gelagert.The phosphitylation reagent (2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphospharin- 4-one) was either made by Aldrich bought or according to Cade and Gerrard (J. Chem. Soc. (1960) 1249-1253) and stored under argon. Sulfur (sublimed) was made by Merck, Darmstadt related, and before use in one Desiccator dried over P₂O₅. Dry dioxane and Pyridine (with less than 0.01% water) was also used purchased from Merck, Darmstadt and as purchased used. DMF and tri-n-butylamine were made by the company Fluka related. All solvents were over 4 A molecular sieves stored.

N⁶-Benzoyl-2′-deoxyadenosin, N⁴-Benzoyl-2′-deoxycytidin und N²-Isobutyryl-2′-deoxyguanosin wurden nach der "Transient Protection"-Methode (Ti et al., J. Am. Chem. Soc. 104 (1982) 1316-1319) hergestellt. Die Deoxynucleoside wurden mit Trimethylchlorsilan zum Schutz von Hydroxylgruppen behandelt und dann sofort mit einem Acylierungsreagenz umgesetzt, um N-Acylierung zu bewirken. Die Entfernung der Trimethylsilylgruppen durch Behandlung mit Ammoniak ergibt die N-acylierten Deoxynucleoside, die dann mit Dimethoxytritylchlorid zum Schutz der 5′-OH-Gruppe umgesetzt werden können. Diese Verbindungen wurden mit Dimethoxytritylchlorid mittels Standardverfahren umgesetzt und die Produkte durch Chromatographie an Silikagel isoliert. Die geschützten 2′-Dioxynucleoside wurden mit Methoxy-Essigsäureanhydrid umgesetzt und die Dimethoxytritylgruppe entfernt, wie von Potter et al. (Nucleic Acids Res. 11 (1983) 7087-7103) für das Deoxyadenosinderivat beschrieben. N⁶-Benzoyl-2′- deoxyadenosin wurde in das N⁶-Benzoyl-5′-dimethoxytrityl- deoxyadenosin übergeführt, das nachfolgend mit Methoxyessigsäureanhydrid umgesetzt wurde. Das Produkt dieser Reaktion wurde mit Essigsäure umgesetzt, um die Dimethoxytritylgruppe zu entfernen unter Bildung von N⁶-Benzoyl-3′-methoxyacetyl-deoxyadenosin. N⁶-benzoyl-2′-deoxyadenosine, N⁴-benzoyl-2′-deoxycytidine and N²-isobutyryl-2'-deoxyguanosine were after the "Transient Protection" method (Ti et al., J. Am. Chem. Soc. 104 (1982) 1316-1319). The deoxynucleosides were used with trimethylchlorosilane to protect Treated hydroxyl groups and then immediately with one Acylation reagent implemented to effect N-acylation. Removal of trimethylsilyl groups by treatment with ammonia gives the N-acylated deoxynucleosides, which then with dimethoxytrityl chloride for protection the 5'-OH group can be implemented. These connections were treated with dimethoxytrityl chloride using standard procedures implemented and the products by chromatography isolated on silica gel. The protected 2'-dioxynucleosides were reacted with methoxy acetic anhydride and removed the dimethoxytrityl group as from Potter et al. (Nucleic Acids Res. 11 (1983) 7087-7103) described for the deoxyadenosine derivative. N⁶-benzoyl-2′- deoxyadenosine was converted into the N⁶-benzoyl-5′-dimethoxytrityl deoxyadenosine transferred, the following with Methoxyacetic anhydride was implemented. The product this reaction was reacted with acetic acid to give the Remove dimethoxytrityl group to form N⁶-Benzoyl-3'-methoxyacetyl-deoxyadenosine.

3′-Acetylthymidin wurde nach Verheyden und Moffat, Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry, Interscience Publishers, New York (1968), S. 383-387, synthetisiert. Thymidin wird zuerst mit Dimethoxytritylchlorid umgesetzt, dann mit Essigsäureanhydrid, und nachfolgend mit Essigsäure, um die 5′-Schutzgruppe zu entfernen, und ergibt 3′-Acetylthymidin.3′-acetylthymidine was after Verheyden and Moffat, Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry, Interscience Publishers, New York (1968), pp. 383-387, synthesized. Thymidine is first used with dimethoxytrityl chloride implemented, then with acetic anhydride, and subsequently with acetic acid to the 5'-protecting group remove, and gives 3'-acetylthymidine.

2′,3′-Methoxymethylidenuridin wurde wie von Griffin et al. (Tetrahedron 23 (1967) 2301-2313) beschrieben, hergestellt. Die Ribonucleoside werden mit Trimethylorthoformiat umgesetzt, um die 2′,3′-O-methoxymethylidenderivate zu ergeben.2 ', 3'-methoxymethylidenuridine was as described by Griffin et al. (Tetrahedron 23 (1967) 2301-2313). The ribonucleosides are made with trimethyl orthoformate implemented to the 2 ', 3'-O-methoxymethylidene derivatives to surrender.

Die NMR-Spektren wurden mit einem Bruker WP200SY Spektrometer (81,01 Hz), "broad band decoupling") aufgenommen. Die Triethylammoniumsalze der Verbindungen wurden in Wasser, enthaltend 20% D₂O und ca. 10 mM EDTA, pH = 8, aufgelöst, um 10 mM-Lösungen zu ergeben. Die Proben wurden in 5 mm Röhrchen mit einer konzentrischen Kapillare, die 80%ige Phosphorsäure als externer Standard enthielt, gegeben. Die chemischen Verschiebungen werden in ppm angegeben, und sind im tieferen Feld bezogen auf die Referenzprobe positiv.The NMR spectra were recorded using a Bruker WP200SY spectrometer (81.01 Hz), "broad band decoupling"). The triethylammonium salts of the compounds were in water, containing 20% D₂O and approx. 10 mM EDTA, pH = 8, dissolved to give 10 mM solutions. The Samples were placed in 5 mm tubes with a concentric Capillary, the 80% phosphoric acid as an external standard contained, given. The chemical shifts are given in ppm and are in the lower field based on the reference sample positive.

TLC wurde entweder an HPTLC-Fertigplatten Si 50000F 254S (Firma Merck Darmstadt), entwickelt mit 2-Propanol/ NH₃:H₂O = 7/1/2 (v/v) (System I) durchgeführt, oder an Kieselgel 60 Platten (Firma Merck Darmstadt), eluiert mit 1-Propanol/NH₃/H₂O = 11/7/2 (System II). Die Umkehrphasen-HPLC wurde mit einem Waters Dual-Pumpen 6000A-System in Kombination mit einem Waters 680-Gradienten- Kontroller und einem Model 440 UV-Detektor, 254 nm, durchgeführt. Die Säulen wurden mit ODS Hypersil (5 µm, von Shandon Southern, Runcon, UK) gefüllt und mit 100 mM Triethylammoniumbicarbonat eluiert, pH = 7,5, das einen linearen Gradienten von Acetonitril von 0 bis 15% in 20 Minuten enthielt.TLC was performed on either HPTLC Si 50000F plates 254S (Merck Darmstadt), developed with 2-propanol / NH₃: H₂O = 7/1/2 (v / v) (system I) carried out, or 60 plates on silica gel (Merck Darmstadt), eluted with 1-propanol / NH₃ / H₂O = 11/7/2 (system II). The Reverse phase HPLC was performed using a Waters dual pump 6000A system in combination with a Waters 680 gradient Controller and a Model 440 UV detector, 254 nm. The columns were made with ODS Hypersil (5 µm, from Shandon Southern, Runcon, UK) and eluted with 100 mM triethylammonium bicarbonate, pH = 7.5, which is a linear gradient of acetonitrile contained from 0 to 15% in 20 minutes.

Bis- tri-n-butylammonium-pyrophosphat wurde nach Moffatt (Canad. J. Chem. 42 (1964) 599) auf folgendem Weg hergestellt: Tetranatriumdiphosphat-decahydrat (2,23 g, 5 mmol) wurde in Wasser (50 ml) gelöst, die Lösung auf eine Dowex 50WX8-Säule in der H⁺-Form appliziert und die Säule mit Wasser gewaschen. Das Eluat wurde direkt in eine gekühlte (Eiswasser) und gerührte Lösung von Tri-n-butylamin (2,38 ml, 10 mmol) in Ethanol (20 ml) tropfen gelassen. Das Waschen wurde fortgesetzt, bis der pH des Eluats auf 5,0 angestiegen war (ca. 70 ml Wasser). Die Ethanol/Wasser-Lösung wurde zur Trockene verdampft, zweimal mit Ethanol wiedereingedampft und schließlich mit wasserfreiem DMF (30 ml) an einer Ölpumpe. Der Rückstand wurde in DMF gelöst und auf 10 ml verdünnt. Die leicht gelbe Lösung wurde über 4A-Molekularsieben gelagert.Bis-tri-n-butylammonium pyrophosphate was made according to Moffatt (Canad. J. Chem. 42 (1964) 599) in the following way prepared: tetrasodium diphosphate decahydrate (2.23 g, 5 mmol) was dissolved in water (50 ml), the solution on applied a Dowex 50WX8 column in the H⁺ shape and the column washed with water. The eluate became direct in a cooled (ice water) and stirred solution of Tri-n-butylamine (2.38 ml, 10 mmol) in ethanol (20 ml) dropped. Washing continued until the pH of the eluate had risen to 5.0 (approx. 70 ml Water). The ethanol / water solution became dry evaporated, evaporated again twice with ethanol and finally with anhydrous DMF (30 ml) on one Oil pump. The residue was dissolved in DMF and opened Diluted 10 ml. The slightly yellow solution was over 4A molecular sieves stored.

Example 1 Synthesis of the purine oxynucleoside 5'-O- (1-thiotriphosphate) dATP α S and dGTP α S

N⁶-Benzoyl-3′-methoxyacetyl-2′-deoxyadenosin (1 c) oder N²-Isobutyryl-3′-methoxyacetyl-2′-deoxyguanosin (1 d) (100 µmol) wurden in wasserfreiem Pyridin (2 ml) gelöst und im Vakuum zur Trockene verdampft. Der Rückstand wurde über P₂O₅ eine Stunde bei Raumtemperatur im Vakuum getrocknet. Der Reaktionskolben wurde mit Argon gefüllt, indem das Gas in den Desikkator eingebracht wurde, und mit einem Gummiseptum verschlossen. Während aller folgenden Verfahrensmaßnahmen wurde ein geringer Argondruck im Reaktionsgefäß aufrechterhalten, indem es mit einem mit Argon gefüllten Ballon verbunden war. Wasserfreies Pyridin wurde durch das Septum (100 µl) injiziert, gefolgt von wasserfreiem Dioxan (300 µl). Zu der gut gerührten Lösung wurden 130 µl (130 µmol) einer frisch zubereiteten 1 M-Lösung von 2-Chlor-4H-1,3,2-dioxaphosphorin- 4-on (7) in wasserfreiem Dioxan injiziert. Es bildete sich ein weißer Niederschlag. Nach 5 Minuten wurde eine Mischung einer 0,5 M-Lösung von Bis-tri-n-butylammoniumpyrophosphat in wasserfreiem DMF (500 µl) und Tri-n-butylamin (100 µl) rasch injiziert. Der weiße Niederschlag löste sich sofort auf. Das Rühren wurde weitere 10 Minuten fortgesetzt, bevor das Septum entfernt wurde und Schwefel (100 mg) zugefügt wurde. Nach Wiederaufsetzen des Septums wurde das Rühren 15 Minuten lang fortgesetzt und dann Wasser (5 ml) injiziert. Nach 30 Minuten wurde der Überschuß an Schwefel durch Filtration entfernt, das Filtrat zur Trockene verdampft und der Rückstand in H₂O (10 ml) und konzentriertem Ammoniak (20 ml) gelöst. Die Ammonolyse wurde 5 Stunden bei 60°C durchgeführt. Die Reaktionslösung wurde zur Trockene verdampft und der Rückstand in Wasser (5 ml) gelöst und die Lösung auf eine DEAE- Sephadex A-25-Säule (2 × 30 cm) appliziert. Sie wurde mit einem linearen Gradienten von 800 ml 0,05 M und 1 M Triethylammoniumbicarbonat bei 4°C eluiert. Fraktionen von ca. 17 ml wurden gesammelt. dATPα S (5c) wurde zwischen 0,73 und 0,83 M Puffer und dGTPα S (5d) zwischen 0,77 und 0,83 M Puffer eluiert. Die Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden vereinigt, zur Trockene verdampft und der Rückstand mit Methanol wiedereingedampft, um Spuren des Puffers zu entfernen. Die Ausbeute an 5 c betrug 63%, an 5 d 67%. N⁶-Benzoyl-3'-methoxyacetyl-2'-deoxyadenosine ( 1 c) or N²-isobutyryl-3'-methoxyacetyl-2'-deoxyguanosine ( 1 d) (100 µmol) were dissolved in anhydrous pyridine (2 ml) and im Vacuum evaporated to dryness. The residue was dried over P₂O₅ for one hour at room temperature in a vacuum. The reaction flask was filled with argon by introducing the gas into the desiccator and sealed with a rubber septum. During all of the following procedures, a low argon pressure was maintained in the reaction vessel by connecting it to an argon-filled balloon. Anhydrous pyridine was injected through the septum (100 µl) followed by anhydrous dioxane (300 µl). 130 μl (130 μmol) of a freshly prepared 1 M solution of 2-chloro-4H-1,3,2-dioxaphosphorin-4-one ( 7 ) in anhydrous dioxane were injected into the well-stirred solution. A white precipitate formed. After 5 minutes, a mixture of a 0.5 M solution of bis-tri-n-butylammonium pyrophosphate in anhydrous DMF (500 µl) and tri-n-butylamine (100 µl) was quickly injected. The white precipitate dissolved immediately. Stirring was continued for another 10 minutes before the septum was removed and sulfur (100 mg) was added. After the septum was replaced, stirring was continued for 15 minutes and then water (5 ml) was injected. After 30 minutes the excess sulfur was removed by filtration, the filtrate evaporated to dryness and the residue dissolved in H₂O (10 ml) and concentrated ammonia (20 ml). The ammonolysis was carried out at 60 ° C for 5 hours. The reaction solution was evaporated to dryness, the residue was dissolved in water (5 ml) and the solution was applied to a DEAE-Sephadex A-25 column (2 × 30 cm). It was eluted with a linear gradient of 800 ml 0.05 M and 1 M triethylammonium bicarbonate at 4 ° C. Fractions of approximately 17 ml were collected. dATP α S (5c) was eluted between 0.73 and 0.83 M buffer and dGTP α S (5d) between 0.77 and 0.83 M buffer. The fractions containing the product were pooled, evaporated to dryness and the residue evaporated again with methanol to remove traces of the buffer. The yield of 5 c was 63%, of 5 d 67%.

Example 2 Synthesis of pyrimidine-deoxynucleoside-5'-O- (1-thiotriphosphate) TTP α S and dCTP α S Method A

3′-Acetylthymidin (1 a) (100 µmol) wurden in den im Beispiel 1 angegebenen Mengen an Pyridin und Dioxan gelöst, aber das N⁴-Benzoyl-3′-methoxyacetyl-2′-deoxycytidin (1 b) (100 µmol) wurde in dem doppelten Volumen jedes dieser Lösungsmittel gelöst. Die experimentellen Bedingungen der Phosphitylierungsreaktion waren die gleichen wie für die im Beispiel 1 angegebene Synthese von dATPα S und dGTPα S, mit der Ausnahme, daß nur 100 µl der 1M-Dioxanlösung des Phosphitylierungsreagenz (100 µmol) zugefügt wurden, und daß die Bis-tri-n-butylammoniumpyrophosphatlösung (300 µl) nach 10 Minuten zugefügt wurde. Die Ammonolyse von TTPα S betrug nur eine Stunde bei Raumtemperatur, aber 5 Stunden bei 60°C für dCTPα S. Die DEAE-Sephadex-Säule wurde mit 0,4 M Puffer voräquilibriert und mit einem linearen Gradienten von 100 ml jedes der 0,4 und 0,8 M Puffer eluiert. TTPα S (5 a, Ausbeute 74%) wurde zwischen 0,59 und 0,63 M, und dCTPα S (5 b, Ausbeute 56%) zwischen 0,60 und 0,65 M Puffer eluiert.3'-acetylthymidine ( 1 a) (100 µmol) were dissolved in the amounts of pyridine and dioxane given in Example 1, but the N⁴-benzoyl-3'-methoxyacetyl-2'-deoxycytidine ( 1 b) (100 µmol) was dissolved in twice the volume of each of these solvents. The experimental conditions of the phosphitylation reaction were the same as for the synthesis of dATP α S and dGTP α S given in Example 1, with the exception that only 100 μl of the 1M dioxane solution of the phosphitylation reagent (100 μmol) were added, and that the bis tri-n-butylammonium pyrophosphate solution (300 µl) was added after 10 minutes. The ammonolysis of TTP α S was only one hour at room temperature, but 5 hours at 60 ° C for dCTP α S. The DEAE-Sephadex column was pre-equilibrated with 0.4 M buffer and with a linear gradient of 100 ml each of the 0 , 4 and 0.8 M buffer eluted. TTP α S ( 5 a , yield 74%) was eluted between 0.59 and 0.63 M, and dCTP α S ( 5 b , yield 56%) between 0.60 and 0.65 M buffer.

Method B:

3′-Acetylthymidin (100 µmol) wurde phosphityliert und mit Pyrophosphat wie in Methode A umgesetzt. Die Umsetzung mit Schwefel wurde jedoch durch Zugabe einer Suspension von 6,4 mg Schwefel (2 Äquivalente) in 200 µl DMF durchgeführt, das Reaktionsröhrchen mit zusätzlichen 100 µl DMF gespült, um einen vollständigen Transfer des Schwefels sicherzustellen. Der Schwefel löste sich in der Reaktionslösung. Die Reaktion wurde 5 bis 10 Minuten lang durchgeführt. Die Aufarbeitung wurde wie in Methode A beschrieben, ausgeführt. Die TLC und NMR-Charakteristika sind in den Tabellen I und II zusammengestellt.3'-acetylthymidine (100 µmol) was phosphitylated and reacted with pyrophosphate as in method A. The implementation with sulfur was, however, by adding a Suspension of 6.4 mg sulfur (2 equivalents) in 200 ul DMF performed, the reaction tube with an additional 100 µl of DMF to make a complete Ensure transfer of sulfur. The sulfur dissolved in the reaction solution. The reaction was carried out for 5 to 10 minutes. The workup was carried out as described in method A. The TLC and NMR characteristics are in Tables I and II compiled.

Example 3 Synthesis of uridine 5'-O- (1-thiotriphosphate), UTP α S

2′,3′-Methoxymethylidenuridin (100 µmol) wurde wie im Beispiel 2 für TTPα S und dCTPα S beschrieben mit 110 µmol des Phosphitylierungsreagenz phosphityliert. Nach Entfernung von überschüssigem Schwefel durch Filtration wurde das Filtrat zur Trockene verdampft und der Rückstand in Wasser (25 ml) und Eisessig (5 ml) aufgelöst, und ergab eine Lösung mit einem pH-Wert von ca. 2,2. Nach einstündigem Stehen bei Raumtemperatur wurde die Lösung zur Trockene verdampft, der Rückstand in Wasser (10 ml) gelöst, und der pH-Wert der Lösung auf 9,0 mit Ammoniak eingestellt. Nach 30 Minuten wurde diese Lösung auf eine DEAE-Sephadex A-25-Säule appliziert, die wie im Beispiel 2 für TTPα S und dCTPα S beschrieben eluiert wurde. Das Produkt eluierte zwischen 0,56 und 0,59 M Puffer, Ausbeute 84%. Die NMR-Charakteristika sind in den Tabellen I und II zusammengestellt.2 ', 3'-methoxymethylidenuridine (100 µmol) was phosphitylated as described in Example 2 for TTP α S and dCTP α S with 110 µmol of the phosphitylation reagent. After removing excess sulfur by filtration, the filtrate was evaporated to dryness and the residue was dissolved in water (25 ml) and glacial acetic acid (5 ml) to give a solution with a pH of about 2.2. After standing at room temperature for 1 hour, the solution was evaporated to dryness, the residue was dissolved in water (10 ml), and the pH of the solution was adjusted to 9.0 with ammonia. After 30 minutes, this solution was applied to a DEAE-Sephadex A-25 column, which was eluted as described in Example 2 for TTP α S and dCTP α S. The product eluted between 0.56 and 0.59 M buffer, yield 84%. The NMR characteristics are summarized in Tables I and II.

Example 4 Synthesis of thymidine 5'-triphosphate, TTP

₃′-Acetylthymidin (1 a) (100 µmol) wurde wie oben beschrieben, phosphityliert. Nach Zugabe von Pyrophosphat und Tri-n-butylamin und 10minütigem Rühren wurde eine Lösung von 1% Jod in Pyridin/Wasser (98/2, v/v) (2 ml, 157 µmol) zugefügt. Nach einer Reaktion von 15 Minuten wurde das überschüssige Jod durch Zugabe einiger Tropfen einer 5%igen wäßrigen Lösung von NaHSO₃ zerstört. Die Reaktionslösung wurde zur Trockene verdampft und der Rückstand in Wasser (10 ml) und konzentriertem Ammoniak (200 ml) gelöst. Nach einer Stunde wurde die Lösung zur Trockene verdampft, der Rückstand in Wasser gelöst und die Lösung auf eine DEAE-Sephadex-Säule appliziert, die mit einem linearen Gradienten von 800 ml von je 0,05 M und 1 M Triethylammoniumbicarbonat eluiert wurde. Das Produkt eluierte zwischen 0,50 und 0,55 M Puffer. Ausbeute 73%.₃'-Acetylthymidine ( 1 a) (100 µmol) was phosphitylated as described above. After adding pyrophosphate and tri-n-butylamine and stirring for 10 minutes, a solution of 1% iodine in pyridine / water (98/2, v / v) (2 ml, 157 µmol) was added. After a reaction of 15 minutes, the excess iodine was destroyed by adding a few drops of a 5% aqueous solution of NaHSO₃. The reaction solution was evaporated to dryness and the residue dissolved in water (10 ml) and concentrated ammonia (200 ml). After one hour the solution was evaporated to dryness, the residue was dissolved in water and the solution was applied to a DEAE-Sephadex column which was eluted with a linear gradient of 800 ml of 0.05 M and 1 M triethylammonium bicarbonate. The product eluted between 0.50 and 0.55 M buffer. Yield 73%.

Example 5 Synthesis of thymidine-5'-O- (thiodiphosphate), TDP α S

3′-Acetylthymidin (100 µmol) wurden wie im Beispiel 2 für die Synthese von TTPα S beschrieben phosphityliert. Anstelle von Pyrophosphat wurde eine Mischung von 0,5 M Tri-n-butylammoniumorthophosphat in wasserfreiem DMF (500 µl) und Tri-n-butylamin (100 µl) zugefügt. Nach Zugabe des Schwefels und Entfernung der Schutzgruppen wurde die Reaktionsmischung an einer DEAE-Sephadex-Säule chromatographiert, die mit einem linearen Gradienten von 800 ml von je 0,05 M und 0,8 M Triethylammoniumbicarbonat eluiert wurde. TDPα S (Ausbeute 23%) wurde zwischen 0,52 und 0,55 M Puffer eluiert und TTPα S (Ausbeute 22%) zwischen 0,56 und 0,62 M Puffer. 3'-acetylthymidine (100 µmol) were phosphitylated as described in Example 2 for the synthesis of TTP α S. Instead of pyrophosphate, a mixture of 0.5 M tri-n-butylammonium orthophosphate in anhydrous DMF (500 μl) and tri-n-butylamine (100 μl) was added. After adding the sulfur and removing the protective groups, the reaction mixture was chromatographed on a DEAE-Sephadex column, which was eluted with a linear gradient of 800 ml of 0.05 M and 0.8 M triethylammonium bicarbonate. TDP α S (yield 23%) was eluted between 0.52 and 0.55 M buffer and TTP α S (yield 22%) between 0.56 and 0.62 M buffer.

Tabelle I Table I

Chromatograph. Daten Chromatograph. Data

Tabelle II Table II

31 p NMR Daten 31 p NMR data

Claims

1. A process for the synthesis of nucleoside-5'-O- (1-thiotriphosphate) (NTP α S) and 2'-deoxynucleoside-5'-O- (1-thiotriphosphate) (dNTP α S), characterized in that a nucleoside derivative in which the NH₂ functions of the bases and the OH functions of the sugar are provided with protective groups other than in the 5'-position, with 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin- 4-one, the reaction product thus obtained is reacted with the alkylammonium salt of pyrophosphoric acid, then reacted with sulfur, and the reaction product obtained is then hydrolyzed and the protective groups are split off.

2. Process for the preparation of nucleoside-5'-O- (1- thiodiphosphates) and 2′-deoxynucleoside-5′-O- (1- thiodiphosphates) in addition to nucleoside 5′-O- (1-thiotriphosphates) and 2′-deoxynucleoside-5′-O- (1-thiotriphosphates), characterized, that in that A method according to claim 1 instead of an alkylammonium salt an alkylammonium salt of pyrophosphoric acid the phosphoric acid used.

3. Process for the synthesis of nucleoside 5'-O-1-triphosphates and 2'-deoxynucleoside-5'-O-triphosphates or of nucleoside 5'-O-diphosphates and 2'-dideoxynucleoside-5'-O-diphosphates in addition to nucleoside 5′-O-triphosphates and 2′-deoxynucleoside-5′-O-triphosphates, characterized, that in that The method of claim 1 or 2 instead of with Reacts sulfur with iodine and water.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized, that the implementation of the protected nucleoside derivative with the phosphitylating agent in Carries out dioxane or dioxane / pyridine.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized, that the implementation of the phosphitylated product with the alkylammonium salt and with sulfur in Dimethylformamide (DMF) carries out.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized, that as the alkyl ammonium salt of pyrophosphoric acid or phosphoric acid the tri-n-butylammonium salt used.