DE3729434A1 - Mikroenkapsulierung von biologisch aktivem material - Google Patents
Mikroenkapsulierung von biologisch aktivem materialInfo
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Description
Die Immobilisierung von Enzymen bzw. lebendem Zellmaterial
ist weithin bekannt. Durch den Einschluß von aktivem
Zellmaterial in Mikrokapseln, wie es z. B. in "Artificial
Cells" T.M.S. Chang und C.C. Thomas Publ., Springfield
Illinois (1972) beschrieben ist, läßt sich durch die
Kompartimentierung unter Beibehaltung einer möglichst
großen Oberfläche die biologische Aktivität des Materials
erhalten bzw. verbessern.
Es sind eine Vielzahl von Verfahren zur Einkapselung von
Zellen und Zellmaterial beschrieben, die meist darauf
beruhen, daß das Zellmaterial in einer semipermeablen,
wasserunlöslichen, biokompatiblen Membran eingeschlossen
wird, die durch Reaktion von gelösten polyanionischen mit
polykationischen Polymeren gebildet wird.
In der deutschen Offenlegungsschrift 30 12 233 wird ein
Verfahren zum Einkapseln von Gewebe oder Einzelzellen
beschrieben. Das Zellmaterial soll lebensfähig in
geschütztem Zustand in einer Membran eingeschlossen sein,
die zur Erhaltung der normalen Stoffwechselfunktionen der
Zellen für Nährstoffe, Ionen, Sauerstoff und andere
niedermolekulare Stoffe durchlässig ist. Das einzukapselnde
Material wird in einem Medium suspendiert, das einen
wasserlöslichen, in Tröpfchen gelierbaren Stoff enthält, um
für das Gewebe eine vorübergehende schützende Umhüllung zu
schaffen. Aufgrund der Empfindlichkeit des Zellmaterials
können für die reversible Gelierung über ein
Elektrolytmilieu nur sehr spezielle Puffermedien eingesetzt
werden. Bevorzugte Stoffe für die Bildung der temporären
Kapseln sind natürliche Polysaccharid-Gummiharze, die a)
bei einer Änderung der Bedingungen, etwa des pH-Werts oder
bei Zugabe von mehrwertigen Kationen, wie Ca2+, zur
reversiblen Bildung einer formhaltigen Masse befähigt sind
und die b) mit Polybasen, deren Amingruppen mit sauren
Polysaccharid-Bestandteilen reagieren können, dauerhaft
komplexierbar sind. Nach Bildung der dauerhaften
semipermeablen Membran kann die temporäre Kapsel durch
Herstellung der Bedingungen, unter denen der Stoff flüssig
ist, aufgelöst werden.
Dies ist insbesondere erforderlich, wenn es sich um äußerst
empfindliches, biologisch aktives Material handelt, das
durch die zahlreichen, quervernetzten Gruppen des
Polysaccharid-Harzes im Zellwachstum bzw. im Stoffwechsel
behindert wird.
In der deutschen Offenlegungsschrift 32 09 127 wird ein
Verfahren beschrieben, in dem Zellen nach der obengenannten
Methode eingekapselt werden, um Stoffwechselprodukte zu
gewinnen.
Biologisch aktives Material kann auch in Proteine mit
weitgehend neutraler Nettoladung eingeschlossen werden, wie
in der Europäischen Anmeldung 01 29 619 erwähnt ist. Dabei
treten jedoch Probleme auf, die z. B. durch leichtere
mikrobiologische Kontamination oder geringere
Reproduzierbarkeit der Proteine hervorgerufen werden, aber
vor allem durch die Tatsache, daß ein reversibler
Gel-/Sol-Übergang nicht möglich ist.
In der europäischen Patentanmeldung 01 88 309 wird ein
Verfahren beschrieben, bei dem lebendes Zellmaterial in
eine biokompatible, semipermeable, wasserunlösliche Membran
eingeschlossen wird, die durch Reaktion von polyanionischen
und polykationischen Polymeren auf Acrylbasis gebildet
wird. Dabei wird das polyanionische oder polykationische
Acrylpolymer in Wasser gelöst und das Zellmaterial darin
suspendiert. Die Suspension wird in Tropfenform in eine
Lösung, die die elektrisch entgegengesetzt geladenen
polykationischen bzw. polyanionischen Acrylpolymere
enthält, gebracht, wobei sich an der Phasengrenze die
Polymer-Polymer-Komplexmembran ausbildet.
In der europäischen Patentanmeldung 01 52 898 wird ein
Verfahren beschrieben, bei dem ein aktives Material
(Zellen, Mikroorganismen, Enzyme, Hormone, Antikörper,
Katalysatoren oder Substrate) in eine Mikrokapsel
eingeschlossen wird, deren Membran durch Reaktion eines
anionischen oder kationischen Polymers mit einem ionischen
Polymer entgegengesetzter Ladung gebildet wird. Als
einsetzbare anionische Polymere werden Alginat, Carrageen,
Hyaluronsäure, Carboxymethylcellulose, Xanthan, Furcellaran
und sulfonierte organische Polymere offenbart; als
kationische Chitosan, Polylysin, Polyethylamin und
Polyvinylamin.
Alle bisher beschriebenen Polyelektrolytmembrankapseln oder
Verfahren zur Herstellung derselben geben jedoch keinerlei
Hinweis darauf, welche Polyelektrolyte, insbesondere welche
Polybasen sich in welchen Konzentrationen besonders gut
eignen, um die folgenden Anforderungen an
Polyelektrolytmembrankapseln zu erfüllen.
Zum einen müssen die eingesetzten Polyelektrolytkomplexe
selbst und die um den Kern gebildete Membran stabil sein; zum
anderen müssen die verwendeten Polyelektrolyte den
biologischen und verfahrenstechnischen Anforderungen genügen.
Zu den biologischen Anforderungen zählen z. B.:
die Zellverträglichkeit, die Stabilität der Membran bei gegebener Ionenstärke oder die Reaktionstemperatur der verwendeten Polyelektrolyte.
die Zellverträglichkeit, die Stabilität der Membran bei gegebener Ionenstärke oder die Reaktionstemperatur der verwendeten Polyelektrolyte.
Zu den verfahrenstechnischen Anforderungen zählen z. B.:
die Viskosität der Lösung. So soll die Lösung sich sowohl verdüsen lassen als auch Tropfen mit ausreichender Elastizität bilden.
die Viskosität der Lösung. So soll die Lösung sich sowohl verdüsen lassen als auch Tropfen mit ausreichender Elastizität bilden.
Die Stabilität der Polyelektrolytmembranen hängt von einer
Vielzahl von Parametern ab, z. B.:
von der Ladungsdichte, der Ladung, dem Molekulargewicht oder der Struktur (Konformation) der Polyelektrolyte.
von der Ladungsdichte, der Ladung, dem Molekulargewicht oder der Struktur (Konformation) der Polyelektrolyte.
Diese Parameter lassen sich zwar im nachhinein ermitteln,
jedoch läßt sich aus den idealisierten Einzelwerten nicht
ohne weiteres das ideale Polymere, welches die oben
gestellten Anforderungen erfüllt, ableiten, da diese
Parameter meist erst in Kombination zu den gewünschten
Eigenschaften führen.
Überraschenderweise wurden nun Polybasen zur Herstellung
von Polyelektrolytmembrankapseln gefunden, die allen oben
genannten Anforderungen genügen.
Die Erfindung betrifft daher:
Polyelektrolytmembrankapseln, bestehend aus einer semipermeablen Membran und einem von ihr eingeschlossenen aktiven Material, wobei die Membran aus einer biokompatiblen, nicht toxischen Polysäure und einer Polybase besteht, dadurch gekennzeichnet, daß die Polybase aus einem Polymer, gebildet aus wiederkehrenden Monomereinheiten der Formel (I)
Polyelektrolytmembrankapseln, bestehend aus einer semipermeablen Membran und einem von ihr eingeschlossenen aktiven Material, wobei die Membran aus einer biokompatiblen, nicht toxischen Polysäure und einer Polybase besteht, dadurch gekennzeichnet, daß die Polybase aus einem Polymer, gebildet aus wiederkehrenden Monomereinheiten der Formel (I)
wobei
R¹ Wasserstoff oder Methyl und
R² eine Aminomethylgruppe, ein Imidazol-Rest oder ein Rest der Formel (II) ist
R¹ Wasserstoff oder Methyl und
R² eine Aminomethylgruppe, ein Imidazol-Rest oder ein Rest der Formel (II) ist
wobei
R³ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet, wobei miteinander verknüpfte Monomereinheiten auch voneinander verschiedene Reste R¹ und/oder R² enthalten können, und
gegebenenfalls noch weiteren hydrophilen, biokompatiblen, keine elektrische Ladung aufweisenden Monomereinheiten und
gegebenenfalls noch weiteren wasserlöslichen, biokompatiblen Polymeren, die gegebenenfalls mit dem Polymer, gebildet aus Monomereinheiten der Formel I und gegebenenfalls weiteren hydrophilen, biokompatiblen, keine elektrische Ladung aufweisenden Monomereinheiten, über überbrückende Einheiten vernetzt sind.
R³ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet, wobei miteinander verknüpfte Monomereinheiten auch voneinander verschiedene Reste R¹ und/oder R² enthalten können, und
gegebenenfalls noch weiteren hydrophilen, biokompatiblen, keine elektrische Ladung aufweisenden Monomereinheiten und
gegebenenfalls noch weiteren wasserlöslichen, biokompatiblen Polymeren, die gegebenenfalls mit dem Polymer, gebildet aus Monomereinheiten der Formel I und gegebenenfalls weiteren hydrophilen, biokompatiblen, keine elektrische Ladung aufweisenden Monomereinheiten, über überbrückende Einheiten vernetzt sind.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur
Herstellung der erfindungsgemäßen
Polyelektrolytmembrankapseln, deren nachträgliche
Modifikation, z. B. Vernetzung sowie deren Verwendung zur
Herstellung von Produkten durch Zellkulturen.
Im folgenden wird die Erfindung detailliert beschrieben.
Unter aktivem Material sind beispielsweise Zellen,
Zellmaterial, Mikroorganismen, Enzyme, Hormone oder auch
nicht biochemische Substanzen wie Substrate oder
Katalysatoren zu verstehen.
Die Enkapsulierung des aktiven Materials kann
auf unterschiedliche Weise erfolgen, wie es z. B. in den
europäischen Offenlegungsschriften 01 52 898 oder 01 88 309
beschrieben ist; zu bevorzugen ist die Enkapsulierung unter
Benutzung der in der Figur abgebildeten
Vertropfungseinrichtung,
auf die sich die Erfindung ebenfalls bezieht.
Die Figur zeigt die Vertropfungseinrichtung bestehend aus
einem Kapillarträger (1), der mit einem Gaseintrittsstutzen
(2), einem Einfüllstutzen (3) für den Kapselinhalt (=
Immobilisat), einer Kernkapillare (4) und einer
Hüllkapillare (5) versehen ist. Die Kernkapillare kann
zusammen mit dem Einfüllstutzen für den Kapselinhalt aus
dem Kapillarträger herausgenommen werden und durch eine
andere Kernkapillare (mit anderem Durchmesser) mit
Einfüllstutzen ersetzt werden. Der Innendurchmesser der
Kernkapillare kann einen weiten Bereich überstreichen. Zu
bevorzugen ist ein Innendurchmesser zwischen ca. 0,1 und 1 mm,
besonders bevorzugt zwischen ca. 0,2 und 0,6 mm,
insbesondere von ca. 0,4 mm. Der Innendurchmesser der
Hüllkapillare (ebenfalls auswechselbar), der auf die
jeweilige Kernkapillare abgestimmt werden sollte, kann
ebenfalls einen weiten Bereich überstreichen. Zu bevorzugen
ist ein Innendurchmesser zwischen ca. 0,3 mm und 1,5 mm,
besonders bevorzugt zwischen ca. 0,7 und 1,1 mm,
insbesondere von ca. 0,9 mm.
Die Wandstärken von Kern- und Hüllkapillare können beliebig
gewählt werden; der Außendurchmesser der Kernkapillare muß
naturgemäß kleiner sein als der Innnendurchmesser der
Hüllkapillare. Für die Wandstärke der Kernkapillare ist ein
Wert von ca. 0,1 mm zu bevorzugen.
Die Hüllkapillare ist derart in den Kapillarträger
eingelassen, daß die Position der Öffnung der Hüllkapillare
mit Hilfe einer Gewindeführung (6) eingestellt werden kann.
Vorzugsweise ist die Hüllkapillare so einzustellen, daß
sich die Öffnungen von Kern- und Hüllkapillare auf gleicher
Höhe befinden.
Zur Enkapsulierung des aktiven Materials wird dieses z. B.
in einer ca. 1-10%igen wäßrigen Lösung der Polysäure
gelöst oder suspendiert und in Tropfenform überführt.
Dies kann z. B. unter Benutzung der zuvor beschriebenen
Vertropfungseinrichtung geschehen, indem die wäßrige Lösung
der Polysäure durch die Kernkapillare gepumpt wird, während
über den Gaseintrittsstutzen ein beliebiges Gas, z. B. Luft,
Stickstoff, Kohlendioxid usw., eingepumpt wird, das durch
den Ringspalt zwischen Kernkapillare und Hüllkapillare
strömt. Die aus der Kernkapillare austretenden Tropfen
werden von dem Gas tangential umströmt und abgedrückt. Die
Tropfengröße nimmt mit sinkendem Innendurchmesser der
Kernkapillare und steigender Strömungsgeschwindigkeit des
Gases ab, wobei der Tropfendurchmesser kleiner als der
Innendurchmesser der Kernkapillare sein kann.
Die Benutzung der beschriebenen Vertropfungseinrichtung
bietet folgende Vorteile:
- - durch Benutzung unterschiedlicher Kapillaren und unterschiedlicher Gasströmungsgeschwindigkeiten läßt sich die Größe der erzeugten Tropfen über einen weiten Bereich variieren, wobei sich insbesondere außergewöhnlich kleine Tropfen herstellen lassen; es können z. B. bei Benutzung einer Kernkapillare von 0,2 mm Innendurchmesser und einer Hüllkapillare von 0,9 mm Innendurchmesser Tropfengrößen zwischen ca. 0,1 mm und 3 mm Durchmesser hergestellt werden.
- - die gewonnenen Tropfen haben eine besonders homogene Größenverteilung
- - die Apparatur ist leicht sterilisierbar, z. B. durch Dampfsterilisation
- - eine geschlossene Ausführung zur aseptischen Herstellung von Immobilisaten ist möglich.
Die auf beschriebene Weise hergestellten Tropfen werden
verkapselt, z. B. indem sie mit einer ca. 0,1-10%igen
wäßrigen Lösung der Polybase auf beliebige Weise, z. B.
durch Eintropfen, in Kontakt gebracht werden, wobei sich an
der Phasengrenze zwischen Polysäure und Polybase die
semipermeable Membran ausbildet, die das aktive Material
einschließt.
Durch den Einsatz der obengenannten Polybasen lassen sich
Mikrokapseln herstellen, deren Durchmesser mit dem der
eingesetzten Tropfen annähernd identisch ist.
Die verwendeten Polysäuren, die das aktive Material
enthalten, sollten - speziell bei der Enkapsulierung von
empfindlichem biologischem Material - bioverträglich sein.
Zur Anwendung kommen hier beispielsweise Polysaccharide
wie Alginat, Carrageen, Carboxymethylcellulose oder Xanthan.
Die zur Herstellung der erfindungsgemäßen
Polyelektrolytmembrankapseln verwendeten Polybasen gemäß
Formel (I) sind, sofern nicht käuflich, in einfacher Weise
herstellbar.
Durch Lösungspolymerisation eines oder gegebenenfalls auch
mehrerer verschiedener Monomere gemäß Formel (I) und
gegebenenfalls noch weiteren hydrophilen, biokompatiblen,
elektrisch neutralen Monomeren, wie z. B. N-Vinylpyrrolidon,
N-Vinylmethylacetamid, Vinylcaprolactam, Acrylsäure oder
Acrylamide, erhält man eine Polybase, die entweder direkt
eingesetzt werden kann oder gegebenenfalls noch mit
weiteren wasserlöslichen, biokompatiblen Polymeren gemischt
werden kann, wobei diese zusätzlich hinzugefügten Polymere
auch noch mit den Polymeren, aufgebaut aus Monomereinheiten
gemäß Formel (I), unter Hinzugabe von Epichlorhydrin
vernetzt werden können. Als zusätzliche wasserlösliche,
biokompatible Polymere können beispielsweise Celluloseether
oder Kondensationsprodukte aus Dicarbonsäuren und Diaminen
eingesetzt werden.
Bevorzugt bestehen die Polybasen aus einem Polymer,
gebildet aus einem oder mehreren verschiedenen Monomeren
der Formel (I) und einem polymeren Kondensationsprodukt aus
Dicarbonsäuren gemäß Formel (IV) und Diaminen gemäß
Formel (V), wobei die beiden Polymeren bevorzugt mit
Epichlorhydrin vernetzt werden. Dabei bilden sich zwischen
den beiden Poylmeren überbrückende Einheiten aus, die sich
vom Epichlorhydrin ableiten. In der Regel handelt es sich
dabei um 2-Hydroxypropyleneinheiten (-CH₂-CHOH-CH₂-). Von den
Monomeren gemäß Formel (I) sind Polyvinylmethylimidazol,
Polyallylamin und Polymethallylamin besonders bevorzugt.
Als Dicarbonsäuren werden geradkettige, gesättigte
Dicarbonsäuren mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, bevorzugt
5 oder 6 Kohlenstoffatome, eingesetzt und als Diamine
oligomere Ethylendiamine mit 2 bis 5 Ethyleneinheiten
bevorzugt zwei Ethyleneinheiten.
Zur Herstellung der bevorzugten Polybasen wird (oder
werden) zunächst das (oder die) Monomer(e) gemäß Formel (I)
in wäßriger Lösung polymerisiert. Nach beendeter
Polymerisation wird das Kondensationsprodukt aus
Dicarbonsäure (IV) und Diamin (V) als wäßrige Lösung zu
dem Polymerisat gegeben und unter Hinzugabe von
Epichlorhydrin vernetzt.
Das Kondensationsprodukt wird bevorzugt aus äquimolaren
Anteilen von Dicarbonsäure (IV) und Diamin (V) hergestellt.
Das Molverhältnis des Polymers, bestehend aus
Monomereinheiten gemäß Formel (I), zu dem des
Kondensationsproduktes beträgt 500-25 : 1, bevorzugt 50 : 1,
besonders bevorzugt 25 : 1.
Die Konzentration des zugesetzten Epichlorhydrins beträgt
0,1 bis 0,5 Mol-% (bezogen auf das Polymer, bestehend
aus Monomeren gemäß Formel (I)), bevorzugt 0,2 Mol-%,
besonders bevorzugt 0,4 Mol-%.
Das Molekulargewicht der eingesetzten Polybasen beträgt
1000-200 000 Dalton. Werden als Monomere gemäß Formel (I)
Polyallylamin oder Polymethallylamin eingesetzt, so beträgt
das Molekulargewicht bevorzugt 5000-100 000 Dalton. Bei der
Verwendung von Polyvinylmethylimidazol als Monomer gemäß
Formel (I) beträgt das Molekulargewicht bevorzugt
5000-200 000 Dalton.
Erfindungsgemäß können biologisch aktive Substanzen oder
aktive Materialien, die in der Lage sind, biologisch aktive
Substanzen zu produzieren, in die Polyelektrolytmembran
eingeschlossen werden. Diese Membran gestattet den
Transport von einer Vielzahl von Substanzen wie Nährstoffe,
Substrat hin zu der biologisch aktiven Substanz und ist in
der Lage, die dort produzierten Stoffe entweder selektiv
zurückzuhalten oder nur solche passieren zu lassen
(Semipermeabilität). Das aktive Material kann z. B. eine Zelle
oder ein Zellmaterial oder ein chemischer oder biochemischer
Reaktant sein. Als Zellen können z. B. eingesetzt werden:
Hybridomazellen oder genetisch modifizierte Zellen,
hergestellt mittels rekombinanter DNA-Technologie, oder
auch Lymphozytenzellen, die in der Lage sind, Antikörper
oder Mikroorganismen für die Fermentation herzustellen.
Darüberhinaus können auch Mikroorganismen wie Bakterien
enkapsuliert werden. Weiterhin ist es möglich, biologisch
aktive Verbindungen wie Enzyme, Hormone, Antikörper oder
Antibiotika einzukapseln, die kontrollierbar durch die
Membran freigesetzt werden können oder - z. B. für
katalytische Reaktionen - von der Membran zurückgehalten
werden.
Die Permeabilität der Membran kann
- a) über die Konzentrationen der eingesetzten Polysäuren und Polybasen
- b) über den pH-Wert der wäßrigen Lösung der Polysäuren bzw. -basen
- c) über das Molekulargewicht der eingesetzten Polysäuren und Polybasen sowie über die Verteilung des Molekulargewichts und
- d) über die geeignete Auswahl, insbesondere der Polybasen und deren Ladungsdichte
gesteuert werden.
So führt beispielsweise eine Erhöhung der
Polymerkonzentration gewöhnlich zu einer Erniedrigung der
Permeabilität; andererseits führt z. B. ein Anteil der
Monomeren mit positiver Ladung unter 30 Mol-% zu
unzureichender Kapselstabilität.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher
erläutert.
In einem 2-l-Glaskolben werden 294,9 g (3,15 mol)
Allylamin-Hydrochlorid zusammen mit 105 ml Wasser gelöst.
Dabei wird ein pH-Wert von 0 gemessen. Nun wird mit 4,23 g
5%iger Ammoniaklösung auf einen pH-Wert von 4,1
eingestellt. Anschließend wird eine Lösung von 3,3 g
2,2′-Azo-bis-(2-amidinopropan)-dihydrochlorid gelöst, in 15 ml
Wasser, zugetropft und unter Einleiten von Stickstoff bei
50°C 16 Stunden polymerisiert. Danach wird nochmals 3,3 g
2,2′-Azo-bis-(2-amidinopropan)-dihydrochlorid in 15 ml
Wasser zugetropft und nochmals 4 Stunden polymerisiert.
Zu dieser Polymerisatlösung werden nun 288,18 g des
Kondensationsproduktes aus 1 Mol Adipinsäure und 1 Mol
Diethylentriamin in Form einer 50%igen wäßrigen Lösung
zugefügt.
Anschließend werden 5,829 g (0,06 Mol) Epichlorhydrin als
5%ige ethanolische Lösung zugefügt und 30 Minuten bei 50°C
vernetzt. Nach dieser Zeit werden nochmals 5,829 g (0,06 Mol)
Epichlorhydrin als 5%ige ethanolische Lösung hinzugefügt und
weitere 30 Minuten bei 50°C vernetzt. Nun wird mit Wasser auf
eine Endkonzentration des Polymerisats von 40% eingestellt.
Die Reaktion wurde durch Messung des K-Wertes in 1%iger
Lösung verfolgt:
K-Wert (vor der Polymerisation) 7,6 · 10³
K-Wert (nach der Polymerisation) 9,5 · 10³
K-Wert (nach der Vernetzung) 18,3 · 10³
K-Wert (vor der Polymerisation) 7,6 · 10³
K-Wert (nach der Polymerisation) 9,5 · 10³
K-Wert (nach der Vernetzung) 18,3 · 10³
Analog Beispiel 1 wird ein Produkt aus 294,9 g (3,15 Mol)
Allylamin-hydrochlorid und 323,75 g (1,25 Mol) des
Kondensationsproduktes aus 1 Mol Korksäure und 1 Mol
Diethylentriamin nach anschließender Vernetzung mit
Epichlorhydrin in Form einer 50%igen wäßrigen Lösung
erhalten.
In einem 1-l-Glaskolben werden 149,8 g (1,59 Mol)
Allylamin-hydrochlorid vorgelegt und in 54,4 g Wasser
gelöst. Anschließend wird mit 7,78 g 5%iger Ammoniaklösung
auf den pH-Wert 4,1 eingestellt. Nun werden 1,7 g
2,2′-Azo-bis-(2-amidinopropan)-dihydrochlorid, gelöst in
8 ml Wasser, zugesetzt und die Reaktionslösung unter
Einleiten von Stickstoff auf 50°C erwärmt und 16 Stunden
polymerisiert. Anschließend werden nochmals 1,7 g
2,2′-Azo-bis-(2-amidinopropan)-dihydrochlorid, gelöst in
8 ml Wasser, zugefügt und bei 50 bis 60°C weitere 4 Stunden
polymerisiert.
Aus dieser wäßrigen Polymerisatlösung werden 144,76 g
entnommen und 457,4 g des Kondensationsproduktes aus 1 Mol
Adipinsäure und 1 Mol Diethylentriamin als 50%ige wäßrige
Lösung zugesetzt. Nach 60-minütiger Reaktionszeit bei
50 bis 60°C wird durch Zutropfen von 37 g 5%iger
ethanolischer Lösung von Epichlorhydrin 30 Minuten bei 50°C
vernetzt. Nach nochmaliger Vernetzung mit nochmals 37 g
5%iger ethanolischer Lösung von Epichlorhydrin wird der
pH-Wert der Reaktionslösung mit 70,7 g konzentrierter
Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,5 und anschließend mit
30,4 g Wasser auf eine Gesamtkonzentration von 40%
eingestellt.
Der Verlauf der Polymerisation wurde anhand der Messung des
K-Wertes verfolgt:
K-Wert (vor der Polymerisation) 8,6 · 10³
K-Wert (nach der Polymerisation) 9,9 · 10³
K-Wert (nach der Vernetzung) 21,6 · 10³
K-Wert (vor der Polymerisation) 8,6 · 10³
K-Wert (nach der Polymerisation) 9,9 · 10³
K-Wert (nach der Vernetzung) 21,6 · 10³
Analog Beispiel 2 werden 149,8 g (1,59 Mol) Allylamin
hydrochlorid polymerisiert und mit 178,8 g des
Kondensationsproduktes aus 1 Mol Sebacinsäure und 1 Mol
Diethylentriamin unter Hinzufügung von Epichlorhydrin
vernetzt. Es wird eine 40%ige wäßrige Lösung erhalten.
In einem 2-l-Glaskolben werden 294,9 g (3,15 Mol)
Allylamin-hydrochlorid in 105 ml Wasser eingetragen und mit
10,6 g 5%iger Ammoniaklösung auf einen pH-Wert von 4,1
eingestellt. Nun fügt man 3,3 g 2,2′-Azo-bis-(2-amidino
propan)-dihydrochlorid, gelöst in 15 ml Wasser, hinzu und
erwärmt unter Einleiten von Stickstoff auf 50°C. Bei dieser
Temperatur wird 16 Stunden polymerisiert. Anschließend
werden nochmals 3,3 g 2,2′-Azo-bis-(2-amidinopropan)-
dihydrochlorid, gelöst in 15 ml Wasser, hinzugegeben und
weitere 4 Stunden bei 50°C polymerisiert.
Zu dieser Polymerisationslösung werden nun 341,4 g
(0,623 Mol) eines Kondensationsproduktes aus 1 Mol
Adipinsäure und 1 Mol Triethylentetramin in Form einer
50%igen wäßrigen Lösung zugesetzt und nach 60-minütiger
Reaktionszeit bei 50 bis 60°C wird durch Zutropfen von
116,58 g einer 5%igen ethanolischen Epichlorhydrinlösung
30 Minuten bei 50°C vernetzt. Nach weiteren 30 Minuten
werden nochmals 116,58 g 5%ige ethanolische
Epichlorhydrinlösung hinzugesetzt und abermals 30 Minuten
vernetzt. Danach wird die Probe auf einen Gehalt an
Polymerisat von 40% eingestellt.
Die Reaktion wurde durch Messung des K-Wertes in 1%iger
wäßriger Lösung verfolgt:
K-Wert (vor der Polymerisation) 8,1 · 10³
K-Wert (nach der Polymerisation) 9,8 · 10³
K-Wert (nach der Vernetzung) 22 · 10³
K-Wert (vor der Polymerisation) 8,1 · 10³
K-Wert (nach der Polymerisation) 9,8 · 10³
K-Wert (nach der Vernetzung) 22 · 10³
Analog Beispiel 5 werden 294,9 g (3,15 Mol) Allylamin
hydrochlorid polymerisiert und mit 161,35 g (0,623 Mol)
eines Kondensationsproduktes aus 1 Mol Korksäure und 1 Mol
Diethylentriamin unter Hinzugabe von Epichlorhydrin
vernetzt. Danach wird die Probe auf einen Gehalt an
Polymerisat von 40% eingestellt.
In einem 2-l-Glaskolben werden 74,9 g (0,8 Mol)
Allylamin-hydrochlorid, gelöst in 27,2 ml Wasser,
vorgelegt und anschließend mit 7,78 g 5%iger
Ammoniaklösung auf einen pH-Wert von 4,1 eingestellt. Nun
werden 0,85 g 2,2′-Azo-bis-(2-amidinopropan)-dihydrochlorid,
gelöst in 8 ml Wasser, hinzugegeben und 16 Stunden unter
Einleiten von Stickstoff bei 55°C polymerisiert.
Anschließend werden nochmals 0,85 g
2,2′-Azo-bis-(2-amidinopropan)-dihydrochlorid zugesetzt und
weitere 3 Stunden bei 55°C polymerisiert. Nun werden 457,43 g
einer 50,5%igen wäßrigen Lösung eines
Kondensationsproduktes aus 1 Mol Adipinsäure und 1 Mol
Diethylentriamin hinzugegeben und nach 60-minütiger
Reaktionszeit bei 50-55°C werden 37 g einer 5%igen
ethanolischen Lösung von Epichlorhydrin hinzugegeben und
20 Minuten vernetzt. Anschließend fügt man nochmals
37 g einer 5%igen ethanolischen Lösung von Epichlorhydrin
zu und vernetzt nochmals 30 Minuten. Anschließend wird mit
70,7 g konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,5
und mit 30,4 ml Wasser auf einen Substanzgehalt von 40%
eingestellt.
Die Reaktion wurde anhand der in 1%iger wäßriger Lösung
gemessenem K-Wert verfolgt:
K-Wert (vor der Polymerisation) 8,0 · 10³
K-Wert (nach der Polymerisation) 20,8 · 10³
K-Wert (nach der Vernetzung) 34,7 · 10³
K-Wert (vor der Polymerisation) 8,0 · 10³
K-Wert (nach der Polymerisation) 20,8 · 10³
K-Wert (nach der Vernetzung) 34,7 · 10³
In einem 1-Liter-Glaskolben werden 294,9 g (3,15 Mol)
Allylamin-hydrochlorid in 105 ml Wasser gelöst und unter
Kühlung 126,39 g (1,276 Mol) N-Vinyl-N-methylacetamid
zugesetzt. Dann wird mit 10,5 g (0,154 Mol) konzentriertem
Ammoniak auf pH = 4 eingestellt. Nun fügt man 10,53 g
2,2′-Azobis-(2-amidinopropan)hydrochlorid, gelöst in
48 g Wasser, zu. Unter Einleiten von Stickstoff wird auf 50°C
Innentemperatur erhitzt und 16 Stunden auspolymerisiert.
Dabei wurde nach 4 Stunden nochmals 10,53 g 2,2′-Azobis-
(2-amidinopropan)hydrochlorid gelöst in 48 g Wasser
hinzugegeben und der pH-Wert mit konzentriertem
Ammoniak wieder auf pH = 4 eingestellt.
Es werden 660,38 g einer 63,3%igen Lösung an Copolymerisat
erhalten.
In einem 1-Liter-Glaskolben werden 294,9 g (3,15 Mol)
Allylamin-hydrochlorid in 105 ml Wasser gelöst und unter
Kühlung 126,39 g (1,345 Mol) N-Vinylimidazol zugefügt.
Anschließend werden 10,53 g 2,2′-Azobis-(2-Amidinopropan)-
hydrochlorid, gelöst in 48 g Wasser, zugegeben. Dann wird
unter Einleiten von Stickstoff auf 50°C erhitzt und
16 Stunden bei dieser Temperatur polymerisiert. Nach
4-stündiger Polymerisation wurden nochmals 10,53 g
2,2′-Azobis-(2-Amidinopropan)hydrochlorid, gelöst in 48 g
Wasser zugegeben. Es werden 645 g einer 64,3%igen wäßrigen
Copolymerisatlösung erhalten.
In einem 4-Liter-Glaskolben werden 1443 g (10 Mol) 1-Vinyl-
3-methylimidazoliumchlorid und 56 g (0,5 Mol) 1-Vinyl-2-
pyrrolidon in 3,8 l Wasser gelöst, das 38 g Kaliumperoxo
disulfat als Initiator enthält. Der Ansatz wird 6 h bei 60°C
unter Stickstoff polymerisiert. Man erhält eine klare
gelb-braune 40%ige Lösung mit neutralem pH-Wert. Der K-Wert
beträgt 60.
Eine Suspension von Hybridomazellen wird mit einer 4 gew.-%igen
λ-Carrageenlösung (Hersteller Sigma Chemie GmbH,
München) in Dulbecco′s Medium 1 : 1 (Massenverhältnis)
verdünnt. Die Lösung wird über eine Düse getropft. Die
Düse besteht aus einer Kernkapillare Innendurchmesser
0,2 mm, Außendurchmesser 0,4 mm. Sie ist konzentrisch in
eine Hüllkapillare mit einem Innendurchmesser von 0,9 mm
eingelassen, so daß über den entstehenden Ringspalt ein
tangentialer Gasstrom erzeugt werden kann, der die aus der
Kernkapillare austretenden Tropfen abdrückt. Je nach
Gasströmungsgeschwindigkeit betragen die Tropfengrößen ca.
0,1 mm-3 mm. Bei einem Gasdurchsatz von 15 l/min
(Stickstoff) werden Tropfengrößen zwischen ca. 0,22 mm und
0,25 mm erzeugt. Die Tropfen fallen in eine Lösung der
Polybase. Verwendet wird ein 0,5 gew.-%ige Lösung der nach
Beispiel 1 hergestellten Base. Es komplexiert sofort eine
Polyelektrolytkomplexmembran aus. Die Kapseln werden
mehrfach in einer Pufferlösung gewaschen und danach in ein
Kulturmedium überführt und im Brutschrank gelagert. Die so
eingeschlossenen Hybridomazellen teilen sich und sind
lebensfähig.
Analog zu Beispiel 11 werden Tropfen einer Zellsuspension
hergestellt. Sie fallen in eine Polybase. Verwendet wird
eine 2 gew.-%ige Lösung der Polybase, die nach Beispiel 10
hergestellt wurde. Die Kapseln werden analog Beispiel 11
weiter behandelt.
Die nach Beispiel 12 hergestellten Kapseln werden im
Brutschrank kultiviert. Die Zellpopulationen wachsen an und
nach 20 Tagen sind die Kapseln vollständig mit Zellen
ausgefüllt. Die Zellen produzieren ca. 2 µg Antikörper pro
Kapsel, d. h. ca. 1,1 mg Antikörper pro ml Reaktorvolumen.
Die nach Beispiel 11 hergestellten Kapseln werden im
Brutschrank kultiviert. Die Kapseln lassen die produzierten
Antikörper passieren. Nach 18 Tagen wurden ca. 0,7 mg
Antikörper pro ml Kulturmedium abgegeben.
1 ml einer Antikörperlösung (0,091 mg IgG Faktor VIII/Type 1,
Hersteller Calbiochem GmbH) in Phosphatpuffer pH 7,4
(0,00205 Mol Na₂HPO₄, 0,0045 Mol NaH₂PO₄) wird mit 1 ml
einer 4 gew.-%igen λ-Carragean-Lösung (Hersteller Sigma
Chemie GmbH, München) gemischt.
Die Lösung wird aus einer Einwegspritze (Kanülendurchmesser
0,4 mm) in eine 100 ml Vorlage einer 0,5 gew.-%ige Lösung
der Polybase gemäß Beispiel 1 getropft. Nach 3 Minuten wurden
die Mikrokapseln durch Dekantieren von überstehender Lösung
der Polybase befreit, dreimal mit Phosphatpuffer pH 7,4
nachgewaschen und in 10 ml des Puffers suspendiert.
Analog werden Mikrokapseln mit der Polybase gemäß Beispiel 10
hergestellt. Die Vorlage der Polybase ist jedoch 2 gew.-%ig.
Nach 20 Minuten werden die Mikrokapseln durch Dekantieren
von überstehender Lösung der Polybase befreit, einmal mit
Phosphatpuffer pH 7,4 nachgewaschen und in 10 ml des Puffers
suspendiert.
Nach definierten Zeiten (s. Tabelle) wird eine 1-ml-Probe der
beiden Suspensionen genommen und ihr Antikörpergehalt
(Gew.-%) im Enzymimmunoassay (ELISA [Enzyme linked
immunosorbent assay], Behringwerke AG, Marburg) bestimmt.
Die Freigabe der gesamten Antikörpermenge aus den
Mikrokapseln wird als 100% angenommen:
Claims (22)
1. Polyelektrolytmembrankapseln, bestehend aus einer
semipermeablen Membran und einem von ihr
eingeschlossenen aktiven Material, wobei die Membran aus
einer biokompatiblen, nicht toxischen Polysäure und
einer Polybase besteht, dadurch gekennzeichnet, daß die
Polybase aus einem Polymer, gebildet aus wiederkehrenden
Monomereinheiten der Formel (I)
wobei
R¹ Wasserstoff oder Methyl und
R² eine Aminomethylgruppe, ein Imidazolrest oder ein Rest der Formel (II) ist wobei
R³ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet, wobei miteinander verknüpfte Monomereinheiten auch voneinander verschiedene Reste R¹ und/oder R² enthalten können, und
gegebenenfalls noch weiteren hydrophilen, biokompatiblen, keine elektrische Ladung aufweisenden Monomereinheiten und
gegebenenfalls noch weiteren wasserlöslichen, biokompatiblen Polymeren, die gegebenenfalls mit dem Polymer, gebildet aus Monomereinheiten der Formel I und gegebenenfalls weiteren hydrophilen, biokompatiblen, keine elektrische Ladung aufweisenden Monomereinheiten, über überbrückende Einheiten vernetzt sind, besteht.
R¹ Wasserstoff oder Methyl und
R² eine Aminomethylgruppe, ein Imidazolrest oder ein Rest der Formel (II) ist wobei
R³ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet, wobei miteinander verknüpfte Monomereinheiten auch voneinander verschiedene Reste R¹ und/oder R² enthalten können, und
gegebenenfalls noch weiteren hydrophilen, biokompatiblen, keine elektrische Ladung aufweisenden Monomereinheiten und
gegebenenfalls noch weiteren wasserlöslichen, biokompatiblen Polymeren, die gegebenenfalls mit dem Polymer, gebildet aus Monomereinheiten der Formel I und gegebenenfalls weiteren hydrophilen, biokompatiblen, keine elektrische Ladung aufweisenden Monomereinheiten, über überbrückende Einheiten vernetzt sind, besteht.
2. Polyelektrolytmembrankapseln, nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die Polybase aus einem Polymer,
gebildet aus wiederkehrenden Monomereinheiten der Formel
(I) gemäß Anspruch 1 und noch weiteren,
wasserlöslichen, biokompatiblen Polymeren, die
gegebenenfalls mit dem Polymer, gebildet aus
Monomereinheiten der Formel I, über überbrückende Einheiten
vernetzt sind, besteht.
3. Polyelektrolytmembrankapseln nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die Polybase aus einem Polymer,
gebildet aus wiederkehrenden Monomereinheiten der Formel
(I) gemäß Anspruch 1 und noch weiteren hydrophilen,
biokompatiblen, keine elektrische Ladung aufweisenden
Monomereinheiten besteht.
4. Polyelektrolytmembrankapseln nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die Polybase aus einem Polymer,
gebildet aus wiederkehrenden Monomereinheiten der Formel
(I) gemäß Anspruch 1 und noch weiteren hydrophilen,
biokompatiblen, keine elektrische Ladung aufweisenden
Monomereinheiten und noch weiteren wasserlöslichen
biokompatiblen Polymeren, die gegebenenfalls mit dem
Polymer, gebildet aus Monomereinheiten der Formel I und
gegebenenfalls weiteren hydrophilen, biokompatiblen,
keine elektrische Ladung aufweisenden Monomereinheiten,
über überbrückende Einheiten vernetzt sind, besteht.
5. Polyelektrolytmembrankapseln nach einem oder mehreren der
Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß als
weitere wasserlösliche, biokompatible Polymere ein
Kondensationsprodukt aus Dicarbonsäuren der Formel (IV)
HOOC - (CH₂) n - COOH (IV)wobei n 0 bis 8 ist,
und Aminen der Formel (V)H₂N-CH₂-(CH₂-NH-CH₂) m -CH₂-NH₂ (V)wobei m 1 bis 4 ist,
eingesetzt wird.
6. Polyelektrolytmembrankapseln nach Anspruch 5, dadurch
gekennzeichnet, daß das Polymer, gebildet aus
wiederkehrenden Monomereinheiten der Formel (I) gemäß
Anspruch 1 und das Kondensationsprodukt aus den
Verbindungen der Formel (IV) und (V) gemäß Anspruch 5
mit überbrückenden Einheiten vernetzt ist, die sich vom
Epichlorhydrin ableiten.
7. Polyelektrolytmembrankapseln nach einem oder mehreren der
Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß als
weitere hydrophile, biokompatible, keine elektrische
Ladung aufweisenden Monomereinheiten N-Vinylpyrrolidon
und/oder N-Vinylmethylacetamid und/oder Vinylcaprolactam
eingesetzt werden.
8. Polyelektrolytmembrankapseln nach einem oder mehreren der
Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß der
molare Anteil der hydrophilen, biokompatiblen, keine
elektrische Ladung tragenden Monomereinheiten - bezogen
auf das Gesamtmolekulargewicht der Polybase - 0-70%
beträgt.
9. Polyelektrolytmembrankapseln nach einem oder mehreren der
Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß
der molare Anteil der wasserlöslichen, biokompatiblen
Polymere - bezogen auf das Gesamtmolekulargewicht der
Polybase - 0-50% beträgt.
10. Polyelektrolytmembrankapseln nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß als Polybase ein Polymer, gebildet aus
Methallylamin- oder Allylamin-Monomeren eingesetzt wird.
11. Polyelektrolytmembrankapseln nach Anspruch 10, dadurch
gekennzeichnet, daß die Polybase ein Molekulargewicht
von 5000-100 000 Dalton besitzt.
12. Polyelektrolytmembrankapseln nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß als Polybase ein Polymer, gebildet aus
Vinylmethylimidazol-Monomeren der Formel (III)
eingesetzt wird.
13. Polyelektrolytmembrankapseln nach Anspruch 12, dadurch
gekennzeichnet, daß die Polybase ein Molekulargewicht
von 5000-200 000 Dalton besitzt.
14. Polyelektrolytmembrankapseln nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß als aktives Material Enzyme, Zellen
oder Zellmaterial eingesetzt wird.
15. Verfahren zur Herstellung von
Polyelektrolytmembrankapseln gemäß Anspruch 1, wobei
man eine Suspension oder Lösung von aktivem Material in
einer wäßrigen Lösung einer wasserlöslichen, nicht
toxischen, biokompatiblen Polysäure herstellt und diese
wäßrige Suspension oder Lösung in Tropfenform in eine
wäßrige Lösung einer wasserlöslichen Polymerbase
einbringt, wobei die Polysäure und die Polybase an der
Phasengrenze miteinander reagiert und um das aktive
Material eine wasserunlösliche, semipermeable Polymer-
Polymer-Komplexmembran ausbildet, dadurch
gekennzeichnet, daß die Polybase ein Polymer, bestehend
aus wiederkehrenden Monomereinheiten der Formel (I) gemäß
Anspruch 1, wobei miteinander verknüpfte Monomereinheiten
auch voneinander verschiedene Reste R¹ und/oder R², wie in
Anspruch 1 definiert, enthalten können und
gegebenenfalls weiteren hydrophilen, biokompatiblen,
keine elektrische Ladung aufweisende Monomereinheiten,
ist und gegebenenfalls noch weitere, wasserlösliche,
biokompatible Polymere, die gegebenenfalls mit
dem Polymer, gebildet aus Monomereinheiten der Formel I
und gegebenenfalls weiteren hydrophilen, biokompatiblen,
keine elektrische Ladung aufweisenden Monomereinheiten,
über überbrückende Einheiten vernetzt sind, enthält.
16. Verwendung der Polyelektrolytmembrankapseln gemäß
Anspruch 14 zur Herstellung von Produkten durch
Zellkulturen oder Enzyme.
17. Verwendung gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet,
daß die Produkte in Polyelektrolytmembrankapseln
gebildet werden und diese nicht verlassen.
18. Verwendung gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet,
daß die Produkte in Polyelektrolytmembrankapseln gebildet
werden und diese nicht verlassen können.
19. Vertropfungseinrichtung zur Herstellung von
Mikrotropfen, bei der die Mikrotropfen aus einer
Kernkapillare durch in Richtung der Kernkapillare
tangential an dem Mikrotropfen entlangstreichendes Gas
abgelöst werden, dadurch gekennzeichnet, daß das Gas
durch den Ringspalt zwischen der Kernkapillare und einer
die Kernkapillare umhüllenden Hüllkapillare strömt.
20. Vertropfungseinrichtung nach Anspruch 19, dadurch
gekennzeichnet, daß die Kernkapillare einen
Innendurchmesser zwischen ca. 0,1 und 1 mm,
bevorzugt zwischen ca. 0,2 und 0,6 mm, insbesondere von
ca. 0,4 mm, besitzt.
21. Vertropfungseinrichtung nach Anspruch 19 oder 20,
dadurch gekennzeichnet, daß die Hüllkapillare einen
Innendurchmesser zwischen ca. 0,3 mm und 1,5 mm,
bevorzugt zwischen ca. 0,7 und 1,1 mm, insbesondere
von ca. 0,9 mm, besitzt.
22. Mikrotropfen, hergestellt mittels einer der in einem
oder mehreren Ansprüche 19-21 beschriebenen
Vertropfungseinrichtung.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19873729434 DE3729434A1 (de) | 1987-02-25 | 1987-09-03 | Mikroenkapsulierung von biologisch aktivem material |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3706010 | 1987-02-25 | ||
DE19873729434 DE3729434A1 (de) | 1987-02-25 | 1987-09-03 | Mikroenkapsulierung von biologisch aktivem material |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3729434A1 true DE3729434A1 (de) | 1988-09-08 |
Family
ID=25852874
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19873729434 Withdrawn DE3729434A1 (de) | 1987-02-25 | 1987-09-03 | Mikroenkapsulierung von biologisch aktivem material |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE3729434A1 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4426396A1 (de) * | 1994-07-26 | 1996-02-01 | Ulrich Prof Dr Zimmermann | Verfahren zur Herstellung konzentrierter Lösungen von mikroverkapselten Zellen oder von suspendierten Wirkstoffen in mikroverkapselter Form |
-
1987
- 1987-09-03 DE DE19873729434 patent/DE3729434A1/de not_active Withdrawn
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4426396A1 (de) * | 1994-07-26 | 1996-02-01 | Ulrich Prof Dr Zimmermann | Verfahren zur Herstellung konzentrierter Lösungen von mikroverkapselten Zellen oder von suspendierten Wirkstoffen in mikroverkapselter Form |
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Legal Events
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---|---|---|---|
8130 | Withdrawal |