DE3722273A1 - SOLID PHASE BINDING REAGENTS, THEIR PRODUCTION AND ASSAY KITS CONTAINING THEM - Google Patents

SOLID PHASE BINDING REAGENTS, THEIR PRODUCTION AND ASSAY KITS CONTAINING THEM

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DE3722273A1
DE3722273A1 DE19873722273 DE3722273A DE3722273A1 DE 3722273 A1 DE3722273 A1 DE 3722273A1 DE 19873722273 DE19873722273 DE 19873722273 DE 3722273 A DE3722273 A DE 3722273A DE 3722273 A1 DE3722273 A1 DE 3722273A1
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Abstract

Solid phase binding reagents for biochemical binding assays are prepared by isolating a plurality of selected binding species from a biological source mixture such as a cell or viral lysate; diluting each isolated species in a carrier liquid, such as a detergent-containing buffer solution, to form a series of stock mixtures each at a preselected concentration; and applying the mixtures to discrete, precisely defined regions on a solid phase support, immobilizing the species according to a preselected pattern. After suitable washing, blocking and stabilization steps, the resulting solid phase reagent may be used like a Western blot of an electropherogram, but with distinct advantages in terms of accuracy, reproducibility and readability.

Description

Die Erfindung betrifft biochemische Bindungs-Assays vom heterogenen Typ, d.h. solche, bei denen eine biochemische Bindung erzeugt wird zwischen auf einem Festphasen-Träger immobilisierten Spezies und Spezies, die in einer Flüssig­ keit gelöst oder suspendiert sind. Die Erfindung betrifft insbesondere Festphasen-Reagentien mit Trägern, an denen in einem bestimmten Muster eine Vielzahl von Bindungs­ spezies fixiert ist, die aus einer gemeinsamen Quelle stammen, wie z.B. Zellen- oder Viruslysat.The invention relates to biochemical binding assays from heterogeneous type, i.e. those where a biochemical Binding is created between on a solid phase support immobilized species and species in a liquid are loosened or suspended. The invention relates especially solid phase reagents with supports on which a variety of binding in a particular pattern species is fixed, from a common source originate, such as Cell or virus lysate.

Die Analyse von biologischen Flüssigkeiten zur Bestimmung von darin in Kombination vorhandenen bestimmten Spezies wird häufig durchgeführt für Diagnose- oder Reihenuntersu­ chungszwecke. Viele dieser Assays umfassen die Inkubation einer Probe der Flüssigkeit mit einem Streifen aus einem Festphasen-Material, an den eine Reihe von Spezies gebunden ist, die jeweils eine Bindungsaffinität für eine der nach­ zuweisenden Spezies haben. Der Streifen wird dann abgelesen, um die Anwesenheit der Bindung zwischen den ursprünglich auf dem Streifen vorhandenen Spezies und denjenigen in der Probe festzustellen.The analysis of biological liquids for determination of certain species present in combination is often performed for diagnostic or screening examinations purposes. Many of these assays involve incubation a sample of the liquid with a streak of a Solid phase material to which a number of species are bound is, each a binding affinity for one of the following assigning species. The strip is then read to the presence of the bond between the originally species present on the strip and those in the Sample.

Die auf den Streifen immobilisierten Spezies sind in der Regel biochemische Spezies, wie Proteine oder Peptide, die charakteristische Komponenten einer größeren biochemischen Spezies, wie z.B. eines Virus oder einer Zelle, sind. Bisher handelte es sich bei diesen Spezies-gebundenen Trägern um Tüpfelaufzeichnungen (Blots) von Elektropherogrammen. Da ein einzelnes Elektropherogramm nur eine begrenzte Anzahl von solchen Aufzeichnungen (Blots) liefern kann, unterliegen die Aufzeichnungen (Blots) Beschränkungen in bezug auf ihre Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Gesamtzuverlässigkeit. Abweichungen von einer elektrophoretischen Trennung zur nächsten sowie von einer Ausgangsmischung zur nächsten sind unvermeidlich. Durch die Verwendung von Elektro­ pherogrammen wird das Ausmaß, bis zu dem die verschiedenen Spezies voneinander getrennt und in gut definierten Banden fokussiert werden können, weiter eingeschränkt. Abweichungen in den Mengen der verschiedenen Spezies in der Ausgangsmi­ schung führen zu weiteren Problemen durch Schaffung einer Überbetonung bestimmter Spezies auf Kosten der anderen, wodurch der Nachweis bzw. die Bestimmung der Gesamtmischung erschwert wird.The species immobilized on the strips are in the Usually biochemical species, such as proteins or peptides, that characteristic components of a larger biochemical Species, such as a virus or a cell. So far were these species-bound carriers Dot recordings (blots) of electropherograms. There a single electropherogram only a limited number of such blots are subject to Records (blots) restrictions on their Accuracy, reproducibility and overall reliability.  Deviations from an electrophoretic separation to next and from one starting mixture to the next are inevitable. By using electrical The extent to which the various Species separated from each other and in well-defined bands can be focused, further restricted. Deviations in the amounts of the different species in the starting medium create further problems by creating a Overemphasis on certain species at the expense of others, whereby the detection or determination of the total mixture is difficult.

Es wurde nun gefunden, daß Festphasen-Bindungsreagentien, die einen hohen Grad der Genauigkeit, der Ablesbarkeit und Reproduzierbarkeit in einem Bindungs-Assay ergeben, aus einem biologischen Quellengemisch hergestellt werden können durch Isolieren der verschiedenen Bindungsspezies der Wahl aus dem Gemisch, Verdünnen jeder isolierten Spezies in einer Trägerflüssigkeit unter Bildung einer Reihe von Stammi­ schungen, die jeweils eine der isolierten Spezies in einer vorgegebenen Konzentration enthalten, und Aufbringen der Mischungen auf diskrete, genau definierte Bereiche auf einem Festphasen-Träger, um die verschiedenen Spezies in einem vorgegebenen Muster an dem Träger zu immobilisieren. Die Erfindung ist insbesondere anwendbar bei der Herstellung einer Vielzahl derartiger Muster auf getrennten Trägern auf identische Weise, wobei alle Spezies scharf definierte Banden oder Bindungsbereiche mit einer im wesentlichen einheitlichen Dichte bilden. Diese Träger können Assay- Kits einverleibt werden, die Materialien zur Durchführung identischer Assays auf einer Vielzahl von Proben enthalten, wobei diese Kits außerdem zusätzliche Komponenten enthalten, wie sie für die Durchführung des Assays erforderlich sind.It has now been found that solid phase binding reagents, which have a high degree of accuracy, readability and Reproducibility in a binding assay result from a biological source mixture can be produced by isolating the various binding species of choice from the mixture, dilute each isolated species in one Carrier liquid to form a series of stocks which are each one of the isolated species in one contain predetermined concentration, and applying the Mixes on discrete, precisely defined areas on one Solid phase carrier to the different species in one immobilize predetermined patterns on the carrier. The Invention is particularly applicable in manufacture a variety of such patterns on separate supports in an identical manner, with all species sharply defined Bands or bond areas with one essentially form uniform density. These carriers can be assayed Kits are incorporated to carry the materials contain identical assays on a variety of samples, these kits also contain additional components as required to perform the assay.

Biologische Quellengemische, die zur praktischen Durchführung der Erfindung geeignet sind, können in bezug auf ihre Zusam­ mensetzung und die Quelle stark variieren. Diese Gemische umfassen im allgemeinen eine Kombination von biologischen Spezies, insbesondere Makromolekülen, die in Form von Mi­ schungen, Anhäufungen oder Kombinationen vorliegen. Die Erfin­ dung ist insbesondere anwendbar auf Mischungen derartiger Spezies, wie Peptide, Polypeptide und Proteine. Typische Beispiele für solche Mischungen sind Zellen- und Virus- Lysate. Die Erfindung kann beispielsweise angewendet werden zum Isolieren und Trennen von Zell- oder Virus- Antigenen für die Verwendung als Bindungsspezies zum Nach­ weis der Anwesenheit von Antikörpern zu den Antigenen in einer Probe einer Körperflüssigkeit. Alternativ können die Spezies in der Mischung die Antikörper selbst sein, die iso­ liert und zum Nachweis der Anwesenheit von Antigenen in der Flüssigkeitsprobe verwendet werden.Biological source mixtures that are used for practical implementation of the invention are suitable in relation to their together  composition and source vary widely. These mixtures generally comprise a combination of biological Species, especially macromolecules, in the form of Mi accumulations, accumulations or combinations. The Erfin manure is particularly applicable to mixtures of such Species such as peptides, polypeptides and proteins. Typical Examples of such mixtures are cell and virus Lysates. The invention can be applied, for example are used to isolate and separate cell or virus Antigens for use as after binding species indicates the presence of antibodies to the antigens in a sample of a body fluid. Alternatively, the Species in the mixture will be the antibodies themselves, the iso and to detect the presence of antigens in the Liquid sample can be used.

Im Prinzip handelt es sich bei den Spezies der erfindungsge­ mäß aufzutrennenden Mischung um irgendeine Kombination von Spezies, von denen jede eine spezifische Bindungsaffinität gegenüber einer von mehreren Komponenten hat, von denen an­ genommen wird, daß sie in der Testprobe vorhanden sind. Ein spezifisches Anwendungsgebiet der vorliegenden Erfin­ dung ist die Herstellung eines Festphasen-Bindungsreagens für einen Assay zur Bestimmung bzw. zum Nachweis des Vorhanden­ seins von Antikörpern zu einem oder mehreren der mit dem erworbenen Immunschwächesyndrom (AIDS) in Verbindung ge­ brachten Viren. Beispiele für anerkannte AIDS-Viren sind das Human T Zellen Leukemia Virus III (HTLV III), das Lymphadenopathy Associated-Virus (LAV) und das Acquired Immune Deficiency Syndrome Related Virus (ARV).In principle, the species of the mixture to be separated according to the invention are any combination of species, each of which has a specific binding affinity for one of several components, which are believed to be present in the test sample. A specific field of application of the present invention is the production of a solid phase binding reagent for an assay for the determination or detection of the presence of antibodies to one or more of the viruses associated with the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). Examples of recognized AIDS viruses are the Human T cell Leukemia Virus III (HTLV III), the Lymphadenopathy Associated Virus (LAV) and the Acquired Immune Deficiency Syndrome Related Virus (ARV).

Vor der Abtrennung der Spezies wird das Gemisch im allge­ meinen hergestellt und bearbeitet nach konventionellen Methoden. Bezüglich der Zellen und Viren, insbesondere der in Zellkulturen vorhandenen Viren, werden die Zellen und Viren in einigen Fällen abgetötet und lysiert als Teil der Herstellung, vorzugsweise durch eine Kombination aus einem Detergens und Wärme in der Weise, daß die Bindungseigenschaf­ ten der Antigene oder anderen Spezies, die in dem Assay ver­ wendet werden sollen, im wesentlichen nicht geändert werden.Before separating the species, the mixture is generally mine manufactured and processed according to conventional Methods. Regarding cells and viruses, especially the Viruses present in cell cultures, the cells and Viruses in some cases are killed and lysed as part of the  Production, preferably by a combination of one Detergent and heat in such a way that the binding properties of the antigens or other species used in the assay should be applied, essentially not changed.

Die Abtrennung und Isolierung der Bindungsspezies von dem Quellengemisch erfolgt unter Anwendung eines Trennverfah­ rens oder -verfahrensfolge, die an das Ausgangsgemisch und an die nachzuweisenden Spezies angepaßt ist. In vielen Fällen ist es erwünscht, bestimmte Spezies unter Ausschluß von anderen zu isolieren, wobei die ausgewählten Spezies solche sind, die sich an die Spezies in der Probe binden, deren Anwesenheit am charakteristischsten ist für den Zustand, der nachgewiesen werden soll. Die Identität der charakteristischsten Spezies in einer Probe als Hinweis auf einen gegebenen Zustand ist dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt.The separation and isolation of the binding species from the Source mixing is done using a separation procedure rens or sequence of procedures related to the starting mixture and is adapted to the species to be detected. In many Cases it is desirable to exclude certain species isolate from others, being the selected species are those that bind to the species in the sample, whose presence is most characteristic of the Condition to be proven. The identity of the most characteristic species in a sample as an indication to a given condition is known to those skilled in the art Area known.

Die Abtrennung und Isolierung kann erzielt werden unter Anwendung konventioneller präparativer Trennmethoden, bei­ spielsweise verschiedener Formen der Chromatographie, wie sie bei biochemischen Präparaten angewendet werden. Je nach Umfang und Vielzahl der gesuchten Spezies kann eine Folge von Trennstufen verschiedener Art zur Isolie­ rung jeweils einer Spezies erforderlich sein. Die Reaktions­ folge kann eines oder mehrere dieser Verfahren, wie z.B. die Hochleistungs-Flüssigchromatographie, die Umkehrpha­ sen-Chromatographie, die Gelpermeationschromatographie, die Ionenaustauschchromatographie, die hydrophobe Wech­ selwirkungschromatographie, die Affinitätschromatographie, die Hydroxyapatit-Chromatographie und die Größenaus­ schlußchromatographie, umfassen.The separation and isolation can be achieved under Application of conventional preparative separation methods, at for example different forms of chromatography, as used in biochemical preparations. Depending on the scope and variety of the species sought a series of isolators of various types tion of one species may be required. The reaction may follow one or more of these methods, e.g. high performance liquid chromatography, reverse ph sen chromatography, gel permeation chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic change interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography and sizes final chromatography, include.

Jede interessierende Bindungs-Spezies in dem Quellengemisch muß von jeder der anderen Spezies vollständig abgetrennt werden, eine vollständige Isolierung der Spezies von allen anderen Komponenten ist jedoch nicht immer erforder­ lich. Im Falle von Virus-Proteinen, die aus einem Virus stammen, das in einer speziellen Zellinie wächst, können beispielsweise auch kontaminierende Proteine und Nuklein­ säuren aus den Wirtszellen vorhanden sein. Wenn diese nicht immunoreaktiv sind mit den gleichen Antikörpern, die an die Virus-Proteine gebunden werden, brauchen sie nicht vollstän­ dig entfernt zu werden. Vorzugsweise wird jedoch eine aus­ reichende Menge dieser und anderer Fremdmaterialien entfernt, so daß die interessierende Spezies mindestens etwa 80 bis 90% des Isolats ausmacht.Any binding species of interest in the source mix must be completely separated from each of the other species be a complete isolation of the species from  however, all other components are not always required Lich. In the case of virus proteins that come from a virus that grow in a special cell line for example also contaminating proteins and nucleotides acids from the host cells are present. If not are immunoreactive with the same antibodies to the Virus proteins do not need to be bound completely dig to be removed. However, one is preferably made out removed sufficient amount of these and other foreign materials, so that the species of interest is at least about 80 to Accounts for 90% of the isolate.

Bei der Auswahl der Bedingungen für die Isolierverfahren muß berücksichtigt werden, daß die Bindungskapazitäten (beispielsweise die Immunoreaktivität) der einzelnen Spezies erhalten bleiben. Membranproteine sind beispielsweise häufig sehr hydrophob, die strenge Bedingungen, wie z.B. hohe Konzentrationen an Detergentien oder organischen Lösungs­ mitteln zum Eluieren aus einer speziellen Kolonne erfordern. Diese potentiell strengen Bedingungen können Proteine bis zu einem Punkt denaturieren, an dem sie mit den Antikörpern zu dem nativen Protein nicht mehr reagieren. Die besten Verfahrensbedingungen sind daher ein Gleichgewicht zwischen denaturierenden Bedingungen mit einer hohen Ausbeute und milderen Bedingungen mit einer höheren Immunoreaktivität.When choosing the conditions for the insulation process it must be taken into account that the binding capacities (e.g. immunoreactivity) of each species remain. For example, membrane proteins are common very hydrophobic, the strict conditions such as height Concentrations of detergents or organic solutions means for elution from a special column.  These potentially stringent conditions can up proteins denature to a point where they with the antibodies no longer react to the native protein. The best Process conditions are therefore a balance between denaturing conditions with a high yield and milder conditions with higher immunoreactivity.

Wenn die Spezies aus dem Quellengemisch einmal isoliert sind, wer­ den sie einzeln in Trägerflüssigkeiten verdünnt zur Bildung von individuellen Stammlösungen, von denen jede eine oder etwa eine der Spezies enthält. In einigen Fällen kann eine spezielle Spezies definiert sein als ein enger Molekular­ gewichtsbereich und sie kann einer verhältnismäßig breiten Elektropherogrammbande mit unscharfen Grenzbereichen ent­ sprechen, während andere Spezies als solche mit einzelnen Molekulargewichten definiert sein können. Das Verdünnen kann umfassen entweder ein Auflösen oder ein Suspendieren der Spezies in der Trägerflüssigkeit, je nach ihrer Löslich­ keit. Die Trägerflüssigkeit selbst kann wäßrig oder orga­ nisch oder eine Mischung davon sein und vorzugsweise handelt es sich dabei um eine Pufferlösung. Zu Beispielen gehören eine mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), TRIS/- Methanol, PBS/Propanol, PBS/Acetonitril und Carbonat. Die Konzentration der Spezies in der Trägerflüssigkeit ist nicht kritisch und sie kann stark variieren. Die Konzentration kann im allgemeinen beliebig gewählt werden, jedoch unter Be­ rücksichtigung der Speziesdichte, die angestrebt wird im Endzustand in gebundener Form an den Festphasen-Träger. Bei den meisten Anwendungszwecken ergibt eine Konzentration in dem Bereich von etwa 0,01 bis etwa 10 µg/ml die besten Ergeb­ nisse.Once the species are isolated from the source mix, who which they individually dilute in carrier liquids for formation of individual stock solutions, each one or contains about one of the species. In some cases, a special species can be defined as a narrow molecular weight range and it can be a relatively wide Electropherogram band with fuzzy border areas ent speak while other species as such with individual Molecular weights can be defined. The thinning can include either dissolving or suspending the species in the carrier liquid, depending on their solubility speed. The carrier liquid itself can be aqueous or orga niche or a mixture thereof and preferably acts it is a buffer solution. Examples include a phosphate buffered saline (PBS), TRIS / - Methanol, PBS / propanol, PBS / acetonitrile and carbonate. The Concentration of the species in the carrier liquid is not critical and it can vary widely. The concentration can generally be chosen arbitrarily, however under Be taking into account the species density that is sought in Final state in bound form on the solid phase support. At most applications result in a concentration in the best results in the range from about 0.01 to about 10 µg / ml nits.

Häufig ist es erwünscht, daß die Stammlösungen aus den ver­ schiedensten Gründen weitere Komponenten enthalten. Zu Bei­ spielen gehören Detergentien, wie Natriumdodecylsulfat (SDS), Triton X-100 (Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pennsylvanien/ USA), 3-(Chloramidopropyl)dimethylammonio)-1-propansulfonat (CHAPS) und Tween 20, 40, 60 und 80 (Handelsprodukte der Firma Atlas Chemical Industries, Inc., Wilmington, Delaware/ USA). Es können auch bakterizide und bakteristatische Agen­ tien darin enthalten sein, wie z.B. Natriumazid und Thimero­ sal. Wenn die Spezies kovalent an den Träger gebunden werden sollen, können verschiedene Kupplungsmittel, wie sie dem Fachmann an sich bekannt sind, verwendet werden. Zu geeig­ neten Beispielen gehören EDAC (Ethyldimethylaminopropyl­ carbodiimid) und bifunktionelle Reagentien, wie z.B. MBS (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester). Diese Kupp­ lungsmittel sind im allgemeinen in der Stammlösung nicht ent­ halten und ihre Verwendung kann entsprechend den konventio­ nellen Methoden sein. So kann beispielsweise die gesamte Trägeroberfläche zuerst mit dem Kupplungsmittel derivatisiert werden, worauf dann die Bindungs-Spezies auf die spezifi­ schen Bereiche aufgebracht werden. Die übrigen Bereiche kön­ nen dann blockiert werden oder ausgelöscht werden, um ein weiteres Binden zu verhindern.It is often desirable that the stock solutions contain other components for a variety of reasons. Examples include detergents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), Triton X-100 (Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania / USA), 3 - (chloramidopropyl) dimethylammonio) -1-propanesulfonate (CHAPS) and Tween 20 , 40 , 60 and 80 (commercial products from Atlas Chemical Industries, Inc., Wilmington, Delaware / USA). It can also contain bactericidal and bacteristatic agents, such as sodium azide and thimero sal. If the species are to be covalently bound to the support, various coupling agents as are known per se to the person skilled in the art can be used. Appropriate examples include EDAC (ethyldimethylaminopropyl carbodiimide) and bifunctional reagents such as MBS (m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester). These coupling agents are generally not contained in the stock solution and their use can be according to the conventional methods. For example, the entire carrier surface can first be derivatized with the coupling agent, after which the binding species are then applied to the specific areas. The remaining areas can then be blocked or wiped out to prevent further binding.

Der Festphasen-Träger kann irgendein Material sein, das die Bindungs-Spezies immobilisieren kann, das jedoch im übrigen inert ist oder inert gemacht werden kann in bezug auf die anderen Reagentien und Komponenten in dem Assay, in dem der Träger verwendet werden soll. Die Auswahl des Trägermaterials hängt vom Typ der darauf zu immobilisierenden Spezies sowie von der Immobilisierungsmethode, die von der Adsorption bis zur chemischen Bindung reicht, ab.The solid phase support can be any material that Binding species can immobilize, but otherwise is inert or can be rendered inert with respect to the other reagents and components in the assay in which the Carrier to be used. The selection of the carrier material depends on the type of species to be immobilized on it as well from the immobilization method, from adsorption to sufficient for chemical bonding.

Im allgemeinen kann irgendeine beliebige geometrische Gestalt verwendet werden, auf der genau definierte Bereiche, vorzugs­ weise diskrete Bereiche, einen für jede Spezies entsprechend einem vorgegebenen Muster bezeichnet werden können. Bei den meisten Anwendungen handelt es sich bei dem Träger um eine Membran, eine Folie bzw. Platte oder einen Streifen aus dem Material. Zu Beispielen für diese Trägermaterialien gehören Cellulosenitrat, Cellulose und derivatisierte Cellulose, Glasfasern, verschiedene Nylonarten und Derivate davon, Teflon und verwandte Materialien und Verbundstoffe aus die­ sen Materialien sowie Kombinationen dieser Materialien mit anderen Materialien, die Proteine oder Peptide binden können. Beispiele für die letztgenannten sind Ionenaustauschharze. Trägermaterialien in Form von Membranen oder Streifen sind zur Erleichterung des Eintauchens in die Probeflüssigkeiten bevorzugt.In general, any geometric shape can be used be used on the precisely defined areas, preferred wise discrete areas, one for each species a given pattern can be designated. Both In most applications, the carrier is a Membrane, a film or plate or a strip from the Material. Examples of these carrier materials include Cellulose nitrate, cellulose and derivatized cellulose, Glass fibers, various types of nylon and derivatives thereof,  Teflon and related materials and composites from the materials and combinations of these materials other materials that can bind proteins or peptides. Examples of the latter are ion exchange resins. Carrier materials in the form of membranes or strips are to facilitate immersion in the sample liquids prefers.

Die Spezies werden in Form ihrer Stammlösungen auf den Trä­ ger aufgebracht unter Anwendung eines vorgegebenen Musters, das dem Anwender bekanntgegeben wird als Hilfsmittel für den Nachweis. Das Muster besteht aus genau definierten Be­ reichen auf dem Träger, die vorzugsweise einen Abstand vonein­ ander haben und jeweils eine einzelne Spezies (oder einen engen Molekulargewichtsbereich) in einer im wesentlichen ein­ heitlichen Dichte über die gesamte Fläche des Bereiches ent­ halten. Die Größe jedes Bereiches und die Gesamtanordnung sind nicht kritisch und können stark variiert werden und sie umfassen beispielsweise diskrete Punkte verschiedener Größen, diskrete Linien definierter Länge und Breite und kontinuier­ liche Linien definierter Breite. Parallele Linien ähnlich den Banden eines Elektropherogramms sind besonders vorteilhaft, wobei mit der vorliegenden Erfindung eine beträchtliche Ver­ besserung gegenüber den Elektropherogrammen erzielt werden kann durch Kontrolle bzw. Steuerung der Linien, um eine im wesentlichen einheitliche Intensität, Schärfe und Abstand zu erzielen.The species are in the form of their stock solutions on the Trä ger applied using a predetermined pattern, which is announced to the user as a tool for evidence. The pattern consists of precisely defined Be range on the carrier, preferably a distance of one different and each have a single species (or one narrow molecular weight range) in a substantially uniform density over the entire area of the area hold. The size of each area and the overall arrangement are not critical and can be varied widely and they include, for example, discrete points of different sizes, discrete lines of defined length and width and continuous lines of defined width. Parallel lines similar to that Bands of an electropherogram are particularly advantageous with the present invention a considerable ver improvement over the electropherograms can be achieved can be done by checking or controlling the lines in order to substantially uniform intensity, sharpness and distance to achieve.

Das Auftragsverfahren kann auch stark variieren, wobei die optimale Methode in jedem Falle von der geometrischen Form und der Anordnung der Bindungsbereiche abhängt. Das Auf­ bringen kann erzielt werden beispielsweise durch Sprühstrah­ len oder Mikrostrahlen, die aus unter Druck stehenden Düsen austreten, sowie durch Übertragung als Folge einer Kapillar­ wirkung. Das Auftragen kann umfassen das kontrollierte Auf­ sprühen von diskreten Mustern auf eine stationäre Membran­ oberfläche, das kontrollierte Aufsprühen von kontinuierli­ chen Linien- oder Punktmustern auf eine sich bewegende Membranoberfläche, das Aufbringen von abgemessenen Tropfen direkt auf eine stationäre oder sich bewegende Membranober­ fläche unter Verwendung einer Präzisionsmikropipettier­ einrichtung, das Aufbringen eines kontrollierten kontinuier­ lichen Stromes unter Verwendung einer Auftragseinrichtung vom Docht- oder Bürsten-Typ sowie beliebige andere Verfahren, mit denen es möglich ist, eine flüssige Lösung oder Suspen­ sion auf einen genau definierten Bereich auf einer Feststoff­ oberfläche aufzubringen.The application process can also vary widely, with the optimal method in any case from the geometric shape and the arrangement of the bond areas. The up bring can be achieved for example by spray len or micro jets coming from pressurized nozzles emerge, as well as by transfer as a result of a capillary effect. The application can include controlled application spray discrete patterns onto a stationary membrane surface, the controlled spraying of continuous  Chen line or dot patterns on a moving Membrane surface, the application of measured drops directly on a stationary or moving membrane top area using a precision micropipette establishment, the application of a controlled continuous Liche electricity using an order facility of the wick or brush type and any other method, with which it is possible to use a liquid solution or suspension sion on a precisely defined area on a solid apply surface.

Das Auftragsverfahren sowie die Konzentration der Stamm­ lösung werden ausgewählt im Hinblick auf die Erzielung der gewünschten Speziesdichte auf dem Festphasen-Träger. Die Dichten können stark variieren und optimale Mengen hängen von dem Nachweisverfahren ab, das in dem Assay selbst in Be­ tracht gezogen wird. Bei den meisten Anwendungen ergibt eine Speziesdichte von mindestens etwa 10 µg/m2 Trägeroberfläche, vorzugsweise von etwa 0,1 bis etwa 10 µg/m2 Trägeroberfläche, die besten Ergebnisse.The application method and the concentration of the stock solution are selected with a view to achieving the desired species density on the solid phase support. The densities can vary widely and optimal amounts depend on the detection method used in the assay itself. For most applications, a species density of at least about 10 µg / m 2 support surface, preferably from about 0.1 to about 10 µg / m 2 support surface, gives the best results.

Wenn einmal die Stammlösung oder Mischung aufgebracht worden ist und die Spezies daran gebunden ist, kann der Träger auf ähnliche Weise wie in einem "Western-Blot" behandelt werden. Diese Behandlung kann umfassen eine Folge von Behandlungs­ stufen, wozu gehören das Waschen, das Blockieren und/oder das Stabilisieren vor dem Trocknen der Membran und vor dem Ver­ packen. Bei den Waschlösungen handelt es sich im allgemeinen um entionisiertes und/oder destilliertes Wasser, das Puffer, Detergentien, bakterizide/bakteristatische Agentien und Pro­ teine, wie BSA oder BGG, enthält. Bei den Blockierungslösun­ gen handelt es sich im allgemeinen um wäßrige und/oder orga­ nische Lösungen, die verschiedene Proteine und/oder Deter­ gentien enthalten. Die Stabilisierungsverfahren können bei­ spielsweise umfassen das Eintauchen des gebundenen Trägers in Lösungen von verschiedenen Proteinen oder Fixiermitteln, wie z.B. Glutaraldehyd, oder das Sättigen des gebundenen Trägers mit diesen Lösungen oder das Lyophilisieren der Bindungs-Spezies auf dem Träger.Once the stock solution or mixture has been applied and the species is bound to it, the carrier can be treated in a similar manner as in a "Western blot". This treatment can include a series of treatments levels, which include washing, blocking and / or stabilizing before drying the membrane and before ver pack. The washing solutions are generally deionized and / or distilled water, the buffer, Detergents, Bactericidal / Bacteristatic Agents and Pro contains such as BSA or BGG. With the blocking solution gene is generally aqueous and / or orga African solutions containing various proteins and / or detectors gentia included. The stabilization process can be done at for example, immersing the bound carrier in solutions of different proteins or fixatives, such as. Glutaraldehyde, or saturating the bound  Carrier with these solutions or lyophilizing the Binding species on the support.

Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, eine Vielzahl von identischen Festphasen-Reagentien herzustellen, von de­ nen jedes das gleiche Muster der Bindungs-Spezies in den gleichen Dichten trägt zur Durchführung wiederholter Assays auf einer Vielzahl von Proben. Ein besonders nützlicher Weg, dieses Ergebnis zu erzielen, besteht darin, die Stamm­ mischungen in Form von Strahlen auf eine sich bewegende Folie bzw. Platte des Trägermaterials auszupressen unter Bildung von diskreten parallelen Linien der Bindungsbereiche. Die Folie bzw. Platte wird dann in Streifen von im wesentlichen gleicher Breite in Richtung quer zu den parallelen Linien zerschnitten.With the present invention it is possible to have a variety of identical solid phase reagents, de each have the same pattern of binding species in the same densities helps to perform repeated assays on a variety of samples. A particularly useful way To achieve this result is the trunk mixtures in the form of jets on a moving film or squeeze plate of the carrier material with formation of discrete parallel lines of the bond areas. The Film or plate is then cut into strips of essentially same width in the direction transverse to the parallel lines cut up.

Die fertigen Reagentien, die jeweils aus den Trägern bestehen, von denen jeder mit einem identischen Muster aus immobili­ sierten Bindungs-Spezies versehen ist, können als Teil eines Assay-Kits, das weitere Komponenten enthält, wie sie in Ver­ bindung mit Festphasen-Reagentien beim Analysieren von Proben verwendet werden, verpackt werden. Die Art der Komponente hängt vom Typ des gewünschten Assays, dem Assay-Verfahren und der Methode ab, mit der die Anwesenheit einer Bindung zwi­ schen Spezies auf dem Träger und der Spezies in der Probe nachgewiesen wird.The finished reagents, each consisting of the carriers, each with an identical pattern from immobili based binding species can be provided as part of a Assay kits containing other components as described in Ver Binding with solid phase reagents when analyzing samples used, packaged. The type of component depends on the type of assay desired, the assay method and the method by which the presence of a bond between species on the support and the species in the sample is proven.

Ein bevorzugtes Nachweisverfahren umfaßt die Verwendung eines Konjugats aus zwei Komponenten, nämlich (a) einem Rezeptor mit einer Affinität für die Bindungsagentien in der Probe in der an die Spezies in dem Festphasen-Träger gebundenen Form und (b) einem Markierungsmittel, das ein nachweisbares Signal ergeben kann. Bei diesen Rezeptoren handelt es sich im allge­ meinen um Antikörper, die für Antigenzentren spezifisch sind, die allen Bindungsagentien gemeinsam sind. Wenn bei­ spielsweise die Bindungsagentien selbst Antikörper eines be­ stimmten Typs sind, wie z.B. Human-IgG, kann der Rezeptor Anti-Human-IgG sein. Alternativ können auch andere Typen von Immunoglobulinen verwendet werden, wie z.B. IgM, IgA, IgE und dgl. Das Markierungsmittel kann irgendeiner der ver­ schiedenen Typen von ein Signal liefernden Spezies sein, wie sie auf dem biochemischen Gebiet allgemein bekannt sind, wie z.B. farbbildende Spezies, fluorometrische Spezies und radio­ metrische Spezies. Eine besonders vorteilhafte Form ist eine solche, in der die Markierungskomponente des Konjugats eine Komponente eines Zwei-Komponenten-Signalerzeugungssystems ist, wobei die andere Komponente in einer getrennten Lösung als Teil des Kits zugeführt wird. So kann beispielsweise die Komponente, die einen Teil des Konjugats bildet, ein Enzym sein, während die Komponente in der getrennten Lösung ein Substrat sein kann, auf welches das Enzym einwirkt. Weitere Kit-Komponenten sind im allgemeinen Blockierungsmittel und Wasch/- Verdünnungsmittel-Lösungen, die ggf. Nicht-Human-Protein ent­ halten.A preferred detection method involves the use of a Two component conjugate, namely (a) a receptor with an affinity for the binding agents in the sample the form bound to the species in the solid phase support and (b) a labeling agent that contains a detectable signal can result. These receptors are generally mean antibodies specific for antigen centers are common to all binding agents. If at for example the binding agents themselves antibodies of a be are of the right type, e.g. Human IgG, the receptor can  Be anti-human IgG. Alternatively, other types of immunoglobulins, such as e.g. IgM, IgA, IgE and the like. The labeling agent can be any of the ver different types of signaling species, such as they are well known in the biochemical field, such as e.g. color-forming species, fluorometric species and radio metric species. A particularly advantageous form is one those in which the labeling component of the conjugate has a Component of a two-component signal generation system with the other component in a separate solution is supplied as part of the kit. For example, the Component that forms part of the conjugate, an enzyme be while the component is in the separate solution Can be substrate on which the enzyme acts. Further Kit components are generally blocking agents and washing / - Diluent solutions that may contain non-human protein hold.

Nachstehend wird ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Isolie­ rung und Reinigung von AIDS-Virus-Proteinen näher beschrie­ ben, es sei jedoch darauf hingewiesen, daß die Erfindung keineswegs darauf beschränkt ist.Below is a method of isolation according to the invention Describe and purify AIDS virus proteins in more detail ben, however, it should be noted that the invention is by no means limited to this.

Beispielexample AIDS-Virus-ProteineAIDS virus proteins

AIDS-Virus-Proteine, die in den AIDS-Antikörper-Assays der­ zeit von Interesse sind, sind diejenigen mit Molekulargewichten von 160, 120, 65, 55, 41-43, 32, 24, 18 und 15 Kilodalton. Die hauptsächlichen Klassen der Trennmethoden, die für die Reinigung dieser Proteine geeignet sind, sind die Affinitäts-, Größenausschluß-, Umkehrphasen-, hydrophobe Wechsel­ wirkungs-, Ionenaustausch- und Hydroxyapatit-Chromatographie. Die Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC)-Methode führt zu einer starken Verbesserung des Auflösungsvermögens jedes Verfahrens. Die Affinitätschromatographie kann umfassen eine Reihe von Methoden, in denen immobilisierte Antikörper, Lectine, Farbstoffe oder andere Gruppen-spezifische Adsor­ bentien verwendet werden. Diese Medien können für eine oder eine Reihe von Virus-Komponenten spezifisch sein.AIDS virus proteins found in the AIDS antibody assays of of interest are those with molecular weights from 160, 120, 65, 55, 41-43, 32, 24, 18 and 15 kilodaltons. The main classes of separation methods used for the Purification of these proteins are suitable, the affinity, Size exclusion, reverse phase, hydrophobic changes effect, ion exchange and hydroxyapatite chromatography. The high performance liquid chromatography (HPLC) method performs to greatly improve the resolving power of each Procedure. Affinity chromatography can include one  Set of methods in which immobilized antibodies, Lectins, dyes, or other group-specific adsor bentien can be used. These media can be for one or a number of virus components may be specific.

Zur Vorbereitung für die Trennungen wird das Virus unter Ver­ wendung von SDS oder CHAPS durch ein Detergenz solubilisiert und mit Mercaptoethanol oder Dithiothreit reduziert. Bei der vorläufigen Chromatographie in einer Lectin-Affinitäts-Kolon­ ne werden die Glycoprotein-Komponenten der Mischung zurück­ gehalten. Während der Durchführung einer Trennung können mehr als ein Typ dieser Adsorbentien verwendet werden und der Typ des verwendeten Lectins hängt von der Spezifität und Affinität für die gewünschten Virus-Komponenten ab.To prepare for the separations, the virus is ver using SDS or CHAPS solubilized by a detergent and reduced with mercaptoethanol or dithiothreitol. In the Preliminary chromatography in a lectin affinity colon ne will return the glycoprotein components of the mixture held. While performing a separation you can more than one type of these adsorbents are used and the type of lectin used depends on the specificity and Affinity for the desired virus components.

Die nicht-zurückgehaltenen Proteine werden dann in einer Umkehrphasen-HPLC-Kolonne konzentriert, danach mit einem zu­ nehmenden Gradienten der organischen Komponente eluiert, um die restlichen Proteine abzutrennen. Bei der Kolonne kann es sich in dieser Stufe um eine Kolonne mit gebundener Phase, wie z.B. C-4-, C-1-, Phenyl- oder Cyanopropyl-Kolonne han­ deln. Die in der Lectin-Kolonne zurückgehaltenen Glycopro­ teine werden eluiert und in einer Umkehrphasen-HPLC-Kolonne konzentriert, aus der sie durch Gradientenelution abgetrennt werden. Die Umkehrphasen-Kolonne führt in jedem Falle zu einer Konzentration und weiteren Abtrennung und Entsalzung der Proteine. Nach der Umkehrphasen-Chromatographie können die Fraktionen in einem Verdampfer, beispielsweise einem Savant Speed-Vac (Handelsprodukt der Firma Savant Instruments Inc., Farmingdale, New York/USA) zur Trockne eingeengt wer­ den. Die Abtrennung kann überwacht werden durch Entnahme klei­ ner Proben aus jeder Fraktion und Untersuchen derselben un­ ter Anwendung der Western-Blot-Analyse.The non-retained proteins are then in one Reverse phase HPLC column concentrated, then with one taking gradient of the organic component eluted to separate the remaining proteins. With the column it can at this stage it is a column with a bound phase, such as. C-4, C-1, phenyl or cyanopropyl column han deln. The Glycopro retained in the lectin column lines are eluted and in a reverse phase HPLC column from which it is separated by gradient elution will. The reverse phase column leads in any case a concentration and further separation and desalination of the proteins. After reverse phase chromatography, you can the fractions in an evaporator, for example one Savant Speed-Vac (commercial product from Savant Instruments Inc., Farmingdale, New York / USA) the. The separation can be monitored by taking small pieces samples from each fraction and examine them ter using Western blot analysis.

Bei einem alternativen Verfahren kann die erste Abtrennung durch Gelpermeationschromatographie erfolgen, wodurch die Proteine mit hohem Molekulargewicht (160, 120 und 65 kDa) voneinander und von den Komponenten mit niedrigerem Molekular­ gewicht getrennt werden. Die Komponenten mit niedrigerem Molekulargewicht können dann direkt auf eine Umkehrphasen- Kolonne aufgegeben werden zur Durchführung einer gleichzei­ tigen Entsalzung und Trennung. Unvollständige Trennungen kön­ nen dann auf anderen Umkehrphasen-Kolonnen wiederholt werden.In an alternative method, the first separation by gel permeation chromatography, whereby the High molecular weight proteins (160, 120 and 65 kDa)  from each other and from the lower molecular components weight to be separated. The components with lower Molecular weight can then be directly attributed to a reverse phase Column to be abandoned to carry out a simultaneous desalination and separation. Incomplete separations can then be repeated on other reverse phase columns.

Eine dritte Alternative besteht darin, die Ionenaustausch- oder Hydroxyapatit-Chromatographie in Gegenwart von Detergen­ tien als erste Maßnahme anzuwenden, woran sich eine Umkehr­ phasen-Schlußtrennung anschließt. Die hydrophobe Wechsel­ wirkungs-Chromatographie in Gegenwart von organischen Modifi­ zierungsmitteln ist eine vierte Alternative, während die Affinitätschromatographie, in der eine Farbstoffkolonne, wie z.B. Affi-Gel Blue, verwendet wird, eine fünfte Alternative ist, an beide schließt sich die Umkehrphasen-HPLC an.A third alternative is to use ion exchange or hydroxyapatite chromatography in the presence of detergent tien as the first measure to apply, whereupon a reversal final phase separation follows. The hydrophobic change effect chromatography in the presence of organic modifi Ornaments is a fourth alternative, while the Affinity chromatography, in which a dye column, such as e.g. Affi-Gel Blue, used a fifth alternative is followed by reverse phase HPLC.

Eine vierte Alternative ist die Verwendung einer oder mehre­ rer Affinitätskolonnen mit immobilisierten Antikörpern gegen­ über einer oder mehreren der Virus-Komponenten, woran sich eine Umkehrphasen-HPLC anschließt.A fourth alternative is to use one or more rer affinity columns with immobilized antibodies against about one or more of the virus components, which is what a reverse phase HPLC follows.

Ein spezifisches Beispiel für eine AIDS-Virus-Protein-Tren­ nung, in der eine Gelpermeationsmethode angewendet wird, wird nachstehend näher beschrieben.A specific example of an AIDS virus protein tren solution in which a gel permeation method is used is described in more detail below.

1) Herstellung der Virus-Probe1) Preparation of the virus sample

Ein gereinigtes Virus wurde in einer Lösung von 2% Natrium­ dodecylsulfat und 700 mM 2-Mercaptoethanol in 60 mM TRIS-Chlo­ rid bei pH 8,0 suspendiert und zwei Minuten lang auf 100°C erhitzt. Das resultierende lysierte und solubilisierte Virus wurde dann direkt einer HPLC-Kolonne zugesetzt.A purified virus was in a solution of 2% sodium dodecyl sulfate and 700 mM 2-mercaptoethanol in 60 mM TRIS-Chlo suspended at pH 8.0 and at 100 ° C for two minutes heated. The resulting lysed and solubilized virus was then added directly to an HPLC column.

2) Größenausschluß-Chromatographie2) Size exclusion chromatography

Bei der Kolonne handelt es sich um eine Bio-Rad TSK 250- Größenausschluß-Chromatographiekolonne einer Größe von 600 mm×7,5 mm (ein Handelsprodukt der Firma Bio-Rad Labora­ tories, Inc., Richmond, Kalifornien/USA) und die Chromato­ graphie wurde durchgeführt unter Anwendung einer isokrati­ schen Elution mit einem Gemisch aus 20% Isopropanol in PBS, das 0,05% Triton X-100 enthielt. Die Strömungsrate betrug 0,75 ml/min und der Abstrom wurde bei 214 nm überwacht. Die Fraktionen mit einem Volumen von 0,5 ml wurden unter Verwen­ dung eines automatischen Fraktionssammlers gesammelt und die organische Komponente wurde in einem Speed-Vac-Verdampfer entfernt. Das Eluat wurde mittels des Western-Blot überwacht, um die Abtrennung der Virus-Proteine sicherzustellen.The column is a Bio-Rad TSK 250- Size exclusion chromatography column of size  600 mm × 7.5 mm (a commercial product from Bio-Rad Labora tories, Inc., Richmond, California / USA) and Chromato graphic was performed using an isocrat elution with a mixture of 20% isopropanol in PBS, containing 0.05% Triton X-100. The flow rate was 0.75 ml / min and the outflow was monitored at 214 nm. The Fractions with a volume of 0.5 ml were used automatic fraction collector and the organic component was in a speed vac evaporator away. The eluate was monitored by means of the Western blot, to ensure the separation of the virus proteins.

Die Virus-Proteine mit dem höchsten Molekulargewicht (160, 120 und 65 kd) wurden einzeln mittels dieser Trennung iso­ liert, während die übrigen Proteine in Form von Mischungen eluiert wurden (65 und 55 kDa; 55 und 41-43, 30 und 24 kDa; und 24 und 18 kDa). Die Einzelkomponenten-Fraktionen (160, 120 und 65 kd) wurden in einer Umkehrphasen-Kolonne (C-8, 4,6 mm×40 mm) entsalzen und das Lösungsmittel wurde ver­ dampft, wobei das reine Protein zurückblieb. Die Proteine aus den Multikomponenten-Fraktionen wurden wie in den nach­ stehenden Abschnitten beschrieben isoliert.The virus proteins with the highest molecular weight (160, 120 and 65 kd) were isolated individually by means of this separation, while the other proteins were eluted in the form of mixtures (65 and 55 kDa; 55 and 41-43, 30 and 24 kDa ; and 24 and 18 kDa). The single component fractions ( 160 , 120 and 65 kd) were desalted in a reverse phase column (C-8, 4.6 mm × 40 mm) and the solvent was evaporated to leave the pure protein. The proteins from the multicomponent fractions were isolated as described in the sections below.

3) Umkehrphasen-hydrophobe Wechselwirkungs-Chromatographie3) Reverse phase hydrophobic interaction chromatography

Die Fraktionen, die ein Protein mit 24 kd enthielten, wurden auf einer Bio-Rad TSK Phenyl-5PW-Kolonne (7,5 mm×125 mm) fraktioniert, um dieses Protein selektiv zu entfernen. Es wurde ein linearer Gradient von 100% Lösungsmittel A (0,1% ige wäßrige Trifluoroessigsäure) bis 100% Lösungsmittel B (0,1%-ige Trifluoroessigsäure in Acetonitril, enthaltend 10% Isopropanol) innerhalb von 30 Minuten durchlaufen gelas­ sen. Das Protein p24 passierte die Kolonne zuerst, während die anderen Proteine anschließend in Form einer Mischung elu­ iert wurden. Die Mischung wurde durch Umkehrphasen-Chromato­ graphie unter Verwendung einer C-4-Kolonne weiter fraktioniert. Die Phenyl-5PW-Kolonne konnte auch als hydrophobe Wechsel­ wirkungs-Kolonne unter Anwendung eines Umkehrsalz­ gradienten in Gegenwart von 20% Isopropanol verwendet werden, wobei ähnliche Ergebnisse erzielt wurden.The fractions containing a 24 kd protein were on a Bio-Rad TSK Phenyl-5PW column (7.5 mm × 125 mm) fractionated to selectively remove this protein. It a linear gradient of 100% solvent A (0.1% aqueous trifluoroacetic acid) to 100% solvent B (Containing 0.1% trifluoroacetic acid in acetonitrile 10% isopropanol) pass through within 30 minutes sen. The p24 protein passed the column first while the other proteins then in the form of a mixture elu ized. The mixture was purified by reverse phase chromatography graphed further using a C-4 column.  The phenyl 5PW column was also able to switch as a hydrophobic action column using a reverse salt gradients are used in the presence of 20% isopropanol, with similar results.

4) Weitere Umkehrphasen-Chromatographie4) Further reverse phase chromatography

Die Proteinmischungen aus der im obigen Abschnitt 2 be­ schriebenen Gelfiltrations-Kolonne wurden weiter fraktio­ niert auf einer Bio-Rad Hi-Pore RP304-Kolonne. Vor der Fraktionierung wurden die Proben in einem Speed-Vac- Verdampfer eingedampft, um die organische Komponente zu entfernen, dann wurden sie direkt in die Kolonne einge­ spritzt. Es wurde ein linearer Gradient von dem Puffer A (0,1%ige wäßrige Heptafluorbuttersäure) bis zum Puffer B (0,1%ige Heptafluorbuttersäure in Acetonitril) über einen Zeitraum von 60 Minuten, nachdem anfänglich 15 Mi­ nuten lang 100% Puffer A durchlaufen gelassen worden waren, in einer Strömungsrate von 1 ml/min durchlaufen ge­ lassen, während das Eluat bei 214 nm überwacht wurde. Es wurden Fraktionen in 0,5 ml-Intervallen gesammelt und durch Western-Blot-Analyse überwacht. Alle restlichen Protein­ mischungen wurden nach dieser Methode in Einzelkomponenten aufgetrennt.The protein mixtures from the gel filtration column described in section 2 above were further fractionated on a Bio-Rad Hi-Pore RP304 column. Before fractionation, the samples were evaporated in a Speed Vac evaporator to remove the organic component, then they were injected directly into the column. A linear gradient was made from Buffer A (0.1% aqueous heptafluorobutyric acid) to Buffer B (0.1% heptafluorobutyric acid in acetonitrile) over a period of 60 minutes after initially running 100% Buffer A for 15 minutes was run at a flow rate of 1 ml / min while monitoring the eluate at 214 nm. Fractions were collected at 0.5 ml intervals and monitored by Western blot analysis. All remaining protein mixtures were separated into individual components using this method.

Die Erfindung wurde zwar vorstehend näher erläutert, es ist jedoch für den Fachmann klar, daß sie darauf keineswegs beschränkt ist, sondern daß zahlreiche zusätzliche Modifi­ kationen, Abänderungen und Substitutionen durchgeführt werden können, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird.The invention was explained in more detail above, it is however, it is clear to the person skilled in the art that they are in no way concerned is limited, but that numerous additional Modifi cations, changes and substitutions can be without the scope of the present Invention is left.

Claims (22)

1. Verfahren zur Herstellung eines Festphasen-Reagens für einen biochemischen Bindungs-Assay, bei dem eine Probe auf die Anwesenheit einer Vielzahl von vorher festgelegten Bindungsagentien analysiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen umfaßt:
  • a) Isolieren einer Vielzahl von biochemischen Spezies, die jeweils eine Affinität für eines der Bindungsagen­ tien aufweisen, aus einem biologischen Quellen-Gemisch,
  • b) Verdünnen jeder der isolierten Spezies in einer ge­ trennten Trägerflüssigkeit unter Bildung einer getrenn­ ten Flüssigkeitsmischung aus jeder der Spezies in einer vorher festgelegten Konzentration und
  • c) Aufbringen einer vorher festgelegten Menge jeder der Flüssigkeitsmischungen auf einen vorher festgelegten Bereich auf einem Festphasen-Träger, um die Spezies in einem vorgegebenen Muster darauf zu immobilisieren.
1. A method of preparing a solid phase reagent for a biochemical binding assay, in which a sample is analyzed for the presence of a plurality of predetermined binding agents, characterized in that it comprises the following steps:
  • a) isolating a large number of biochemical species, each having an affinity for one of the binding agents, from a biological source mixture,
  • b) diluting each of the isolated species in a separated carrier liquid to form a separate liquid mixture of each of the species in a predetermined concentration and
  • c) applying a predetermined amount of each of the liquid mixtures to a predetermined area on a solid phase support to immobilize the species thereon in a predetermined pattern.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem biologischen Quellen-Gemisch um einen Vertreter aus der Gruppe der Virus- und Zellenlysate und Kombinationen davon handelt. 2. The method according to claim 1, characterized in that the biological source mixture is one Representatives from the group of virus and cell lysates and Combinations of them.   3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die biochemischen Spezies ausgewählt werden aus der Gruppe der Peptide, Polypeptide, Proteine und Kombinationen davon.3. The method according to claim 1 or 2, characterized indicates that the biochemical species are selected from the group of peptides, polypeptides, proteins and Combinations of these. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den biochemischen Spezies um Virus-Antigene handelt.4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized characterized that it is in the biochemical species are virus antigens. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt die Herstellung einer Viel­ zahl der Festphasen-Reagentien durch gleichmäßiges Auf­ bringen der Flüssigkeitsmischungen in der Stufe (c) auf jeweils eine Vielzahl der Festphasen-Träger.5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that it comprises the preparation of a large number of the solid-phase reagents by uniformly bringing the liquid mixtures in step ( c ) onto a plurality of the solid-phase carriers. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe (c) umfaßt das Aufbringen kontinuierlicher Ströme jeder der Flüssigkeitsmischungen in paralle­ len Linien entlang einer Platte aus dem Festphasen-Träger und anschließendes Auftrennen der Platte in Streifen quer zu den parallelen Linien.6. The method according to claim 5, characterized in that step ( c ) comprises applying continuous streams of each of the liquid mixtures in parallel lines along a plate from the solid phase support and then separating the plate into strips transverse to the parallel lines. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die kontinuierlichen Ströme Strahlen darstellen, die aus unter Druck stehenden Düsen austreten.7. The method according to claim 6, characterized in that that the continuous streams represent rays that emerge from pressurized nozzles. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe (c) umfaßt das kovalente Binden der Spezies an den Festphasen-Träger.8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that step ( c ) comprises the covalent binding of the species to the solid phase support. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe (c) umfaßt das Aufbringen der Flüssigkeitsmischungen bis zu einer Speziesdichte von mindestens etwa 10 µg/m2 Oberfläche des Festphasen-Trägers.9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that step ( c ) comprises applying the liquid mixtures up to a species density of at least about 10 µg / m 2 surface of the solid phase carrier. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe (c) umfaßt das Aufbringen der Flüssigkeitsmischungen bis zu einer Speziesdichte von etwa 0,1 bis etwa 10 µg/m2 Oberfläche des Festphasen- Trägers.10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that step ( c ) comprises applying the liquid mixtures up to a species density of about 0.1 to about 10 µg / m 2 surface of the solid phase carrier. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägerflüssigkeiten in der Stufe (b) Pufferlösungen verwendet werden.11. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that buffer solutions are used as carrier liquids in step ( b ). 12. Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von Fest­ phasen-Reagentien zum Analysieren jeder einer Vielzahl von biologischen Proben zur Bestimmung der Anwesenheit einer Vielzahl von vorher ausgewählten Bindungsagentien, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen umfaßt:
  • a) individuelles Isolieren einer Vielzahl von biochemischen Spezies, die jeweils eine Affinität für eines der Bin­ dungsagentien haben, aus einem biologischen Quellen­ gemisch,
  • b) Verdünnen jeder der isolierten Spezies in einer Puffer­ lösung unter Bildung einer Vielzahl von Stammischungen, die jeweils eine der isolierten Spezies in einer Konzen­ tration in dem Bereich von etwa 0,01 bis etwa 10 µg/ml enthalten,
  • c) Auspressen der Stammischungen in Form von Strahlen auf eine Festphasen-Trägerplatte, die sich in Relation dazu bewegt, um die isolierten Spezies in Form von diskreten parallelen Linien in vorgegebenen Dichten in dem Bereich von etwa 0,1 bis etwa 10 µg/ml daran zu binden,
  • d) Blockieren der ungebundenen Bereiche des Festphasen- Trägers, um eine nicht-spezifische Bindung im wesentli­ chen zu verhindern, und
  • e) Zerschneiden der Platte zu Streifen mit einer im wesent­ lichen gleichen Breite quer zu den parallelen Linien.
12. A method of making a variety of solid phase reagents for analyzing each of a variety of biological samples to determine the presence of a variety of preselected binding agents, characterized in that it comprises the following steps:
  • a) individually isolating a large number of biochemical species, each having an affinity for one of the binding agents, from a biological source mixture,
  • b) diluting each of the isolated species in a buffer solution to form a variety of masterbatches, each containing one of the isolated species in a concentration ranging from about 0.01 to about 10 µg / ml,
  • c) Squeezing the masterbatches in the form of jets onto a solid phase support plate which moves in relation to it around the isolated species in the form of discrete parallel lines at predetermined densities in the range from about 0.1 to about 10 µg / ml thereon to bind
  • d) blocking the unbound areas of the solid phase support to substantially prevent non-specific binding, and
  • e) Cutting the plate into strips with a substantially same width across the parallel lines.
13. Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von Fest­ phasen-Reagentien für die Verwendung bei der Analyse jeweils einer Vielzahl von biologischen Proben zur Bestimmung von Antikörpern mit einer Affinität für vorher festgelegte Antigene eines Virus, der in einer Wirtszelle vorliegt, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen um­ faßt:
  • a) Lysieren der Wirtszelle und des Virus unter Bildung eines Lysats,
  • b) individuelles Isolieren der vorher festgelegten Antigene aus dem Lysat,
  • c) Verdünnen der isolierten Antigene in Pufferlösungen unter Bildung einer Vielzahl von Stammlösungen, von denen jede eines der isolierten Antigene in einer vorgegebenen Konzentration enthält,
  • d) Aufbringen vorher festgelegter Mengen derStammlösungen auf vorher festgelegte Bereiche auf einem Festphasen- Träger, um die Antigene darin in vorgegebenen Dichten in einem vorgegebenen Raummuster an den Träger zu binden und
  • e) Blockieren der ungebundenen Bereiche auf dem Träger, um eine nicht-spezifische Bindung im wesentlichen zu verhindern.
13. A method for producing a plurality of solid phase reagents for use in the analysis of a plurality of biological samples for the determination of antibodies with an affinity for predetermined antigens of a virus which is present in a host cell, characterized in that it the following stages:
  • a) lysing the host cell and the virus to form a lysate,
  • b) individual isolation of the predetermined antigens from the lysate,
  • c) diluting the isolated antigens in buffer solutions to form a large number of stock solutions, each of which contains one of the isolated antigens in a predetermined concentration,
  • d) applying predetermined amounts of the stock solutions to predetermined areas on a solid phase support in order to bind the antigens therein in predetermined densities in a predetermined spatial pattern and
  • e) blocking the unbound areas on the support to substantially prevent non-specific binding.
14. Festphasen-Reagens für einen biochemischen Bindungs- Assay, gekennzeichnet durch eine Vielzahl von biochemischen Bindungsspezies, die an einen Festphasen-Träger in diskre­ ten Bereichen desselben in vorher festgelegten Dichten gebunden sind, wie es nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 erhältlich ist.14. Solid phase reagent for a biochemical binding Assay characterized by a variety of biochemical Binding species attached to a solid phase support in discre areas of the same in predetermined densities are bound as it is according to the method according to one of the Claims 1 to 13 is available. 15. Assay-Kit, gekennzeichnet durch eine Vielzahl von Festphasen-Reagentien, wie sie nach dem Verfahren nach An­ spruch 12 erhältlich sind, die jeweils umfassen eine Viel­ zahl von biochemischen Bindungsspezies, die an einen Fest­ phasen-Träger in diskreten Bereichen in vorher festgelegten Dichten gebunden sind. 15. Assay kit, characterized by a variety of Solid phase reagents, as described by the method according to An Proverb 12 are available, each comprising a lot number of biochemical binding species involved in a festival phase carriers in discrete areas in predetermined areas Densities are bound.   16. Assay-Kit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem umfaßt ein Konjugat aus (a) einem Rezeptor mit einer Affinität für alle Bindungsagentien und (b) einem Markierungsmittel, das ein nachweisbares Signal abgeben kann.16. Assay kit according to claim 15, characterized in that that it also comprises a conjugate of (a) a receptor with an affinity for all binding agents and (b) one Marking agent that emit a detectable signal can. 17. Assay-Kit nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Markierungsmittel um eine Komponente eines Zwei-Komponenten-Signalerzeugungssystems handelt und daß das Assay-Kit außerdem die restliche Komponente des Zwei-Komponenten-Signalerzeugungssystems umfaßt.17. Assay kit according to claim 16, characterized in that that the marker is a component a two-component signal generation system that the assay kit also contains the remaining component of the Two component signal generation system. 18. Assay-Kit, gekennzeichnet durch eine Vielzahl von nach dem Verfahren gemäß Anspruch 13 erhältlichen Fest­ phasen-Reagentien, die jeweils umfassen eine Vielzahl von Virus-Antigenen, die an einen Festphasen-Träger in dis­ kreten Bereichen in vorher festgelegten Dichten gebunden sind.18. Assay kit characterized by a variety of Fest obtainable by the method of claim 13 phase reagents, each comprising a variety of Virus antigens attached to a solid phase support in dis cret areas are bound in predetermined densities. 19. Assay-Kit nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem umfaßt ein Konjugat aus (a) einem Rezeptor mit einer Affinität für Antikörper gegenüber den Virus- Antigenen und (b) einem Markierungsmittel, das ein nach­ weisbares Signal abgeben kann.19. Assay kit according to claim 18, characterized in that that it also comprises a conjugate of (a) a receptor with an affinity for antibodies to the virus Antigens and (b) a marker that is an after can give a signal that can be indicated. 20. Assay-Kit nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Rezeptor um Anti-Human-IgG handelt.20. Assay kit according to claim 19, characterized in that that the receptor is anti-human IgG. 21. Assay-Kit nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es sich bei dem Markierungsmittel um eine Komponente eines Zwei-Komponenten-Signalerzeugungssystems handelt und daß das Assay-Kit außerdem eine Lösung der restlichen Komponente des Zwei-Komponenten-Signalerzeugungs­ systems umfaßt.21. Assay kit according to claim 19 or 20, characterized records that the marker is a Component of a two-component signal generation system and that the assay kit is also a solution of remaining component of the two-component signal generation systems includes. 22. Assay-Kit nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Rezeptor um Anti- Human-IgG handelt und daß es sich bei dem Markierungs­ mittel um eine Komponente eines Zwei-Komponenten-Signal­ erzeugungssystems handelt und daß das Assay-Kit außerdem eine Lösung der restlichen Komponente des Zwei-Komponenten- Signalerzeugungssystems sowie eine ein Nicht-Human-Protein enthaltende Waschlösung umfaßt.22. Assay kit according to one of claims 19 to 21, characterized  characterized in that the receptor is anti Human IgG and that the label medium around a component of a two-component signal generation system and that the assay kit also a solution to the remaining component of the two-component Signal generation system as well as a non-human protein containing washing solution.
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