DE3710633A1 - Recombinant DNA for the repressible and inducible expression of foreign genes - Google Patents

Recombinant DNA for the repressible and inducible expression of foreign genes

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Abstract

A recombinant DNA which contains the consensus sequence <IMAGE> and a promoter which has the DNA sequence GGN10GC, where the consensus sequence is preferably located 15 to 150 base pairs upstream of the transcription start of a gene which is expressed under the control of the promoter, and the promoter is located between the consensus sequence and the trascription start, makes inducible and repressible expression of a foreign gene possible.

Description

Die Erfindung betrifft rekombinante DNA und Expressions­ vektoren, Verfahren zur Herstellung solcher rekombinanter DNA und Expressionsvektoren sowie deren Verwendung zur induzierbaren und reprimierbaren Expression eines Fremdgens.The invention relates to recombinant DNA and expressions vectors, methods of producing such recombinant DNA and expression vectors and their use for inducible and repressible expression of a Foreign gene.

Ein wichtiges Ziel der angewandten Gentechnologie ist die Proteinproduktion aus rekombinanter DNA. Dazu wird eine besondere Klasse von Vektoren, die sogenannten Expressionsvektoren, benötigt. Diese besitzen nicht nur die strukturellen Voraussetzungen für die Klonierung, den Transfer und die Vermehrung der rekombinanten DNA, sondern auch für die Expression in ein Protein. Hierzu benötigen diese rekombinanten DNA-Moleküle spezielle Regulationssequenzen, sogenannte Promotoren, welche die Transkription der DNA-Sequenz in RNA bewirken, deren Translation durch die Ribosomen zum fertigen Protein führt.An important goal of applied genetic engineering is protein production from recombinant DNA. This will a special class of vectors, the so-called Expression vectors. They don't just own the structural requirements for cloning, the transfer and reproduction of the recombinant DNA, but also for expression in a protein. For this these recombinant DNA molecules require special Regulatory sequences, so-called promoters, which the Transcription of the DNA sequence into RNA, whose Translation through the ribosomes to the finished protein leads.

Als Promotoren werden DNA-Regionen bezeichnet, an die bakterielle RNA-Polymerase zur Transkription eines oder mehrerer Gene binden muß. Viele solche Promotoren haben strukturelle Gemeinsamkeiten, deren Bedeutung u. a. in der Interaktion mit bestimmten Proteinen vermutet wird. Durch solche Interaktionen mit zellulären Proteinen oder anderen Molekülen kann eine Repression, jedoch auch eine Induktion der Aktivität eines Promotors bewirkt werden. Ein Beispiel dafür ist beispielsweise die Interaktion des Lamda-Promotors P₁ mit dem Lamda- Repressor cI.DNA regions are referred to as promoters to which bacterial RNA polymerase for the transcription of one or bind several genes. Many have such promoters structural similarities, their meaning u. a. in interaction with certain proteins is suspected. Through such interactions with cellular proteins or other molecules can cause repression, however also an induction of the activity of a promoter be effected. An example of this is, for example the interaction of the Lamda promoter P 1 with the Lamda Repressor cI.

Bei der gentechnologischen Produktion von Proteinen ist es von besonderem Vorteil, wenn ein in einem Expressions­ vektor vorhandener Promotor durch Vorhandensein oder Zugabe von Repressor oder Induktor reguliert werden kann. Bisher ist es jedoch nur durch Zugabe von Induktor oder durch Verwendung von temperatursensitiven Mikro­ organismen und einer genau eingehaltenen Temperaturver­ änderung möglich, eine solche Repression oder Induktion zu bewirken. Die verwendeten Induktoren sind meist sehr teuer und die angewandten Verfahren zur Induktion oder Repression kompliziert und nur bedingt zur Regulation der Expression eines Proteins geeignet. Es ist daher Aufgabe dieser Erfindung, rekombinante DNA und Expressions­ vektoren bereitzustellen, die auf möglichst einfache Art und Weise eine Regulation der Expression eines gewünschten Genprodukts ermöglichen.In the genetic engineering of proteins It is particularly beneficial if one is in an expression vector present promoter by presence or Addition of repressor or inductor can be regulated can. So far, however, it has only been through the addition of inductor or by using temperature sensitive micro organisms and a precisely maintained temperature Change possible, such repression or induction to effect. The inductors used are mostly very expensive and the methods used for induction or Repression complicated and only conditionally for regulation suitable for the expression of a protein. It is therefore Object of this invention, recombinant DNA and expressions to provide vectors that are as simple as possible Way a regulation of the expression of a enable desired gene product.

Gelöst wird diese Aufgabe durch rekombinante DNA, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie die Consensus-SequenzThis task is solved by recombinant DNA, which is characterized in that it is the consensus sequence

und einen Promotor, der die DNA-Sequenz GGN₁₀GC aufweist, enthält.and a promoter which has the DNA sequence GGN₁₀GC, contains.

Durch das Vorhandensein dieser DNA-Consensus-Sequenz wird bewirkt, daß ein dahinterliegender Promotor, der die DNA-Sequenz GGN₁₀GC aufweist, durch Sauerstoff reprimiert, dagegen durch Formiat unter anaeroben Bedingungen induziert wird. By the presence of this DNA consensus sequence causes a promoter behind it, the has the DNA sequence GGN₁₀GC, by oxygen repressed, however by formate under anaerobic Conditions is induced.  

Bevorzugt befindet sich diese DNA-Consensus-Sequenz 15 bis 150 Basenpaare upstream (d. h. auf der 5′-Seite) vom Transkriptionsstart eines unter der Kontrolle des Promotors exprimierten Gens, wobei sich der Promotor zwischen der Consensus-Sequenz und dem Transkriptionsstart befindet. Besonders bevorzugt liegt die Consensus-Sequenz 80 bis 130 Basenpaare vor dem Transkriptionsstart.This DNA consensus sequence 15 is preferably located up to 150 base pairs upstream (i.e. on the 5′-side) from Start of transcription under the control of Promotors expressed gene, the promoter between the consensus sequence and the start of transcription located. The consensus sequence is particularly preferred 80 to 130 base pairs before the start of transcription.

Als Promotoren geeignet sind der fdhF-Promotor, ein Promotor einer für die Hydrogenaseexpression essentiellen Transkriptionseinheit oder essentielle Strukturelemente der ntr-A-abhängigen Promotoren, soweit sie die obenge­ nannte DNA-Sequenz enthalten. Bevorzugt wird der fdhF- Promotor verwendet.The fdhF promoter, a, are suitable as promoters Promoter of one essential for the expression of hydrogenase Transcription unit or essential structural elements the ntr-A-dependent promoters, insofar as they meet the above contain named DNA sequence. The fdhF- Promoter used.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Expressions­ vektor, der die erfindungsgemäße rekombinante DNA einligiert in einen geeigneten Vektor enthält. Als Vektoren können hierbei üblicherweise verwendete Vektoren wie z. B. pBR322 oder pUC-Vektoren verwendet werden. Zusätzlich kann ein erfindungsgemäßer Expressionsvektor hinter dem Promotor einen Polylinker enthalten, der das Einsetzen eines beliebigen Fremdgens durch das Vorhanden­ sein von mehreren Restriktionsschnittstellen erleichtert.Another object of the invention is an expression vector representing the recombinant DNA according to the invention included in a suitable vector. As Vectors can be commonly used vectors such as B. pBR322 or pUC vectors can be used. In addition, an expression vector according to the invention contain a polylinker behind the promoter Insertion of any foreign gene by the presence be relieved by several restriction interfaces.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist das Plasmid pBN80, DSM 4073P am 31.03.1987 bei DSM hinterlegt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es den upstream-Bereich des fdhF-Gens ab -240 Basenpaare vor dem Transkriptions­ start, enthält. In diesem upstream-Bereich des fdhF- Gens ist sowohl die obengenannte DNA-Consensus-Sequenz, sowie der fdhF-Promotor, der die DNA-Sequenz GGN₁₀GC aufweist, enthalten. Dieses Plasmid zeigt durch O₂ reprimierbare und durch Formiat unter anaeroben Bedin­ gungen induzierbare Tetrazyklinresistenz. Es ist jedoch auch weiterhin möglich, durch Spaltung mit geeigneten Restriktionsnukleasen und Ligieren ein weiteres Fremdgen in dieses Plasmid zu insertieren und dessen Expression auf die obengenannte Weise zu steuern.Another object of the invention is the plasmid pBN80, DSM 4073P deposited on March 31, 1987 at DSM, the is characterized in that it is the upstream area of the fdhF gene from -240 base pairs before transcription start, contains. In this upstream area of the fdhF Gene is both the DNA consensus sequence above, and the fdhF promoter, the DNA sequence GGN₁₀GC has included. This plasmid shows by O₂ repressible and through formate under anaerobic conditions inducible tetracycline resistance. However, it is still possible through division  with suitable restriction nucleases and ligating insert another foreign gene into this plasmid and to control its expression in the manner mentioned above.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfah­ ren zur Herstellung der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine die Consensus-Sequenz enthaltende DNA-Sequenz aus einer Genbank eines Mikroorganismus, der ein Gen enthält, das durch O₂ reprimierbar und unter anaeroben Bedingungen durch Formiat induzierbar ist, nach bekannten Methoden identifiziert, isoliert und mit einem geeigneten Promotor verbindet.Another object of the invention is a method ren for the production of the recombinant according to the invention DNA, which is characterized by the fact that one DNA sequence containing consensus sequence from a Genebank of a microorganism that contains a gene that repressible by O₂ and under anaerobic conditions can be induced by formate, according to known methods identified, isolated and with a suitable promoter connects.

Zur Identifikation dieser DNA-Sequenz kann z. B. eine Hybridisierung oder Kopplung an ein Indikatorgen und Überprüfen der Expression unter aeroben und anaeroben Bedingungen, durchgeführt werden.To identify this DNA sequence z. Legs Hybridization or coupling to an indicator gene and Check expression under aerobic and anaerobic Conditions.

Bevorzugt wird die DNA-Sequenz aus E. coli, DSM 2093, DSM 2102 oder Salmonella typhimurium, DSM 544, isoliert. Analog zu diesem Verfahren zur Herstellung einer rekom­ binanten DNA kann man auch anstelle eines DNA-Fragments, welches nur die Consensus-Sequenz enthält, die gesamte upstream-Region eines durch Formiat induzierbaren und durch O₂ reprimierbaren Gens, das sowohl die Consensus- Sequenz als auch einen Promotor enthält, der wiederum die DNA-Sequenz GGN₁₀GC enthält, isolieren. Bevorzugt geschieht dies, indem man die upstream-Region des fdhF-Gens oder einer für die Hydrogenaseexpression essentiellen Transkriptionseinheit isoliert.The DNA sequence from E. coli, DSM 2093, is preferred. DSM 2102 or Salmonella typhimurium, DSM 544, isolated. Analogous to this process for producing a recom binary DNA can also be used instead of a DNA fragment, which contains only the consensus sequence, the whole upstream region of a formate inducible and by O₂ repressible gene that both the consensus Sequence also contains a promoter, which in turn the DNA sequence GGN₁₀GC contains isolate. Prefers this is done by looking at the upstream region of the fdhF gene or one for hydrogenase expression essential transcription unit isolated.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Expressionsvek­ tors, der die erfindungsgemäße rekombinante DNA enthält, wobei man die wie oben isolierte rekombinante DNA-Se­ quenz, die die Consensus-Sequenz, verbunden mit einem geeigneten Promotor, oder die upstream-Region eines durch Formiat induzierbaren und durch O₂ reprimierbaren Gens, welche sowohl die Consensus-Sequenz als auch einen Promotor enthält, gegebenenfalls zusätzlich mit einem Polylinker in einen geeigneten Vektor insertiert. Als Vektoren kommen hierbei die obengenannten Vektoren, aber auch alle übrigen zur Expression von Fremgenen geeigneten Vektoren in Frage.Another object of the invention is a method for the production of an expression vector according to the invention tors which contains the recombinant DNA according to the invention,  wherein the recombinant DNA Se isolated as above which is the consensus sequence associated with a suitable promoter, or the upstream region of a by formate inducible and repressible by O₂ Gene, which is both the consensus sequence as well contains a promoter, optionally with a polylinker inserted into a suitable vector. The vectors mentioned here come as vectors, but also all others for the expression of foreign genes suitable vectors in question.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des Plas­ mids pBN80, DSM 4073P bei DSM hinterlegt am 31.03.1987, ist dadurch gekennzeichnet, daß man die upstream-Region des fdhF-Gens ab -240 bp vor dem Transkriptionsstart in den mit PstI und BglII geschnittenen Vektor pGA46, DSM 4068P bei DSM hinterlegt am 27.03.1987, insertiert.The process according to the invention for producing the plasma mids pBN80, DSM 4073P deposited at DSM on March 31, 1987, is characterized by the upstream region of the fdhF gene from -240 bp before the start of transcription in the vector pGA46, DSM cut with PstI and BglII 4068P deposited with DSM on 03/27/1987, inserted.

Die erfindungsgemäße Verwendung einer rekombinanten DNA oder eines Expressionsvektors, wie sie oben beschrieben sind, zur induzierbaren und reprimierbaren Expression eines Fremdgens, ist dadurch gekennzeichnet, daß die Induktion unter anaeroben Bedingungen durch Formiat, die Repression durch O₂ bewirkt wird.The use of a recombinant DNA according to the invention or an expression vector as described above are for inducible and repressible expression of a foreign gene is characterized in that the Induction under anaerobic conditions by formate, the repression is caused by O₂.

Die Expression kann hierbei in einem dafür geeigneten Mikroorganismus der Gattung Enterobacteriacease, bevor­ zugt in E. coli oder Salmonella typhimurium durchgeführt werden.The expression can be in a suitable Microorganism of the genus Enterobacteriacease before performed in E. coli or Salmonella typhimurium will.

Durch erfindungsgemäße rekombinante DNA und Expres­ sionsvektoren ist es auf einfache Art und Weise möglich, die Expression eines Fremdgens zu regulieren. So wird beispielsweise in der aeroben frühen Wachstums­ phase des verwendeten Mikroorganismus eine möglicher­ weise störende Expression des Fremdgens unterdrückt. Beim Übergang in die späte logarithmische, anaerobe Wachstumsphase wird die Expression dann durch vom Mikroorganismus gebildetes Formiat induziert und durch Zugabe von Formiat ins Wachstumsmedium der Mikroorganismen eine Verstärkung der Expression erreicht. Auf diese Art und Weise kann vermieden werden, daß Zugabe von Induktor Zellen in unterschiedlichen Stadien der Wachstumsphase zur Expression des Fremdgens anregt, was ein weiteres Wachstum eventuell verhindern kann und auf die Zelle selbst negative Auswirkungen haben könnte. In der anaeroben späten logerithmischen Wachstumsphase sind die Zellen bereits hochgewachsen und haben eine opti­ male Dichte erreicht. Dabei tritt automatisch eine Sauerstofflimitierung ein, die fermentationstechnisch noch verstärkt oder reguliert werden kann. Durch die hohe Zelldichte der Mikroorganismen kann eine optimale Expressioon des Fremdgens erreicht werden.By recombinant DNA and expresses according to the invention sions vectors it is simple possible to regulate the expression of a foreign gene. For example, in aerobic early growth phase of the microorganism used a possible wise disruptive expression of the foreign gene suppressed. At the transition to the late logarithmic, anaerobic Expression phase is then by the growth phase  Formate induced and produced by microorganism Adding formate to the growth medium of the Microorganisms increase expression reached. This way you can avoid be that adding inductor cells in different stages of the growth phase Expression of the foreign gene stimulates what is another May prevent growth and on the cell itself could have negative effects. In the are anaerobic late logerithmic growth phase the cells have already grown up and are opti male density reached. This automatically occurs Oxygen limitation, the fermentation technology can still be strengthened or regulated. Through the high cell density of the microorganisms can be optimal Expression of the foreign gene can be achieved.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Expressionsvekto­ ren zur Produktion von Proteinen von hohem Interesse stellt daher eine kostengünstige und einfache Möglich­ keit zur Regulation dar, da teure und komplizierte In­ duktion (Induktorzugabe, Temperaturshift usw.) nicht mehr notwendig ist. Erfindungsgemäße Expressionsvek­ toren haben auf Grund dieser Eigenschaften erhebliche Vorteile gegenüber den bisherigen Systemen.The use of the expression vector according to the invention for the production of proteins of high interest therefore represents an inexpensive and easy way regulation because expensive and complicated In production (inductor addition, temperature shift, etc.) not is more necessary. Expression vector according to the invention Due to these properties, gates have considerable Advantages over the previous systems.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern.The following examples are intended to further illustrate the invention explain.

Beispiel 1Example 1 Konstruktion von fdhF-lac-Z-FusionsplasmidenConstruction of fdhF-lac-Z fusion plasmids

Das AatII-Fragment (ungefähr 1,5 kb) des Plasmids pBN2, DSM 4072P am 27.03.1987 bei DSM hinterlegt, einem fdhF- lac-Z-Fusionsplasmid (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, (1986) 4650-4654), wurde durch präpa­ rative Agarose-Gelelektrophorese isoliert und unterschied­ lich lange mit 0,2 U/µg DNA Bal31 Exonuclease bei 20°C inkubiert. Nach dem Auffüllen der überhängenden 5′-Enden mit DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) wurden die Fragmente mit EcoRI-Linkern (dGGAATTCC) ligiert und nachfolgend mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und BamHI verdaut. Durch präparative Agarose-Gelelektrophorese wurde das Fragmentgemisch aufgetrennt und drei Größen­ fraktionen (Vergleich mit Restriktionsfragmenten bekannter Größe als Längenmarker) wurden aus dem Gel eluiert. Diese Fragmente wurden in die Multilinkerstelle des Plasmids pMC1403, DSM 4067P am 27.03.1987 bei DSM hinterlegt, kloniert. Als Rezipient wurde hierbei E. coli FM 911, DSM 4066P (MC 4100, fdhF, rec A56, lac-), am 27.03.1987 bei DSM hinterlegt, verwendet. Hieraus ergaben sich Klone, die von der 5"-Seite der upstream-Region her verkürzt waren. In einem zweiten Schritt wurde der kürzeste Klon, pBN208, DSM 4069P am 27.03.1987 bei DSM hinterlegt, isoliert, durch Ver­ dauung mit EcoRI linearisiert und mit 0,1 U/µg DNA Bal31 bei 20°C inkubiert. Nach Auffüllen der überhän­ genden 5′-Enden wurden wieder EcoRI-Linker anligiert und in der Folge wurde die DNA mit EcoRI und ClaI ge­ schnitten. Es ergab sich eine Serie von Fragmenten, die in den EcoRI/ClaI-verdauten Vektor pMC1403, DSM 4067P am 27.03.1987 bei DSM hinterlegt, zurückkloniert wurden. Die erhaltenen Plasmide wurden erneut in den E.coli- Stamm FM 911, transformiert. Die beiden Klone, pBN210, DSM 4070P am 27.03.1987 bei DSM hinterlegt, und PBN211, DSM 4071P am 27.03.1987 bei DSM hinterlegt, wurden isoliert.The AatII fragment (approximately 1.5 kb) of plasmid pBN2, DSM 4072P was deposited on March 27, 1987 with DSM, an fdhF-lac-Z fusion plasmid (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, (1986) 4650- 4654), was isolated by preparative agarose gel electrophoresis and incubated for different times with 0.2 U / µg DNA Bal31 exonuclease at 20 ° C. After filling in the overhanging 5 'ends with DNA polymerase (Klenow fragment), the fragments were ligated with EcoRI linkers (dGGAATTCC) and subsequently digested with the restriction endonucleases EcoRI and BamHI. The fragment mixture was separated by preparative agarose gel electrophoresis and three size fractions (comparison with restriction fragments of known size as length markers) were eluted from the gel. These fragments were deposited into the multilinker site of the plasmid pMC1403, DSM 4067P on March 27, 1987 at DSM. E. coli FM 911, DSM 4066P (MC 4100, fdhF, rec A56, lac - ), deposited with DSM on March 27, 1987, was used as recipient. This resulted in clones that were shortened from the 5 "side of the upstream region. In a second step, the shortest clone, pBN208, DSM 4069P, was deposited with DSM on March 27, 1987, isolated, linearized by digest with EcoRI and incubated with 0.1 U / µg DNA Bal31 at 20 ° C. After filling in the overhanging 5'-ends, EcoRI linkers were ligated again and the DNA was subsequently cut with EcoRI and ClaI Fragments which were cloned back into the EcoRI / ClaI digested vector pMC1403, DSM 4067P at DSM on March 27, 1987. The plasmids obtained were transformed again into the E. coli strain FM 911. The two clones, pBN210, DSM 4070P deposited with DSM on March 27, 1987, and PBN211, DSM 4071P deposited with DSM on March 27, 1987, were isolated.

Die Transformation der Plasmide pBN2, pBN208, pBN210, pBN211, pMC1403 in den Stamm FM911 (MC4100, fdhF, rec A56) wurde im wesentlichen nach der von Cohen et al. beschriebenen Methode (Cohen et al. (1977), PNAS 69: 2110-2114) durchgeführt:
Früh logarithmische Zellen werden nach Abkühlung auf 0°C geerntet und anschließend einer Behandlung mit eiskaltem CaCl₂ (50 mM) unterzogen. Die Zugabe der DNS erfolgt bei 0°C und nach einer Inkubation von 45 Minuten bei 0°C wird ein Hitzeschock (4 Minuten, 43°C) durchgeführt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur werden die Zellen in Vollmedium bei 37°C 1 Stunde zur phänotypischen Expression inkubiert. Die Selektion nach Ampicillinresistenz bei den Plasmiden pBN2, pBN208, pBN210, pBN211, pMC1403, erfolgt auf Platten mit 100 µg/ml Ampicillin.The transformation of the plasmids pBN2, pBN208, pBN210, pBN211, pMC1403 into the strain FM911 (MC4100, fdhF, rec A56) was carried out essentially according to the method described by Cohen et al. described method (Cohen et al. (1977), PNAS 69: 2110-2114):
Early logarithmic cells are harvested after cooling to 0 ° C and then subjected to treatment with ice-cold CaCl₂ (50 mM). The DNA is added at 0 ° C. and after an incubation of 45 minutes at 0 ° C., a heat shock (4 minutes, 43 ° C.) is carried out. After cooling to room temperature, the cells are incubated in full medium at 37 ° C. for 1 hour for phenotypic expression. The selection for ampicillin resistance in the plasmids pBN2, pBN208, pBN210, pBN211, pMC1403 is carried out on plates with 100 µg / ml ampicillin.

Die genauen Verbindungspunkte von Vektor mit dem fdhF- DNA-Fragment, d. h. die Position der EcoRI-Linker wurde durch DNA-Sequenzierung nach der Methode von Maxam und Gilbert, Methods of Enzymology 65, 499-560 (1980) durchgeführt.The exact connection points of vector with the fdhF DNA fragment, i.e. H. the position of the EcoRI linker was by DNA sequencing using the Maxam and Gilbert, Methods of Enzymology 65, 499-560 (1980) carried out.

In der Fig. 1 ist die Nucleotidsequenz des fdhF-Gens, einschließlich des 5′ upstream-Bereichs gezeigt. ATG bezeichnet den Start der Translation Aus der Figur kann man die verbleibende Sequenz des fdhF-Bereichs für die Plasmide pBN208, pBN210 und pBN211 entnehmen.In Fig. 1, the nucleotide sequence of the fdhF gene, including the 5 'upstream region is shown. ATG denotes the start of translation. The figure shows the remaining sequence of the fdhF region for the plasmids pBN208, pBN210 and pBN211.

Beispiel 2Example 2 Vergleich der β-Galactosidase-Expression der Plasmide pBN208, pBN210 und pBN211Comparison of the β- galactosidase expression of the plasmids pBN208, pBN210 and pBN211

Die wie in Beispiel 1 dargestellt, erhaltenen fdhF-LacZ- Fusionsplasmide wurden unter anaeroben und aeroben Wachstumsbedingungen auf Expression von β-Galacto­ sidaseaktivität untersucht. Die β-Galactosidaseaktivität wurde nach J. H. Miller, Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1972) festgestellt und die spezifische Aktivität errechnet. Das Ergebnis ist in Fig. 2 dargestellt. In Fig. 2A sind die Ergebnisse der Expression unter anaeroben Bedingungen, im Teil B unter aeroben Wachstumsbedingungen gezeigt. Auf der Abszisse ist die Lokation der Deletion, das bedeutet die Position des Eco-Linkers vor dem Translationsstart (Position +1), angegeben. Eco-Linker bei -240 entspricht dem Plasmid pBN208, bei -184 dem Plasmid pBN210 und bei -143 dem Plasmid pBN211. Nitrat wurde in einer Menge von 10 mmol und Formiat mit einer Endkonzentration von 30 mmol zugegeben.The fdhF-LacZ fusion plasmids obtained as shown in Example 1 were examined under anaerobic and aerobic growth conditions for expression of β- galactosidase activity. The β- galactosidase activity was determined according to JH Miller, Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1972) and the specific activity was calculated. The result is shown in Fig. 2. The results of the expression under anaerobic conditions are shown in FIG. 2A, in part B under aerobic growth conditions. The location of the deletion, ie the position of the eco-linker before the translation start (position +1), is shown on the abscissa. Eco-Linker at -240 corresponds to plasmid pBN208, at -184 to plasmid pBN210 and at -143 to plasmid pBN211. Nitrate was added in an amount of 10 mmol and formate at a final concentration of 30 mmol.

Beispiel 3Example 3 Herstellung des Plasmids pBN80, DSM 4073P am 27.03.1987 bei DSM hinterlegt.Preparation of plasmid pBN80, DSM 4073P on March 27, 1987 deposited with DSM.

Das 1,11 Kb BamHI/PstI Fragment des Plasmids pBN208 wurde durch präparative Gelelektrophorese isoliert und anschließend in den, mit den Restriktionsendonukleasen PstI und BglIII gespaltenen Vektor pGA46, DSM 4068P am 27.03.1987 bei DSM hinterlegt, kloniert. In rekombinan­ ten Plasmiden wird dadurch das β-Laktamasegen rekonsti­ tuiert. Das ligierte Plasmid pBN80, DSM 4073P am 31.03.1987 bei DSM hinterlegt, wurde, wie im Beispiel 1 für die Plasmide pBN2, pBN208, pBN210, pBN211 und pMC1403, beschrieben, in E. coli FM911 transformiert. Die Selektion nach Transformanten mit rekombinanten Plasmiden erfolgte daher nach Chloramphenicolresistenz (30 µg/ml) und Ampicillinresistenz (100 µg/ml). Die erhaltenen Klone wurden auf ihre Tetrazyklin-Resistenz unter aeroben und anaeroben Bedingungen untersucht. Auf Platten mit phosphatgepuffertem (ph 7) Vollmedium (mit 0,8% Glukose) sind die Klone unter aeroben Bedingungen Tetrazyklin-sensitiv. Unter anaeroben Bedingungen ist die Tetrazyklin-Resistenz exprimiert und wird mit Formiat (30 mM) induziert. Unter anaeroben Bedingungen in Gegenwart von 50 mM Nitrat sind die Klone dagegen Tetrazyklin-sensitiv.The 1.11 Kb BamHI / PstI fragment of the plasmid pBN208 was isolated by preparative gel electrophoresis and then cloned into the vector pGA46, DSM 4068P, which was cleaved with the restriction endonucleases PstI and BglIII, deposited on March 27, 1987 at DSM. As a result, the β- lactamase gene is reconstituted in recombinant plasmids. The ligated plasmid pBN80, DSM 4073P deposited on March 31, 1987 at DSM, was transformed into E. coli FM911 as described in example 1 for the plasmids pBN2, pBN208, pBN210, pBN211 and pMC1403. The selection for transformants with recombinant plasmids was therefore based on chloramphenicol resistance (30 µg / ml) and ampicillin resistance (100 µg / ml). The clones obtained were examined for their tetracycline resistance under aerobic and anaerobic conditions. The clones are sensitive to tetracycline under aerobic conditions on plates with phosphate-buffered (pH 7) complete medium (with 0.8% glucose). Under anaerobic conditions, tetracycline resistance is expressed and induced with formate (30 mM). The clones, however, are sensitive to tetracycline under anaerobic conditions in the presence of 50 mM nitrate.

Claims (18)

1. Rekombinante DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Consensus-Sequenz und einen Promotor, der die DNA-Sequenz GGN₁₀GC aufweist, enthält.1. Recombinant DNA, characterized in that it has the consensus sequence and a promoter having the DNA sequence GGN₁₀GC contains. 2. Rekombinante DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichent, daß sich die Consensus-Sequenz 15 bis 150 Basenpaare upstream vom Transkriptionsstart eines unter der Kontrolle des Promotors exprimierten Gens und der Promotor zwischen der Consensus-Se­ quenz und dem Transkriptionsstart befindet.2. Recombinant DNA according to claim 1, characterized by that the consensus sequence 15 to 150 Base pairs upstream from the start of transcription expressed under the control of the promoter Gens and the promoter between the Consensus-Se quenz and the start of transcription. 3. Rekombinante DNA nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Consensus-Sequenz 80 bis 130 bp vor dem Transkriptionsstart befindet.3. Recombinant DNA according to claim 2, characterized, that the consensus sequence is 80 to 130 bp the start of transcription. 4. Rekombinante DNA nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichent, daß sie den Promotor einer für die Hydrogenase- Expression essentiellen Transkriptionseinheit oder den fdhF-Promotor enthält.4. Recombinant DNA according to claim 1 to 3, characterized by that they are the promoter for the hydrogenase Expression essential transcription unit or contains the fdhF promoter. 5. Rekombinante DNA nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie essentielle Strukturelemente der ntrA- abhängigen Promotoren enthält. 5. Recombinant DNA according to claim 1 to 3, characterized, that they are essential structural elements of the ntrA dependent promoters contains.   6. Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine rekombinante DNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 einligiert in einen geeigneten Vektor enthält.6. Expression vector, thereby characterized that he was a recombinant DNA according to claims 1 to 5 included in a suitable vector. 7. Expressionsvektor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich einen Polylinker zum Einsetzen eines Fremdgens enthält.7. expression vector according to claim 6, characterized, that he also has a polylinker for insertion contains a foreign gene. 8. Plasmid pBN80, DSM 4073P, dadurch gekennzeichnet, daß es den upstream-Bereich des fdhF-Gens von -240 bp bis zum Transkriptionsstart einschließlich des fdhF-Pro­ motors enthält.8. Plasmid pBN80, DSM 4073P, thereby characterized that it is the upstream range of the fdhF gene from -240 bp to Start of transcription including the fdhF-Pro motors contains. 9. Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten DNA nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine die Consensus-Sequenz enthaltende DNA-Sequenz aus einer Genbank eines Mikroorganismus, der ein Gen enthält, das durch O₂ reprimierbar und unter anaeroben Bedingungen durch Formiat induzierbar ist, nach bekannten Methoden identifiziert, isoliert und mit einem geeigneten Promotor ver­ bindet.9. Process for the production of a recombinant DNA according to claim 1 to 5, characterized characterized that one the DNA sequence containing the consensus sequence a gene bank of a microorganism that contains a gene contains that can be repressed by O₂ and under anaerobic conditions inducible by formate is identified by known methods, isolated and ver with a suitable promoter binds. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die DNA-Sequenz aus der Genbank eines Mikroorganismus aus der Gruppe der Enterobacteriacease isoliert.10. The method according to claim 9, characterized characterized that one the DNA sequence from the gene bank of a microorganism isolated from the group of Enterobacteriacease. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die DNA-Sequenz aus E. coli, DSM 2092 oder 2102, oder Salmonella thyphimurium, DSM 554, isoliert. 11. The method according to claim 10, characterized characterized that one the DNA sequence from E. coli, DSM 2092 or 2102, or Salmonella thyphimurium, DSM 554, isolated.   12. Verfahren nach Anspruch 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, 12. man die gesamte upstream-Region eines durch Formiat induzierbaren und durch O₂ reprimierbaren Gens, welche sowohl die Consensus-Sequenz als auch einen Promotor enthält, isoliert.12. The method according to claim 9 to 11, characterized, 12. One through the entire upstream region Formate inducible and repressible by O₂ Gene, which is both the consensus sequence as well contains a promoter isolated. 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die upstream-Region des fdhF-Gens isoliert.13. The method according to claim 12, characterized characterized that one the isolated upstream region of the fdhF gene. 14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die upstream-Region des Promotors einer für die Hydroge­ nase-Expression essentiellen Transkriptionseinheit isoliert.14. The method according to claim 12, characterized characterized that one the promoter one upstream region for the hydroge nase expression essential transcription unit isolated. 15. Verfahren nach Anspruch 9 bis 14 zur Herstellung eines Expressionsvektors nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichent, daß man die isolierte rekombinante DNA-Sequenz, welche die Consensus-Sequenz und den Promotor ent­ hält, gegebenenfalls mit einem Polylinker in einen geeigneten Vektor insertiert.15. The method according to claim 9 to 14 for the production an expression vector according to claim 6 or 7, characterized by that the isolated recombinant DNA sequence, which ent the consensus sequence and the promoter holds, if necessary with a polylinker in one appropriate vector inserted. 16. Verfahren nach Anspruch 13 zur Herstellung des Plasmids pBN80, DSM 4073P, nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die upstream-Region des fdhF-Gens von -240 bp bis zum Transkriptionsstart in den mit PstI und BglII geschnittenen Vektor pGA46, DSM 4068P, ligiert. 16. The method according to claim 13 for producing the Plasmids pBN80, DSM 4073P, according to claim 8, characterized, that the upstream region of the fdhF gene from -240 bp until the start of transcription in the PstI and BglII cut vector pGA46, DSM 4068P, ligated.   17. Verwendung einer rekombinanten DNA nach Anspruch 1 bis 5 und 8 oder eines Expressionsvektors nach Anspruch 6 und 7 zur induzierbaren und reprimier­ baren Expression eines Fremdgens, dadurch gekennzeichnet, daß die Induktion unter anaeroben Bedingungen durch Formiat, die Repression durch O₂ bewirkt wird.17. Use of a recombinant DNA according to claim 1 to 5 and 8 or an expression vector Claims 6 and 7 for inducible and reprimier expression of a foreign gene, characterized, that induction under anaerobic conditions by formate, which causes repression by O₂ becomes. 18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Ex­ pression in E. coli oder Salmonella typhimurium, durchgeführt wird.18. Use according to claim 17, characterized characterized that the Ex pression in E. coli or Salmonella typhimurium, is carried out.
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