DE3631016C2 - - Google Patents

Info

Publication number
DE3631016C2
DE3631016C2 DE19863631016 DE3631016A DE3631016C2 DE 3631016 C2 DE3631016 C2 DE 3631016C2 DE 19863631016 DE19863631016 DE 19863631016 DE 3631016 A DE3631016 A DE 3631016A DE 3631016 C2 DE3631016 C2 DE 3631016C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
htlv
viruses
cells
antibodies
cell line
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
DE19863631016
Other languages
German (de)
Other versions
DE3631016A1 (en
Inventor
Andreas Dr. Immelmann
Karsten Dr. 4006 Erkrath De Henco
Hagen Von 6242 Kronberg De Briesen
Ulrich Dr. 4006 Erkrath De Aldag
Walter B. Prof. Dr. Rondebosch Za Becker
Helga Dr. 6232 Bad Soden De Ruebsamen-Waigmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
DIAGEN INSTITUT FUER MOLEKULARBIOLOGISCHE DIAGNOST
Original Assignee
CHEMOTHERAPEUTISCHES FORSCHUNGSINSTITUT GEORG-SPEYER-HAUS ZU FRANKFURT AM MAIN - STIFTUNG DES BUERGERLICHEN RECHTS - 6000 FRANKFURT DE
Diagen Institut fur Molekularbiologische Diagnostik 4000 Duesseldorf De GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CHEMOTHERAPEUTISCHES FORSCHUNGSINSTITUT GEORG-SPEYER-HAUS ZU FRANKFURT AM MAIN - STIFTUNG DES BUERGERLICHEN RECHTS - 6000 FRANKFURT DE, Diagen Institut fur Molekularbiologische Diagnostik 4000 Duesseldorf De GmbH filed Critical CHEMOTHERAPEUTISCHES FORSCHUNGSINSTITUT GEORG-SPEYER-HAUS ZU FRANKFURT AM MAIN - STIFTUNG DES BUERGERLICHEN RECHTS - 6000 FRANKFURT DE
Priority to DE19863631016 priority Critical patent/DE3631016A1/en
Priority to EP87113240A priority patent/EP0260599A3/en
Publication of DE3631016A1 publication Critical patent/DE3631016A1/en
Application granted granted Critical
Publication of DE3631016C2 publication Critical patent/DE3631016C2/de
Granted legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G01N33/521—Single-layer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G01N33/567—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds utilising isolate of tissue or organ as binding agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen T-lymphotrope Viren. Dabei wird eine zu untersuchende Probe mit einer humanen Zellinie umgesetzt, die mit T-lymphotropen Viren infiziert ist. Die anschließende Markierung der viralen Antigene geschieht mit Hilfe eines zweiten gegen menschliche Antikörper gerichteten Antikörpers oder Antikörperfragments, die einen Marker tragen.The present invention relates to a method for the detection of antibodies against T-lymphotropic Viruses. One becomes too investigating sample implemented with a human cell line, which is infected with T-lymphotropic viruses. The subsequent labeling of the viral antigens happens with the help of a second against human Antibody-directed antibody or antibody fragment, that carry a marker.

T-lymphotrope Viren sind Erreger schwerwiegender Erkrankungen des Immunsystems. So wurde als Erreger der erworbenen Immunschwäche Aids (Acquired immune deficiency syndrome), das zur Gruppe der Retroviren gehörende HTLV-III-Virus (human T-lymphotropic virus-III) identifiziert, das synonym auch LAV (Lymphadenopathie Virus) und neuerdings HIV (human immunopathic virus) bezeichnet wird. Dieser Virustyp infiziert im Patienten die T4-Helferzellen, die eine wichtige Untergruppe der Tl-Lymphozyten darstellen. AIDS ist eine sich in fast allen Erdteilen epidemisch ausbreitende Erkrankung.T-lymphotropic viruses are more serious Immune system disorders. So it was as a pathogen the acquired immune deficiency Aids (Acquired immune deficiency syndrome), which belongs to the group of retroviruses belonging to HTLV-III virus (human T-lymphotropic virus-III) identified, the synonym also LAV (lymphadenopathy Virus) and recently HIV (human immunopathic virus). This type of virus infects in the patient the T4 helper cells, the one represent an important subset of Tl lymphocytes. AIDS is becoming epidemic in almost all parts of the world spreading disease.

Neben der vorwiegend durch Kontakte verschiedenster infektiöser Körperflüssigkeiten mit Blut übertragenen HTLV-III-Infektion deutet sich weltweit eine weitere Virusepidemie an, die in Afrika und den Mittelmeerländern bereits erhebliche Verbreitung gefunden hat. Es handelt sich hierbei um eine Infektion mit HTLV-I-Viren, die beim Erwachsenen eine Form der T-Zelleukämie induzieren können. Charakteristisch für diese Infektion ist ihre Verbreitung über Blutkontakte, die der des AIDS-Virus entspricht. Häufig wird eine Koinfektion mit beiden Virustypen beobach­ tet. Die Inkubationszeit von HTLV-I induzierten Leukämien beträgt zwischen 5 und 30 Jahren. So wird die epidemiologische Bedeutung dieser Infektion zum gegenwärtigen Zeitpunkt stark unterschätzt.In addition to the most diverse contacts infectious body fluids with blood transmitted HTLV-III infection suggests another worldwide Virus epidemic in Africa and the Mediterranean countries already found considerable distribution Has. This is an infection with HTLV-I viruses, which are a form of Can induce T cell leukemia. Characteristic for this infection, its spread is via blood contacts, which corresponds to that of the AIDS virus. Often co-infection with both virus types is observed  tet. The incubation period of HTLV-I induced leukemia is between 5 and 30 years. So it will epidemiological relevance of this infection to the present Time greatly underestimated.

Zunächst schien die Immunschwäche AIDS auf bestimmte Risikogruppen beschränkt zu sein. Die starke Verbreitung der Immunschwäche innerhalb dieser Risikogruppen legte es schon recht früh nahe, daß die Erkrankung durch einen infektiösen Faktor übertragen wurde. Es gelang, das HTLV-III-Virus als infektiösen Faktor zu identifizieren und zu charakterisieren.At first the AIDS immunodeficiency seemed certain Risk groups to be limited. The wide spread the immunodeficiency within these risk groups suggested early on that the disease transmitted by an infectious factor has been. It managed to identify the HTLV-III virus as infectious Identify and characterize the factor.

Im Zuge der intensiven Erforschung der Erkrankung wurde von Gallo et al. in den Publikationen des US-Department of Commerce, Springfield, National Technical Information Service (NIH) Nr. SN6-602,945 und SN6-602,946 eine Methode zur Produktion von AIDS-Viren und eine Methode zur Bestimmung von anti-AIDS-Antikörpern im Serum von AIDS-Kranken bzw. von Patienten, die an Lymphadenopathie litten, beschrieben. Die Lymphadenopathie ist eine Erkrankung, die allgemein der Immunschwäche AIDS vorausgeht.In the course of intensive research into the disease was developed by Gallo et al. in the publications of the US Department of Commerce, Springfield, National Technical Information Service (NIH) No. SN6-602,945 and SN6-602,946 a method for the production of AIDS viruses and a method for the determination of anti-AIDS antibodies in the serum of AIDS patients or patients, who suffered from lymphadenopathy. Lymphadenopathy is a disease that generally precedes the immune deficiency AIDS.

Eine von einem erwachsenen Patienten, der an einer lymphatischen Leukämie litt, isolierte neoplastische aneuploide T-Zellinie wurde mit HTLV-III-Viren infiziert. Die Zellinie wurde als H9/HTLV-IIIB bei der American Type Culture Collection (ATCC, CRL 8543) hinterlegt. Diese permissive Zellinie wurde zur Produktion und Isolierung von HTLV-III-Viren eingesetzt. Weiterhin konnte man mit Hilfe der transformierten Zellen, die für HTLV-III-Viren spezifische Oberflächenantigene exprimieren, anti-AIDS-Antikörper im Serum vom Patienten oder Probanden nachweisen. In SN6-602,945 wird ein analytisches Verfahren beschrieben, in dem zunächst aus mit HTLV-III infizierten Zellen gewonnene virusspezifische Antigene isoliert und mit dem zu untersuchenden Serum umgesetzt werden. Eventuell im Probandenserum vorhandene anti-AIDS-Virus-Antikörper werden mittels eines Radioimmunoassays oder der Western Blot-Methode nachgewiesen. Ebenfalls in SN6-602,945 wird eine Bestimmung von anti-AIDS-Antikörpern im Probandenserum mittels ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) und gereinigten HTLV-III-Viren beschrieben. Außerdem wird dort ein Verfahren offenbart, in dem mit HTLV-III-Viren infizierte T-Zellen direkt mit den Probandenseren umgesetzt und die eventuell an der T-Zelloberfläche adsorbierten Antikörper durch fluoreszenzmarkierte sekundäre Antikörper nachgewiesen werden. Als Screening-Test ist üblicherweise der ELISA in der Anwendung. Die anderen Methoden sind sehr aufwendig und erfordern technisch versiertes Perso­ nal.A neoplastic aneuploid T cell line isolated from an adult patient with lymphoblastic leukemia was infected with HTLV-III viruses. The cell line was deposited as H9 / HTLV-III B with the American Type Culture Collection (ATCC, CRL 8543). This permissive cell line was used for the production and isolation of HTLV-III viruses. Furthermore, with the help of the transformed cells, which express surface antigens specific for HTLV-III viruses, anti-AIDS antibodies could be detected in the serum of the patient or test persons. SN6-602,945 describes an analytical method in which virus-specific antigens obtained from cells infected with HTLV-III are first isolated and reacted with the serum to be examined. Any anti-AIDS virus antibodies present in the test person's serum are detected by means of a radioimmunoassay or the Western blot method. SN6-602,945 also describes a determination of anti-AIDS antibodies in the test person's serum by means of ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) and purified HTLV-III viruses. In addition, a method is disclosed therein in which T cells infected with HTLV-III viruses are reacted directly with the subject sera and the antibodies which are possibly adsorbed on the T cell surface are detected by fluorescence-labeled secondary antibodies. The ELISA is usually used as a screening test. The other methods are very complex and require technically experienced personnel.

Die permissive Zellinie H9 zeichnet sich durch eine hohe virusspezifische Antigenexpression aus. Fast jede Zelle wird infiziert und kann mit eventuell im Serum vorhandenen anti-AIDS-Antikörpern reagieren. Die letzte Eigenschaft der H9-Linie kann jedoch Ursache von möglichen Fehlinterpretationen sein. Wird HTLV-III spezifisches Antigen auf der Oberfläche jeder Zelle angeboten, bei gleichzeitig niedrigem anti-AIDS-Antikörpertiter im Probandenserum, so werden die Antikörper auf zu viele H9-Zellen verteilt (verdünnt), als daß man sie durch Markierung mit Sekundär-Antikörpern mit hinreichender Genauigkeit nachweisen könnte. Ein Signal, das auf das Vorhandensein von anti-AIDS-Virus-Antikörpern hinweist, kann im schwach fluoreszierenden Hintergrund unter­ gehen. The permissive cell line H9 is characterized by a high virus-specific antigen expression. Nearly every cell is infected and can possibly Anti-AIDS antibodies present in serum react. However, the last feature of the H9 line can cause it of possible misinterpretations. Becomes HTLV-III specific antigen on the surface offered to every cell, at the same time low anti-AIDS antibody titer in the subject's serum, so be the antibodies are distributed to too many H9 cells (diluted) than that by marking it with Secondary antibodies with sufficient accuracy could prove. A signal that indicates the presence of anti-AIDS virus antibodies can be found in the low fluorescent background go.  

Als weiterer Nachteil der intensiven Antigenexpression der H9-Zellinie tritt ein anderes Phänomen in Erscheinung.Another disadvantage of intensive antigen expression another phenomenon occurs in the H9 cell line Appearance.

Enthält das Probandenserum beispielsweise Auto-Antikörper gegen Membran- oder Zellstrukturen wie anti-HLA(Human Leucocyte Antigen)-Antikörper oder anti-mitochondriale Antikörper, wie sie bei rheumatischen Krankheitsbildern vorkommen, werden die Oberflächen der H9-Zellen mit diesen Antikörpern belegt. Der Sekundär-Antikörper markiert dann die an die Zelle adsorbierten Immunkomplexe und täuscht somit eine AIDS-positive Reaktion vor. Daher müssen sämtliche Untersuchungen, die nach diesem Stand der Technik durchgeführt werden, jeweils mit nicht-infizierten H9-Zellen kontrolliert werden. Die kostenintensiven und zeitraubenden Verfahrensschritte machen die bekannten Verfahren unattraktiv für Screening-Programme zur Untersuchung auf T-lymphotrope Viren in Körperflüssigkeiten. Ein gravierender Nachteil der beschriebenen Testkonfigurationen besteht darin, daß sie eine hohe Vorverdünnung der Serumproben erfordern, um unspezifische Reaktionen zu unterdrücken. Patientenseren mit niedrigem Antikörpertiter können durch diese Vorbehandlung bis unter die Nachweisgrenze verdünnt werden.Does the subject's serum contain auto-antibodies, for example? against membrane or cell structures such as anti-HLA (Human Leucocyte antigen) antibody or anti-mitochondrial Antibodies such as those used in rheumatic Diseases occur, the surfaces of the H9 cells with these antibodies. The Secondary antibody then labels the to the cell adsorbed immune complexes and thus deceives one AIDS positive response. So everyone has to Studies based on this state of the art be performed, each with non-infected H9 cells are controlled. The costly and time-consuming process steps make the known Procedure unattractive for screening programs for testing for T-lymphotropic viruses in Body fluids. A serious disadvantage of test configurations described is that they require a high predilution of the serum samples, to suppress non-specific reactions. Patient sera with low antibody titers can through this pretreatment to below the detection limit be diluted.

Es ist weiterhin wünschenswert, in ein und demselben Verfahren festzustellen, ob eine zu untersuchende Serumprobe anti-HTLV-I- und/oder anti-HTLV-III-Antikörper enthält. Mit den bisher verwandten H9-Zellen kann diese Parallelbestimmung nicht durchgeführt werden.It is also desirable to be in one and the same Procedure to determine whether a test Serum sample anti-HTLV-I and / or anti-HTLV-III antibodies contains. With the previously used H9 cells cannot carry out this parallel determination will.

Ein entscheidender Nachteil der bisher bekannten Verfahren besteht darin, daß bei der Herstellung der Reagentien und Materialien für den Antikörpernach­ weis mit hoch infektiösen Substanzen hantiert werden muß. Das infektiöse Potential von Virus-infizierten Zellkulturen ist um ein Vielfaches höher als das von Seren, die von mit HTLV-III-Virus infizierten Patienten stammen, deren Virustiter im Serum außerordentlich klein sind.A decisive disadvantage of the previously known The method is that in the manufacture of the Antibodies and materials for the antibody  can be handled with highly infectious substances got to. The infectious potential of virus-infected Cell cultures are many times higher than that of Sera from patients infected with HTLV-III virus originate, whose virus titer in the serum is extraordinary are small.

Die Fähigkeit der Viren, ihre antigenen Strukturen spontan oder induziert zu variieren, wirft ein weiteres gravierendes Problem auf. Somit ist es möglich, daß Varianten einer pathogenen Virusart, die zwar mit den bekannten und charakterisierten Virusisolaten nicht oder nur schwach immunologisch kreuzreagieren, jedoch dieselben oder ähnliche Symptome wie die des Stammvirus verursachen, mit etablierten Nachweisverfahren nicht erfaßt werden. So sind beispielweise bereits T-lymphotrope Viren bekannt, die ursächlich mit Erkrankungen wie AIDS, ARC (Aids related complex) oder Lymphadenopathie korrelieren, nämlich die Varianten LAV-2 und HTLV-IV des HTLV-III/LAV-1- Virus. Antikörper gegen diese Varianten zeigen nur schwache oder keine immunologische Reaktionen mit den bekannten und charakterisierten Virusisolaten des HTLV-III/LAV-1-Virus.The ability of viruses to protect their antigenic structures to vary spontaneously or induced throws another serious problem. So it is possible that variants of a pathogenic virus type, the with the known and characterized virus isolates not cross-reacting or only weakly immunologically, however, the same or similar symptoms like that of the stem virus, with established ones Verification procedures cannot be recorded. For example already known T-lymphotropic viruses that causally with diseases such as AIDS, ARC (Aids related complex) or correlate lymphadenopathy, namely the variants LAV-2 and HTLV-IV of the HTLV-III / LAV-1- Virus. Antibodies against these variants show weak or no immunological reactions with the known and characterized virus isolates of the HTLV-III / LAV-1 virus.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein leistungsfähiges Diagnoseverfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen T-lymphotrope Viren in zu untersuchenden Proben bereitzustellen, womit entscheidende Vorteile gegenüber den bekannten Verfahren erzielt werden, wie beispielsweiseThe object of the present invention is to be a powerful Diagnostic procedures for detection of antibodies against T-lymphotropic viruses to be examined Provide samples, with decisive advantages compared to the known methods, like for example

  • - die Detektion niedriger Antikörper-Konzentrationen in Probenseren durch den Einsatz unverdünnter oder schwach verdünnter Proben,- the detection of low antibody concentrations in sample sera through the use of undiluted or slightly diluted samples,
  • - die Detektion niedriger Antikörper-Konzentrationen durch Verwendung von Zellen als internem Standard, die keine virale Antigene in meßbaren Mengen präsen­ tieren,- the detection of low antibody concentrations  by using cells as an internal standard, that do not present viral antigens in measurable amounts animals,
  • - die Konzentrierung geringer Antikörper-Konzentrationen auf wenigen infizierten Zellen,- the concentration of low antibody concentrations on a few infected cells,
  • - die weitestgehende Unterdrückung von Immunreaktionen mit intrazellulären Proteinen und Zellstrukturen. Derartige Antikörper werden häufig bei Autoimmunkrankheiten, z. B. im rheumatischen Umfeld beob­ achtet.- the suppression of immune reactions as far as possible with intracellular proteins and cell structures. Such antibodies are often used in autoimmune diseases, e.g. B. in the rheumatic environment respect.
  • - Ausschluß eines falsch positiven Signals aufgrund von in der Probe vorhandenen HLA-Antikörpern bzw. Autoantikörper gegen äußere Membranstrukturen,- Exclusion of a false positive signal due to HLA antibodies present in the sample or Autoantibodies against external membrane structures,
  • - das Arbeiten mit nicht infektiösem Material,- working with non-infectious material,
  • - die hohe Standardisierung und Konfektionierung der Untersuchungsverfahren,- The high standardization and packaging of the Examination procedure,
  • - die Möglichkeit der simultanen Bestimmung von Antikörpern gegen HTLV-I- und/oder HTLV-III-Viren in einer zu untersuchenden Probe und- The possibility of the simultaneous determination of antibodies against HTLV-I and / or HTLV-III viruses in a sample to be examined and
  • - der Nachweis von solchen T-lymphotropen Viren, die Varianten der bekannten HTLV-III-Viren sind, welche mit bekannten und charakterisierten Virusisolaten wie HTLV-III/LAV-1 nicht oder nur schwach immunologisch kreuzreagieren, aber ursächlich mit den Erkrankungen AIDS, ARC (aids related complex) oder Lymphadenopathie korrelieren, wie z. B. die Varianten LAV-2 oder HTLV-IV.- the detection of such T-lymphotropic viruses that Variants of the known HTLV-III viruses are which with known and characterized virus isolates like HTLV-III / LAV-1 not or only weakly immunologically cross-react, but causally with the diseases AIDS, ARC (aids related complex) or lymphadenopathy correlate, e.g. B. the variants LAV-2 or HTLV-IV.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen T-lymphotrope Viren durch Umsetzung der zu untersuchenden Probe mit einer humanen Zellinie, die mit T-lymphotropen Viren infiziert ist, und anschließenden Markierung mit Hilfe eines zweiten gegen menschliche Antikörper gerichteten Antikörpers oder Antikörperfragmente, welche einen Marker tragen. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß eine Zellinie ver­ wendet wird, von der nur ein Teil der Zellen nach der Infektion mit T-lymphotropen Viren detektierbar virale Antigene exprimiert und bei der die negativ reagierenden Zellen als interner Standard verwendet werden.According to the invention the object is achieved by a Method for the detection of antibodies against T-lymphotropic Viruses by implementing the ones to be examined Sample with a human cell line with T-lymphotropic Virus is infected, and then flagged with the help of a second against human Antibody-directed antibody or antibody fragments, which carry a marker. The procedure is characterized in that a cell line ver  only part of the cells are turned over infection with T-lymphotropic viruses is detectable viral antigens expressed and in which the negative reacting cells used as an internal standard will.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht auf einfache Weise auch den diagnostischen Nachweis von Antikörpern gegen T-lymphotrope Viren, die aufgrund der ungewöhnlich starken Varianz der T-lymphotropen Viren, beispielsweise HTLV-III/LAV-1, mit den bekannten und charakterisierten Virusantigenen keine oder nur schwache immunologische Reaktionen zeigen. Es müssen dazu beispielsweise lediglich Virusisolate aus Blutzellen von Patienten, die mit den bisher nicht bekannten T-lymphotropen Viren infiziert sind und Symptome von AIDS, ARC (Aids related complex) oder Lymphadenopathie zeigen, zur Infektion der erfindungsgemäß verwendbaren Zellinien benutzt werden. Antikörper gegen T-lymphotrope Viren wie LAV-2-Viren und HTLV-IV-Viren können auf diese Weise diagnostiziert werden.The method according to the invention enables simple Way also the diagnostic evidence of Antibodies to T-lymphotropic viruses due to the unusually strong variance of the T-lymphotropic Viruses, for example HTLV-III / LAV-1, with the known and did not characterize virus antigens or show only weak immunological reactions. All that is required, for example, is virus isolates from blood cells from patients with the previous unknown T-lymphotropic viruses are infected and symptoms of AIDS, ARC (Aids related complex) or show lymphadenopathy for infection of the invention usable cell lines can be used. Antibodies against T-lymphotropic viruses such as LAV-2 viruses and HTLV-IV viruses can be diagnosed in this way will.

Als Zellinien gemäß der Erfindung werden bevorzugt HUT 78 (ATCC TIB 161) und 191 TJ (ECACC 86090501) verwendet. Auch HUT 102 (ATCC, TIB 162) kann verwendet werden.Preferred cell lines according to the invention are HUT 78 (ATCC TIB 161) and 191 TJ (ECACC 86090501) used. Also HUT 102 (ATCC, TIB 162) can be used.

Die Zielzellen von der Art der HUT 78 exprimieren nur zu einem geringen Prozentsatz (ca. 1 bis 10%) virale Antigene. Wie über in situ Hybridisierung gezeigt werden konnte, produziert diese Zellfraktion jedoch mehr als die tausendfache Menge an Virus im Vergleich mit den verbleibenden 90 bis 99% der Zellen. Nach Markierung der HTLV-III-Antigen/anti-HTLV-III-Antikörperkomplexe mit markierten Antikörpern gegen menschliches Immunoglobulin kann im Vergleich mit dem internen Standard der nicht-antigentragenden Zellen sehr sensitiv ein positives Signal beobachtet werden. Antikörperpositive Seren können um den Faktor 1 : 1 bis 1 : 10 000 verdünnt werden und zeigen weiterhin eine eindeutig identifizierbare Positivreak­ tion.Express the target cells of the HUT 78 type only a small percentage (approx. 1 to 10%) viral antigens. How about in situ hybridization was shown to produce this cell fraction however, more than a thousand times the amount of virus in the Comparison with the remaining 90 to 99% of the cells. After labeling the HTLV-III antigen / anti-HTLV-III antibody complexes with labeled antibodies against human immunoglobulin can be compared  with the internal standard of non-antigenic Cells very sensitively observed a positive signal will. Antibody positive sera can be increased by a factor Diluted 1: 1 to 1: 10,000 and continue to show a clearly identifiable positive freak tion.

Der Marker des Sekundärantikörpers gegen die gebildeten Antigen-Antikörperkomplexe besteht aus einer Struktureinheit, die entweder elektromagnetische Wellen absorbiert, fluoresziert, chemiluminesziert, radioaktiv ist oder mit einem Enzym markiert ist. Somit kommen als geeignete Detektionsmethoden bekannte Diagnoseverfahren der klinischen Chemie in Betracht, wie z. B. RIA (radio immuno essay), ELISA, die Zytofluorimetrie, die Immunfluoreszenzmikroskopie und Immunfluoreszenzspektroskopie, sowie deren verwandte Methoden, wie zellulärer RIA und zellulärer ELISA.The marker of the secondary antibody against the formed Antigen-antibody complexes consists of one Structural unit that is either electromagnetic Absorbs waves, fluoresces, chemiluminesces, is radioactive or is labeled with an enzyme. Thus, known detection methods come as suitable Diagnostic methods of clinical chemistry in Consider how. B. RIA (radio immuno essay), ELISA, cytofluorimetry, immunofluorescence microscopy and immunofluorescence spectroscopy, as well as their related methods, such as cellular RIA and cellular ELISA.

Eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der simultane Nachweis von Antikörpern gegen HTLV-I- und HTLV-III-Viren in ein und derselben zu untersuchenden Probe. Das erfindungsgemäße Verfahren wird dazu beispielsweise unter Einsatz der Zellinie 191 TJ (unter der Nummer 86090501 bei ECACC hinterlegt) durchgeführt. Die mit STLV-I-Viren transformierten Zellen exprimieren konstitutiv zu mehr als 50% STLV-I-Antigene, die große Homologie mit den HTLV-I-Antigenen aufweisen. Es stellte sich heraus, daß anti-HTLV-I-Antiseren mit den STLV-I-Antigenen kreuzreagieren. Die Simultanbestimmung von anti-HTLV-I- neben anti-HTLV-III-Antikörpern derselben zu analysierenden Probe geschieht einfach dadurch, daß ein Aliquot der mit HTLV-I- oder STLV-I-Viren transformierten Zellen, die konstitutiv HTLV-I- oder STLV-I-Antigene exprimieren, entnommen wird und in vitro zusätzlich mit HTLV-III-Viren infiziert wird. Das zu untersuchende Probandenserum wird nun parallel gegen HTLV-III infizierte und nicht-infizierte Zellen getestet. Als Testverfahren kann ein bekanntes Diagnoseverfahren der klinischen Chemie verwendet werden, wie z. B. RIA, ELISA, Zytofluorimetrie, die Immunfluoreszenzmikroskopie oder die Immunfluoreszenzspektroskopie, sowie deren verwandte Methoden, wie zellulärer RIA und zellulärer ELISA. Wird ein positives Signal lediglich an den in vitro mit HTLV-III infizierten Zellen beobachtet, so ist davon auszugehen, daß in der zu untersuchenden Probe nur anti-HTLV-III-Antikörper enthalten sind. Tritt jedoch sowohl an den infizierten als auch an nicht-infizierten Zellen ein positives Signal auf, kann dieses bewirkt sein, durchAn embodiment of the method according to the invention is the simultaneous detection of antibodies against HTLV-I and HTLV-III viruses in one and the same sample to be examined. The method according to the invention is done for example using the Cell line 191 TJ (under number 86090501 deposited with ECACC). The one with STLV-I viruses  transformed cells express constitutive more than 50% STLV-I antigens, the great homology with the HTLV-I antigens. It turned out found that anti-HTLV-I antisera with the STLV-I antigens cross-react. The simultaneous determination of anti-HTLV-I- in addition to anti-HTLV-III antibodies thereof sample to be analyzed is done simply by that an aliquot of HTLV-I or STLV-I viruses transformed cells that are constitutive Express HTLV-I or STLV-I antigens taken is also infected with HTLV-III viruses in vitro becomes. The test serum to be examined is now infected in parallel against HTLV-III and uninfected cells tested. As a test procedure can be a well known diagnostic method of clinical Chemistry can be used, such as. B. RIA, ELISA, cytofluorimetry, immunofluorescence microscopy or immunofluorescence spectroscopy, as well as their related Methods such as cellular RIA and cellular ELISA. If a positive signal is only sent to the in cells infected with HTLV-III in vitro, see it can be assumed that in the Sample only anti-HTLV-III antibodies are included. However, occurs on both the infected and positive signal to uninfected cells, can this be caused by

  • a) anti-HTLV-I-Antikörper odera) anti-HTLV-I antibody or
  • b) anti-HLA-Antikörper bzw. auto-Antikörper gegen Membran- oder Zellstrukturen wie mitochondriale Proteine.b) anti-HLA antibodies or auto antibodies against membrane or cell structures such as mitochondrial proteins.

Eine Diskriminierung dieser beiden Möglichkeiten erfolgt in einem Bestätigungstest, in dem das Probandenserum gegen HTLV-I transformierte Zellen ohne HTLV-III-Koinfektion, sowie gegen nicht-transformierte periphere T-Lymphozyten getestet wird. Diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht es, daß potentiell infektiöse HTLV-I-haltige Serumproben auch erfaßt werden.Discrimination between these two options takes place in a confirmation test in which the subject's serum cells transformed against HTLV-I without HTLV III co-infection, as well as against non-transformed peripheral T lymphocytes is tested. These Embodiment of the method according to the invention  enables potentially infectious HTLV-I containing Serum samples are also collected.

Das erfindungsgemäße Verfahren bietet in einer bevorzugten Ausführungsform den weiteren Vorteil, daß mit infizierten Zellen gearbeitet werden kann, die jedoch nicht mehr infektiös sind. Trotzdem werden die antigenen Strukturen in dem Sinne unverändert präsentiert, daß die Reaktion der Antikörper gegen T-lymphotrope Viren mit den entsprechenden antigenen Strukturen auf der Zelle stattfindet.The method according to the invention offers a preferred Embodiment has the further advantage that can be worked with infected cells that but are no longer infectious. Still be the antigenic structures in the sense unchanged presents that the reaction of the antibodies against T-lymphotropic viruses with the corresponding antigens Structures on the cell takes place.

Die bisher verwendeten Methoden zur Fixierung von Zellen für die Immunfluoreszenz, die auch zum Nachweis von anti-HTLV-III-Antikörpern eingesetzt wurden, z. B. die Acetonfixierung nativer Zellen an Glas oder reduktive Behandlung der Zellen mit Detergenzien wie SDS (Natriumdodecylsulfat) bei Western Blots, zerstören die übergeordneten Strukturen der Antigene. Antikörper, die intakte Konformationen des Antigens zur Bindung benötigen, entziehen sich also dem Nachweis mittels Antigen-Antikörperkomplexen.The previously used methods for fixing Cells for immunofluorescence, which are also used for detection of anti-HTLV-III antibodies have been used, e.g. B. the acetone fixation of native cells on glass or reductive treatment of the cells with detergents like SDS (sodium dodecyl sulfate) in Western Blots, destroy the parent structures of the Antigens. Antibodies that have intact conformations of the Need antigens for binding, therefore elude detection using antigen-antibody complexes.

Aus der Elektronenmikroskopie sind Verfahren zur in situ Fixierung bekannt, die dafür Sorge tragen, daß die komplexen molekularen Strukturen biologischen Materials weitestgehend in ihrer räumlichen Anordnung und Struktur erhalten bleiben. In der immunologischen Forschung wurde die in situ Fixierung bereits bei der gemischten Lymphozytenreaktion mit fixierten Stimulatorzellen angewendet.Methods of electron microscopy are used in known fixation, which ensure that the complex molecular structures biological Materials largely in their spatial arrangement and structure are preserved. In the immunological Research has already been done in situ fixation with the mixed lymphocyte reaction with fixed stimulator cells applied.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß eine in situ Fixierung der mit T-lymphotropen Viren infizierten Zellen die Empfindlichkeit des Nachweises von Antikörpern gegen T-lymphotrope Viren wie HTLV-I-, STLV-I-, sowie HTLV-III/LAV-1-Viren nicht herabsetzt. Als geeignete Fixierungsmittel für die in situ Fixierung im erfindungsgemäßen Verfahren haben sich Aldehyde bewährt, insbesondere Paraformaldehyd, Formaldehyd und/oder Glutaraldehyd, sofern diese nicht spektroskopisch mit optischen Detektionsverfahren interferieren.Surprisingly, it has been shown that an in situ fixation of those infected with T-lymphotropic viruses Cells the sensitivity of the detection of antibodies against T-lymphotropic viruses such as  HTLV-I, STLV-I, and HTLV-III / LAV-1 viruses are not belittles. As a suitable fixative for the in situ fixation in the method according to the invention Aldehydes have proven their worth, especially paraformaldehyde, Formaldehyde and / or glutaraldehyde, if this is not spectroscopic with optical detection methods interfere.

Möglicherweise kann man den überraschenden Befund der nicht verminderten Empfindlichkeit des Nachweises von Antikörpern gegen T-lymphotrope Viren bei Einsatz in situ fixierter Zellen dadurch deuten, daß die neugebildeten Virionen in der äußeren Zellmembran vesikulär konzentriert werden, und so trotz Plastifizierung des Zellinneren zur Reaktion mit sperrigen Antikörpern befähigt bleiben. Das gilt insbesondere für alle Viren vom HTLV-III-Typ, Lentiviren, Spumaviren und HTLV-I-Viren. Kreuzreaktionen mit internen Antigenen, z. B. mit mitochondrialen Antigenen, werden effizient unterdrückt.You may be able to find the surprising finding the undiminished sensitivity of the detection of antibodies against T-lymphotropic viruses Use of cells fixed in situ indicate that the newly formed virions in the outer cell membrane be vesicularly concentrated, and so despite Plasticization of the cell interior to react with remain able to carry bulky antibodies. That applies especially for all HTLV-III type viruses, lentiviruses, Spuma viruses and HTLV-I viruses. Cross reactions with internal antigens, e.g. B. with mitochondrial Antigens are suppressed efficiently.

Durch den Einsatz dieser Zellen in fluoreszenz-spektroskopischen Geräten wie FACS und Fluoreszenzspektrometern ist sogar eine empfindliche und automatisierbare Signalquantifizierung möglich, die Konzen­ trationsbestimmungen von Antikörpern über einen weiten Bereich zulassen, wie es bei ELISA-Verfahren bisher nicht möglich war.By using these cells in fluorescence spectroscopic Devices such as FACS and fluorescence spectrometers is even a sensitive and automatable Signal quantification possible, the conc determination of antibodies over a wide range Allow range as is the case with ELISA procedures was previously not possible.

Damit wird es möglich, Test-Kits weithin unter Vermeidung von Arbeiten mit stark pathogenen Lösungen oder Materialien zu produzieren. Mit so fixierten Zellen ist es überraschenderweise immer noch möglich, die immunologischen Reaktionen nicht nur an einer festen Phase, sondern auch in Lösung unter Verwendung nicht infektiöser Reagentien in Form freier aber plastifizierter Zellen durchzuführen. This makes it possible to avoid testing kits widely of working with highly pathogenic solutions or to produce materials. With so fixed Cells it is still surprisingly possible the immunological reactions don't just start a solid phase, but also in solution under Use of non-infectious reagents in the form perform free but plasticized cells.  

Die Zellen können aber auch gegebenenfalls nachträglich an Oberflächen, beispielsweise Glas immobilisiert werden bzw. an solchen Oberflächen anhaften.However, the cells can also be added subsequently immobilized on surfaces, for example glass will adhere to such surfaces.

Ein derartiges Test-Kit enthält zweckmäßigerweise fixierte Zellen einer Zellinie, die mit T-lymphotropen Viren infiziert sind, wobei die Zellinie nur teilweise virale Antigene detektierbar exprimiert, weiterhin fixierte Zellen einer Zellinie, die durch T-lymphotrope Viren transformiert sind, wodurch die Zellinie konstitutiv zu mehr als 50% virale Antigene exprimiert, sowie einen Marker tragende Sekundärantikörper gegen menschliche Antikörper.Such a test kit expediently contains fixed cells of a cell line with T-lymphotropic Viruses are infected, with the cell line only partially expressed viral antigens detectably, furthermore fixed cells of a cell line that pass through T-lymphotropic viruses are transformed, making the Cell line constitutive of more than 50% viral antigens expressed, as well as a secondary antibody carrying a marker against human antibodies.

Insbesondere bei der Anwendung der Immunfluoreszenzmikroskopie sind die Eigenschaften der erfindungsgemäß verwendbaren HUT-78-Zellinie von großem Vorteil. Die HTLV-III-Antigene sind homogen über die Plasmamembran der infizierten Zellen verteilt. Daraus ergeben sich drei charakteristische Beurteilungskriterien bei der Auswertung des Immunfluoreszenztestes:Especially when using immunofluorescence microscopy are the properties of the invention usable HUT-78 cell line of great advantage. The HTLV-III antigens are homogeneous across the plasma membrane spread the infected cells. Resulting from it three characteristic assessment criteria when evaluating the immunofluorescence test:

  • 1. Nur 1 bis 10% aller Zellen fluoreszieren,1. Only 1 to 10% of all cells fluoresce,
  • 2. die Fluoreszenz tritt membrangebunden auf und erscheint als ein die Zelle säumender Ring und2. The fluorescence occurs on the membrane and appears as a ring lining the cell and
  • 3. die Fluoreszenz unterliegt keinen "capping"-Phänomenen, sondern tritt homogen verteilt auf.3. the fluorescence is not subject to any "capping" phenomena, but occurs homogeneously distributed.

Die HUT-78-Zellinie exprimiert nur in 1 bis 10% der Zellen AIDS-Virus-spezifische Antigene. Damit steht den in Seren eventuell vorhandenen anti-AIDS-Virus-Antikörpern der entsprechende Bindungspartner nur auf wenigen Zellen im Überschuß zur Verfügung. Beispielsweise ist ein Fluoreszenzsignal nicht über die gesamte Zellpopulation homogen verteilt, sondern nur auf Antigen-exprimierende Zellen konzentriert. Besonders deutlich tritt der Effekt durch die Markierung der mehrkernigen Synzytien in Erscheinung. Die lokale Anreicherung der viralen Antigene führt zu einer beträchtlichen Empfindlichkeitssteigerung der Untersuchungsmethode.The HUT-78 cell line only expresses in 1 to 10% of the Cells AIDS virus specific antigens. With that stands the anti-AIDS virus antibodies that may be present in sera the corresponding attachment partner only available in excess on a few cells. For example a fluorescence signal is not over the entire cell population distributed homogeneously, but only focused on antigen-expressing cells. Especially the effect clearly appears through the marking of the multinuclear syncytia in appearance. The local enrichment of the viral antigens leads to a considerable increase in sensitivity of the Examination method.

Durch die hohe Sensitivität des HTLV-III-Immunfluoreszenztestes ist die Beurteilung auch solcher Probandenseren möglich, die in anderen Bestätigungsuntersuchungen keine zweifelsfreien Resultate lieferten. So fanden sich unter getesteten 119 Proben aus Blutbanken 3 Seren, die als Antikörper-positiv eingestuft waren, jedoch nach dem erfindungsgemäßen Verfahren als eindeutig negativ beurteilt wurden. Nach Rückfrage ergab sich, daß diese Seren von Blutspendern stammten, die keiner Risikogruppe angehörten, keinerlei lymphopathische Auffälligkeiten zeigten und bei denen eine Infektion mit HTLV-III-Viren als unwahrscheinlich anzusehen war. So waren im ersten Screening-Test diese Proben als Antikörper positiv aufgefallen; anschließende Bestätigungsuntersuchungen zeigten widersprüchliche Ergebnisse, die letztlich jedoch zu einer offensichtlich falschen Einstufung dieser Seren als "Antikörper-positiv" führten.Due to the high sensitivity of the HTLV-III immunofluorescence test is the assessment of such test sera possible in other confirmation exams did not produce any unequivocal results. There were 119 samples tested from blood banks 3 sera that are antibody positive were classified, but according to the invention Procedures were assessed as clearly negative. Upon inquiry, it was found that these sera were from blood donors came from no risk group, showed no lymphopathic abnormalities and those infected with HTLV-III viruses was considered unlikely. So were in first screening test these samples as antibodies noticed positively; subsequent confirmation examinations showed conflicting results,  which ultimately turns out to be an obviously wrong one Classification of these sera as "antibody positive" led.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher erläutert.The invention is illustrated below by means of examples explained in more detail.

Die humane T-Zellinie 191 TJ wurde am 5. September 1986 bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP 4 OJG in England unter der Nummer 86090501 hinterlegt. Die humanen Zellinien HUT 78 und HUT 102 sind bekannt und unter den Nummern ATCC TIB 161 bzw. ATCC TIB 162 bei Amercian Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA hinterlegt (ATCC-Katalog, 5. Ausgabe 1985, S. 239). Die humane Zellinie HUT 78 ist außerdem bei ECACC unter der Nummer 87092502 erneut hinterlegt worden.The human T cell line 191 TJ was released on September 5 1986 at the European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP 4 OJG in England filed under number 86090501. The human cell lines HUT 78 and HUT 102 are known and under the numbers ATCC TIB 161 or ATCC TIB 162 at Amercian Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA deposited (ATCC catalog, 5th edition 1985, p. 239). The human cell line HUT 78 is also at ECACC under number 87092502 have been deposited again.

Beispiel 1Example 1

Die Permanentlinie 191 TJ (ECACC, 86090501) wurde etabliert durch Kokultivierung menschlicher Nabelschnurzellen mit peripheren Lymphocyten eines Affen (Cercopithecus aethiops pygerythrus), der mit dem STLV-I-Virus (Simian T-cell Leukemia Virus I) infiziert war.The permanent line 191 TJ (ECACC, 86090501) was established by coculturing human umbilical cord cells with peripheral monkey lymphocytes (Cercopithecus aethiops pygerythrus), which with the STLV-I virus (Simian T-cell Leukemia Virus I) infected was.

Die Kultivierung dieser Zellen geschieht in RPMI-1640 Medium (Gibco, Paisley, Schottland) mit folgenden Zusätzen: 0,2% NaHCO₃; 20% foetales Kälberserum, 2% L-Glutamin; 100 IU/ml Penicillin sowie 60 µg/ml Streptomycin. Die Zellen werden in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre, die 5 Volumenprozent CO₂ enthält, bei 37°C inkubiert.These cells are cultivated in RPMI-1640 Medium (Gibco, Paisley, Scotland) with the following Additions: 0.2% NaHCO₃; 20% fetal calf serum, 2% L-glutamine; 100 IU / ml penicillin and 60 µg / ml Streptomycin. The cells are saturated with water vapor Atmosphere that 5 volume percent Contains CO₂, incubated at 37 ° C.

Eine Infektion dieser Zellen mit dem HTLV-III-Virus erfolgt durch Kokultivierung der Zellinie 191 TJ mit einer Kultur peripherer Lymphocyten eines AIDS-Patienten. Periphere Lymphocyten des Patienten P 34, der mit dem HTLV-III-Virus infiziert war, wurden nach der Ficoll-Hypaque-Methode isoliert und in Kulturmedium RPMI-1640, das zusätzlich 20% T-Zellwachstumsfaktor sowie 100 µg/ml Phytohämagglutinin enthielt, für einige Tage inkubiert. Zellen der Linie 191 TJ (ECACC, 86090501) sowie die aktivierten, infizierten Lymphocyten wurden im Verhältnis 1 : 5 gemischt und weiterhin kultiviert.Infection of these cells with the HTLV-III virus is done by co-cultivating the 191 TJ cell line  a culture of peripheral lymphocytes from an AIDS patient. Peripheral lymphocytes of patient P 34, who was infected with the HTLV-III virus isolated according to the Ficoll-Hypaque method and in culture medium RPMI-1640, the additional 20% T cell growth factor as well as 100 µg / ml phytohemagglutinin, incubated for a few days. Cells of the line 191 TJ (ECACC, 86090501) as well as the activated, infected Lymphocytes were mixed 1: 5 and still cultivated.

Beispiel 2Example 2

Die Zellinien HUT 78 (ATCC, TIB 161) und HUT 102 (ATCC, TIB 162) wurden aus Patienten mit einer T-Zell-Leukämie isoliert. Die Kultivierung dieser Zellen geschieht in RPMI-1640-Medium mit folgenden Zusätzen: 0,2% NaHCO₃; 20% foetales Kälberserum; 2% L-Glutamin; 100 IU/ml Penicillin sowie 60 µg/ml Streptomycin. Die Zellen werden in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre, die 5 Volumenprozent CO₂ enthält, bei 37°C inkubiert.The cell lines HUT 78 (ATCC, TIB 161) and HUT 102 (ATCC, TIB 162) were from patients with T cell leukemia isolated. The cultivation of these cells happens in RPMI-1640 medium with the following additions: 0.2% NaHCO₃; 20% fetal calf serum; 2% L-glutamine; 100 IU / ml penicillin and 60 µg / ml Streptomycin. The cells are saturated with water vapor Atmosphere that 5 volume percent Contains CO₂, incubated at 37 ° C.

Eine Infektion dieser Zellen mit HTLV-III-Virus erfolgt durch Kokultivierung der Zellinine HUT 78 (ATCC, TIB 161) oder HUT 102 (ATCC, TIB 162) mit einer Kultur peripherer Lymphocyten eines AIDS-Patienten. Periphere Lymphocyten des Patienten P 34, der mit dem HTLV-III-Virus infiziert war, wurden nach der Ficoll-Hypaque-Methode isoliert und in Kulturmedium RPMI-1640, das zusätzlich 20% T-Zellwachstumsfaktor sowie 100 µg/ml Phytohämagglutinin enthielt, für einige Tage inkubiert. Zellen der Linien HUT 78 (ATCC, TIB 161) oder HUT 102 (ATCC, TIB 162) sowie die aktivierten, infizierten Lymphocyten wurden im Verhältnis 1 : 5 gemischt und weiterhin kul­ tiviert. These cells are infected with HTLV-III virus by coculturing the HUT 78 cell line (ATCC, TIB 161) or HUT 102 (ATCC, TIB 162) with a culture of peripheral lymphocytes from an AIDS patient. Peripheral lymphocytes of patient P 34, who was infected with the HTLV-III virus isolated according to the Ficoll-Hypaque method and in culture medium RPMI-1640, the additional 20% T cell growth factor and 100 µg / ml phytohaemagglutinin contained, incubated for several days. Cells of the lines HUT 78 (ATCC, TIB 161) or HUT 102 (ATCC, TIB 162) as well as the activated, infected lymphocytes were mixed in a ratio of 1: 5 and still cul activated.  

Beispiel 3Example 3

Die Fixierung von HTLV-III infizierten humanen Lymphocyten bzw. Syncytien in Suspension mit Aldehyden geschieht wie folgt:The fixation of HTLV-III infected human lymphocytes or syncytia in suspension with aldehydes happens as follows:

Humane T-Lymphocyten z. B. von der Art der HUT 78 (ATCC, TIB 161) sowie humane T-Lymphocyten von der Art der HUT 102 (ATCC, TIB 161) Zellen, die entsprechend dem Vorgehen in Beispiel 2 mit HTLV-III-Viren infiziert wurden, werden durch Zentrifugation (5 Minuten bei 250 g) gesammelt, in phosphatgepufferter Saline (PBS) zweimal gewaschen und auf eine Zelldichte von 4 × 10⁷/ml in PBS eingestellt. Aldehyde von der Art des Formaldehyd, Paraformaldehyd oder Glutaraldehyd werden bis zu einer Konzentration von 4% zugegeben. Anschließend werden die Zellen für 30 Minuten bei Temperatur eines Eisbades fixiert und dann zweimal in PBS gewaschen.Human T lymphocytes e.g. B. of the type of HUT 78 (ATCC, TIB 161) and human T lymphocytes on the type of HUT 102 (ATCC, TIB 161) cells that according to the procedure in Example 2 with HTLV-III viruses were infected by centrifugation (5 minutes at 250 g), in phosphate buffered Saline (PBS) washed twice and on one Cell density set at 4 × 10⁷ / ml in PBS. Aldehydes on the type of formaldehyde, paraformaldehyde or Glutaraldehyde are used up to a concentration of 4% added. Then the cells for 30 Minutes at the temperature of an ice bath and then washed twice in PBS.

Beispiel 4Example 4

Die Fixierung von HTLV-III infizierten/STLV-I transformierten oder HTLV-III infizierten/HTLV-I transformierten humanen Lymphocyten bzw. Syncytien in Suspension mit Aldehyden geschieht wie folgt:The fixation of HTLV-III infected / STLV-I transformed or HTLV-III infected / HTLV-I transformed human lymphocytes or syncytia in Suspension with aldehydes happens as follows:

Humane T-Lymphocyten z. B. von der Art der 191 TJ (ECACC, 86090501) Zellen oder der HUT 102 (ATCC, TIB 162) Zellen, sowie humane T-Lymphocyten von der Art der 191 TJ Zellen und der HUT 102 (ATCC, TIB 162) Zellen, die entsprechend dem Vorgehen in Beispielen 1 und 2 mit HTLV-III-Viren infiziert wurden, werden durch Zentrifugation gesammelt (5 Minuten bei 250 g), in phosphatgepufferter Saline (PBS) zweimal gewaschen und auf eine Zelldichte von 4 × 10⁷/ml in PBS eingestellt. Human T lymphocytes e.g. B. of the type of 191 TJ (ECACC, 86090501) cells or the HUT 102 (ATCC, TIB 162) cells, as well as human T-lymphocytes of the type the 191 TJ cells and the HUT 102 (ATCC, TIB 162) Cells that follow the procedure in examples 1 and 2 were infected with HTLV-III viruses collected by centrifugation (5 minutes at 250 g), washed twice in phosphate buffered saline (PBS) and to a cell density of 4 × 10⁷ / ml in PBS set.  

Aldehyde von der Art des Formaldehyd, Paraformaldehyd oder Glutaraldehyd werden bis zu einer Konzentration von 4% zugegeben. Anschließend werden die Zellen für 30 Minuten bei Temperatur eines Eisbades fixiert und dann zweimal in PBS gewaschen.Aldehydes of the formaldehyde type, paraformaldehyde or glutaraldehyde up to a concentration of 4% added. Then the Cells for 30 minutes at the temperature of an ice bath fixed and then washed twice in PBS.

Beispiel 5Example 5

Die Beschichtung von maskierten Objektträgern mit HTLV-III, HTLV-III/STLV-I oder HTLV-III/HTLV-I infizierten, hochinfektiösen Zellen und deren Fixierung geschieht wie folgt:The coating of masked slides with HTLV-III, HTLV-III / STLV-I or HTLV-III / HTLV-I infected, highly infectious cells and their fixation happens as follows:

Nicht infizierte Zellen von der Art HUT 78 (ATCC, TIB 161), HUT 102 (ATCC, TIB 162) und 191 TJ sowie Zellen von der Art der HUT 78 (ATCC, TIB 161), HUT 102 (ATCC, TIB 162) und 191 TJ, die entsprechend den Beispielen 1 und 2 entweder mit HTLV-III (HUT 78) oder HTLV-III und STLV-I (191 TJ) oder HTLV-I und HTLV-III (HUT 102) infiziert wurden, werden durch Zentrifugation gesammelt (5 Minuten bei 250 g), in phosphatgepufferter Saline (PBS) zweimal gewaschen und auf eine Zelldichte von 2 × 10⁶/ml in PBS eingestellt. Für den Immunfluoreszenztest werden maskierte Objektträger mit 12 Auftragsfeldern von 5 mm Durchmesser verwandt. Je 10 Mikroliter der Zellsuspensionen von infizierten und nicht infizierten Zellen werden pro Auftragsstelle auf Objektträger pipettiert: Die Auftragsstellen 1 bis 6 erhalten nicht infizierte Zellen. Auftragsstellen 7 bis 12 erhalten infizierte Zellen. Die Zellen werden an der Luft für 30 Minuten getrocknet und anschließend für 10 Minuten in wasserfreiem Aceton, das auf -80°C vorgekühlt ist, fixiert. Beschichtete Objektträger werden bei -20°C gelagert. Uninfected cells of the HUT 78 type (ATCC, TIB 161), HUT 102 (ATCC, TIB 162) and 191 TJ as well HUT 78-type cells (ATCC, TIB 161), HUT 102 (ATCC, TIB 162) and 191 TJ, which correspond to the Examples 1 and 2 with either HTLV-III (HUT 78) or HTLV-III and STLV-I (191 TJ) or HTLV-I and HTLV-III (HUT 102) are infected by Centrifugation collected (5 minutes at 250 g), in phosphate buffered saline (PBS) washed twice and adjusted to a cell density of 2 × 10⁶ / ml in PBS. Masked are used for the immunofluorescence test Slides with 12 order fields of 5 mm Diameter related. 10 microliters each of the cell suspensions of infected and uninfected cells are pipetted onto slides per job: The order points 1 to 6 do not receive infected cells. Receive job orders 7 to 12 infected cells. The cells are in the air for Dried for 30 minutes and then for 10 minutes in anhydrous acetone, pre-cooled to -80 ° C is fixed. Coated slides are used at Stored at -20 ° C.  

Beispiel 6Example 6

Die Beschichtung von maskierten Objektträgern mit HTLV-III, HTLV-III/STLV-I oder HTLV-III/HTLV-I infizierten und in situ vorfixierten Zellen geschieht wie folgt:The coating of masked slides with HTLV-III, HTLV-III / STLV-I or HTLV-III / HTLV-I infected and cells pre-fixed in situ as follows:

Humane T-Lymphocyten z. B. von der Art der HUT 78 (ATCC TIB 161) Zellen, der 191 TJ Zellen und der HUT 102 (ATCC TIB 162) Zellen sowie humane T-Lymphocyten derselben Art, die entsprechend dem Vorgehen in Beispielen 1 und 2 infiziert wurden und entsprechend den Beispielen 3 und 4 in situ fixiert wurden, werden mit PBS auf eine Zelldichte von 2 × 10⁶/ml eingestellt. Für den Immunfluoreszenztest werden maskierte Objektträger mit 12 Auftragsfeldern von 5 mm Durchmesser verwandt. Je 10 Mikroliter der Zellsuspensionen von infizierten und nicht infizierten Zellen werden pro Auftragsstelle auf Objektträger pipettiert: Die Auftragsstellen 1 bis 6 erhalten nicht infizierte Zellen. Auftragsstellen 7 bis 12 erhalten infizierte Zellen. Die Zellen werden an der Luft für 30 Minuten getrocknet und anschließend für 10 Minuten in wasserfreiem Aceton, das auf -80°C vorgekühlt ist, fixiert. Beschichtete Objektträger werden bei -20°C gelagert.Human T lymphocytes e.g. B. of the type of HUT 78 (ATCC TIB 161) cells, the 191 TJ cells and the HUT 102 (ATCC TIB 162) cells and human T lymphocytes of the same type, according to the procedure in examples 1 and 2 were infected and accordingly Examples 3 and 4 were fixed in situ adjusted to a cell density of 2 × 10⁶ / ml with PBS. Masked are used for the immunofluorescence test Slides with 12 order fields of 5 mm Diameter related. 10 microliters each of the cell suspensions of infected and uninfected cells are pipetted onto slides per job: The order points 1 to 6 do not receive infected cells. Receive job orders 7 to 12 infected cells. The cells are in the air for Dried for 30 minutes and then for 10 minutes in anhydrous acetone, pre-cooled to -80 ° C is fixed. Coated slides are used at Stored at -20 ° C.

Beispiel 7Example 7

Der Immunfluoreszenztest zur in vitro Bestimmung von anti-HTLV-III-Antikörpern im Serum wird wie folgt durchgeführt:The immunofluorescence test for the in vitro determination of Anti-HTLV-III antibodies in serum is as follows carried out:

Die Objektträger wurden gemäß den Beispielen 5 oder 6 angefertigt. The slides were made according to Examples 5 or 6 made.  

In einem ersten Inkubationsschritt binden die im Serum vorhandenen anti-HTLV-III-Antikörper an Virusproteine, die in die Plasmamembran infizierter Zellen von der Art der HUT 78 Zellen integriert sind. In einem zweiten Inkubationsschritt werden an die gebundenen Antikörper fluoreszenzmarkierte Antikörper, die gegen menschliches Immunglobulin gerichtet sind, gebunden. Die Menge des gebundenen Sekundärantikörpers ist abhängig vom anti-HTLV-III-Antikörpergehalt der Serumprobe. Nicht gebundene Sekundärantikörper werden durch Waschen entfernt. Zellgebundene Fluoreszenz wird im Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen.In a first incubation step, the bind in the Anti-HTLV-III antibodies to virus proteins present in serum, the cells infected in the plasma membrane of the type of HUT 78 cells are integrated. In a second incubation step, the bound antibody fluorescence-labeled antibody, which are directed against human immunoglobulin are bound. The amount of secondary antibody bound depends on the anti-HTLV-III antibody content the serum sample. Unbound secondary antibodies are removed by washing. Cell-bound Fluorescence is in the fluorescence microscope proven.

Als Reagentien werden benötigt:The following reagents are required:

Phosphatgepufferte Saline
Rinderserumalbumin
Antikörper-FITC-Konjugat (Fluorescein Isothiocyanat)
GlycerinPhosphate buffered saline
Bovine serum albumin
Antibody-FITC conjugate (fluorescein isothiocyanate)
Glycerin

Herstellung der Lösungen:Manufacturing the solutions:

  • I Phosphatgepufferte Saline: 6 g NaCl, 1,8 g K₂HPO₄ × 3 H₂O und 0,27 g KH₂PO₄ in 1 Liter aqua bidest. lösen.I Phosphate-buffered saline: 6 g NaCl, 1.8 g K₂HPO₄ × 3 H₂O and 0.27 g KH₂PO₄ in 1 liter double distilled water. to solve.
  • II Probenpuffer: 0,5 g Rinderserumalbumin in 50 ml Lösung I lösen.II Sample buffer: Dissolve 0.5 g bovine serum albumin in 50 ml solution I.
  • III Antikörper-FITC-Konjugat: 1 Volumenteil des anti-IgG-Antikörper-FITC-Konjugats mit 40 Volumenteilen Lösung II mischen.III Antibody-FITC conjugate: Mix 1 volume of the anti-IgG antibody-FITC conjugate with 40 volumes of solution II.
  • IV Eindecklösung: 9 Volumenteile Glycerin mit 1 Volumenteil Lösung I mischen.IV mounting solution: 9 volumes of glycerin with 1 volume of solution I mix.

Zur Probenvorbereitung wird 1 Volumenteil Probandenserum mit 9 Volumenteilen Lösung II gemischt.1 volume of test sample serum is used for sample preparation mixed with 9 parts by volume of solution II.

Der Test wird bei Raumtemperatur, 18 bis 25°C, ausgeführt:The test is carried out at room temperature, 18 to 25 ° C, executed:

  • - 15 Mikroliter verdünntes Probandenserum sind auf eine Auftragsstelle, die infizierte Zellen enthält, aufzutropfen. Ebenfalls 15 Mikroliter sind auf die darüberliegende Auftragsstelle, die nicht infizierte Zellen enthält, zu pipettieren. Auf jedem Objektträger sind zwei Positionen für ein Positivserum und ein Negativserum als Kontrollen vorgesehen. Der Objektträger wird in einer feuchten Kammer für 30 Minuten bei 37°C inkubiert.- 15 microliters of diluted test serum are on a job site that contains infected cells, to drip on. 15 microliters are also on the overlying job that is not infected Contains cells to pipette. On every slide are two positions for a positive serum and a negative serum is provided as controls. The slide is in a humid chamber for 30 minutes incubated at 37 ° C.
  • - Anschließend wird der Objektträger für 5 Minuten in 50 ml Lösung I gewaschen. Dieser Waschvorgang ist einmal zu wiederholen. Der Objektträger wird sodann an der Luft getrocknet.- Then slide the slide for 5 minutes washed in 50 ml of solution I. This washing process is to repeat once. The slide is then air dried.
  • - 15 Mikroliter Antikörper-Konjugat (Lösung III) sind auf die Auftragsstellen zu pipettieren. Der Objektträger wird dann in einer feuchten Kammer für 30 Minuten bei 37°C inkubiert.15 microliter antibody conjugate (solution III) are pipetted onto the application points. The Slides are then placed in a humid chamber for Incubated for 30 minutes at 37 ° C.
  • - Der Objektträger wird anschließend für 5 Minuten in 50 ml Lösung I gewaschen. Dieser Waschvorgang ist einmal zu wiederholen. Der Objektträger wird sodann an der Luft getrocknet.- The slide is then left for 5 minutes washed in 50 ml of solution I. This washing process is to repeat once. The slide is then air dried.
  • - 5 Mikroliter Lösung IV sind auf die Auftragsstellen zu pipettieren und diese mit Deckgläschen abzu­ decken.- 5 microliters of Solution IV are on the job sites to pipette and cover with cover glasses cover.

Der Objektträger wird im Fluoreszenzmikroskop bei einer Gesamtvergrößerung von 200× unter Verwendung der Filterkombination für Fluorescein-Isothiocyanat untersucht. Als positiv und damit indikativ für die Präsenz von anti-HTLV-III-Antikörpern werden solche Fluoreszenzerscheinungen gewertet, die ringförmig an den infizierten Zellen auftreten. Wird mit einem Serum eine Fluoreszenzfärbung sowohl an infizierten als auch an nicht infizierten Zellen erhalten, muß davon ausgegangen werden, daß das Serum kreuzreagierende Antikörper enthält, die nicht mit einer HTLV-III-Infektion korrelieren.The slide is placed in the fluorescence microscope a total magnification of 200 × using the filter combination for fluorescein isothiocyanate examined. As positive and therefore indicative of the Presence of anti-HTLV-III antibodies becomes such Fluorescence phenomena rated that ring-shaped the infected cells occur. Will with one Serum fluorescent stains on both infected as well as on uninfected cells can be assumed that the serum cross-reacting Contains antibodies that are not compatible with a Correlate HTLV III infection.

Beispiel 8Example 8

Der Immunfluoreszenztest zur simultanen in vitro Bestimmung von anti-HTLV-III-Antikörpern und anti-HTLV-I-Antikörpern im Serum wird wie folgt ausge­ führt:The immunofluorescence test for simultaneous in vitro Determination of anti-HTLV-III antibodies and anti-HTLV-I antibodies in the serum is as follows leads:

Testprinzip des Immunfluoreszenztestes auf Objektträgern, die entsprechend den Beispielen 5 oder 6 angefertigt wurden:Test principle of the immunofluorescence test on slides, those corresponding to Examples 5 or 6 were made:

In einem ersten Inkubationsschritt binden im Serum vorhandene anti-HTLV-III-Antikörper und/oder anti-HTLV-I-Antikörper an Virusproteine, die in die Plasmamembran infizierter Zellen von der Art der 191 TJ (ECACC, 86090501) Zelle oder der HUT 102 (ATCC TIB 162) Zelle integriert sind. Im zweiten Inkubationsschritt werden an die gebundenen Antikörper Fluoreszenz-markierte Antikörper, die gegen menschliches Immunglobulin gerichtet sind, gebunden. Die Menge des gebundenen Sekundärantikörpers ist abhängig vom anti-HTLV-III-Antikörpergehalt und/oder anti-HTLV-I-Antikörper-Gehalt der Serumprobe. Nichtgebundene Sekundärantikörper werden durch Waschen entfernt. In a first incubation step, bind in the serum existing anti-HTLV-III antibodies and / or anti-HTLV-I antibodies of viral proteins that enter the plasma membrane infected cells of the 191 TJ type (ECACC, 86090501) cell or the HUT 102 (ATCC TIB 162) cell are integrated. In the second incubation step are fluorescence-labeled on the bound antibodies Antibodies against human Immunoglobulin are directed bound. The amount of the bound secondary antibody depends on anti-HTLV-III antibody content and / or anti-HTLV-I antibody content the serum sample. Unbound Secondary antibodies are removed by washing.  

Zellgebundene Fluoreszenz wird im Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen.Cell-bound fluorescence is in the fluorescence microscope proven.

Die Testdurchführung erfolgt wie in Beispiel 7 dar­ gestellt.The test is carried out as in Example 7 posed.

Beispiel 9Example 9

Der zelluläre ELISA zur in vitro Bestimmung von anti-HTLV-III- bzw. anti-HTLV-I-Antikörpern im Serum wird wie folgt durchgeführt:The cellular ELISA for the in vitro determination of anti-HTLV-III or anti-HTLV-I antibodies in the serum is carried out as follows:

Entsprechend den Beispielen 7 und 8 wird der Nachweis von Serumantikörpern gegen HTLV-III und/oder HTLV-I in einem zellulären ELISA geführt, indem diese Antikörper an solche Zellen binden können, deren Infektion in den Beispielen 1 und 2 beschrieben wurden. Derart infizierte Zellen sowie nicht infizierte Zellen gleicher Art werden auf geeigneten festen Trägern gemäß Beispielen 5 oder 6 fixiert und dort mit den zu untersuchenden Seren umgesetzt: In einem ersten Inkubationsschritt binden im Serum vorhandenen anti-HTLV-III-Antikörper an Virusproteine, die in die Plasmamembran infizierter Zellen von der Art HUT 78 (ATCC TIB 161) Zellen bzw. anti-HTLV-III- und/oder anti-HTLV-I-Antikörper an Virusproteine, die in die Plasmamembran infizierter Zellen von der Art der 191 TJ (ECACC, 86090501) Zellen oder der HUT 102 (ATCC, TIB 162) Zellen integriert sind.According to Examples 7 and 8, the proof of serum antibodies against HTLV-III and / or HTLV-I performed in a cellular ELISA by this Can bind antibodies to such cells whose Infection in Examples 1 and 2 have been described. Such infected cells as well as non-infected Cells of the same type are fixed on suitable solid Carriers fixed according to Examples 5 or 6 and there implemented with the sera to be examined: In one bind the first incubation step in the serum anti-HTLV-III antibodies to virus proteins that into the plasma membrane of infected cells of the type HUT 78 (ATCC TIB 161) cells or anti-HTLV-III and / or anti-HTLV-I antibodies to virus proteins, which in the plasma membrane of infected cells of the type of 191 TJ (ECACC, 86090501) cells or the HUT 102 (ATCC, TIB 162) cells are integrated.

In einem zweiten Inkubationsschritt werden an die gebundenen Antikörper peroxidasemarkierte Antikörper, die gegen menschliches Immunglobulin gerichtet sind, gebunden. Die Menge des gebundenen Sekundärantikörpers ist abhängig vom anti-HTLV-III-Antikörpergehalt und/oder anti-HTLV-Antikörpergehalt der Serumprobe. In a second incubation step, the bound antibody peroxidase-labeled antibody, which are directed against human immunoglobulin are bound. The amount of secondary antibody bound depends on the anti-HTLV-III antibody content and / or anti-HTLV antibody content of Serum sample.  

Nicht gebundene Sekundärantikörper werden durch Waschen entfernt. Die zellgebundene Peroxidase oxidiert Diaminobenzidin, welches in oxidierter Form an der Stelle des gebundenen Antikörpers präzipitiert. Die Testdurchführung erfolgt mit Objektträgern als festen Träger für fixierte Zellen.Secondary antibodies that are not bound are washed away. The cell-bound peroxidase oxidizes Diaminobenzidine, which is in oxidized form the site of the bound antibody precipitated. The test is carried out with slides as solid support for fixed cells.

Als Reagentien werden benötigt:The following reagents are required:

Phosphatgepufferte Saline
Rinderserumalbumin
Antikörper-Peroxidase-Konjugat
Diaminobenzidin
Tris-Puffer
Glycerin
H₂O₂Phosphate buffered saline
Bovine serum albumin
Antibody-peroxidase conjugate
Diaminobenzidine
Tris buffer
Glycerin
H₂O₂

Herstellung der Lösungen:Manufacturing the solutions:

  • I Phosphatgepufferte Saline: 6 g NaCl, 1,8 g K₂HPO₄ × 3 H₂O und 0,27 g KH₂PO₄ in 1 l aqua bidest. lösen.I Phosphate buffered saline: 6 g NaCl, 1.8 g K₂HPO₄ × 3 H₂O and 0.27 g KH₂PO₄ in 1 l double distilled water. to solve.
  • II Probenpuffer: 0,5 g Rinderserumalbumin in 50 ml Lösung I lösen.II Sample buffer: Dissolve 0.5 g bovine serum albumin in 50 ml solution I.
  • III Antikörper-Peroxidase-Konjugat: 1 Volumenteil des anti-IgG-Antikörper-Peroxidase-Konjugats mit 40 Volumenteilen Lösung II mischen.III Antibody-Peroxidase Conjugate: Mix 1 volume of the anti-IgG-Antibody-Peroxidase conjugate with 40 volumes of Solution II.
  • IV Tris-HCl-Lösung: 6 g Tris in 800 ml aqua bidest. lösen, pH-Wert auf 7,5 einstellen, auf 1 l auffüllen. IV Tris-HCl solution: 6 g Tris in 800 ml aqua bidest. solve, pH set to 7.5, fill up to 1 l.  
  • V Diaminobenzidin-Lösung: 0,1 g Diaminobenzidin in 100 ml Lösung IV lösen, pH-Wert auf 5,5 einstellen.V diaminobenzidine solution: dissolve 0.1 g diaminobenzidine in 100 ml solution IV, Set pH to 5.5.
  • VI Eindecklösung: 9 Volumenteile Glycerin mit 1 Volumenteil Lösung I mischen.VI mounting solution: 9 volumes of glycerol with 1 volume of solution I mix.

Zur Probenvorbereitung wird 1 Volumenteil Probandenserum mit 9 Volumenteilen Lösung II gemischt.1 volume of test sample serum is used for sample preparation mixed with 9 parts by volume of solution II.

Der Test wird bei Raumtemperatur, 18-25°C, durchge­ führt:The test is carried out at room temperature, 18-25 ° C leads:

  • - 15 Mikroliter verdünntes Probandenserum sind auf eine Auftragsstelle, die infizierte Zellen enthält, aufzutropfen. Ebenfalls 15 Mikroliter sind auf die darüberliegende Auftragsstelle, die nicht infizierte Zellen enthält, zu pipettieren. Auf jedem Objektträger sind zwei Positionen für ein Positivserum und ein Negativserum als Kontrollen vorgesehen. Der Objektträger wird in einer feuchten Kammer für 30 Minuten bei 37°C inkubiert.- 15 microliters of diluted test serum are on a job site that contains infected cells, to drip on. 15 microliters are also on the overlying job that is not infected Contains cells to pipette. On every slide are two positions for a positive serum and a negative serum is provided as controls. The slide is in a humid chamber for 30 minutes incubated at 37 ° C.
  • - Anschließend wird der Objektträger für 5 Minuten in 50 ml Lösung I gewaschen. Dieser Waschvorgang ist einmal zu wiederholen. Der Objektträger wird sodann an der Luft getrocknet.- Then slide the slide for 5 minutes washed in 50 ml of solution I. This washing process is to repeat once. The slide is then air dried.
  • - 15 Mikroliter Antikörper-Konjugat (Lösung III) sind auf die Auftragsstellen zu pipettieren. Der Objektträger wird dann in einer feuchten Kammer für 30 Minuten bei 37°C inkubiert.15 microliter antibody conjugate (solution III) are pipetted onto the application points. The Slides are then placed in a humid chamber for Incubated for 30 minutes at 37 ° C.
  • - Der Objektträger wird anschließend für 5 Minuten in 50 ml Lösung I gewaschen. Dieser Waschvorgang ist einmal zu wiederholen. - The slide is then left for 5 minutes washed in 50 ml of solution I. This washing process is to repeat once.  
  • - Zu 100 ml Lösung V werden 30 Mikroliter H₂O₂ gegeben, die Lösung wird intensiv gemischt und der Objektträger wird unter Lichtabschluß für 30 Minuten in dieser Lösung inkubiert.- 30 microliters of H₂O₂ are added to 100 ml of solution V, the solution is mixed intensively and the slide is under light for 30 minutes incubated in this solution.
  • - Der Objektträger wird anschließend für 5 Minuten in 50 ml Lösung I gewaschen. Dieser Waschvorgang ist einmal zu wiederholen, anschließend wird der Objektträger an der Luft getrocknet.- The slide is then left for 5 minutes washed in 50 ml of solution I. This washing process is Repeat once, then slide air dried.
  • - 5 Mikroliter Lösung IV sind auf die Auftragsstellen zu pipettieren und diese mit Deckgläschen abzu­ decken.- 5 microliters of Solution IV are on the job sites to pipette and cover with cover glasses cover.

Der Objektträger wird im Lichtmikroskop bei einer Gesamtvergrößerung von 200× untersucht. Als positiv und damit indikativ für die Präsenz von anti-HTLV-III-Antikörpern und/oder anti-HTLV-I-Antikörpern werden dunkle Präzipitate gewertet, die ringförmig an den infizierten Zellen auftreten. Wird mit einem Serum eine Färbung sowohl an infizierten als auch an nicht infizierten Zellen erhalten, muß davon ausgegangen werden, daß das Serum anti-HTLV-I-Antikörper oder kreuzreagierende Antikörper enthält, die nicht mit einer HTLV-III-Infektion korrelieren.The slide is in the light microscope at a Total magnification of 200 × examined. As positive and thus indicative of the presence of anti-HTLV-III antibodies and / or anti-HTLV-I antibodies dark precipitates are evaluated, which are ring-shaped occur on the infected cells. Will with one Serum stained both infected and on receive uninfected cells, must be assumed be that the serum anti-HTLV-I antibody or contains cross-reacting antibodies that do not correlate with HTLV-III infection.

Beispiel 10Example 10

Der ELISA zur in vitro Bestimmung von anti-HTLV-III- bzw. anti-HTLV-I-Antikörpern im Serum wird wie folgt durchgeführt:The ELISA for the in vitro determination of anti-HTLV-III or anti-HTLV-I antibodies in the serum is as follows carried out:

Entsprechend Beispiel 9 können Serumantikörper gegen HTLV-III und/oder HTLV-I nachgewiesen werden, indem sie in einer Sekundärreaktion mit Phosphatase-markierten Antikörpern, die gegen menschliches Immunglobulin gerichtet sind, umgesetzt werden. Die Menge des gebundenen Sekundärantikörpers ist abhängig vom anti-HTLV-III-Antikörpergehalt und/oder anti-HTLV-I-Antikörpergehalt der Serumprobe. Nichtgebundene Sekundärantikörper werden durch Waschen entfernt. Die zellgebundene Phosphatase setzt ein Substrat um, welches sichtbares Licht absorbiert. Diese Lichtabsorption, die der Menge an gebundenen Serumantikörpern entspricht, wird in einem Photometer quantifiziert. Für diese Art des Nachweissystems würde jedoch vorzugsweise eine Zellinie eingesetzt werden, welche zu einer höheren Frequenz virale Antigene exprimiert, wie z. B. klonierte und selektionierte Varianten der Zellinien 191 TJ (ECACC, 86090501) und HUT 78 (ATCC, TIB 161).According to Example 9, serum antibodies against HTLV-III and / or HTLV-I can be demonstrated by they labeled with phosphatase in a secondary reaction Antibodies against human immunoglobulin are implemented. The amount  of the bound secondary antibody depends on anti-HTLV-III antibody content and / or anti-HTLV-I antibody content the serum sample. Unbound Secondary antibodies are removed by washing. The cell-bound phosphatase converts a substrate which absorbs visible light. This light absorption, that of the amount of bound serum antibodies is quantified in a photometer. For this type of detection system, however, would preferably a cell line is used, which lead to higher frequency viral antigens expressed such. B. cloned and selected Variants of the cell lines 191 TJ (ECACC, 86090501) and HUT 78 (ATCC, TIB 161).

Testdurchführung mit Objektträgern als festen Träger für fixierte Zellen:Test execution with slides as fixed supports for fixed cells:

Als Reagentien werden benötigt:The following reagents are required:

Phosphatgepufferte Saline
Rinderserumalbumin
Antikörper-Phosphatase-Konjugat
Para-Nitrophenylphosphat
DiethanolaminpufferPhosphate buffered saline
Bovine serum albumin
Antibody-phosphatase conjugate
Para-nitrophenyl phosphate
Diethanolamine buffer

Herstellung der Lösungen:Manufacturing the solutions:

  • I Phosphatgepufferte Saline: 6 g NaCl, 1,8 g K₂HPO₄ × 3 H₂O und 0,27 g KH₂PO₄ in 1 l aqua bidest. lösen.I phosphate buffered saline: 6 g NaCl, 1.8 g K₂HPO₄ × 3 H₂O and 0.27 g KH₂PO₄ in 1 l double distilled water to solve.
  • II Probenpuffer: 0,5 g Rinderserumalbumin in 50 ml Lösung I lö­ sen. II sample buffer: 0.5 g bovine serum albumin in 50 ml solution I dissolve sen.  
  • III Antikörper-Phosphatase-Konjugat: 1 Volumenteil des anti-IgG-Antikörper-Phosphatase-Konjugats mit 40 Volumenteilen Lösung II mischen.III Antibody-Phosphatase Conjugate: 1 volume of the anti-IgG antibody-phosphatase conjugate with 40 parts by volume of solution II Mix.
  • IV Diethanolaminpuffer: Eine 1molare Lösung von Diethanolamin, die Mg Cl₂ in einer Konzentration von 0,5 mM enthält, wird auf pH 9,8 eingestellt.IV Diethanolamine Buffer: A 1 molar solution of diethanolamine, the Mg Contains Cl₂ in a concentration of 0.5 mM, is adjusted to pH 9.8.
  • V Para-Nitrophenylphosphatlösung: 0,1 g para-Nitrophenylphosphat in 100 ml Lösung IV lösen.V Para-nitrophenyl phosphate solution: 0.1 g para-nitrophenyl phosphate in 100 ml of solution IV to solve.

Zur Probenvorbereitung werden 1 Volumenteil Probandenserum mit 9 Volumenteilen Lösung II gemischt.For the preparation of the sample, 1 volume part of the sample serum is used mixed with 9 parts by volume of solution II.

Der Test wird bei Raumtemperatur, 18 bis 25°C, durchge­ führt.The test is carried out at room temperature, 18 to 25 ° C leads.

Zur Probenvorbereitung wird 1 Volumenteil Probandenserum mit 9 Volumenteilen Lösung II gemischt.1 volume of test sample serum is used for sample preparation mixed with 9 parts by volume of solution II.

Der Test wird bei Raumtemperatur, 18-25°C durchge­ führt:The test is carried out at room temperature, 18-25 ° C leads:

  • - 15 Mikroliter verdünntes Probandenserum sind auf eine Auftragsstelle, die infizierte Zellen enthält, aufzutropfen. Ebenfalls 15 Mikroliter sind auf die darüberliegende Auftragsstelle, die nicht infizierte Zellen enthält, zu pipettieren. Auf jedem Objektträger sind zwei Positionen für ein Positivserum und ein Negativserum als Kontrollen vorgesehen. Der Objektträger wird in einer feuchten Kammer für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. - 15 microliters of diluted test serum are on a job site that contains infected cells, to drip on. 15 microliters are also on the overlying job that is not infected Contains cells to pipette. On every slide are two positions for a positive serum and a negative serum is provided as controls. The slide is in a humid chamber for 30 minutes incubated at 37 ° C.  
  • - Anschließend wird der Objektträger für 5 Minuten in 50 ml Lösung I gewaschen. Dieser Waschvorgang ist einmal zu wiederholen. Der Objektträger wird sodann an der Luft getrocknet.- Then slide the slide for 5 minutes washed in 50 ml of solution I. This washing process is to repeat once. The slide is then air dried.
  • - 15 Mikroliter Antikörper-Konjugat (Lösung III) sind auf die Auftragsstellen zu pipettieren. Der Objektträger wird dann in einer feuchten Kammer für 30 Minuten bei 37°C inkubiert.15 microliter antibody conjugate (solution III) are pipetted onto the application points. The Slides are then placed in a humid chamber for Incubated for 30 minutes at 37 ° C.
  • - Der Objektträger wird anschließend für 5 Minuten in 50 ml Lösung I gewaschen. Dieser Waschvorgang ist einmal zu wiederholen.- The slide is then left for 5 minutes washed in 50 ml of solution I. This washing process is to repeat once.
  • - Der Objektträger wird getrocknet; auf jede Auftragsstelle werden 60 µl frisch angesetzte Lösung V pipettiert und der Objektträger wird für 30 Minuten in einer feuchten Kammer inkubiert.- The slide is dried; to every order point 60 µl of freshly prepared solution V pipetted and the slide is left for 30 minutes incubated in a humid chamber.
  • - Von jeder Auftragsstelle werden 50 µl der Substratlösung abgenommen und in einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen.- 50 µl of the substrate solution from each application point removed and in a spectrophotometer measured at a wavelength of 405 nm.

Die Menge an umgesetztem Substrat und damit die Lichtabsorption bei 405 nm entspricht der Menge an im Serum vorhandenen anti-HTLV-III- und/oder anti-HTLV-I-Antikörpern. Die von einem zu untersuchenden Probandenserum bewirkte Lichtabsorption wird verglichen mit der Absorption, die ein im Test mitgeführtes Negativserum bewirkt.The amount of substrate implemented and thus the Light absorption at 405 nm corresponds to the amount of anti-HTLV-III and / or anti-HTLV-I antibodies present in the serum. The one to be examined Subject serum induced light absorption is compared with the absorption that a carried in the test Negative serum causes.

Beispiel 11Example 11

Die cytofluorimetrische Untersuchung zur in vitro Bestimmung von anti-HTLV-III- bzw. anti-HTLV-I-Antikörpern im Serum wird wie folgt ausgeführt: The cytofluorimetric examination for in vitro Determination of anti-HTLV-III or anti-HTLV-I antibodies in the serum is carried out as follows:  

Humane T-Lymphocyten z. B. von der Art der HUT 78 (ATCC TIB 161) Zellen, der HUT 102 (ATCC, TIB 162) Zellen oder der 191 TJ (ECACC, 86090501) Zellen, sowie humane T-Lymphocyten derselben Art, die entsprechend dem Vorgehen in Beispielen 1 und 2 infiziert wurden und entsprechend den Beispielen 3 und 4 in situ fixiert wurden, werden mit zu untersuchendem Serum umgesetzt. Im ersten Inkubationsschritt binden die im Serum vorhandenen anti-HTLV-III- und/oder anti-HTLV-I-Antikörper an Virusproteine, die in die Plasmamembran infizierter Zellen integriert sind. Im zweiten Inkubationsschritt werden an die gebundenen Antikörper Fluoreszenz-markierte Antikörper, die gegen menschliches Immunglobulin gerichtet sind, gebunden. Die Menge des gebundenen Sekundärantikörpers ist abhängig von anti-HTLV-III- und/oder anti-HTLV-I-Antikörpergehalt der Serumprobe. Nicht gebundene Sekundärantikörper werden durch Waschen entfernt. Die zellgebundene Fluoreszenz wird in einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsorter gemessen. Die Auswertung erfolgt durch die Zählung von 10 000 bis 20 000 Einzelzellen und eine Verrechnung der Fluoreszenzintensität jeder Einzelzelle im Vergleich mit der Fluoreszenzintensität nicht infizierter Zellen. Für diese Art des Nachweissystems würde jedoch vorzugsweise eine Zellinie eingesetzt werden, welche zu einer höheren Frequenz virale Antigene exprimiert, wie z. B. klonierte und selektionierte Varianten der Zellinien 191 TJ (ECACC, 86090501) und HUT 78 (ATCC, TIB 161).Human T lymphocytes e.g. B. of the type of HUT 78 (ATCC TIB 161) cells, the HUT 102 (ATCC, TIB 162) Cells or the 191 TJ (ECACC, 86090501) cells, as well as human T-lymphocytes of the same type, which accordingly the procedure in Examples 1 and 2 infected and according to Examples 3 and 4 were fixed in situ, are to be examined Serum implemented. Bind in the first incubation step the anti-HTLV-III and / or present in the serum anti-HTLV-I antibodies to virus proteins that are in the Plasma membrane of infected cells are integrated. in the second incubation step are bound to the Antibodies fluorescence-labeled antibodies that are directed against human immunoglobulin, bound. The amount of secondary antibody bound depends on anti-HTLV-III and / or anti-HTLV-I antibody content the serum sample. Not bound Secondary antibodies are removed by washing. The cell-bound fluorescence is in one Fluorescence activated cell sorter measured. The Evaluation is done by counting from 10,000 to 20,000 single cells and a calculation of the fluorescence intensity each individual cell in comparison with the fluorescence intensity of uninfected cells. However, this type of detection system would be preferred a cell line can be used, which too expressing viral antigens at a higher frequency, such as B. cloned and selected variants of Cell lines 191 TJ (ECACC, 86090501) and HUT 78 (ATCC, TIB 161).

Als Reagentien werden benötigt:The following reagents are required:

Phosphatgepufferte Saline
Rinderserumalbumin
Antikörper-FITC-Konjugat
Suspension fixierter Zellen in einer Konzentration von 4 × 10⁷/mlPhosphate buffered saline
Bovine serum albumin
Antibody-FITC conjugate
Suspension of fixed cells in a concentration of 4 × 10⁷ / ml

Herstellung der Lösungen:Manufacturing the solutions:

  • I Phosphatgepufferte Saline: 6 g NaCl, 1,8 g K₂HPO₄ × 3 H₂O und 0,27 g KH₂PO₄ in 1 l aqua bidest. lösen.I phosphate buffered saline: 6 g NaCl, 1.8 g K₂HPO₄ × 3 H₂O and 0.27 g KH₂PO₄ in 1 l double distilled water to solve.
  • II Probenpuffer: 0,5 g Rinderserumalbumin in 50 ml Lösung I lö­ sen.II sample buffer: 0.5 g bovine serum albumin in 50 ml solution I dissolve sen.
  • III Antikörper-FITC-Konjugat: 1 Volumenteil des anti-IgG-Antikörper-FITC-Konjugats mit 40 Volumenteilen Lösung II mischen.III Antibody-FITC conjugate: 1 volume of the anti-IgG antibody-FITC conjugate mix with 40 parts by volume of solution II.

Zur Probenvorbereitung wird 1 Volumenteil Probandenserum mit 9 Volumenteilen Lösung II gemischt.1 volume of test sample serum is used for sample preparation mixed with 9 parts by volume of solution II.

Der Test wird bei Raumtemperatur (18-25°C) durch­ geführt:The test is carried out at room temperature (18-25 ° C) guided:

  • - 50 Mikroliter verdünntes Probandenserum wird mit 25 Mikrolitern Zellsuspension infizierter und nicht infizierter Zellen versetzt.
    Parallel sind Kontrollansätze mit Positivserum sowie Negativserum durchzuführen. Die Ansätze werden für 30 Minuten bei 37°C inkubiert.    - 50 microliters of diluted test serum is mixed with 25 microliters of cell suspension of infected and non-infected cells.
    Control approaches with positive serum and negative serum are to be carried out in parallel. The batches are incubated at 37 ° C. for 30 minutes.
  • - Die Zellen werden durch Zentrifugation sedimentiert, zweimal in Lösung I gewaschen und in je 20 Mikrolitern Lösung I resuspendiert.- The cells are sedimented by centrifugation, washed twice in solution I and in 20 each Microliters of solution I resuspended.
  • - 50 Mikroliter Antikörper-Konjugat werden jedem Ansatz zugesetzt; die Ansätze werden für weitere 30 Minuten bei 37°C inkubiert.- 50 microliters of antibody conjugate will each  Approach added; the approaches will continue for another 30 Incubated for minutes at 37 ° C.
  • - Die Zellen werden durch Zentrifugation sedimentiert, zweimal in Lösung I gewaschen und in 100 Mikrolitern Lösung I resuspendiert und im Zellsorter analysiert.- The cells are sedimented by centrifugation, washed twice in solution I and in 100 microliters Solution I resuspended and in the cell sorter analyzed.
Beispiel 12Example 12

Der fluoreszenzspektroskopische Nachweis zur in vitro Bestimmung von anti-HTLV-III- bzw. anti-HTLV-I-Antikörpern im Serum wird wie folgt ausgeführt:The fluorescence spectroscopic detection for in vitro Determination of anti-HTLV-III or anti-HTLV-I antibodies in the serum is carried out as follows:

Entsprechend dem Vorgehen in Beispiel 11 kann die zellgebundene Fluoreszenz auch in einem Photometer nachgewiesen werden: Die mit einem fluoreszierenden Sekundärantikörper markierten Zellen werden in einer Küvette fluoreszenzspektroskopisch untersucht, wobei das emittierte Licht, welches der Menge an gebundenem anti-HTLV-III- und/oder anti-HTLV-I-Antikörper entspricht, über Photomultiplier quantifiziert wird. Die Verrechnung der Fluoreszenzintensität erfolgt im Vergleich mit der Fluoreszenzintensität nicht infizierter Zellen. Für diese Art des Nachweissystems würde jedoch vorzugsweise eine Zellinie eingesetzt werden, welche zu einer höheren Frequenz virale Antigene exprimiert, wie zum Beispiel klonierte und selektionierte Varianten der Zellinien 191 TJ (ECACC, 86090501) und HUT 78 (ATCC, TIB 161).According to the procedure in Example 11, the cell-bound fluorescence also in a photometer can be detected: those with a fluorescent Secondary antibodies are labeled in a cell Cell examined by fluorescence spectroscopy, whereby the emitted light, which is the amount of bound anti-HTLV-III and / or anti-HTLV-I antibodies corresponds, is quantified via photomultiplier. The fluorescence intensity is calculated in the Comparison with the fluorescence intensity of non-infected Cells. For this type of detection system however, a cell line would preferably be used which lead to higher frequency viral antigens expressed, such as cloned and selected variants of the cell lines 191 TJ (ECACC, 86090501) and HUT 78 (ATCC, TIB 161).

Die Testdurchführung erfolgt wie in Beispiel 11 dargestellt. Nach dem letzten Waschschritt werden die Zellen in einem geeigneten Volumen PBS resuspendiert und in Meßküvetten überführt.The test is carried out as shown in Example 11. After the last washing step, the Cells resuspended in an appropriate volume of PBS and transferred to measuring cuvettes.

Claims (24)

1. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen T-lymphotrope Viren durch Umsetzung der zu untersuchenden Probe mit einer humanen Zellinie, die mit T-lymphotropen Viren infiziert ist, und anschließende Markierung mit Hilfe eines zweiten, gegen menschliche Antikörper gerichteten Antikörpers oder Antikörperfragments, welche einen Marker tragen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zellinie verwendet wird, von der nur ein Teil der Zellen nach der Infektion mit T-lymphotropen Viren detektierbar virale Antigene exprimiert, und bei der die negativ reagierenden Zellen als interner Standard verwertet werden.1. Method for the detection of antibodies against T-lymphotropic viruses by reacting the sample to be examined with a human cell line which is infected with T-lymphotropic viruses, and subsequent labeling with the aid of a second antibody or antibody fragment directed against human antibodies, which one Bear markers, characterized in that a cell line is used, of which only a part of the cells expresses detectable viral antigens after infection with T-lymphotropic viruses, and in which the negatively reacting cells are used as an internal standard. 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisenden Antikörper Antikörper gegen T-lymphotrope Viren sind, die ursächlich mit den Erkrankungen AIDS, ARC (Aids related complex) oder Lymphadenopathie korrelieren.2. The method according to claim 1, characterized in that the antibodies to be detected antibodies against T-lymphotropic Viruses are the cause of the diseases AIDS, ARC (Aids related complex) or lymphadenopathy correlate. 3. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisenden Antikörper Antikörper gegen HTLV-III/LAV-1-Viren sind.3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that that the antibodies to be detected antibodies against HTLV-III / LAV-1 viruses. 4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisenden Antikörper Antikörper gegen HTLV-I-Viren sind.4. The method according to claim 1, characterized in that the antibodies to be detected antibodies against HTLV-I viruses are. 5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisenden Antikörper Antikörper gegen STLV-I-Viren sind. 5. The method according to claim 1, characterized in that the antibodies to be detected antibodies against STLV-I viruses are.   6. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisenden Antikörper Antikörper gegen Varianten des HTLV-III/LAV-1-Virus sind.6. The method according to claims 1 to 3, characterized in that that the antibodies to be detected are antibodies against variants of the HTLV-III / LAV-1 virus. 7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Varianten des HTLV-III/LAV-1-Virus, LAV-2- oder HTLV-IV-Viren sind.7. The method according to claim 6, characterized in that the variants of the HTLV-III / LAV-1 virus, LAV-2 or HTLV-IV viruses are. 8. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß simultan Antikörper gegen HTLV-I-Viren neben Antikörpern gegen HTLV-III/LAV-1-Viren und Varianten von HTLV-III/LAV-1-Viren nachgewiesen werden.8. The method according to claims 1 to 7, characterized in that that simultaneously antibodies against HTLV-I viruses in addition to antibodies against HTLV-III / LAV-1 viruses and variants of HTLV-III / LAV-1 viruses. 9. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine durch HTLV-I Viren oder STLV-I-Viren transformierte Zellinie verwendet wird, die konstitutiv zu mehr als 50% HTLV-I-Antigen oder STLV-I-Antigen in der äußeren Zellmembran exprimiert.9. The method according to claims 1 to 8, characterized in that one by HTLV-I viruses or STLV-I viruses transformed cell line is used which is constitutive to more than 50% HTLV-I antigen or STLV-I antigen in the outer cell membrane expressed. 10. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellinie STLV-I-Antigene konstitutiv exprimiert, die stark mit anti-HTLV-I-Antikörpern kreuzreagieren.10. The method according to claims 1 to 9, characterized in that the cell line is constitutive of STLV-I antigens expressed strongly with anti-HTLV-I antibodies cross-react. 11. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellinie Syncytien auszubilden vermag.11. The method according to claims 1 to 10, characterized in that the cell line form syncytia can 12. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellinie HUT 78 (ATCC, TIB 161) eingesetzt wird.12. The method according to claims 1 to 3, 6 and 7, characterized characterized in that the cell line HUT 78 (ATCC, TIB 161) is used. 13. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die beschriebenen Zellen 191 TJ Zellen sind (ECACC, 86090501). 13. The method according to claims 1 to 11, characterized in that the cells described 191 TJ cells are (ECACC, 86090501).   14. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß fixierte Zellen dieser Zellinien eingesetzt werden.14. The method according to claims 1 to 13, characterized in that that fixed cells of these cell lines are used will. 15. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen eingesetzt werden, die in situ und nativ mit Aldehyden fixiert wurden und als nicht infektiöses zelluläres Reagens für den Antikörpernachweis eingesetzt werden.15. The method according to claims 1 to 13, characterized in that cells are used that are in situ and were fixed natively with aldehydes and not infectious cellular reagent for antibody detection be used. 16. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die gegen Antigen-Antikörper-Komplexe eingesetzten zweiten Antikörper mindestens eine Struktureinheit gebunden haben, die entweder elektromagnetische Wellen absorbiert, fluoresziert, chemiluminesziert, radioaktiv ist oder mit einem Enzym markiert ist.16. The method according to claims 1 to 15, characterized in that the antigen-antibody complexes second antibody used at least one structural unit have bound either electromagnetic Absorbs waves, fluoresces, chemiluminesces, is radioactive or labeled with an enzyme is. 17. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der Antikörper gegen T-lymphotrope Viren ein zellulärer ELISA, ein zellulärer RIA oder die zelluläre Immunfluoreszenzmikroskopie eingesetzt wird.17. The method according to claims 1 to 16, characterized in that to detect the antibodies against T-lymphotropic viruses a cellular ELISA, a cellular one RIA or cellular immunofluorescence microscopy is used. 18. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der Antikörper gegen T-lymphotrope Viren die Cytofluorimetrie, die Fluoreszenzspektralphotometrie oder ein ELISA eingesetzt wird.18. The method according to claims 1 to 16, characterized in that that to detect the antibodies against T-lymphotropic viruses cytofluorimetry, fluorescence spectrophotometry or an ELISA is used. 19. Verwendung einer Zellinie, die mit T-lymphotropen Viren infiziert ist, bei der nur teilweise virale Antigene des infizierenden T-lymphotropen Virus exprimiert sind, wobei die negativ reagierenden Zellen als interner Standard verwertet werden, zum Nachweis von Antikörpern gegen T-lymphotrope Viren. 19. Use of a cell line containing T-lymphotropic viruses is infected with only partially viral antigens of the infecting T-lymphotropic virus are, with the negatively reacting cells as internal Standard be used for the detection of antibodies against T-lymphotropic viruses.   20. Verwendung einer Zellinie gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch HTLV-I-Viren oder STLV-I-Viren transformiert ist und konstitutiv zu mehr als 50% HTLV-I-Antigen oder STLV-I-Antigen in der äußeren Zellmembran exprimiert.20. Use of a cell line according to claim 19, characterized characterized by HTLV-I viruses or STLV-I viruses is transformed and constitutive to more than 50% HTLV-I antigen or STLV-I antigen in the outer cell membrane expressed. 21. Verwendung einer Zellinie gemäß Anspruch 19 zum simultanen Nachweis verschiedener T-lymphotroper Viren.21. Use of a cell line according to claim 19 for simultaneous Detection of various T-lymphotropic viruses. 22. Verwendung einer Zellinie gemäß den Ansprüchen 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellinie Syncytien auszubilden vermag.22. Use of a cell line according to claims 19 to 21, characterized in that the cell line syncytia can train. 23. Verwendung einer Zellinie gemäß den Ansprüchen 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellinie HUT 78 (ATCC, TIB 161) eingesetzt wird.23. Use of a cell line according to claims 19 to 22, characterized in that the cell line HUT 78 (ATCC, TIB 161) is used. 24. Verwendung einer Zellinie gemäß den Ansprüchen 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellinie 191 TJ (ECACC, 86090501) eingesetzt wird.24. Use of a cell line according to claims 19 to 22, characterized in that the cell line 191 TJ (ECACC, 86090501) is used.
DE19863631016 1986-09-12 1986-09-12 Method and agents for detecting antibodies against T-lymphotropic viruses Granted DE3631016A1 (en)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19863631016 DE3631016A1 (en) 1986-09-12 1986-09-12 Method and agents for detecting antibodies against T-lymphotropic viruses
EP87113240A EP0260599A3 (en) 1986-09-12 1987-09-10 Method and agent for detecting antibodies against human and animal retroviruses, especially t-lymphotropic viruses

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19863631016 DE3631016A1 (en) 1986-09-12 1986-09-12 Method and agents for detecting antibodies against T-lymphotropic viruses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3631016A1 DE3631016A1 (en) 1988-03-24
DE3631016C2 true DE3631016C2 (en) 1989-02-09

Family

ID=6309408

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19863631016 Granted DE3631016A1 (en) 1986-09-12 1986-09-12 Method and agents for detecting antibodies against T-lymphotropic viruses

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE3631016A1 (en)

Also Published As

Publication number Publication date
DE3631016A1 (en) 1988-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0770679B2 (en) HCV-specific peptides, preparations related to them and their use
Bar-Joseph et al. Detection of citrus tristeza virus. I. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and SDS-immunodiffusion methods
EP0944832B1 (en) ANTIGEN-SPECIFIC IgM DETECTION
EP0407904B1 (en) Method for the determination of an analyte
EP2223111A1 (en) Elispot method having two filter systems
EP0922958B1 (en) Interference reduction in diagnostic methods using D-amino acid peptides
EP0825441B1 (en) Sensitivity enhancement in the immunochemical determination of an analyte
DE60012140T2 (en) USE OF URINTRYPSINE INHIBITOR FOR THE DIAGNOSIS OF AIDS
EP0265851B1 (en) Method for the determination of anti-HIV, means therefor and their use in this method
EP0572845B1 (en) Method for immunochemical measurement of an analyte
DE3631016C2 (en)
AT397581B (en) METHOD FOR DETERMINING ANTI-P.FALCIPARUM-SPOROZOIT ANTIBODIES IN HUMAN BLOOD
DE60218321T2 (en) IDENTIFICATION OF THE VIRUS OF THE VIRAL RINDER DIARRHOE IN TISSUE SAMPLES
DE69632535T2 (en) PEPTIDES FOR DETECTING HIV-1
DE69929468T2 (en) IMPROVED SPECIFICITY IN THE DETECTION OF ANTI-RUBELLA IgM ANTIBODIES
DE69836265T2 (en) SYNTHETIC PEPTIDES FOR TEST METHODS FOR DETERMINING THE INFECTION WITH VIRUS HIV1 OF GROUP O
EP0538703B1 (en) Method to detect the presence or absence of Epstein-Barr virus infections
EP1594890B1 (en) Peptide derived from a vca-p18 capside antigen of the epstein-barr virus and the use thereof
DE60311278T2 (en) IMMUNOCHROMATOGRAPHY SYSTEM AND METHOD FOR THE SIMULTANEOUS IDENTIFICATION OF AGA AND T-TG ANTIBODIES AND USE THEREOF FOR THE DIAGNOSIS OF CELIAC DISEASE
DE19514089C2 (en) Detection procedure for HIV-TAT
DE69333201T2 (en) Device and test for the determination of an antigen or an antibody in a test sample
DE4120281C2 (en) Immunochemical method for the simultaneous detection of several different antibody specificities, peptide mixtures and test therefor
EP0062227A1 (en) Artificial control and reference serum, method of making the same and its use
EP0800084A1 (en) Technique for detecting infections with TBE-virus and other flaviviruses
EP0589348A2 (en) Method for immunological quantification of inactivated antigenes

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
8127 New person/name/address of the applicant

Owner name: DIAGEN INSTITUT FUER MOLEKULARBIOLOGISCHE DIAGNOST

D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition