DE3613311A1 - Process for the continuous isolation of exoenzymes - Google Patents

Process for the continuous isolation of exoenzymes

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Abstract

The isolation of exoenzymes by cultivation of exoenzyme-producing bacteria in a continuous flow fermenter is achieved by continuously maintaining an oxygen limitation corresponding to a maximum exoenzyme production in the culture, which is achieved in particular by controlling the input of oxygen depending on a monitoring of the redox voltage in the culture. It is expedient for the biomass concentration in the fermenter to be maximised, which is controlled with the aid of the residence time and/or the redox voltage of the culture, where appropriate with additional biomass retention, but no nutrient limitation should occur during this. It is expedient for the redox voltages to be between 0 and -100 mV, in particular about -15 to -50 mV, with the culture at a pH of about 6.0.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur kontinuierlichen Gewinnung von Exoenzymen durch Kultivierung von exoenzymproduzierenden Bakterien in einem Fermenter mit kontinuierlichem Durchfluß.The invention relates to a method for the continuous production of exoenzymes by cultivating exoenzyme-producing Bacteria in a fermenter with continuous Flow.

Exoenzyme wie Proteasen, Xylanasen, Amylasen etc. werden durch Kultivierung von Bakterien, insbesondere von Stämmen der Gattung Bacillus gewonnen. Ihre Herstellung erfolgt bis heute im allgemeinen lediglich in diskontinuierlicher (Batch-)Fermentation, da die Ausschüttung dieser Enzyme durch die Organismen in kontinuierlicher Kultur (Chemostat) rasch nachläßt (F. G. Priest, Bacteriological Reviews, Bd. 41, Nr. 3, S. 711-753).Exoenzymes such as proteases, xylanases, amylases etc. are cultivated by bacteria, especially strains of the genus Bacillus won. They are still manufactured today generally only in batch (Batch) fermentation since the distribution of this Enzymes by the organisms in continuous Culture (chemostat) rapidly subsides (F.G. Priest, Bacteriological Reviews, Vol. 41, No. 3, p. 711-753).

Die Gründe für das Nachlassen der Exoenzymausschüttung, sobald man eine Batchfermentation in eine kontinuierliche Fermentation überführt, sind noch nicht vollständig geklärt. Die Beobachtung, daß die Exoenzymproduktion in der Batchkultur hauptsächlich in der spätlogarithmischen und stationären Phase sowie vor der Sporenbildung stattfindet, nicht dagegen in der logarithmischen Wachstumsphase (B. N. Dancer u. J. Mandelstam, J. Bacteriol. 121 (1975) Seiten 411-415), läßt darauf schließen, daß Exoenzyme im allgemeinen zwar konstitutiv gebildet werden, jedoch einer Katabolitrepression unterliegen (P. Schaeffer, Bacteriol. Rev. 33 (1969) Seiten 48-71). Für eine Katabolitrepression spricht auch die Beobachtung, daß die Exoenzymproduktion desto höher ist, je schwerer die C-Quelle im Medium für die Organismen zu verwerten ist (V. Moses u. P. B. Sharp, J. Gen. Microbiol. 71 (1972) Seiten 181-190), d. h. die Verwendung von Glycerin oder Lactose als C-Quelle führt zu einer besseren Enzymausbeute als die Verwendung von Glucose.The reasons for the decrease in exoenzyme release, once you have a batch fermentation transferred to a continuous fermentation, have not yet been fully clarified. The observation, that exoenzyme production in the Batch culture mainly in the late logarithmic and stationary phase as well as before Spore formation takes place, but not in the logarithmic growth phase (B. N. Dancer  u. J. Mandelstam, J. Bacteriol. 121 (1975) Pages 411-415), suggests that Exoenzymes are generally constitutive but are subject to catabolite repression (P. Schaeffer, Bacteriol. Rev. 33 (1969) Pages 48-71). For catabolite repression also speaks the observation that exoenzyme production the higher the heavier the C source to be used in the medium for the organisms (V. Moses and P. B. Sharp, J. Gen. Microbiol. 71 (1972) pp. 181-190), d. H. the usage of glycerin or lactose as a C source for a better enzyme yield than the use of glucose.

Ausgehend von einer solchen Katabolitrepression wurden verschiedentlich mehrstufige kontinuierliche Fermentationsverfahren vorgeschlagen (J. A. Tsaplina u. L. G. Loginova, in 5. Int. Fermentation Symp. Versuchs- und Lehranstalt für Spiritusfabrikation und Fermentationstechnologie, Berlin, Herausg. Dellweg, Seite 262), die jedoch für eine technische Produktion nicht befriedigen.Starting from such a catabolite repression have been variously multi-level continuous Fermentation process proposed (J.A. Tsaplina and L.G. Loginova, in 5th Int. Fermentation Symp. Experimental and educational institute for alcohol production and fermentation technology, Berlin, ed. Dellweg, page 262), but not for technical production to satisfy.

Von der Anmelderin wurde nun in einer vorangehenden De-Patentanmeldung P 35 24 273.6-41 vom 6. 7. 1985) gezeigt, daß die mit Erreichen des steady-states der Fermentation schon weitgehend abgeklungene Exoenzymproduktion (s. z. B. Fig. 6) wieder angeregt werden kann, wenn man in der Kultur wiederkehrend einen auf eine Dezimierung folgenden Vermehrungszustand herbeiführt, was besonders zweckmäßig durch eine wiederkehrende mehr oder minder kurzzeitige Aufprägung eines wachstumsinhibierenden Einflusses, insbesondere durch Auslenkung des pH-Wertes erreicht wird, wie aus Fig. 7 hervorgeht:The applicant has now shown in a previous de-patent application P 35 24 273.6-41 dated July 6, 1985) that the exoenzyme production which has largely subsided when the fermentation has reached steady state (see, for example, FIG. 6) is stimulated again can be achieved if a propagation state that follows a decimation is recurrently brought about in the culture, which is particularly expediently achieved by a recurring more or less short-term imprinting of a growth-inhibiting influence, in particular by deflection of the pH value, as can be seen from FIG. 7:

Daraus ist ersichtlich, daß jeweils nach pH-absenkungsbedingter Abnahme der Biomassekonzentration ein Wiederanstieg derselben und zusammen damit eine erneute Zunahme der Exoenzymbildung auftritt.From this it can be seen that in each case after pH-lowering Decrease in biomass concentration a resurgence of the same and together with it a renewed increase in exoenzyme formation occurs.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß eine praktisch stetige Enzymproduktion im kontinuierlichen Betrieb erreicht werden kann, wenn man sauerstofflimitiert arbeitet.It has now surprisingly been found that a practically steady enzyme production can be achieved in continuous operation can if you work with limited oxygen.

Das erfindungsgemäße Verfahren der eingangs genannten Art ist daher im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß man in der Kultur fortlaufend eine maximaler Exoenzymproduktion entsprechende Sauerstoff-Limitierung aufrechterhält.The inventive method of the beginning is essentially because of this type characterized that one is continuous in culture corresponding to a maximum exoenzyme production Oxygen limitation maintained.

Als Mikroorganismen dienen dabei exoenzymproduzierende Bakterien, insbesondere der Gattung Bacillus. Speziell untersucht wurde die Art Bacillus amyloliquefaciens, Stämme DSM 7 und DSM 1061.Exoenzyme-producing serve as microorganisms Bacteria, especially of the genus Bacillus. Art Bacillus amyloliquefaciens, strains DSM 7 and DSM 1061.

Zur Veranschaulichung der Erfindung wird zunächst auf Fig. 8 Bezug genommen: Diese zeigt eine durch wiederkehrende pH-Absenkung "periodisch angestoßene" Xylanasebildung im Durchflußfermenter, bei der gleichzeitig die Redoxspannung aufgezeichnet wurde:To illustrate the invention, reference is first made to FIG. 8: This shows a "periodically initiated" xylanase formation in the flow-through fermenter by means of a recurrent pH reduction, in which the redox voltage was recorded at the same time:

Man erkennt, daß maximale Enzymkonzentrationen in der Kultur mit mittleren Redoxspannungen im Abfallbereich übereinstimmen, wie auch aus der eine einzelne Periode wiedergebenden Fig. 9 ersichtlich ist.It can be seen that maximum enzyme concentrations in the culture correspond to average redox voltages in the waste region, as can also be seen from FIG. 9 which represents a single period.

Es ist nun möglich, eine praktisch stetige Exoenzymbildung in der Kultur zu erreichen, wenn man die maximaler Exoenzymkonzentration entsprechenden Redoxspannungen kontinuierlich aufrechterhält, indem man in der Kultur fortlaufend für einen solchen Sauerstoffeintrag sorgt, der maximaler Exoenzymproduktion entspricht.It is now possible to be practically steady To achieve exoenzyme formation in culture, if you have the maximum exoenzyme concentration corresponding redox voltages continuously maintained by continuing in the culture ensures such an oxygen input, corresponds to the maximum exoenzyme production.

Zu diesem Zweck wird die den Sauerstoffgehalt der Kulter sehr empfindlich anzeigende Redoxspannung im Fermenter überwacht und als Regelparameter für den Sauerstoffeintrag benutzt, der insbesondere über die Rührgeschwindigkeit variiert wird.For this purpose, the oxygen content the cult shows very sensitive redox voltage monitored in the fermenter and as control parameters used for the oxygen entry, the in particular varies over the stirring speed becomes.

Nützlicherweise enthält die Kultur ein Antischaummittel bekannter Art, wie z. B. Polypropylenglycol oder Siliconöl, um ggf. stärkere Schaumbildung bei dem über die Rührgeschwindigkeit geregelten Sauerstoffeintrag zu unterdrücken.The culture usefully contains an anti-foaming agent known type, such as. B. polypropylene glycol or silicone oil in order to increase foam formation the one controlled by the stirring speed Suppress oxygen entry.

Da durch das erfindungsgemäße Prinzip der Redox- Regelung über den Sauerstoffeintrag verhindert wird, daß die Bakterienkultur in einer steady-state einläuft, die Kultur also die Tendenz zeigt, in ihrer Konzentration immer weiter zuzunehmen oder aber auszuwaschen, ist es dringend erwünscht, die Biomassekonzentration durch geeignete Maßnahmen im gewünschten Rahmen zu halten. Since the principle of redox Control over the oxygen entry prevented is that the bacterial culture is in a steady-state comes in, so culture shows the tendency increasing in concentration or to wash out, it is highly desirable the biomass concentration through suitable measures to keep within the desired framework.  

Zu diesem Zweck wird insbesondere eine zweite Regelung vorgesehen, bei der die Biomassekonzentration aufgrund kontinuierlicher Messung derselben (optischen Dichte) durch Variation der Verweilzeit im Fermenter und/oder der Redoxspannung der Kultur geregelt wird. Die Redoxspannung soll dabei selbstverständlich im Bereich optimaler Enzymproduktion bleiben.For this purpose, a second one in particular Regulation provided for the biomass concentration due to continuous measurement the same (optical density) by variation the dwell time in the fermenter and / or the redox voltage the culture is regulated. The redox voltage should of course in the area optimal enzyme production.

Vorzugsweise wird bei der erfindungsgemäßen sauerstofflimitierten Exoenzymbildung im Durchflußfermenter für eine möglichst hohe Biomassekonzentration im Reaktor gesorgt, die jedoch noch keiner Nährstofflimitierung (Kohlenstoff, Stickstoff etc.) unterliegt. Zusätzlich kann die Biomasse nach bekannten Verfahren zurückgehalten und über eine Variation der Rückhalterate eine optimale Biomassekonzentration aufrechterhalten werden. Preferably in the invention Oxygen-limited exoenzyme formation in the flow fermenter for the highest possible biomass concentration worried in the reactor, however no nutrient limitation (carbon, Nitrogen etc.). Additionally can the biomass is retained using known methods and by varying the retention rate an optimal biomass concentration be maintained.  

Die maximaler Exoenzymproduktion entsprechende Redoxspannung (bzw. das Redoxpotential) hängt - dem Betrag nach - selbstverständlich von den für die Fermentation gewählten Parametern, wie insbesondere pH-Wert, Nährstoffzusammensetzung und -konzentration, Belüftungsrate, speziellem Mikroorganismus, Temperatur etc. ab.Corresponding to the maximum exoenzyme production Redox voltage (or the redox potential) depends - the amount - of course from the parameters chosen for the fermentation, such as especially pH, nutrient composition and concentration, ventilation rate, special Microorganism, temperature etc.

D. h. der jeweils einzuregelnde Sauerstoffeintrag (bzw. die jeweils einzuhaltende Redoxspannung) wird für eine spezielle Produktion tunlichst zu Beginn unmittelbar im jeweiligen Fermentationssystem bestimmt.I.e. the oxygen input to be regulated in each case (or the redox voltage to be observed in each case) is as possible for a special production at the beginning directly in the respective fermentation system certainly.

Wie aus den beigefügten Kurvenbildern ersichtlich ist, werden relativ enge Sauerstoffeintragsbereiche eingeregelt im Bereich sehr geringer Sauerstoffgehalte in der Kultur, deren Erfassung und Regelung einen so empfindlichen Indikator wie das Redoxpotential voraussetzt:As can be seen from the attached graphs is relatively narrow oxygen entry areas adjusted in the area very low Oxygen levels in the culture, their detection and regulation such a sensitive indicator as the redox potential presupposes:

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Beispielen beschrieben unter Bezugnahme auf die angefügten Zeichnungen; es zeigen:The invention is illustrated below by means of examples described with reference to the attached drawings; show it:

Fig. 1 bis 5 Kurven für die kontinuierliche Xylanasebildung; Fig. 1 to 5 for the continuous curves Xylanasebildung;

Fig. 6 eine ungesteuerte Xylanasebildung in einem Durchflußfermenter; Fig. 6 is an uncontrolled Xylanasebildung in a Durchflußfermenter;

Fig. 7 die quasikontinuierliche Xylanasebildung durch wiederkehrende pH-Absenkung; Fig. 7, the quasi-continuous Xylanasebildung by recurrent pH reduction;

Fig. 8 Kurven analog zu Fig. 7 mit gleichzeitigem Redoxspannungsauftrag und Fig. 8 curves analogous to Fig. 7 with simultaneous ORP and

Fig. 9 Biomassekonzentration, Xylanasebildung und Redoxspannung einer Periode bei quasikontinuierlicher Arbeitsweise gem. Fig. 7 und 8. Fig. 9 biomass concentration, xylanase formation and redox voltage of a period in quasi-continuous mode of operation acc. Fig. 7 and 8.

Die folgenden Beispiele 1 und 2 beschreiben zwei unterschiedliche Zeitabschnitte derselben über einen längeren Zeitraum laufenden kontinuierlichen Fermentation, deren allgemeine Bedingungen somit exakt gleich waren; und zwar wurdenThe following examples 1 and 2 describe two different periods of the same continuous over a longer period of time Fermentation, its general conditions were therefore exactly the same; namely

Bakterien vom Stamm Bacillus amyloliquefaciens DSM 7 in einem Rührkesselreaktor (Fermenter) unter folgenden Bedingungen kultiviert:Bacteria from the Bacillus amyloliquefaciens strain DSM 7 in a stirred tank reactor (fermenter) cultivated under the following conditions:

7 l-Fermenter,3Typ (BIOSTAT"E" der Fa. B. BRAUN, Melsungen) Arbeitsvolumen,33 l Belüftung,36 l/min Druckluft (2 VVm) Rührertyp,3Turbo-Blattrührer Drehzahl,3300 Upm, wenn nicht vom Regler angesteuert pH,36,0, wenn nicht anders angegeben Verweilzeit,35 Stunden, wenn nicht anders angegeben. 7 l fermenter, 3 type (BIOSTAT "E" from B. BRAUN, Melsungen) Working volume, 33 l Ventilation, 36 l / min compressed air (2 VVm) Stirrer type, 3-turbo blade stirrer Speed, 3300 rpm, if not from the controller controlled pH, 36.0 unless otherwise stated Residence time, 35 hours, if not different specified.  

Bei dem zur Redoxregelung verwendeten Regler handelte es sich um einen PID-Regler (Fa. Foxboro), der das Redoxpotential durch Ansteuern der Rührerdrehzahl des Fermenters konstant auf dem vorgegebenen Sollwert hielt.With the controller used for redox control it was a PID controller (from Foxboro), which the redox potential by controlling the Stirrer speed of the fermenter constantly kept the specified target value.

Das zuvor sterilisierte Medium hatte folgende Zusammensetzung:The medium previously sterilized had the following Composition:

20g Glycerin  6g (NH4)2SO4  1,67g NaNO3  0,52g Mg(NO3)2 · 7 H2O  1g Hefeextrakt  2,72g KH2PO4  0,5g Zitronensäure 72mg CaCl2 · 2 H2O 10mg FeSO4 · 7 H2O  5mg MnSO4 · H2O  0,083ml Polypropylenglycol 2000  0,083ml Silicon-Antischaum-Emulsion M 30 (Fa. Serva) H2Oad 1000 ml20g glycerin 6g (NH 4 ) 2 SO 4 1.67g NaNO 3 0.52g Mg (NO 3 ) 2 · 7 H 2 O 1g yeast extract 2.72g KH 2 PO 4 0.5g citric acid 72mg CaCl 2 · 2 H 2 O 10 mg FeSO 4 .7 H 2 O 5 mg MnSO 4 .H 2 O 0.083 ml polypropylene glycol 2000 0.083 ml silicone antifoam emulsion M 30 (from Serva) H 2 Oad 1000 ml

Beispiel 1 (Vergleichsbeispiel):Example 1 (comparative example):

Die Bakterienkultur wurde im Zeitraum 1656 bis 1661 [h] durch eine pH-Absenkung zu einer Biomassedichteabnahme gezwungen, fing ab ca. t = 1686 [h] wieder an stark zuzunehmen und lief unter unveränderten Bedingungen (300 Upm, 2 VVm, τ = 5 Std.) ab ca. t = 1687 [h] in ein steady-state ein, der andauerte, bis drei t = 1710,7 [h] die Kultur erneut durch eine pH-Absenkung auf pH 5,0 zu einer Biomassedichteabnahme gezwungen wurde (Fig. 9; untere durchgezogene Kurve).In the period from 1656 to 1661 [h], the bacterial culture was forced to decrease the biomass density by lowering the pH, started to increase again from about t = 1686 [h] and ran under unchanged conditions (300 rpm, 2 VVm, τ = 5 Hours) from about t = 1687 [h] into a steady state, which continued until three t = 1710.7 [h] the culture was again forced to decrease the biomass density by lowering the pH to pH 5.0 ( Fig. 9; lower solid curve).

Das Redoxpotential (die Redoxspannung) nahm während der Biomassezunahme zunächst stark ab, verweilte dann von ca. t = 1682 bis 1693 [h] in einem Bereich von ca. 0 bis -50 mV und stürtze danach sehr schnell auf Werte um -290 mV ab, wo es bis t = 1710,7 verblieb (Fig. 9; obere Kurve).The redox potential (the redox voltage) initially decreased sharply during the increase in biomass, then lingered from approx. T = 1682 to 1693 [h] in a range from approx. 0 to -50 mV and then fell very quickly to values around -290 mV , where it remained until t = 1710.7 ( Fig. 9; upper curve).

Während des Ansteigens der Biomassekonzentration und des Einschwingens in den steady-state zeigte sich ein Ansteigen der Enzymkonzentration, die jedoch ab ca. t = 1693 [h] wieder zurückging (Fig. 9; untere gestrichelte Kurve).During the increase in the biomass concentration and the settling into steady-state, there was an increase in the enzyme concentration, which, however, decreased again from approx. T = 1693 [h] ( FIG. 9; lower dashed curve).

Die größte Enzymausbeute (∼2000 U Xylanase pro g Biotrockenmasse) wurde zwischen t = 1685 und 1693 [h] erhalten. Dies entspricht dem Zeitraum, in dem das Redoxpotential im dem Bereich 0 bis -50 mV lag. Danach ist eine starke Abnahme sowohl der Enzymkonzentration als auch der Enzymausbeute zu beobachten.The greatest enzyme yield (∼2000 U xylanase per g dry biomass) was obtained between t = 1685 and 1693 [h]. This corresponds to the period in which the redox potential was in the range 0 to -50 mV. After that, a sharp decrease in both the enzyme concentration and the enzyme yield can be observed.

Die Verweilzeit blieb während des beschriebenen Versuchsabschnitts konstant bei τ = 5 Stunden.The residence time remained constant at τ = 5 hours during the test section described.

Beispiel 2Example 2

Die Bakterienkultur wurde zum Zeitpunkt t = 1960 bis 1964 [h] durch eine pH-Absenkung zu einer Biomassedichteabnahme gezwungen und fing ab ca. t = 1977 [h] wieder an stark zuzunehmen (Fig. 1). The bacterial culture was forced to decrease the biomass density at a time t = 1960 to 1964 [h] by a pH decrease and started to increase again strongly from approx. T = 1977 [h] ( Fig. 1).

Gleichzeitig mit der Biomassezunahme nahm das Redoxpotential bis ca. t = 1985 [h] stark ab und hielt sich danach in einem Bereich von ca. 0 bis -50 mV (Fig. 2). Rechtzeitig, bevor das Redoxpotential, wie im Vergleichsbeispiel, auf niedrigere Werte abstürzen konnte, wurde zum Zeitpunkt t = 1988 [h] die Redox-Regelung eingeschaltet. Während die Rührerdrehzahl des Fermenters bis dahin auf konstant 300 Upm gehalten wurde, wurde die Rührerdrehzahl ab t = 1988 [h] extern vom Redox-Regler angesteuert, um das Redoxpotential auf dem jeweils vorgegebenen Redox-Sollwert zu halten.Simultaneously with the increase in biomass, the redox potential decreased sharply until approx. T = 1985 [h] and then remained in a range from approx. 0 to -50 mV ( FIG. 2). The redox control was switched on in good time before the redox potential could drop to lower values, as in the comparative example, at time t = 1988 [h]. While the stirrer speed of the fermenter had been kept at a constant 300 rpm until then, the stirrer speed was controlled externally by the redox controller from t = 1988 [h] in order to keep the redox potential at the respectively predefined redox setpoint.

Als erster Redox-Sollwert wurde von t = 1988 bis 1992 [h] -15 mV gewählt. Da dieser Sollwert geringfügig über dem letzten freien Redoxwert lag, konnte die Biomassekonzentration zunächst weiter zunehmen.From t = 1988 to 1992 [h] -15 mV was chosen as the first redox setpoint. Since this target value was slightly above the last free redox value, the biomass concentration was initially able to increase further.

Um eine zu starke Biomassezunahme oder -abnahme zu vermeiden, wurde bei t = 1989 und zu weiteren Zeitpunkten die Verweilzeit der kontinuierlichen Kultur variiert (Fig. 5).In order to avoid an excessive increase or decrease in biomass, the dwell time of the continuous culture was varied at t = 1989 and at other times ( FIG. 5).

Hauptsächlich ebenfalls zur Beeinflussung der Biomassedichte wurde der Redox-Sollwert innerhalb des Bereichs von -15 bis -50 mV variiert (Fig. 2).Mainly also to influence the biomass density, the redox setpoint was varied within the range from -15 to -50 mV ( Fig. 2).

Während des gesamten Zeitraums der Redoxregelung verlief die Enzymkonzentration etwa parallel zur Biomassedichte, so daß die Enzymausbeute konstant im Bereich von 2000 bis 3000 U Xylanase pro g Biotrockenmasse lag (Fig. 3 und 4).During the entire period of the redox control, the enzyme concentration was approximately parallel to the biomass density, so that the enzyme yield was constant in the range from 2000 to 3000 U xylanase per g of dry biomass ( FIGS. 3 and 4).

Die vorstehend beschriebenen Beispiele beziehen sich auf die Bildung von Xylanase. Analoge Verhältnisse wurden für Protease und Amylase gefunden.Obtain the examples described above relate to the formation of xylanase. Analogue Ratios were for protease and amylase found.

Die Aufarbeitung der Produktlösung des Fermentes erfolgt nach bekannten Methoden z. B. durch Zentrifugieren oder Cross-Flow-Filtration unter kontinuierlicher Abtrennung der Biomasse von der flüssigen Phase, aus der dann das Enzym bzw. die Enzyme in bekannter Weise, z. B. durch Aussalzen, abgetrennt und isoliert bzw. gereinigt werden.Working up the product solution of the ferment takes place according to known methods. B. by Centrifuge or cross flow filtration under continuous separation of the biomass from the liquid phase, from which the enzyme or the enzymes in a known manner, for. B. by Salt out, separate and isolate or clean will.

Claims (6)

1. Verfahren zur kontinuierlichen Gewinnung von Exoenzymen durch Kultivierung von exoenzymproduzierenden Bakterien in einem Fermenter mit kontinuierlichem Durchfluß, dadurch gekennzeichnet, daß man in der Kultur fortlaufend eine maximaler Exoenzymproduktion entsprechende Sauerstoff- Limitierung aufrechterhält.1. A process for the continuous production of exoenzymes by cultivating exoenzyme-producing bacteria in a fermenter with a continuous flow, characterized in that a maximum exoenzyme production corresponding to oxygen limitation is continuously maintained in the culture. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die maximaler Exoenzymproduktion entsprechende Sauerstoff-Limitierung durch fortlaufende Regelung des Sauerstoffeintrags abhängig von der kontinuierlich überwachten Redoxspannung der Kultur einhält.2. The method according to claim 1, characterized, that one corresponds to the maximum exoenzyme production Oxygen limitation through continuous Regulation of the oxygen input dependent from the continuously monitored redox voltage that adheres to culture. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine möglichst hohe Biomassekonzentration im Fermenter hält, die jedoch noch keiner Nährstoff- Limitierung unterliegt.3. The method according to claim 1 or 2, characterized, that you have the highest possible biomass concentration holds in the fermenter, which, however, has not yet Limitation is subject. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Biomassekonzentration mit Hilfe der Verweilzeit im Fermenter und/oder der Redoxspannung der Kultur regelt. 4. The method according to claim 3, characterized, that you can use the biomass concentration with the dwell time in the fermenter and / or the redox voltage regulates culture.   5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Biomassekonzentration zusätzlich durch Biomasserückhaltung unter Variation der Rückhalterate aufrechterhält.5. The method according to claim 4, characterized, that you have the biomass concentration in addition through biomass retention with variation of the Retention rate maintained. 6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Redoxspannung bei einem pH-Wert der Kultur von 6,0 zwischen 0 und -100 mV, insbesondere in der Gegend von -15 bis -50 mV, hält.6. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that the redox voltage at a pH the culture of 6.0 between 0 and -100 mV, especially in the range of -15 to -50 mV, holds.
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