DE3586181T2 - IMPROVED ANTIQUE COMPOSITION. - Google Patents

IMPROVED ANTIQUE COMPOSITION.

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DE3586181T2 DE8585905494T DE3586181T DE3586181T2 DE 3586181 T2 DE3586181 T2 DE 3586181T2 DE 8585905494 T DE8585905494 T DE 8585905494T DE 3586181 T DE3586181 T DE 3586181T DE 3586181 T2 DE3586181 T2 DE 3586181T2
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Description

Technisches GebietTechnical area

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung einer Antigenzusammensetzung bzw. -präparation, die in Wirbeltieren Antikörper erzeugen kann, die an fimbrielle Antigene des Typs 4 von bakteriellen Pathogenen bindet und die Antigenpräparation selbst.The present invention relates to a method for producing an antigen composition or preparation capable of producing antibodies in vertebrates that bind to fimbrial type 4 antigens of bacterial pathogens and the antigen preparation itself.

Das zur Verdeutlichung dieser Erfindung verwendete spezifische Beispiel ist dasjenige der Erzeugung fimbrieller Antigene, die als Impfstoff gegen B. nodosus wirksam sind, der der wesentliche Erreger der Fußfäuleinfektion bei Schafen und anderen Huftieren ist.The specific example used to illustrate this invention is that of the production of fimbrial antigens effective as a vaccine against B. nodosus, which is the major causative agent of footrot infection in sheep and other ungulates.

Stand der TechnikState of the art

B. nodosus ist ein anaerobes Bakterium, dessen Freilandisolate durch die Anwesenheit von Oberflächenfilamenten gekennzeichnet sind, die Fimbrien (oder üblicherweise "Pili") bezeichnet sind, die etwa 6 nm im Durchmesser und bis zu einige Hundert nm lang sind. In anderen Bakterien haben Fimbrien Hafteigenschaften und obwohl die genaue Funktion von Fimbrien in B. nodosus nicht eindeutig definiert worden ist, scheint es wahrscheinlich, daß sie bei der Anlagerung an und/oder der Kolonisierung von Epithelialgewebe im Huf beteiligt sind. Fimbrien von B. nodosus weisen eine polare Lokalisierung auf der Zelle auf und scheinen bei der Oberflächenfortbewegung durch ein Phänomen, das als Flimmerbewegung bekannt ist, beteiligt zu sein. Verwandte Fimbrien findet man in einer Reihe von gram-negativen Spezies, die u.a. in den Gattungen Pseudomonas, Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Bacteroides und Eikenella klassifiziert sind.B. nodosus is an anaerobic bacterium whose field isolates are characterized by the presence of surface filaments called fimbriae (or more commonly "pili") that are about 6 nm in diameter and up to several hundred nm long. In other bacteria, fimbriae have adhesive properties and although the exact function of fimbriae in B. nodosus has not been clearly defined, it seems likely that they are involved in the attachment to and/or colonization of epithelial tissue in the hoof. Fimbriae of B. nodosus exhibit polar localization on the cell and appear to be involved in surface locomotion through a phenomenon known as ciliary motility. Related fimbriae are found in a number of gram-negative species, including the genera Pseudomonas, Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Bacteroides and Eikenella.

Im Falle von B. nodosus haben sich eine große Anzahl von Hinweisen im Laufe des letzten Jahrzehnts angesammelt, die vermuten lassen, daß die Fimbrien eine zentrale Rolle sowohl bei der Infektiösität der Bakterien als auch bei der immunologischen Schutzantwort des Schafs spielen. Fimbrien sind auch bei der Pathogenese und Immunität in anderen bakteriellen Pathogenen beteiligt. Die Impfung von Schafen entweder mit gesamten Zellen oder mit gereinigten Fimbrien aus B. nodosus vermittelt Resistenz gegen homologe Fußfäuleinfektionen.In the case of B. nodosus, a large body of evidence has accumulated over the past decade suggesting that fimbriae play a central role in both the infectivity of the bacteria and the immune response of the sheep. Fimbriae are also involved in pathogenesis and immunity in other bacterial pathogens. Vaccination of sheep with either whole cells or purified fimbriae from B. nodosus confers resistance to homologous footrot infections.

Es gibt mindestens 8 oder 9 Hauptserogruppen von B. nodosus (umfassend eine Anzahl von Subtypen), die auf Basis des "K"- Agglutinierungstests klassifiziert sind.There are at least 8 or 9 major serogroups of B. nodosus (comprising a number of subtypes) classified based on the "K" agglutination test.

Es wurde gefunden, daß die Fimbrien das an der spezifischen Agglutinierungsreaktion beteiligte Antigen sind und dementsprechend ist der durch Impfung mit gesamten Zellen oder fimbriellen Präparationen vermittelte Bereich einer wirksamen Immunität auf die betreffende Serogruppe bzw. den betreffenden Serotyp beschränkt.It has been found that the fimbriae are the antigen involved in the specific agglutination reaction and, accordingly, the range of effective immunity conferred by vaccination with whole cells or fimbrial preparations is limited to the serogroup or serotype in question.

Die erhältlichen kommerziellen Impfstoffe gegen Fußfäule bestehen aus einem Gemisch von gesamten Zellen verschiedener B.nodosus Serotypen. Der hohe Preis dieser Impfstoffe, der etwa eine Größenordnung höher als der von anderen vergleichbaren Impfstoffen (z.B. gegen die Gruppe von chlostridialen Infektionen) ist, bleibt jedoch ein ernsthaftes Hindernis für ihre verbreitete Anwendung und Akzeptanz durch die Schafzuchtindustrie. Als Ergebnis beruhen gegenwärtige Verfahren zur Bekämpfung von Fußfäule weiterhin stark auf topischer Applizierung von therapeutischen Mitteln, die wenig oder keinen Einfluß auf die Vermeidung der Krankheit besitzen.The commercially available vaccines against footrot consist of a mixture of whole cells of different B.nodosus serotypes. However, the high cost of these vaccines, which is about an order of magnitude higher than that of other comparable vaccines (e.g. against the group of clostridial infections), remains a serious obstacle to their widespread use and acceptance by the sheep industry. As a result, current methods of controlling footrot continue to rely heavily on topical application of therapeutic agents that have little or no effect on preventing the disease.

Der hohe Preis der Erzeugung von Impfstoffen gegen Fußfäule steht in direktem Zusammenhang mit der Schwierigkeit der Kultivierung von B. nodosus mit Fimbrien. Dieses Bakterium hat sehr schwierige Wachstumserfordernisse, umfassend komplexe Nährmedien und die Abwesenheit von Sauerstoff. Da die fimbrielle Expression ein instabiles Merkmal von B. nodosus, insbesondere bei den zur kommerziellen Erzeugung erforderlichen Flüssignährkultur-Bedingungen ist, kann weiterhin eine chargenweise Variation in den Ausbeuten fimbrieller Antigene die Qualität und Verläßlichkeit der Impfstoffpräparationen beeinträchtigen, was eine erhebliche Kostenlast im Bereich von Qualitätskontrolltests bedingt.The high cost of producing vaccines against footrot is directly related to the difficulty of Cultivation of B. nodosus with fimbriae. This bacterium has very difficult growth requirements, including complex culture media and the absence of oxygen. Furthermore, since fimbrial expression is an unstable feature of B. nodosus, particularly under the liquid culture conditions required for commercial production, batch-to-batch variation in fimbrial antigen yields can affect the quality and reliability of vaccine preparations, imposing a significant cost burden in the area of quality control testing.

Die anhängige australische Patentanmeldung Nr. 34979/84 der Anmelderin beschreibt die Erzeugung des fimbriellen B. nodosus Untereinheit-Antigens, das von klonierten Genkopien in Escherichia coli exprimiert wird. Das Antigen wird in diesen Zellen zu den reifen Fimbrien assembliert.The Applicant's pending Australian patent application No. 34979/84 describes the production of the B. nodosus fimbrial subunit antigen expressed from cloned gene copies in Escherichia coli. The antigen is assembled into the mature fimbriae in these cells.

Diese Erfindung beschreibt die weitere Entwicklung dieses Verfahrens, indem sie die Erzeugung von supramolekularen, extrazellulären fimbriellen Strukturen aus rekombinanten Bakterienwirten beschreibt. Dies bringt erhebliche Vorteile sowohl hinsichtlich der Antigenität der Präparation (für Impfzwecke) als auch der Praktikabilität und Wirtschaftlichkeit der Antigenerzeugung mit sich. Die Erfindung nützt ein kompatibles fimbrielles Assemblierungssystem in einem geeigneten Wirt für Fimbrien des Typs 4, wie etwa Pseudomonas aeruginosa. Dieses Verfahren ist auf die Erzeugung von Fimbrien als Impfstoffantigene anwendbar, die gegen eine Reihe bakterieller Pathogene, die Fimbrien vom Typ 4 erzeugen, aktiv sind.This invention describes the further development of this process by describing the generation of supramolecular, extracellular fimbrial structures from recombinant bacterial hosts. This brings significant advantages both in terms of the antigenicity of the preparation (for vaccination purposes) and the practicality and economics of antigen production. The invention utilizes a compatible fimbrial assembly system in a suitable host for type 4 fimbriae, such as Pseudomonas aeruginosa. This process is applicable to the generation of fimbriae as vaccine antigens active against a range of bacterial pathogens that produce type 4 fimbriae.

Offenbarung der ErfindungDisclosure of the invention

Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung einer Antigenpräparation zur Anwendung bei der Erzeugung von Antikörpern, die gegen eine Bakterienspezies wirksam sind, die natürlicherweise Fimbrien des Typs 4 erzeugt, umfassend das Kultivieren von genetisch manipulierten, aeroben oder fakultativ anaeroben Wirtszellen mit Fimbrien des Typs 4, welche die für die fimbriellen Untereinheitstrukturantigene von mindestens einem Stamm der Bakterienspezies kodierenden Gene und ein endogen kompatibles System zur morphogenetischen Assemblierung von Fimbrien des Typs 4 enthalten, so daß reife Fimbrien als extrazelluläre Strukturen erzeugt werden, und das vollständige oder teilweise Ernten der von den Wirtszellen im wesentlichen freien Fimbrien.The present invention provides a method for producing an antigen preparation for use in generating antibodies effective against a bacterial species which naturally produces type 4 fimbriae, comprising culturing genetically engineered aerobic or facultatively anaerobic host cells having type 4 fimbriae which contain the genes encoding the fimbrial subunit structural antigens of at least one strain of the bacterial species and an endogenously compatible system for morphogenetic assembly of type 4 fimbriae to produce mature fimbriae as extracellular structures, and completely or partially harvesting the fimbriae substantially free from the host cells.

Unter einem anderen Gesichtspunkt liefert die Erfindung ein genetisch manipuliertes, aerobes oder fakultativ anaerobes Bakterium mit Fimbrien des Typs 4, wobei das Bakterium dadurch gekennzeichnet ist, daß es exogene Gene enthält, die für die fimbriellen Untereinheit-Strukturantigene von mindestens einem Bakterienstamm kodieren, der natürlicherweise Fimbrien des Typs 4 erzeugt, so daß Expression der exogenen Gene die Erzeugung von Fimbrien des mindestens eines Stammes als extrazelluläre Strukturen bewirkt.In another aspect, the invention provides a genetically engineered aerobic or facultatively anaerobic bacterium having type 4 fimbriae, the bacterium being characterized by containing exogenous genes encoding the fimbrial subunit structural antigens of at least one bacterial strain that naturally produces type 4 fimbriae, such that expression of the exogenous genes causes the production of fimbriae of the at least one strain as extracellular structures.

B. nodosus Fimbrienstränge bestehen aus einer kleinen wiederholten Polypeptiduntereinheit (Protein) von etwa 150 Aminosäuren, von etwa 17000 Dalton (17 kD) Molekulargewicht, dessen genaue Größe in verschiedenen Serotypen der Bakterien zu variieren scheint. Eine ähnliche serologische und strukturelle Variation tritt in den fimbriellen Untereinheiten von anderen Pathogenen mit Fimbrien des Typs 4 auf, wie etwa Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis und Moraxella bovis, vermutlich als Mechanismus zur Vermeidung von Immunreaktionen des Wirts. Wir haben festgestellt, daß aus B. nodosus stammende fimbrielle Präparationen auch ein weiteres signifikantes Antigen, ein Protein mit etwa 80000 Dalton (80 kD) Molekulargewicht enthalten. Unsere Untersuchungen weisen darauf hin, daß dieses Protein physikalisch am Fimbrienstrang befestigt ist und das Basalprotein darstellen kann, welches die Fimbrien an der Oberfläche der Bakterienzellen verankert. In B. nodosus zeigt dieses Protein wie die fimbrielle Untereinheit sowohl strukturelle als auch antigene Variation zwischen verschiedenen Stämmen und ist ein weiteres Hauptpolypeptid-Antigen, gegen das Schafe bei Infektion mit B. nodosus oder Impfung entweder mit Gesamtzell- oder isolierten fimbriellen Präparationen reagieren.B. nodosus fimbrial strands consist of a small repeated polypeptide subunit (protein) of about 150 amino acids, of about 17,000 daltons (17 kD) molecular weight, the exact size of which appears to vary in different serotypes of the bacteria. Similar serological and structural variation occurs in the fimbrial subunits of other pathogens with type 4 fimbriae, such as Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, and Moraxella bovis, presumably as a mechanism to avoid host immune responses. We have found that fimbrial preparations derived from B. nodosus also contain another significant antigen, a protein of about 80,000 daltons (80 kD) molecular weight. Our studies indicate that this protein is physically attached to the fimbrial strand and may represent the basal protein which which anchors fimbriae to the surface of bacterial cells. In B. nodosus, this protein, like the fimbrial subunit, shows both structural and antigenic variation between different strains and is another major polypeptide antigen against which sheep react when infected with B. nodosus or vaccinated with either whole cell or isolated fimbrial preparations.

Wir haben festgestellt, daß unter Verwendung von "Western" Transfermatrixanalysen, wobei Fimbrien aus einer Reihe unterschiedlicher B. nodosus Isolate von unterschiedlichen Serotypen durch Gelelektrophorese aufgetrennt, auf Papier transferiert und mit einer Reihe homologer und heterologer Antiseren behandelt wurden, es der Fimbrienstrang (d.h. das 17 kD Untereinheit-Antigen) ist, welches das Serogruppen- und Serotyp-spezifische Antigen und daher das primäre protektive Antigen ist.We have found that using Western transfer matrix analysis, where fimbriae from a panel of different B. nodosus isolates of different serotypes were separated by gel electrophoresis, transferred to paper and treated with a panel of homologous and heterologous antisera, it is the fimbrial strand (i.e., the 17 kD subunit antigen) that is the serogroup and serotype specific antigen and therefore the primary protective antigen.

Die anhängige australische Patentanmeldung Nr. 34979/84 der Anmelderin beschreibt die Erzeugung des Untereinheitstruktur- Antigens aus B. nodosus Fimbrien von klonierten Genkopien, die in E.coli exprimiert werden. In diesem Falle wird jedoch die B. nodosus Fimbrienuntereinheit nicht zu reifen Fimbrienstrukturen auf der Zelloberfläche assembliert, sondern wird stattdessen in die Membranfraktion der Zelle eingebettet. Dies führt zu schweren Nachteilen sowohl hinsichtlich der Antigenität des Materials als auch der Schwierigkeit seiner Isolierung und Reinigung, obwohl sogar die Expressionsstärke des Proteins durch geeignete Manipulierung des klonierten Gens gesteigert werden kann. Die vorliegende Erfindung betrifft die weitere Entwicklung des Impfstoffs, indem sie die Herstellung des spezifischen aktiven Antigenbestandteils in Form reifer fimbrieller Strukturen aus neuen genetisch manipulierten Bakterienwirtszellen beschreibt. Die Strategien und Einzelheiten dieser Konstruktionen werden im folgenden beschrieben.The applicant's pending Australian patent application No. 34979/84 describes the production of the subunit structure antigen from B. nodosus fimbriae from cloned gene copies expressed in E. coli. In this case, however, the B. nodosus fimbrial subunit is not assembled into mature fimbrial structures on the cell surface, but is instead embedded in the membrane fraction of the cell. This leads to severe disadvantages both in terms of the antigenicity of the material and the difficulty of isolating and purifying it, although even the expression level of the protein can be increased by appropriate manipulation of the cloned gene. The present invention relates to the further development of the vaccine by describing the production of the specific active antigen component in the form of mature fimbrial structures from new genetically engineered bacterial host cells. The strategies and details of these constructions are described below.

Die Herstellung des Antigens in Form reifer Fimbrien hat erhebliche immunologische und technische Vorteile hinsichtlich der Wirksamkeit des Impfstoffs, der Einfachheit seiner Komponenten und der Leichtigkeit und Wirtschaftlichkeit seiner Herstellung, die auf den folgenden Überlegungen beruhen:The production of the antigen in the form of mature fimbriae has significant immunological and technical advantages in terms of the efficacy of the vaccine, the simplicity of its components and the ease and economy of its manufacture, which are based on the following considerations:

(i) Reife Fimbrien scheinen eine intensivere und bessere (d.h. K-agglutinierende) immunologische Reaktion als die äquivalente Dosis von fimbriellem Untereinheitprotein hervorzurufen. Ein serologischer K-Agglutinierungstiter von etwa 5000 wird allgemein als die Minimalreaktion erachtet, die einer ausreichenden protektiven Immunität gegen Infektion mit einem gegebenen Stamm von B. nodosus entspricht. Dieses Ausmaß der Reaktion (und bis zu einer Größenordnung höher) wird ohne weiteres bei Impfung mit reifen Fimbrien, aber nicht mit dem isolierten Untereinheitprotein erreicht, welches nur geringe Mengen an K-agglutinierenden Serumantikörpern erzeugt.(i) Mature fimbriae appear to elicit a more intense and better (i.e., K-agglutinating) immunological response than the equivalent dose of fimbrial subunit protein. A serological K-agglutination titre of about 5000 is generally considered to be the minimum response corresponding to sufficient protective immunity against infection with a given strain of B. nodosus. This level of response (and up to an order of magnitude higher) is readily achieved by vaccination with mature fimbriae but not with the isolated subunit protein, which generates only low levels of K-agglutinating serum antibodies.

(ii) Die Expression von reifen Fimbrien auf der Oberfläche der rekombinanten Zelle erlaubt die einfache und bequeme Trennung der fimbriellen Antigene vom Wirtsbakterium in einem industriellen Maßstab. Dies hat mehrere Vorteile:(ii) The expression of mature fimbriae on the surface of the recombinant cell allows the simple and convenient separation of the fimbrial antigens from the host bacterium on an industrial scale. This has several advantages:

a) die Herstellung des Antigens zur Anwendung in einer wirksamen Impfstofformulierung erfordert keine teueren oder komplizierten Extraktions- oder Reinigungsprozeduren,(a) the production of the antigen for use in an effective vaccine formulation does not require expensive or complicated extraction or purification procedures,

b) die Wirtszellen können von der Impfstoffpräparation entfernt werden. Dies vermeidet mögliche Probleme in Verbindung mit der Verwendung rekombinanter Organismen in vivo aufgrund von Überlegungen zur biologischen Sicherheit/biologischen Gefährdung und/oder der Gegenwart toxischer oder anderer unerwünschter Komponenten im Wirtsbakterium,b) the host cells can be removed from the vaccine preparation. This avoids potential problems associated with the use of recombinant organisms in vivo due to biosafety/biohazard considerations and/or the presence of toxic or other undesirable components in the host bacterium,

c) die Entfernung der Wirtszellen beseitigt auch die Möglichkeit einer antigenen Kompetition zwischen zellulären Komponenten und den fimbriellen Antigenen,c) the removal of host cells also eliminates the possibility of antigenic competition between cellular components and the fimbrial antigens,

d) die Verwendung von Impfstoffen auf Basis isolierter Fimbrien sollte das Auftreten einer nekrotischen Reaktion an der Impfstelle verringern. Dies ist ein häufiges Problem bei den gegenwärtig verfügbaren B. nodosus Gesamtzell-Impfstoffen, insbesondere wenn sie mit der Verwendung starker immunologischer Adjuvanzbedingungen, wie etwa Ölemulsion und/oder Aluminiumsulfat-Adsorption gekoppelt sind.(d) the use of vaccines based on isolated fimbriae should reduce the occurrence of a necrotic reaction at the vaccination site. This is a common problem with currently available B. nodosus whole cell vaccines, especially when coupled with the use of strong immunological adjuvant conditions such as oil emulsion and/or aluminium sulphate adsorption.

e) die Verwendung isolierter Fimbrien in Impfstofformulierungen sollte die Standardisierung von Bestandteilen und die Qualitätskontrolle insbesondere im Zusammenhang eines multivalenten Impfstoffs vereinfachen,(e) the use of isolated fimbriae in vaccine formulations should facilitate standardisation of ingredients and quality control, in particular in the context of a multivalent vaccine,

iii) die Expression reifer Fimbrien in einem rekombinanten Wirt erlaubt die Möglichkeit des Einbaus mehr als eines Antigentyps einer strukturellen Untereinheit in die tatsächlich erzeugten Stränge. Dies würde einen einfacheren Impfstoff mit einer breiten Aktivität gegen mehr als einen Antigentyp erzeugen, entweder in Bezug auf die unterschiedlichen Serogruppen von B. nodosus oder als gemischter Impfstoff, der gegen fimbrielle Antigene vom Typ 4 aus mehr als einer pathogenen Spezies wirksam ist.iii) the expression of mature fimbriae in a recombinant host allows the possibility of incorporating more than one type of antigen of a structural subunit into the actual strands produced. This would produce a simpler vaccine with broad activity against more than one type of antigen, either with respect to the different serogroups of B. nodosus or as a mixed vaccine effective against type 4 fimbrial antigens from more than one pathogenic species.

Die Biosynthese und Assemblierung fimbrieller Stränge, d.h. die morphogenetische Expression scheint die Beteiligung mehrerer Gene außer demjenigen, das für die strukturelle Untereinheit selbst kodiert, zu erfordern. Untersuchungen der Plasmid- und Chromosomal-kodierten fimbriellen Systeme vom Typ 1 oder Typ 2 uropathogener und enterotoxischer Stämme von E.coli haben beispielsweise gezeigt, daß mindestens 5 bis 7 Gene bei dem Prozeß beteiligt sind; eines kodiert für die fimbrielle Untereinheit, ein weiteres für ein Basalprotein und der Rest für andere Polypeptide, deren exakte Funktionen man noch nicht genau versteht, die aber als Assemblierungsfaktoren bei der Konstruktion und dem Aufbau des fimbriellen Strangs zu wirken scheinen. Diese Gene sind normalerweise im Genom geclustert und nehmen bis zu 5 bis 10 Kilobasen (kb) DNA-Sequenzinformation ein.The biosynthesis and assembly of fimbrial strands, ie, morphogenetic expression, appears to require the involvement of several genes in addition to the one encoding the structural subunit itself. Studies of the plasmid- and chromosomally encoded fimbrial systems of type 1 or type 2 of uropathogenic and enterotoxigenic strains of E. coli, for example, have shown that at least 5 to 7 genes are involved in the process; one encodes the fimbrial subunit, another one encodes a basal protein. and the rest for other polypeptides whose exact functions are not yet well understood but which appear to act as assembly factors in the construction and assembly of the fimbrial strand. These genes are normally clustered in the genome and occupy up to 5 to 10 kilobases (kb) of DNA sequence information.

Das für die 17 kD Untereinheitstruktur der B. nodosus Serotyp A1 Fimbrien kodierende Gen befindet sich auf einem 5,5 kb HindIII-Segment einer in einen E.coli-Plasmidvektor klonierten B. nodosus DNA, wie in unserer anhängigen australischen Patentanmeldung Nr. 34979/84 beschrieben ist. Das Gen wird in E.coli von einem Promotor innerhalb der klonierten Sequenz exprimiert. Dieses Gen ist repräsentativ für solche, die man in anderen Serotypen von B. nodosus sowie in anderen Bakterien mit Fimbrien des Typs 4 findet. In diesem Zusammenhang haben wir ebenfalls unter Verwendung derselben generellen Strategien die für die Strukturuntereinheiten von Pseudomonas aeruginosa-Stamm PAK-Fimbrien und solche einer Anzahl verschiedener Serotypen von B. nodosus kodierenden Gene kloniert, obwohl mindestens in den letzteren Fällen offenbar ein gewisser Grad an Restriktionsstellen-Polymorphismus und Sequenzabweichung zwischen den unterschiedlichen Serotypen besteht. Das für die Strukturuntereinheit von B. nodosus Serogruppe C Fimbrien kodierende Gen ist beispielsweise auf einem klonierten (HindIII) Fragment mit etwa 4,5 kb lokalisiert, das selbst zwei zusätzliche innere HindIII-Stellen enthält, von denen mindestens eine innerhalb des funktionalen Gens zu liegen scheint. Das Gen der fimbriellen Untereinheit der Serogruppe F befindet sich auf einem klonierten HindIII- Fragment von etwa 3 kb. In keinem Fall haben wir jedoch die Bildung reifer fimbrieller Strukturen auf der Oberflächen von rekombinanten, diese klonierten Gene exprimierenden E.coli- Wirtszellen beobachtet. Diese Klone scheinen auch nicht das Basalproteinantigen zu exprimieren. Der wahrscheinliche Grund für das Fehlen der Assemblierung reifer Fimbrien in den rekombinanten Zellen ist der, daß die klonierten DNA-Segmente nicht die gesamte zur richtigen morphogenetischen Expression erforderliche Information enthalten, d.h. einige oder alle Gene, die für das Basalprotein und die Assemblierungsfaktoren kodieren und/oder assoziierte Promotoren. Andererseits ist es möglich, daß einige oder alle dieser weiteren Gene im Milieu der E.coli-Wirtszelle nicht richtig exprimiert werden oder funktionieren.The gene encoding the 17 kD subunit structure of B. nodosus serotype A1 fimbriae is located on a 5.5 kb HindIII segment of B. nodosus DNA cloned into an E. coli plasmid vector as described in our pending Australian patent application No. 34979/84. The gene is expressed in E. coli from a promoter within the cloned sequence. This gene is representative of those found in other serotypes of B. nodosus as well as in other bacteria with type 4 fimbriae. In this context, we have also cloned, using the same general strategies, the genes encoding the structural subunits of Pseudomonas aeruginosa strain PAK fimbriae and those of a number of different serotypes of B. nodosus, although at least in the latter cases there appears to be some degree of restriction site polymorphism and sequence divergence between the different serotypes. For example, the gene encoding the structural subunit of B. nodosus serogroup C fimbriae is located on a cloned (HindIII) fragment of about 4.5 kb, which itself contains two additional internal HindIII sites, at least one of which appears to be within the functional gene. The serogroup F fimbrial subunit gene is located on a cloned HindIII fragment of about 3 kb. In no case, however, have we observed the formation of mature fimbrial structures on the surfaces of recombinant E. coli host cells expressing these cloned genes. These clones also do not appear to express the basal protein antigen. The likely reason for the lack of assembly of mature fimbriae in the recombinant cells is that the cloned DNA segments do not contain all the information required for proper morphogenetic expression, ie some or all of the genes encoding the basal protein and assembly factors and/or associated promoters. On the other hand, it is possible that some or all of these other genes are not properly expressed or function in the E. coli host cell environment.

Das Problem, eine morphogenetische Expression von Fimbrien in rekombinanten Wirtszellen zu erhalten, kann durch den Versuch angegangen werden, die anderen erforderlichen Gene zu klonieren und zu exprimieren. Die Ausgangsstrategie umfaßt hier die Ausdehnung der klonierten Sequenzen, welche das Strukturuntereinheitgen flankieren, in der Annahme, daß die Gene tatsächlich wie in E.coli geclustert sind, durch chromosomales "Walking" unter Verwendung einer Serie überlappender Klone, die durch Spaltung mit unterschiedlichen Restriktionsendonukleasen (mit Erkennungssequenzen von 6 Basen) oder durch partielle Spaltung mit einem Restriktionsenzym, wie etwa Sau3A (das eine Erkennungssequenz von 4 Basen aufweist) erzeugt worden sind. Es ist möglich, daß zur Vermeidung schädlicher Gen-Dosiseffekte, die mit der Expression von Membranproteinen in Zusammenhang stehen, Vektoren mit geringer Kopienzahl erforderlich sind und wir haben Hinweise, die vermuten lassen, daß solche Gene in der Nachbarschaft der B. nodosus fimbriellen Untereinheitgene lokalisiert sind, was Probleme beim Klonieren dieser Sequenzen verursacht hat. Wenn man ihn jedoch einmal erhalten hat, kann ein ausgedehnter Bereich um das Untereinheitgen rekonstruiert und in einer Anzahl von Bakterienwirten auf die Fähigkeit zur Erzeugung reifer fimbrieller Strukturen getestet werden, was unter Verwendung von Standardtechniken zur Isolierung von Fimbrien, immunologischen und elektrophoretischen Analysen und elektronenmikroskopischer Untersuchung von gesamten Zellen und isolierten Fraktionen gemessen wird. Eine alternative Strategie besteht darin, Transposonmutagenese zur Erzeugung einer Serie von fim&supmin; -Mutanten zu verwenden und solche Gene zu klonieren, die unter Verwendung des Transposons als genetischer oder Hybridisierungsmarker beeinflußt werden. Diese Strategie erfordert nicht, daß die Gene im bakteriellen Genom geclustert sind. Die beteiligten Gene können (in jedem Fall) mit einer geeigneten molekulargenetischen Manipulation, wie erforderlich, zu einem die fimbrielle Untereinheit enthaltenden funktionellen System rekonstruiert werden, um die Fimbrienbiosynthese zu maximieren und stabilisieren und um das richtige Gleichgewicht der Expression von jedem der beteiligten Gene vorzusehen.The problem of obtaining morphogenetic expression of fimbriae in recombinant host cells can be addressed by attempting to clone and express the other required genes. The initial strategy here involves extending the cloned sequences flanking the structural subunit gene, assuming that the genes are indeed clustered as in E. coli, by chromosomal walking using a series of overlapping clones generated by digestion with different restriction endonucleases (with recognition sequences of 6 bases) or by partial digestion with a restriction enzyme such as Sau3A (which has a recognition sequence of 4 bases). It is possible that low copy number vectors are required to avoid deleterious gene dosage effects associated with the expression of membrane proteins, and we have evidence to suggest that such genes are located in the vicinity of the B. nodosus fimbrial subunit genes, which has caused problems in cloning these sequences. However, once obtained, an extensive region around the subunit gene can be reconstructed and tested in a number of bacterial hosts for the ability to produce mature fimbrial structures, using standard techniques for fimbriae isolation, immunological and electrophoretic analyses, and electron microscopic Examination of whole cells and isolated fractions. An alternative strategy is to use transposon mutagenesis to generate a series of fim⊃min; mutants and to clone those genes that are affected using the transposon as a genetic or hybridization marker. This strategy does not require that the genes be clustered in the bacterial genome. The genes involved can (in any case) be reconstructed into a functional system containing the fimbrial subunit with appropriate molecular genetic manipulation as required to maximize and stabilize fimbrial biosynthesis and to provide the correct balance of expression of each of the genes involved.

Man kann sich dem Problem der morphogenetischen Expression von Fimbrien auch durch genetische oder molekulargenetische Komplementation des Gens der fimbriellen Untereinheit mit einem kompatiblen Assemblierungssystem annähern, das vollständig oder teilweise aus anderen Bakterien stammt. Obwohl diese Methode, wie oben ausgeführt, Genisolierung und/oder - modifikation umfaßt, hat sie den Vorteil, möglicherweise die einfachste Lösung für das Problem zu liefern. Versuche zur Komplementation fehlender Funktionen durch Subklonierung des Gens für die fimbrielle Untereinheit von B. nodosus in Plasmidvektoren, die fimbrielle Assemblierungsgene von E.coli enthalten, sind bis jetzt ohne Erfolg gewesen, ebenso wie ähnliche Experimente, die mit dem Gen für die fimbrielle Untereinheit von N. gonorrhoeae durchgeführt wurden, während Klebsiella pneumoniae Fimbrien von klonierten DNA-Segmenten, die sowohl in E.coli als auch in Salmonella typhimurium insertiert waren, exprimiert worden sind. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß eine gewisse grundsätzliche Unverträglichkeit zwischen Fimbrien des Typs 4 und solchen Systemen besteht, die man in Enterobacteriaceae mit Fimbrien findet, umfassend die Gattungen Klebsiella, Escherichia und Salmonella. Es gibt in der Tat beträchtliche Unterschiede zwischen den Strukturuntereinheiten von Fimbrien des Typs 4 und solchen, die man in E.coli findet, insbesondere hinsichtlich der Lokalisierung von hydrophoben Regionen, die am N-Terminus in den ersteren und am C-Terminus in den letzteren auftreten. Andererseits gibt es große Ähnlichkeiten zwischen den fimbriellen Untereinheiten von unterschiedlichen Bakterien mit Fimbrien des Typs 4, einschließlich Bacteroides nodosus, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Moraxella nonliquifaciens und Moraxella bovis (siehe Tabelle 1), welche die einzigen Spezies sind, für die ausführliche Daten gegenwärtig verfügbar sind. Sequenzanalysen haben gezeigt, daß alle fimbriellen Untereinheiten dieser Bakterien das kennzeichnende Merkmal des Besitzes der ungewöhnlichen Aminosäure Methylphenylalanin (Me-Phe) als ersten Rest im reifen Protein aufweisen. Diese fimbriellen Untereinheiten haben auch einen sehr hohen Grad an Aminosäuresequenz- Homologie innerhalb der ersten 20 bis 25 % des Proteins gemeinsam, sogar in dem Ausmaß, daß wo Änderungen aufgetreten sind, diese im allgemeinen konservative Aminosäuresubstitutionen beinhalten. Die Gesamtlänge dieser Proteine variiert im Bereich von etwa 140 bis 160 Aminosäuren. Eine starke Homologie wird innerhalb der ersten 32 Reste beobachtet, wobei sich weitere Homologiezonen bis zu etwa Rest 50 erstrecken. Weiterhin scheinen die Untereinheiten auch eine ähnliche und ungewöhnliche 6 bis 7 Aminosäuren lange, positiv geladene N-terminale Leadersequenz im primären Translationsprodukt gemeinsam zu haben, die in einer Stufe vor dem Einbau in den reifen Fimbrienstrang vom Protein abgespalten wird. Die Interspeziesvariation zwischen diesen fimbriellen Untereinheiten tritt in erster Linie in den zwei carboxyterminalen Dritteln des Proteins auf. Eine intraspezifische Variation (d.h. zwischen unterschiedlichen Serotypen) tritt ebenfalls in diesem Bereich auf und umfaßt nicht nur Aminosäuresubstitutionen, sondern auch kleine Insertionen und Deletionen im Leserahmen. Tabelle 1 Vergleich der N-terminalen Aminosäuresequenzen der fimbriellen Untereinheiten von B. nodosus (1), P. aeruginosa (2), N. gonorrhoeae (3), N. meningitidis (4), M. nonliquefaciens (5) und M. bovis (6). The problem of morphogenetic expression of fimbriae can also be approached by genetic or molecular genetic complementation of the fimbrial subunit gene with a compatible assembly system derived wholly or in part from other bacteria. Although this method involves gene isolation and/or modification, as discussed above, it has the advantage of providing possibly the simplest solution to the problem. Attempts to complement missing functions by subcloning the B. nodosus fimbrial subunit gene into plasmid vectors containing E. coli fimbrial assembly genes have so far been unsuccessful, as have similar experiments carried out with the N. gonorrhoeae fimbrial subunit gene, while Klebsiella pneumoniae fimbriae have been expressed from cloned DNA segments inserted into both E. coli and Salmonella typhimurium. These results suggest that there is some fundamental incompatibility between fimbriae of type 4 and those systems found in Enterobacteriaceae with fimbriae, comprising the genera Klebsiella, Escherichia and Salmonella. There are indeed considerable differences between the structural subunits of type 4 fimbriae and those found in E. coli, particularly with regard to the location of hydrophobic regions, which occur at the N-terminus in the former and at the C-terminus in the latter. On the other hand, there are great similarities between the fimbrial subunits of various bacteria with type 4 fimbriae, including Bacteroides nodosus, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Moraxella nonliquifaciens and Moraxella bovis (see Table 1), which are the only species for which detailed data are currently available. Sequence analyses have shown that all fimbrial subunits of these bacteria share the distinguishing feature of possessing the unusual amino acid methylphenylalanine (Me-Phe) as the first residue in the mature protein. These fimbrial subunits also share a very high degree of amino acid sequence homology within the first 20 to 25% of the protein, to the extent that where changes have occurred, they generally involve conservative amino acid substitutions. The total length of these proteins varies in the range of about 140 to 160 amino acids. Strong homology is observed within the first 32 residues, with further zones of homology extending to about residue 50. Furthermore, the subunits also appear to share a similar and unusual 6 to 7 amino acid long, positively charged N-terminal leader sequence in the primary translation product, which is cleaved from the protein at a stage prior to incorporation into the mature fimbrial strand. Interspecies variation among these fimbrial subunits occurs primarily in the two carboxy-terminal thirds of the protein. Intraspecific variation (ie between different serotypes) also occurs in this region and includes not only amino acid substitutions but also small insertions and deletions in the reading frame. Table 1 Comparison of the N-terminal amino acid sequences of the fimbrial subunits of B. nodosus (1), P. aeruginosa (2), N. gonorrhoeae (3), N. meningitidis (4), M. nonliquefaciens (5), and M. bovis (6).

Legende: Es sind die ersten 48 Reste der reifen Fimbrienuntereinheit gezeigt, die vom N-terminalen Methylphenylalanin (MeF)-Rest numeriert sind, sowie die Leadersequenz, die im primären Translationsprodukt vorhanden ist (wo diese bestimmt worden ist). Der Pfeil (T) zeigt die Spaltungsstelle, obwohl in einem Teil von Molekülen die Spaltung auf der carboxyterminalen Seite des MeF-Rests aufzutreten scheint (--> ). Striche zeigen das Fehlen eines Rests an dem betreffenden Punkt. Die Reste sind unter Verwendung des 1-Buchstabencodes für Aminosäuren aufgelistet, wie er von der IUPAC-IUB Kommission für die biochemische Nomenklatur vorgeschlagen worden ist.Legend: The first 48 residues of the mature fimbrial subunit are shown, numbered from the N-terminal methylphenylalanine (MeF) residue, as well as the leader sequence present in the primary translation product (where this has been determined). The arrow (T) indicates the cleavage site, although in a subset of molecules the cleavage appears to occur on the carboxy-terminal side of the MeF residue (--> ). Dashes indicate the absence of a residue at that point. Residues are listed using the 1-letter code for amino acids as proposed by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature.

Bei N. gonorrhoeae wurde vermutet, daß der konservierte aminoterminale Anteil der Fimbrienuntereinheit bei einer Untereinheit-Untereinheit-Wechselwirkung innerhalb des Fimbrienstrangs beteiligt ist und dies mag wohl der Fall sein. Wir haben jedoch überlegt, daß die starke Konservierung dieser Sequenz über eine Anzahl unterschiedlicher Bakterienspezies und Gattungen, welche Fimbrien des Typs 4 besitzen, aufgetreten ist, weil diese aminoterminale Region bedeutende topogene Signale zur fimbriellen Morphogenese enthält, wobei bezüglich der Wechselwirkung der Strukturuntereinheit mit dem Assemblierungssystem, Faktoren und dem Mechanismus umfaßt werden. Wenn dies so ist, sollten die diese Signale enthaltenden Fimbrienuntereinheiten austauschbar in der Typ 4 (MePhe)-Gruppe funktionieren. Dies ist der Kernpunkt der Erfindung, den wir jetzt durch die morphogenetische Expression und Herstellung des B. nodosus Fimbrientyps aus einem klonierten Untereinheitgen, das in den Fimbriaten P. aeruginosa insertiert worden ist, und die Verwendung dieses Materials als wirksamer Impfstoff gegen Fußfäule in Schafen gezeigt haben. P. aeruginosa wurde ausgewählt (unter den verfügbaren Bakterien mit Fimbrien des Typs 4) als (Prototyp) Aufnahmewirt auf der Basis, daß diese Spezies ein genetisch gut charakterisierter Aerobier ist, der leicht auf relativ einfachen Medien kultiviert ist und für den Plasmidshuttle- Vektorsysteme zur Klonierung und zum Transfer von Genen verfügbar sind.At N. gonorrhoeae, it has been suggested that the conserved amino-terminal portion of the fimbrial subunit is involved in subunit-subunit interactions within the fimbrial strand, and this may well be the case. However, we reasoned that the high conservation of this sequence across a number of different bacterial species and genera possessing type 4 fimbriae has occurred because this amino-terminal region contains important topogenic signals for fimbrial morphogenesis involving the interaction of the structural subunit with the assembly system, factors, and mechanism. If this is so, the fimbrial subunits containing these signals should function interchangeably in the type 4 (MePhe) group. This is the crux of the invention which we have now demonstrated by the morphogenetic expression and production of the B. nodosus fimbrial type from a cloned subunit gene inserted into the fimbriate P. aeruginosa and the use of this material as an effective vaccine against footrot in sheep. P. aeruginosa was chosen (among available bacteria with type 4 fimbriae) as the (prototype) receiving host on the basis that this species is a genetically well-characterized aerobe which is easily cultured on relatively simple media and for which plasmid shuttle vector systems are available for cloning and gene transfer.

Fimbrien des Typs 4 sind hier als solche Fimbrien definiert, die (i) üblicherweise in Bakterienspezies gefunden werden, welche das als Flimmerbewegung bekannte Phänomen aufweisen, obwohl dies nicht immer vorliegt (siehe unten); (ii) eine polare oder polarartige Lokalisierung an der Oberfläche der Zelle aufweisen; und (iii) eine hochkonservierte Sequenz in der aminoterminalen Region der Strukturuntereinheit besitzen, d.h. (a) eine ähnliche kurze (6 bis 7 Aminosäuren lange) Leadersequenz im primären Translationsprodukt, gefolgt von (b) einer hydrophoben Region, die (mehr als 75 %) Homologie mit der folgenden 32 Aminosäuren langen Konsensussequenz zeigt, welche mit dem (modifizierten) Phenylalaninrest beginnt, der normalerweise an Position 1 des reifen Proteins auftritt: Type 4 fimbriae are defined here as those fimbriae that (i) are commonly found in bacterial species exhibiting the phenomenon known as ciliation, although this is not always present (see below); (ii) exhibit a polar or polar-like localization at the surface of the cell; and (iii) possess a highly conserved sequence in the amino-terminal region of the structural subunit, i.e. (a) a similar short (6 to 7 amino acids long) leader sequence in the primary translation product, followed by (b) a hydrophobic region showing (more than 75%) homology with the following 32 amino acid consensus sequence, which begins with the (modified) phenylalanine residue that normally occurs at position 1 of the mature protein:

(siehe Figur 1).(see Figure 1).

Die Klammern weisen darauf hin, daß einer der darin befindlichen Reste in dieser Position vorliegen kann. Diese Paare sind konservativ in dem Sinn, daß jede der Aminosäuren in dem Paar eine ähnliche Struktur und Eigenschaften aufweist, z.B. Isoleucin/Valin (I/V), Isoleucin/Leucin (I/L), Glutamin/Asparagin (Q/N), Arginin/Lysin (R/K) und in geringerem Außmaß Alanin/Serin (A/S).The parentheses indicate that any of the residues within can be present in that position. These pairs are conservative in the sense that each of the amino acids in the pair has a similar structure and properties, e.g. isoleucine/valine (I/V), isoleucine/leucine (I/L), glutamine/asparagine (Q/N), arginine/lysine (R/K), and to a lesser extent alanine/serine (A/S).

Es sollte festgestellt werden, daß obwohl eine Flimmerbewegung üblicherweise von Fimbrien des Typs 4 enthaltenden Stämmen gezeigt wird, dies nicht immer oder notwendigerweise der Fall ist. Beispielsweise wurde festgestellt, daß einige (Mutanten) Stämme von P. aeruginosa polare Fimbrien des Typs 4 behalten, obwohl sie offenbar die Fähigkeit verloren haben, eine Flimmerbewegung zu zeigen. Fimbrien des Typs 4 findet man in B. nodosus, P. aeruginosa, N. gonorrhoeae, N. meningitidis, M. nonliquefaciens und M. bovis und u.a. vermutlich auch in Acinetobacter calcoaceticus, Bacteroides ureolyticus, Eikenella corrodens, Moraxella kingae, Moraxella lacunata, Moraxella osloensis, Pseudomonas acidovorans, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas maltophilia, Pseudomonas pseudoalcaligenes, Pseudomonas putrefaciens, Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas stutzeri und Pseudomonas testosteroni. Fimbrien des Typs 4 findet man möglicherweise auch in manchen grampositiven Spezies, wie etwa Streptococcus sanguis.It should be noted that although ciliation is commonly exhibited by strains containing type 4 fimbriae, this is not always or necessarily the case. For example, some (mutant) strains of P. aeruginosa have been found to retain polar type 4 fimbriae, although they have apparently lost the ability to exhibit ciliation. Fimbriae of type 4 are found in B. nodosus, P. aeruginosa, N. gonorrhoeae, N. meningitidis, M. nonliquefaciens and M. bovis and probably also in Acinetobacter calcoaceticus, Bacteroides ureolyticus, Eikenella corrodens, Moraxella kingae, Moraxella lacunata, Moraxella osloensis, Pseudomonas acidovorans, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas maltophilia, Pseudomonas pseudoalcaligenes, Pseudomonas putrefaciens, Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas stutzeri and Pseudomonas testosteroni. Fimbriae Type 4 may also be found in some Gram-positive species, such as Streptococcus sanguis.

Die Aktivität der Antigenpräparation kann als die Fähigkeit dargestellt werden, Antikörper oder eine andere Immunreaktion in vivo gegen die betreffende Spezies von Bakterien zu erzeugen und/oder die Fähigkeit, Antikörper gegen die Bakterien zu binden. Somit kann die Antigenpräparation entweder als Impfstoff oder als diagnostischer Test für die Bakterien oder ihre Antikörper nützlich sein.The activity of the antigen preparation can be represented as the ability to generate antibodies or other immune response in vivo against the species of bacteria in question and/or the ability to bind antibodies against the bacteria. Thus, the antigen preparation can be useful either as a vaccine or as a diagnostic test for the bacteria or their antibodies.

Die Quelle des Fimbrien-Untereinheitgens kann jede, Fimbrien des Typs 4 besitzende Spezies oder ein Stamm davon sein. Im Wirtsorganismus kann das Fimbrienuntereinheitgen von einer Anzahl unterschiedlicher Bakterien mit Fimbrien des Typs 4 vorhanden sein. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung enthält der Wirtsorganismus Fimbrienuntereinheitgene für eine Anzahl von Serotypen einer einzigen Spezies mit Fimbrien des Typs 4.The source of the fimbrial subunit gene can be any species or strain possessing type 4 fimbriae. The host organism can contain the fimbrial subunit gene from a number of different bacteria having type 4 fimbriae. In preferred embodiments of the invention, the host organism contains fimbrial subunit genes for a number of serotypes of a single species having type 4 fimbriae.

Die Wirtszelle kann eine beliebige kompatible Spezies oder ein kompatibler Stamm sein, die bzw. der Fimbrien des Typs 4 exprimiert und vorzugsweise ein Aerobier oder ein fakultativer Anaerobier ist, der mit einem geeigneten, mindestens für das Fimbrienuntereinheitgen kodierenden Plasmidvektor transformiert werden kann und diesen behalten kann. Die Wirtszelle kann die exogenen Gene entweder in einem Plasmid oder durch Insertion in ihr Chromosom enthalten. Das Plasmid kann entweder exogen oder endogen sein.The host cell may be any compatible species or strain that expresses type 4 fimbriae and is preferably an aerobe or a facultative anaerobe that can be transformed with and maintain a suitable plasmid vector encoding at least the fimbrial subunit gene. The host cell may contain the exogenous genes either in a plasmid or by insertion into its chromosome. The plasmid may be either exogenous or endogenous.

In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind die Gene für die morphogenetische Assemblierung der Fimbrien für die Wirtszelle, die selbst eine Spezies mit Fimbrien des Typs 4 ist, endogen. In anderen Ausführungsformen der Erfindung jedoch können die Gene exogen sein, von derselben Spezies wie die Untereinheitgene oder von einer anderen Spezies mit Fimbrien des Typs 4 stammen.In preferred embodiments of the invention, the genes for morphogenetic assembly of the fimbriae are endogenous to the host cell, which itself is a species with type 4 fimbriae. In other embodiments of the invention, however, the genes may be exogenous, from the same species as the subunit genes or from a different species with type 4 fimbriae.

In einer bevorzugten Ausführungsform verwendet man einen Promotor zur Erhöhung der Stärke der Genexpression, der ein beliebiger in der Wirtsspezies aktiver Promotor mit oder ohne begleitende regulatorische Sequenzen sein kann. Bevorzugte Promotoren umfassen die PL- und PR-Promotoren des Bakteriophagen Lambda sowie andere starke natürliche oder synthetische Promotoren, wie etwa den tac-Hybridpromotor. Die Regulation des Promotors kann von chemischer oder physikalischer Art sein, wie in der Technik wohlbekannt ist. In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung kann die molekulare Struktur des Untereinheitgens geändert werden, insbesondere um seine Leadersequenz zu derjenigen der Wirtszelle homologer zu machen, um die morphogenetische Expression in einem bestimmten Wirt zu verbessern.In a preferred embodiment, a promoter is used to increase the level of gene expression, which may be any promoter active in the host species, with or without accompanying regulatory sequences. Preferred promoters include the PL and PR promoters of bacteriophage lambda, as well as other strong natural or synthetic promoters, such as the tac hybrid promoter. The regulation of the promoter may be chemical or physical, as is well known in the art. In an alternative embodiment of the invention, the molecular structure of the subunit gene may be altered, particularly to make its leader sequence more homologous to that of the host cell, in order to improve morphogenetic expression in a particular host.

Die Antigenpräparationen werden bei Verwendung als Impfstoff vorzugsweise mit einem gebräuchlichen Adjuvanz- und Trägersystem verabreicht.When used as a vaccine, the antigen preparations are preferably administered with a common adjuvant and carrier system.

Kurze Beschreibung der ZeichnungenShort description of the drawings

Das folgende Beispiel ist bezüglich der beigefügten Zeichnungen beschrieben, worin:The following example is described with reference to the attached drawings, in which:

Figur 1 die Herkunft und Konstruktion von pJSM202 zeigt. Eine volle Beschreibung ist im Text angegeben. Die kreuzschraffierten Sequenzen in pBA121 zeigen solche, die ursprünglich von B. nodosus VCS 1001 kloniert worden sind, wobei das innere dunkle Segment das Dra1-Fragment angibt, welches das Fimbrienuntereinheitgen enthält (siehe Figur 2 für Details). Die schraffierten Sequenzen in pPL-Lambda zeigen das BamH1-Segment (ursprünglicherweise vom Bakteriophagen Lambda stammend), welches den PL-Promotor enthält und in das das Dra1- Fragment von pBA121 kloniert wurde (an der Hpa1-Stelle). Die genaue Orientierung dieser Konstruktion in PJSM202 wurde nicht bestimmt (d.h. dieses Segment kann umgedreht sein). Die dünne Linie in den Plasmiden pBA121, pPL-Lambda und pJSM129 stellt von pBR322 stammende Sequenzen dar. Die dünne Linie in pJSM202 stellt von pKT240 stammende Sequenzen dar. Verschiedene Restriktionsendonukleasestellen sind entsprechend eingezeichnet. Die Zahlen beziehen sich auf die Entfernung in Kilobasen (kb) um jedes Plasmid herum. Die Pfeile zeigen die Richtung der Transkription und die ungefähren Grenzen des betreffenden Gens. Abkürzungen sind: fim, Fimbrienuntereinheitgen; amp, Ampicillin (oder Carbenicillin)-Resistenz; tet, Tetracyclinresistenz (in pBA121 nicht funktional); kan, Kanamycinresistenz; ori, Replikationsursprung; mob, Mobilisierungsfuktionen.Figure 1 shows the origin and construction of pJSM202. A full description is given in the text. The cross-hatched sequences in pBA121 show those originally cloned from B. nodosus VCS 1001, with the inner dark segment indicating the Dra1 fragment containing the fimbrial subunit gene (see Figure 2 for details). The hatched sequences in pPL-Lambda show the BamH1 segment (originally derived from bacteriophage lambda) containing the PL promoter and into which the Dra1 fragment of pBA121 was cloned (at the Hpa1 site). The exact orientation of this construction in PJSM202 has not been determined (i.e., this segment may be flipped). The thin line in plasmids pBA121, pPL-Lambda and pJSM129 represents sequences derived from pBR322. The thin line in pJSM202 represents sequences derived from pKT240. Various restriction endonuclease sites are indicated accordingly. Numbers refer to the distance in kilobases (kb) around each plasmid. Arrows indicate the direction of transcription and the approximate boundaries of the gene in question. Abbreviations are: fim, fimbrial subunit gene; amp, ampicillin (or carbenicillin) resistance; tet, tetracycline resistance (not functional in pBA121); kan, kanamycin resistance; ori, origin of replication; mob, mobilization functions.

Figur 2 zeigt die Nukleotidsequenz des für die Fimbrienuntereinheit von B. nodosus VCS 1001 kodierenden Gens und flankierender DNA. Die abgeleitete Aminosäuresequenz der Fimbrienuntereinheit ist unter Verwendung des Standard-Ein- Buchstabencodes, wie von der IUPAC-IUB Kommission für die biochemische Nomenklatur vorgeschlagen, gezeigt. Die Positionen der das Gen flankierenden Dra1-Restriktionsendonukleasestellen (TTTAAA) und der innerhalb des Gens befindlichen PvuII (CAGCTG) und Pst1 (CTGCAG) Stellen sind durch die Striche angezeigt.Figure 2 shows the nucleotide sequence of the gene encoding the fimbrial subunit of B. nodosus VCS 1001 and flanking DNA. The deduced amino acid sequence of the fimbrial subunit is shown using the standard one-letter code as proposed by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature. The positions of the Dra1 restriction endonuclease sites flanking the gene (TTTAAA) and the PvuII (CAGCTG) and Pst1 (CTGCAG) sites located within the gene are indicated by the dashes.

Figur 3 zeigt eine Westerntransferanalyse von Zellpellet- und Überstandfraktionen von pJSM202 enthaltenden P. aeruginosa PAK/2Pfs und E.coli E418 Zellen. Rekombinante Zellen wurden auf Luria Broth Agarmedium mit dem erforderlichen Antibiotikum kultiviert. P. aeruginosa-Zellen wurden über Nacht bei 37ºC kultiviert. E.coli-Zellen wurden für 8 Stunden bei 30ºC inkubiert, dann zur Induzierung der Synthese der Fimbrienuntereinheit vom (dereprimierten) PL-Promotor für 4 Stunden auf 42ºC verlagert. Die Zellen wurden in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) geerntet, einem mechanischen Vermengen unterworfen und die Zellen durch Zentrifugation pelletiert. Der Überstand wurde dann entfernt und die Zellen in frischer PBS resuspendiert. Gleiche Mengen an Zell- und Überstandfraktionen wurden dann auf SDS-Harnstoff-8 bis 15 %igen Polyacrylamid-Gradientengelen mit einem Standard-Tris-Glycin (Laemmli)-Puffersystem elektrophoretisiert. Die resultierenden Gelauftrennungen wurden dann elektrophoretisch auf Nitrocellulosepapier transferiert, mit Anti-B. nodosus Fimbrien- Antiserum und dann mit ¹²&sup5;I-markiertem Protein A unter Standardbedingungen inkubiert. Die Position von gebundenen Antikörpern wurde durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Spuren 2, 4, 6 und 8 enthalten Zellpelletmaterial. Die Spuren 3, 5 und 7 enthalten Überstandfraktionen. Die Spuren 2 und 3, 4 und 5 stammen von zwei unabhängigen mit pJSM202 transformierten Primärklonen von P. aeruginosa PAK/2Pfs. Die Spuren 6 und 7 stammen von pJSM202 enthaltenden E.coli E418. Spur 8 zeigt pJSM125 enthaltende P. aeruginosa PAK/2Pfs-Zellen. Spur 1 enthält gereinigte Fimbrien aus B. nodosus VCS 1001.Figure 3 shows Western transfer analysis of cell pellet and supernatant fractions from P. aeruginosa PAK/2Pfs and E. coli E418 cells containing pJSM202. Recombinant cells were cultured on Luria Broth agar medium with the required antibiotic. P. aeruginosa cells were cultured overnight at 37ºC. E. coli cells were incubated for 8 hours at 30ºC, then shifted to 42ºC for 4 hours to induce synthesis of the fimbrial subunit from the (de-repressed) PL promoter. Cells were harvested in phosphate buffered saline (PBS), subjected to mechanical mixing and the cells pelleted by centrifugation. The supernatant was then removed and the cells resuspended in fresh PBS. resuspended. Equal amounts of cell and supernatant fractions were then electrophoresed on SDS-urea-8 to 15% polyacrylamide gradient gels with a standard Tris-glycine (Laemmli) buffer system. The resulting gel separations were then electrophoretically transferred to nitrocellulose paper, incubated with anti-B. nodosus fimbrial antiserum and then with 125I-labeled protein A under standard conditions. The position of bound antibodies was visualized by autoradiography. Lanes 2, 4, 6 and 8 contain cell pellet material. Lanes 3, 5 and 7 contain supernatant fractions. Lanes 2 and 3, 4 and 5 are from two independent primary clones of P. aeruginosa PAK/2Pfs transformed with pJSM202. Lanes 6 and 7 are from E. coli E418 containing pJSM202. Lane 8 shows P. aeruginosa PAK/2Pfs cells containing pJSM125. Lane 1 contains purified fimbriae from B. nodosus VCS 1001.

Figur 4 zeigt die Ergebnisse der Reinigung von Fimbrien aus P. aeruginosa PKN-A1. Die Zellen wurden, wie im Text beschrieben, auf Agarplatten kultiviert und in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) geerntet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt und der Überstand aufbewahrt (Überstandfraktion). Anschließend wurden die Zellen in PBS resuspendiert, einem mechanischen Vermengen unterworfen und wieder wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt, um eine vermengte Überstand-Fraktion zu ergeben. Die Überstand- und die vermengten Überstand-Fraktionen wurden dann zu gleichen Teilen aufgeteilt und entweder einer isoelektrischen Präzipitation bei pH 4,5 oder einer Präzipitation mit 0,1 M MgCl&sub2; unterworfen. Die Präzipitate wurden durch Zentrifugation gewonnen, erneut in PBS gelöst und durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese, wie in der Legende zu Figur 3 beschrieben, analysiert. Die Proteinbanden wurden durch Anfärben mit Coomassieblau R250 sichtbar gemacht. Spuren 2 und 3 enthalten Fimbrien, die aus der Überstandfraktion durch isoelektrische bzw. MgCl&sub2;-Präzipitation gewonnen wurden. Spuren 4 und 5 enthalten Fimbrien, die aus der vermengten Überstandfraktion durch isoelektrische bzw. MgCl&sub2;-Präzipitation erhalten wurden. Die Spuren 2 bis 5 enthalten alle eine Materialmenge, die 3,5 % derjenigen entspricht, die aus einer einzigen Petrischalenkultur von PKN-A1-Zellen gewonnen wird. Die Spur 1 enthält Fimbrien, die aus P. aeruginosa PAK/2Pfs gereinigt wurden (etwa 5 µg). Die Spur 6 enthält aus B. nodosus VCS 1001 gereinigte Fimbrien (etwa 10 µg).Figure 4 shows the results of the purification of fimbriae from P. aeruginosa PKN-A1. Cells were cultured on agar plates as described in the text and harvested in phosphate buffered saline (PBS). Cells were removed by centrifugation and the supernatant was saved (supernatant fraction). Cells were then resuspended in PBS, subjected to mechanical mixing, and again removed by centrifugation to yield a mixed supernatant fraction. The supernatant and mixed supernatant fractions were then divided equally and subjected to either isoelectric precipitation at pH 4.5 or precipitation with 0.1 M MgCl2. Precipitates were recovered by centrifugation, redissolved in PBS, and analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis as described in the legend to Figure 3. The protein bands were visualized by staining with Coomassie blue R250. Lanes 2 and 3 contain fimbriae obtained from the supernatant fraction by isoelectric and MgCl₂ precipitation, respectively. Lanes 4 and 5 contain fimbriae obtained from the pooled supernatant fraction by isoelectric and MgCl2 precipitation, respectively. Lanes 2 to 5 all contain an amount of material equivalent to 3.5% of that obtained from a single Petri dish culture of PKN-A1 cells. Lane 1 contains fimbriae purified from P. aeruginosa PAK/2Pfs (approximately 5 µg). Lane 6 contains fimbriae purified from B. nodosus VCS 1001 (approximately 10 µg).

Figur 5 zeigt die elektrophoretischen und immunologischen Eigenschaften von Fimbrien, die aus P. aeruginosa PKN-A1 gereinigt wurden. Die Fimbrien wurden aus zwei unabhängigen, mit pJSM202 transformierten Primärklonen von P. aeruginosa PAK/2Pfs (Spuren 3 und 4) gereinigt (durch zweimalige isoelektrische Präzipitation) und mit Fimbrien verglichen, die aus dem Wirtsstamm P. aeruginosa PAK/2Pfs (Spuren 1 und 5) und aus B. nodosus VCS 1001 (Spuren 2 und 6) erhalten wurden. Diese Fimbrien (etwa 2 µg in jedem Fall) wurden auf SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt, wie in der Legende von Figur 3 beschrieben, und mit Coomassieblau R250 angefärbt (Bild A). Ähnliche (ungefärbte) Auftrennungen wurden einer Westerntransferanalyse unterzogen, wie in der Legende von Figur 3 beschrieben ist, wobei entweder Anti-P. aeruginosa PAK/2Pfs- Fimbrienantiserum (Bild B) oder Anti-B. nodosus-Fimbrienantiserum (Bild C) verwendet wurde. Nur der untere (die Fimbrienuntereinheit enthaltende) Teil ist gezeigt.Figure 5 shows the electrophoretic and immunological properties of fimbriae purified from P. aeruginosa PKN-A1. Fimbriae were purified (by two isoelectric precipitations) from two independent primary clones of P. aeruginosa PAK/2Pfs transformed with pJSM202 (lanes 3 and 4) and compared with fimbriae obtained from the host strain P. aeruginosa PAK/2Pfs (lanes 1 and 5) and from B. nodosus VCS 1001 (lanes 2 and 6). These fimbriae (approximately 2 µg in each case) were separated on SDS-polyacrylamide gels as described in the legend to Figure 3 and stained with Coomassie blue R250 (panel A). Similar (unstained) separations were subjected to Western transfer analysis as described in the legend to Figure 3 using either anti-P. aeruginosa PAK/2Pfs fimbrial antiserum (panel B) or anti-B. nodosus fimbrial antiserum (panel C). Only the lower (fimbrial subunit-containing) part is shown.

Figur 6 zeigt die elektrophoretische und immunologische Analyse der im Impfversuch verwendeten Antigenproben. Spur 2 enthält gesamte Zellen von B. nodosus VCS 1001, Spur 3 enthält aus B. nodosus VCS 1001 gereinigte Fimbrien, Spur 4 enthält aus P. aeruginosa PAK/2Pfs gereinigte Fimbrien, Spur 5 enthält aus P. aeruginosa PKN-A1 gereinigte Fimbrien, Spur 6 enthält aus P. aeruginosa PKN-A1 (unter Verwendung von MgCl&sub2;) gereinigte Fimbrien (siehe Text für Details). Spuren 1 und 7 enthalten ein Gemisch von Standard-Protein-Molekulargewichtsmarkern. Die Proben wurden durch Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt und entweder mit Coomassieblau R250 (Bild A) gefärbt oder einer Westerntransferanalyse unterworfen, wobei Anti-P. aeruginosa PAK/2Pfs- Fimbrienantiserum (Bild B) oder Anti-B. nodosus VCS 1001- Fimbrienantiserum (Bild C) verwendet wurde, wie in den Legenden zu den Figuren 3 und 5 beschrieben ist. In Bild A ist das gesamte Gel gezeigt, während in den Bildern B und C nur der untere, die Fimbrienuntereinheiten enthaltende Teil gezeigt ist.Figure 6 shows the electrophoretic and immunological analysis of the antigen samples used in the vaccination experiment. Lane 2 contains whole cells of B. nodosus VCS 1001, lane 3 contains fimbriae purified from B. nodosus VCS 1001, lane 4 contains fimbriae purified from P. aeruginosa PAK/2Pfs, lane 5 contains fimbriae purified from P. aeruginosa PKN-A1, lane 6 contains fimbriae purified from P. aeruginosa PKN-A1 (using MgCl₂) (see text for details). Lanes 1 and 7 contain a mixture of standard protein molecular weight markers. Samples were separated by electrophoresis on SDS-polyacrylamide gels and either stained with Coomassie blue R250 (panel A) or subjected to Western transfer analysis using anti-P. aeruginosa PAK/2Pfs fimbrial antiserum (panel B) or anti-B. nodosus VCS 1001 fimbrial antiserum (panel C) as described in the legends to Figures 3 and 5. In panel A the entire gel is shown, while in panels B and C only the lower part containing the fimbrial subunits is shown.

Beste Art zur Durchführung der ErfindungBest mode for carrying out the invention BeispielExample

Das zur Verdeutlichung dieser Erfindung verwendete spezifische Beispiel umfaßt die morphogenetische Expression von B. nodosus Fimbrien von einem klonierten Untereinheitgen, das nach geeigneten gentechnologischen Manipulationen in einen Fimbriatenstamm von Pseudomonas aeruginosa insertiert worden ist, und die Verwendung von daraus stammenden Fimbrienpräparationen als wirksamer Impfstoff gegen Fußfäuleinfektion in Schafen, die durch den homologen B. nodosus-Stamm hervorgerufen wird.The specific example used to illustrate this invention involves the morphogenetic expression of B. nodosus fimbriae from a cloned subunit gene inserted into a fimbriate strain of Pseudomonas aeruginosa after appropriate genetic engineering manipulations, and the use of fimbrial preparations derived therefrom as an effective vaccine against footrot infection in sheep caused by the homologous B. nodosus strain.

Das in diesem Beispiel verwendete B. nodosus Fimbrienuntereinheitgen stammte von B. nodosus VCS 1001, früher als Stamm 198 (ATCC Nr. 25549) bekannt, welcher der ausgewählte Prototypstamm von Serogruppe A (Subtyp 1) ist. Das Gen befindet sich auf einem 5,5 kb HindIII-Fragment von B. nodosus DNA, das ursprünglich durch immunologische Musterung einer klonierten, in E.coli hergestellten HindIII-Genbank unter Verwendung des positiven Selektionsplasmidvektors pTR262 hergestellt wurde, wie in der anhängigen australischen Patentanmeldung Nr. 34979/84 der Anmelderin beschrieben ist.The B. nodosus fimbrial subunit gene used in this example was from B. nodosus VCS 1001, formerly known as strain 198 (ATCC No. 25549), which is the selected prototype strain of serogroup A (subtype 1). The gene is located on a 5.5 kb HindIII fragment of B. nodosus DNA originally prepared by immunological screening of a cloned HindIII library prepared in E. coli using the positive selection plasmid vector pTR262, as described in the applicant's pending Australian patent application No. 34979/84.

Das 5,5 kb HindIII-Segment wurde anschließend in den Plasmidvektor pBR322 subkloniert, um pBA121 zu ergeben (Anderson, B.J. et al., J.Bacteriol. 160, 748-754 (1984)). Figur 1 zeigt die Restriktionskarte dieses Plasmids und die Lokalisierung des Strukturgens, das für die Fimbrienuntereinheit kodiert. Die Nukleotidsequenz dieses Gens und benachbarter DNA ist jetzt bestimmt worden und ist in Figur 2 dargestellt.The 5.5 kb HindIII segment was then subcloned into the plasmid vector pBR322 to give pBA121 (Anderson, B.J. et al., J.Bacteriol. 160, 748-754 (1984)). Figure 1 shows the restriction map of this plasmid and the location of the structural gene encoding the fimbrial subunit. The nucleotide sequence of this gene and adjacent DNA has now been determined and is shown in Figure 2.

Der in diesem Beispiel verwendete P. aeruginosa Wirtsstamm ist der P. aeruginosa Stamm PAK/2Pfs (ATCC Nr. 53308), der eine Multifimbrienmutante des Stammes PAK ist. Das in diesem Beispiel verwendete Vektorplasmid ist pKT240 (Bagdasarian, M.M. et al., Gene 26, 273-282 (1983)), das ein Plasmid mit breitem Wirtsspektrum ist und sowohl in E.coli als auch in P. aeruginosa repliziert und propagiert werden kann und das genetische Marker für Penicillin- (Ampicillin, Carbenicillin) und Kanamycinresistenz sowie eine Anzahl singulärer Restriktionsstellen zur Genklonierung enthält (siehe Figur 1).The P. aeruginosa host strain used in this example is P. aeruginosa strain PAK/2Pfs (ATCC No. 53308), which is a multifimbrial mutant of strain PAK. The vector plasmid used in this example is pKT240 (Bagdasarian, M.M. et al., Gene 26, 273-282 (1983)), which is a broad host range plasmid that can be replicated and propagated in both E. coli and P. aeruginosa and contains genetic markers for penicillin (ampicillin, carbenicillin) and kanamycin resistance as well as a number of unique restriction sites for gene cloning (see Figure 1).

A. Genetische Konstruktionen und ManipulationenA. Genetic constructions and manipulations

In den anfänglichen Konstrukten wurde das das B. nodosus Fimbrienuntereinheitgen enthaltende 5,5 kb HindIII-Fragment direkt in die HindIII-Stelle von pKT240 (siehe Figur 1) kloniert, um pJSM125 zu ergeben. Dieses Plasmid wurde dann in kompetente P. aeruginosa PAK/2Pfs-Zellen transformiert (wie im folgenden beschrieben ist). Immunologische Analysen der resultierenden Transformanten zeigten, daß die B. nodosus Fimbrienuntereinheit in diesen Zellen exprimiert wurde, aber mit einer relativ geringen Stärke. Nichtsdestoweniger gab es klare Hinweise, daß mindestens einige der in diesen rekombinanten Zellen erzeugten B. nodosus Fimbrienuntereinheiten zu reifen Fimbrien assembliert wurden, da das Antigensignal gemeinsam mit den Fimbrien gereinigt wurde und in den am meisten hochgereinigten Fraktionen bestehen blieb. Das Signal war jedoch schwach und der überwiegende Teil der Fimbrien bestand aus der endogenen Pseudomonasuntereinheit, die normalerweise vom Wirtsstamm erzeugt wird.In the initial constructs, the 5.5 kb HindIII fragment containing the B. nodosus fimbrial subunit gene was cloned directly into the HindIII site of pKT240 (see Figure 1) to give pJSM125. This plasmid was then transformed into competent P. aeruginosa PAK/2Pfs cells (as described below). Immunological analyses of the resulting transformants showed that the B. nodosus fimbrial subunit was expressed in these cells, but at a relatively low level. Nevertheless, there was clear evidence that at least some of the B. nodosus fimbrial subunits produced in these recombinant cells were assembled into mature fimbriae, since the antigen signal copurified with the fimbriae and persisted in the most highly purified fractions. However, the signal was weak and the majority of the fimbriae consisted of the endogenous Pseudomonas subunit normally produced by the host strain.

Das Problem der geringen Expression des B. nodosus Fimbrienuntereinheitgens in P. aeruginosa wurde überwunden, indem dieses Gen unter die transkriptionelle Kontrolle des starken Promotors PL aus dem Bakteriophagen Lambda gestellt wurde, wie in Figur 1 ausgeführt und im folgenden detailliert erläutert ist:The problem of low expression of the B. nodosus fimbrial subunit gene in P. aeruginosa was overcome by placing this gene under transcriptional control of the strong promoter PL from bacteriophage lambda, as shown in Figure 1 and detailed below:

pBA121 wurde mit der Restriktionsendonuklease DraI verdaut, die an günstigen, das Fimbrienuntereinheitgen flankierenden Stellen spaltet, einmal 30 Nukleotide stromaufwärts des Initiationskodons (ATG) und weiterhin 69 Nukleotide stromabwärts des Terminationskodons (TAA), um eine glattendige, 576 Basenpaare lange Genkassette zu ergeben (siehe Figur 2). Diese Kassette wurde durch Gelelektrophorese gereinigt und in die (glattendige) Hpa1-Stelle ligiert, die sich stromabwärts des PL-Promotors im Plasmid pPL-Lambda (Pharmacia P-L Biochemicals) befindet, um pJSM129 zu ergeben (Figur 1). Alle Konstruktionen unter Beteiligung des PL-Promotors wurden in dem bei 30ºC kultivierten E.coli-Stamm E418 durchgeführt. E.coli E418 ist ein Lambda-Lysogenstamm, der das temperatursensitive C1857 Repressorgen enthält. Die korrekte Orientierung der DraI Insertion hinsichtlich des PL-Promotors im Plasmid wurde durch Bezugnahme auf die internen PvuII- und PstI-Stellen innerhalb des Fimbrienuntereinheitgens getestet und durch die Überproduktion des Antigens in E.coli nach Verlagerung der Kultur auf 42ºC bestätigt. Diese Konstruktion ist offenbar in E.coli-Zellen, denen ein funktionaler C1-Repressor fehlt, letal, vermutlich da die Zellen nicht in der Lage sind, mit der großen Menge an B. nodosus Fimbrienuntereinheit zurechtzukommen, die erzeugt und in der Membran abgelagert wird.pBA121 was digested with the restriction endonuclease DraI, which cleaves at convenient sites flanking the fimbrial subunit gene, once 30 nucleotides upstream of the initiation codon (ATG) and further 69 nucleotides downstream of the termination codon (TAA), to yield a blunt-ended, 576 base pair gene cassette (see Figure 2). This cassette was purified by gel electrophoresis and ligated into the (blunt-ended) Hpa1 site located downstream of the PL promoter in the plasmid pPL-Lambda (Pharmacia P-L Biochemicals) to yield pJSM129 (Figure 1). All constructions involving the PL promoter were carried out in E. coli strain E418 grown at 30°C. E. coli E418 is a lambda lysogen strain containing the temperature-sensitive C1857 repressor gene. The correct orientation of the DraI insertion with respect to the PL promoter in the plasmid was tested by reference to the internal PvuII and PstI sites within the fimbrial subunit gene and confirmed by the overproduction of the antigen in E. coli after shifting the culture to 42ºC. This construction is apparently lethal in E. coli cells lacking a functional C1 repressor, presumably because the cells are unable to cope with the large amount of B. nodosus fimbrial subunit that is produced and deposited in the membrane.

Das B. nodosus Fimbriengen/PL-Promotor-Konstrukt wurde dann wie folgt in den Vektor pKT240 überführt: pJSM129 wurde mit der Restriktionsendonuklease BamH1 verdaut, um ein Fragment von etwa 1,75 kb freizusetzen, welches den PL-Promotor und das Fimbrienuntereinheitgen enthält (siehe Figur 1). Dieses Fragment wurde durch Gelelektrophorese gereinigt und in die entsprechende Stelle in pKT240 ligiert, um das als pJSM202 bezeichnete Plasmid (ATCC Nr. 40203) zu ergeben.The B. nodosus fimbrial gene/PL promoter construct was then transferred into the vector pKT240 as follows: pJSM129 was the restriction endonuclease BamH1 to release a fragment of approximately 1.75 kb containing the PL promoter and fimbrial subunit gene (see Figure 1). This fragment was purified by gel electrophoresis and ligated into the corresponding site in pKT240 to yield the plasmid designated pJSM202 (ATCC No. 40203).

Die Anwesenheit des BamH1-Fragments in diesem Plasmid wurde durch Restriktionsendonukleasenanalyse bestätigt, obwohl die Orientierung dieser Insertion nicht bestimmt wurde. Eine weitere Charakterisierung zeigte, daß pJSM202 enthaltende E.coli E418-Zellen große Mengen der B. nodosus Fimbrienuntereinheit bei Kultivierung bei 42ºC erzeugten (siehe Figur 3), und daß pJSM202 wie pJSM129 keine überlebensfähigen Transformanten in E.coli-Stämmen, denen der C1-Repressor fehlt, erzeugt. (In beiden Fällen kann jedoch diese Fähigkeit durch Insertion eines das C1857-Gen enthaltenden klonierten DNA-Segments in die Plasmide selbst wiedererlangt werden.)The presence of the BamH1 fragment in this plasmid was confirmed by restriction endonuclease analysis, although the orientation of this insertion was not determined. Further characterization showed that E. coli E418 cells containing pJSM202 produced high levels of the B. nodosus fimbrial subunit when grown at 42°C (see Figure 3), and that pJSM202, like pJSM129, does not produce viable transformants in E. coli strains lacking the C1 repressor. (In both cases, however, this ability can be recovered by inserting a cloned DNA segment containing the C1857 gene into the plasmids themselves.)

Alle oben beschriebenen Konstruktionen, Manipulationen und Analysen wurden unter Verwendung von gentechnologischen Standardmethoden durchgeführt.All constructions, manipulations and analyses described above were performed using standard genetic engineering methods.

B. Morphogenetische Expression von B. nodosus Fimbrien in pJSM202 (ATCC Nr. 40203) enthaltenden Pseudomonas aeruginosa PAK/2Pfs (ATCC Nr. 53308)B. Morphogenetic expression of B. nodosus fimbriae in Pseudomonas aeruginosa PAK/2Pfs (ATCC No. 53308) containing pJSM202 (ATCC No. 40203) Transformation von P. aeruginosa Fimbriaten mit pJSM202Transformation of P. aeruginosa fimbriate with pJSM202

Der P. aeruginosa-Stamm PAK/2Pfs wurde wie folgt für die DNA- Transformation kompetent gemacht: Die Zellen wurden über Nacht bei 43ºC (bis zu stationären Phase) in KNO&sub3;-Medium (2,5 % Oxoid Nutrient Broth Nr. 2, 0,5 % Hefeextrakt und 0,4 % KNO&sub3;) kultiviert. Dann wurde eine Probe der Kultur 1:25 mit frischem KNO&sub3;-Medium verdünnt und unter Schütteln bei 37ºC kultiviert, bis die Kultur die früh-mittlere Logphase des Wachstums erreichte. Anschließend wurde die Kultur schnell auf Eis abgekühlt und die Zellen durch Zentrifugation gewonnen. Alle nachfolgenden Schritte wurden bei 4ºC durchgeführt. Die Zellen wurden zweimal durch Resuspendierung in einem Fünftel Volumen 0,1M MgCl&sub2; und Rezentrifugation gewaschen. Dann wurden die Zellen in 1/8 Volumen 0,15M MgCl&sub2; resuspendiert und 20-30 Minuten auf Eis belassen. Die Zellen wurden erneut durch Zentrifugation gewonnen und schließlich in einem Zwanzigstel Volumen 0,15M MgCl&sub2; resuspendiert und bereit zur Transformation auf Eis gehalten.P. aeruginosa strain PAK/2Pfs was made competent for DNA transformation as follows: Cells were cultured overnight at 43ºC (to stationary phase) in KNO₃ medium (2.5% Oxoid Nutrient Broth No. 2, 0.5% yeast extract and 0.4% KNO₃). A sample of the culture was then diluted 1:25 with fresh KNO₃ medium and incubated with shaking at 37ºC. until the culture reached the early-mid log phase of growth. The culture was then rapidly cooled on ice and the cells were recovered by centrifugation. All subsequent steps were carried out at 4ºC. The cells were washed twice by resuspension in one-fifth volume of 0.1M MgCl₂ and recentrifugation. Then the cells were resuspended in 1/8 volume of 0.15M MgCl₂ and kept on ice for 20-30 minutes. The cells were recovered again by centrifugation and finally resuspended in one-twentieth volume of 0.15M MgCl₂ and kept on ice ready for transformation.

pJSM202 wurde wie folgt in kompetente P. aeruginosa PAK/2Pfs- Zellen transformiert: Etwa 200 bis 400 ng gereinigte Plasmid- DNA (in 5 bis 10 µl Puffer) wurde zu 0,2 ml Zellsuspension gegeben, vermischt und für 1 Stunde auf Eis gegeben. Das Transformationsgemisch wurde dann einem Hitzeschock bei 42ºC für 2 Minuten unterzogen, anschließend mit einem gleichen Volumen KNO&sub3;-Medium verdünnt und bei 37ºC für eine Stunde inkubiert, um phänotypische Expression von Antibiotikum-Resistenzgenen auf dem Plasmid zu erlauben. Proben (0,1 ml) wurden dann auf Nährstoff (Luria Broth) Platten mit Carbenicillin (1 mg/ml) ausplattiert. (P. aeruginosa PAK/2Pfs ist nicht besonders sensitiv gegenüber Ampicillin oder Kanamycin). Die Platten wurden bei 37ºC inkubiert und sichtbare Kolonien erschienen in etwa 2 Tagen.pJSM202 was transformed into competent P. aeruginosa PAK/2Pfs cells as follows: Approximately 200 to 400 ng of purified plasmid DNA (in 5 to 10 µl buffer) was added to 0.2 ml of cell suspension, mixed, and placed on ice for 1 hour. The transformation mixture was then heat shocked at 42°C for 2 minutes, subsequently diluted with an equal volume of KNO3 medium and incubated at 37°C for 1 hour to allow phenotypic expression of antibiotic resistance genes on the plasmid. Samples (0.1 ml) were then plated on nutrient (Luria Broth) plates with carbenicillin (1 mg/ml). (P. aeruginosa PAK/2Pfs is not particularly sensitive to ampicillin or kanamycin). Plates were incubated at 37ºC and visible colonies appeared in approximately 2 days.

Verschiedene Transformanten wurden ausgewählt und bei allen wurde durch Plasmidisolierung und Restriktionsanalyse bestätigt, daß sie pJSM202 enthalten. Dieses Plasmid ist daher für P. aeruginosa PAK/2Pfs (oder andere getestete Fimbriatenstämme) nicht letal, trotz der Tatsache, daß wir festgestellt haben, daß der PL-Promotor in diesen Zellen hochaktiv ist und daß große Mengen der B. nodosus Fimbrienuntereinheit erzeugt werden. Es wurde jedoch gefunden, daß die Transformanten relativ langsam wachsen und eine kurze Lagerungsbeständigkeit als Plattenkulturen aufweisen, was eine regelmäßige Subkultivierung zum Aufrechterhalten der Lebensfähigkeit erforderte. Diese Transformanten scheinen auch nicht bei Standard-Gefrierbedingungen (als Suspensionen in Nährmedium mit 15 % Glycerin bei -70ºC) gut haltbar zu sein. Aus diesem Grund haben wir periodisch frische Chargen durch Retransformation von P. aeruginosa PAK/2Pfs mit pJSM202 regeneriert. Diese rekombinanten transformierten Zellen werden (allgemein) PKN- A1 bezeichnet.Several transformants were selected and all were confirmed to contain pJSM202 by plasmid isolation and restriction analysis. This plasmid is therefore not lethal to P. aeruginosa PAK/2Pfs (or other fimbriate strains tested), despite the fact that we found that the PL promoter is highly active in these cells and that large amounts of the B. nodosus fimbrial subunit are produced. However, the transformants were found to grow relatively slowly and to have a short storage stability. than plate cultures, which required regular subculturing to maintain viability. These transformants also do not appear to be stable under standard freezing conditions (as suspensions in 15% glycerol broth at -70ºC). For this reason, we periodically regenerated fresh batches by retransforming P. aeruginosa PAK/2Pfs with pJSM202. These recombinant transformed cells are (generally) referred to as PKN- A1.

(ii) Isolierung und Analyse von durch P. aeruginosa PKN-A1 (PAK/2Pfs + pJSM202) erzeugten Fimbrien(ii) Isolation and analysis of fimbriae produced by P. aeruginosa PKN-A1 (PAK/2Pfs + pJSM202)

Eine Untersuchung von P. aeruginosa PKN-A1-Zellen hat ergeben, daß nicht nur große Mengen der B. nodosus Fimbrienuntereinheit in diesen Zellen erzeugt werden, sondern daß auch die Fimbrienstränge, die von diesen Zellen aufgebaut werden, in der Tat vollständig oder fast vollständig aus diesem Protein bestehen, wobei wenig oder keine Untereinheiten vom P. aeruginosa-Typ vorhanden sind.An examination of P. aeruginosa PKN-A1 cells has revealed that not only are large amounts of the B. nodosus fimbrial subunit produced in these cells, but that the fimbrial strands assembled by these cells are in fact composed entirely or almost entirely of this protein, with little or no P. aeruginosa-type subunits present.

Die morphogenetische Expression von B. nodosus Fimbrien in PKN-A1 ist durch Fimbrienisolierung und Reinigung in Verbindung mit elektrophoretischen, immunologischen und elektronenmikrographischen Analysen alleine oder in Kombination gezeigt worden, wie im folgenden beschrieben ist. Obwohl Fimbrien vom B. nodosus-Typ den natürlicherweise vom P. aeruginosa-Wirtsstamm erzeugten physikalisch sehr ähnlich sind, können sie unter Verwendung spezifischer Antiseren unterschieden werden. Weiterhin haben die Fimbrienuntereinheiten aus dem Donorstamm B. nodosus VCS 1001 und dem Wirtsstamm P. aeruginosa PAK/2Pfs leicht unterschiedliche Molekulargewichte und können somit auch aufgrund ihrer elektrophoretischen Mobilitäten in SDS- Polyacrylamidgelen unterschieden werden (siehe Figuren 4, 5 und 6), das scheinbare Molekulargewicht der B. nodosus VSC1001-Untereinheit ist etwa 17.000, während das der P. aeruginosa PAK/2Pfs-Untereinheit etwa 16.000 ist, die tatsächlichen Molekulargewichte (berechnet von der Sequenz) sind 16.218 (151 Aminosäuren) bzw. 15.082 (145 Aminosäuren).The morphogenetic expression of B. nodosus fimbriae in PKN-A1 has been demonstrated by fimbrial isolation and purification in conjunction with electrophoretic, immunological and electron micrographic analyses alone or in combination, as described below. Although B. nodosus-type fimbriae are physically very similar to those naturally produced by the P. aeruginosa host strain, they can be distinguished using specific antisera. Furthermore, the fimbrial subunits from the donor strain B. nodosus VCS 1001 and the host strain P. aeruginosa PAK/2Pfs have slightly different molecular weights and thus can also be distinguished by their electrophoretic mobilities in SDS-polyacrylamide gels (see Figures 4, 5 and 6); the apparent molecular weight of the B. nodosus VSC1001 subunit is approximately 17,000, while that of the P. aeruginosa PAK/2Pfs subunit is about 16,000, the actual molecular weights (calculated from the sequence) are 16,218 (151 amino acids) and 15,082 (145 amino acids), respectively.

Für die im folgenden beschriebenen Analysen wurden die Bakterienzellen auf festen Medien kultiviert, der Wirtsstamm P. aeruginosa PAK/2Pfs auf Nähr-(Luria Broth) agar, der rekombinante P. aeruginosa-Stamm PKN-A1 (mit pJSM202) auf demselben Medium unter Zusatz von 1 mg Carbenicillin/ml, rekombinante E.coli 418 mit pJSM202 auf demselben Medium unter Zusatz von 50 µg Ampicillin/ml und B. nodosus-Zellen auf "Hoof"-Agar (wie von Mattick et al (1984), J.Bacteriol. 160, 740-747 beschrieben ist). Die Kulturen wurden durch Abschaben in phosphatgepufferte Salzlösung geerntet.For the analyses described below, bacterial cells were grown on solid media, the host strain P. aeruginosa PAK/2Pfs on nutrient (Luria Broth) agar, the recombinant P. aeruginosa strain PKN-A1 (with pJSM202) on the same medium with the addition of 1 mg carbenicillin/ml, recombinant E. coli 418 with pJSM202 on the same medium with the addition of 50 µg ampicillin/ml and B. nodosus cells on "Hoof" agar (as described by Mattick et al (1984), J. Bacteriol. 160, 740-747). Cultures were harvested by scraping into phosphate buffered saline.

Die morphogenetische Expression von Fimbrien des B. nodosus- Typs in P. aeruginosa PKN-A1-Zellen wurde zunächst durch das Vorhandensein erheblicher Mengen dieses Antigens in der extrazellulären Umgebung angezeigt. In vielen Bakterien mit Fimbrien, einschließlich B. nodosus und P. aeruginosa, scheint ein Teil der Fimbrien in das Medium (oder den Resuspendierungspuffer) abgeschieden zu werden und dort nach Entfernung der Zellen durch Zentrifugation zu verbleiben. Weitere Fimbrien können durch mechanisches Vermengen der Zellsuspension (siehe Figur 4) oder durch Erhitzen der Kultur (auf etwa 60ºC) für eine kurze Zeitdauer entfernt werden. Dies ist in Figur 3 veranschaulicht, die eine Westerntransfer- (Immunoblot) Analyse der Zellpellet- und der erhaltenen Überstandfraktionen aus rekombinanten Zellen zeigt. Diese Ergebnisse zeigen zunächst, daß die B. nodosus Fimbrienuntereinheit sehr wirksam vom PL-Promotor in P. aeruginosa- Zellen mit pJSM202 in einer Stärke von mindestens zwei Größenorndungen höher als im selben Wirt mit pJSM225 transkribiert wird, wobei das Gen von einem assoziierten Promotor innerhalb des ursprünglich klonierten Segments von B. nodosus-DNA transkribiert wird. Zweitens findet man einen großen Teil des fimbriellen Untereinheitantigens in der von P. aeruginosa PKN-A1 erhaltenen Überstandfraktion. Dies steht im Gegensatz zur Situation in E.coli E418-Zellen mit pJSM202, wo das Antigen vollständig in der Zell- (Pellet) Fraktion lokalisiert ist (die im Überstand gefundenen Spuren stammen offenbar von Zellfragmenten, die nicht durch Zentrifugation entfernt worden sind). Man findet auch eine erhebliche Menge der B. nodosus Fimbrienuntereinheit bei den Zellen im Falle von PKN-A1, es ist aber nicht bekannt, in welchem Ausmaß dies nicht von der Zelle entfernte Fimbrien oder innerhalb der Zelle angereicherte, (noch) nicht assemblierte Untereinheiten darstellt. Drittens ist die Größe der in E.coli gefundenen Fimbrienuntereinheit in der Tat etwas größer als die in P. aeruginosa oder in B. nodosus selbst gefundene. Dies scheint auf die Unfähigkeit von E.coli zur Spaltung des kurzen Signalpeptids vom primären Translationsprodukt (siehe Tabelle 1) zurückzuführen sein, was vermutlich ein Teil des normalen Prozesses der morphogenetischen Expression ist.The morphogenetic expression of B. nodosus-type fimbriae in P. aeruginosa PKN-A1 cells was initially indicated by the presence of significant amounts of this antigen in the extracellular environment. In many fimbriae-containing bacteria, including B. nodosus and P. aeruginosa, a portion of the fimbriae appear to be secreted into the medium (or resuspension buffer) and remain there after removal of the cells by centrifugation. Additional fimbriae can be removed by mechanical mixing of the cell suspension (see Figure 4) or by heating the culture (at about 60°C) for a short period of time. This is illustrated in Figure 3, which shows Western transfer (immunoblot) analysis of the cell pellet and the resulting supernatant fractions from recombinant cells. These results demonstrate, first, that the B. nodosus fimbrial subunit is very efficiently transcribed from the PL promoter in P. aeruginosa cells with pJSM202 at a level at least two orders of magnitude higher than in the same host with pJSM225, where the gene is transcribed from an associated promoter within the originally cloned segment of B. nodosus DNA. Second, one finds a large proportion of the fimbrial subunit antigen in the supernatant fraction obtained from P. aeruginosa PKN-A1. This is in contrast to the situation in E. coli E418 cells with pJSM202, where the antigen is entirely localized in the cell (pellet) fraction (the traces found in the supernatant apparently derive from cell fragments that have not been removed by centrifugation). A significant amount of the B. nodosus fimbrial subunit is also found on the cells in the case of PKN-A1, but it is not known to what extent this represents fimbriae not removed from the cell or subunits enriched within the cell that have not (yet) been assembled. Third, the size of the fimbrial subunit found in E. coli is indeed slightly larger than that found in P. aeruginosa or in B. nodosus itself. This appears to be due to the inability of E. coli to cleave the short signal peptide from the primary translation product (see Table 1), which is presumably part of the normal process of morphogenetic expression.

Die Assemblierung von B. nodosus Fimbrienuntereinheiten zu reifen Fimbrien in P. aeruginosa PKN-A1-Zellen wurde auch durch die Anwesenheit dieses Antigens in gereinigten Fimbrien, die unter unterschiedlichen Bedingungen isoliert wurden, gezeigt. Fimbrien können von zellfreien Überständen durch eine der unabhängigen Methoden entweder der isoelektrischen Präzipitation bei pH 4,5 oder der durch die Zugabe von MgCl&sub2; induzierten Präzipitation gewonnen werden. Dies sind Standardprozeduren, die zur Isolierung von Fimbrien sowohl aus P. aeruginosa als auch aus B. nodosus anwendbar sind. Unter Verwendung beider Methoden wurden gute Ausbeuten gereinigter Fimbrien (etwa 1 bis 1,5 mg pro Standard (85 mm) Petrischalenkultur) aus den rekombinanten PKN-A1-Zellen erhalten, was durch Elektronenmikroskopie von negativ gefärbten Proben bestätigt wurde. Diese Fimbrien konnten auch weiter durch isopyknische Bandierung in CsCl-Gradienten gereinigt werden. Die elektrophoretische Analyse (Figur 4) zeigte, daß die aus PKN-A1-Zellen isolierten Fimbrien in erster Linie aus einer Strukturuntereinheit zusammengesetzt sind, die mit der aus B. nodosus erhaltenen im Gel komigriert. Etwas unerwartet gibt es wenig oder keinen Hinweis auf die Fimbrienuntereinheit, die für den Wirtsstamm PAK/2Pfs charakteristisch ist (siehe Figur 4, auch im folgenden).The assembly of B. nodosus fimbrial subunits into mature fimbriae in P. aeruginosa PKN-A1 cells was also demonstrated by the presence of this antigen in purified fimbriae isolated under different conditions. Fimbriae can be recovered from cell-free supernatants by either of the independent methods of isoelectric precipitation at pH 4.5 or precipitation induced by the addition of MgCl2. These are standard procedures applicable to the isolation of fimbriae from both P. aeruginosa and B. nodosus. Using both methods, good yields of purified fimbriae (approximately 1 to 1.5 mg per standard (85 mm) Petri dish culture) were obtained from the recombinant PKN-A1 cells, which was confirmed by electron microscopy of negatively stained samples. These fimbriae could also be further purified by isopycnic banding in CsCl gradients. Electrophoretic analysis (Figure 4) showed that the fimbriae isolated from PKN-A1 cells are composed primarily of a structural subunit that gel-co-migrates with that obtained from B. nodosus. Somewhat unexpectedly, there is little or no evidence for the fimbrial subunit characteristic of the host strain PAK/2Pfs (see Figure 4, also below).

Diese Ergebnisse wurden durch Westerntransferanalyse der von PKN-A1-Zellen erzeugten Fimbrien im Vergleich zu solchen, die aus dem B. nodosus-Stamm VCS1001 und P. aeruginosa PAK/2Pfs erhalten wurden, bestätigt (Figur 5). Dieses Experiment zeigt deutlich, daß die von PKN-A1 erzeugten Fimbrien nicht nur aus einer Strukturuntereinheit bestehen, welche dieselbe elektrophoretische Mobilität wie die in B. nodosus selbst auftretende aufweist (Figur 5A), sondern auch daß dieses Protein von gegen B. nodosus Fimbrien gerichteten Antikörpern erkannt wird (Figur 5C). Der reziproke Western unter Verwendung von Anti-P. aeruginosa Fimbrien-Antiserum bestätigt, daß die von diesen rekombinanten Zellen erzeugten Fimbrien wenig oder überhaupt keine natürlicherweise durch den Wirt exprimierten Strukturuntereinheit enthalten (Figur 5B). Kontrollexperimente haben gezeigt, daß die Anwesenheit des Vektorplasmids pKT240 selbst die Zusammensetzung der Fimbrien in P. aeruginose nicht beeinflußt.These results were confirmed by Western transfer analysis of fimbriae produced by PKN-A1 cells compared with those obtained from B. nodosus strain VCS1001 and P. aeruginosa PAK/2Pfs (Figure 5). This experiment clearly shows that the fimbriae produced by PKN-A1 not only consist of a structural subunit that has the same electrophoretic mobility as that found in B. nodosus itself (Figure 5A), but also that this protein is recognized by antibodies directed against B. nodosus fimbriae (Figure 5C). The reciprocal Western using anti-P. aeruginosa fimbriae antiserum confirms that the fimbriae produced by these recombinant cells contain little or no structural subunit naturally expressed by the host (Figure 5B). Control experiments have shown that the presence of the vector plasmid pKT240 itself does not affect the composition of the fimbriae in P. aeruginose.

Die Erzeugung von Fimbrien des B. nodosus-Typs in PKN-A1- Zellen wurde ebenfalls unabhängig durch Immunogoldmarkierung und elektronenmikroskopische Untersuchung bestätigt. Fimbrien wurden aus B. nodosus VCS1001, P. aeruginosa-Stamm PAK/2Pfs und P. aeruginosa PKN-A1 präpariert, auf Träger gegeben und entweder mit Anti-P. aeruginosa PAK/2Pfs Fimbrien-Antiserum oder Anti-B. nodosus VCS1001 Fimbrien-Antiserum inkubiert. Nach Waschen wurden die Proben mit Gold-markiertem Protein A inkubiert, erneut gewaschen, dann negativ angefärbt und durch Elektronenmikroskopie sichtbar gemacht. Die Antikörperbindung wurde durch die Anwesenheit von elektronendichten, kugelförmigen Goldteilchen sowie durch das Zusammenklumpen der Fimbrienstränge angezeigt. Wie erwartet, reagierten B. nodosus VCS1001-Fimbrien stark mit dem homologen Antiserum, aber nicht mit Antiserum, das gegen P. aeruginosa Fimbrien erzeugt worden war. Auch umgekehrt wurde gefunden, daß P. aeruginosa PAK/2Pfs stark mit dem homologen Antiserum, aber nicht mit Antiserum gegen B. nodosus Fimbrien reagierte. Das Muster ist in den rekombinanten P. aeruginosa-Zellen mit pJSM202 völlig umgedreht, die jetzt ein ähnliches Profil wie das in B. nodosus beobachtete aufweisen. Von PKN-A1 erzeugte Fimbrien werden nicht von Antikörpern erkannt, die gegen P. aeruginosa Fimbrien gerichtet sind, sondern reagieren stark mit solchen gegen B. nodosus Fimbrien. Diese Ergebnisse können in der folgenden Tabelle zusammengefaßt werden, wobei + Antikörpererkennung und - das Fehlen von Antikörpererkennung bedeutet. Stamm B.nodosus P.aeruginosa Antiserum VCS1001 (Wirt) PAK/2Pfs (Wirt) PKN-A1 (rekombinant) Anti-B.nodosus VCS1001 Fimbrien Anti-P.aeruginosa PAK/2Pfs FimbrienThe generation of B. nodosus-type fimbriae in PKN-A1 cells was also independently confirmed by immunogold labeling and electron microscopy. Fimbriae were prepared from B. nodosus VCS1001, P. aeruginosa strain PAK/2Pfs and P. aeruginosa PKN-A1, placed on slides and incubated with either anti-P. aeruginosa PAK/2Pfs fimbrial antiserum or anti-B. nodosus VCS1001 fimbrial antiserum. After washing, samples were incubated with gold-labeled protein A, washed again, then negatively stained and visualized by electron microscopy. Antibody binding was indicated by the presence of electron-dense, spherical gold particles and by the clumping of the fimbrial strands. As expected, B. nodosus VCS1001 fimbriae reacted strongly with the homologous antiserum but not with antiserum raised against P. aeruginosa fimbriae. Conversely, P. aeruginosa PAK/2Pfs was also found to react strongly with the homologous antiserum but not with antiserum raised against B. nodosus fimbriae. The pattern is completely reversed in the recombinant P. aeruginosa cells with pJSM202, which now display a profile similar to that observed in B. nodosus. Fimbriae raised by PKN-A1 are not recognized by antibodies directed against P. aeruginosa fimbriae but react strongly with those against B. nodosus fimbriae. These results can be summarized in the following table, where + means antibody detection and - means absence of antibody detection. Strain B.nodosus P.aeruginosa Antiserum VCS1001 (host) PAK/2Pfs (host) PKN-A1 (recombinant) Anti-B.nodosus VCS1001 fimbriae Anti-P.aeruginosa PAK/2Pfs fimbriae

Es wurden auch verschiedene andere Kriterien verw-endet, um die Erzeugung von B. nodosus Fimbrien durch P. aeruginosa-Zellen mit pJSM202 zu bestätigen. Diese umfassen Nachweise, daß gegen die rekombinanten Fimbrien erzeugte Antiseren B. nodosus (VCS1001)-Zellen agglutinieren (siehe den folgenden Impfversuch) und daß umgekehrt gegen B. nodosus (VCS1001) erzeugte Antiseren eine Agglutinierung der rekombinanten P. aeruginosa PKN-A1-Zellen verursachen. Diese Agglutinierungsreaktionen sind (B.nodosus) Serotyp-spezifisch. Kontrollexperimente zeigten, daß Anti-B. nodosus-Antiseren den Wirt P. aeruginosa PAK/2Pfs (mit oder ohne das Vektorplasmid pKT240) nicht agglutinieren und daß gegen normale P. aeruginosa Fimbrien erzeugte Antiseren nicht B. nodosus agglutinieren. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Antikörper-Antigen-Standard- Festphasen-Bindungstests wie etwa ELISA-Tests erhalten.Several other criteria were also used to confirm the production of B. nodosus fimbriae by P. aeruginosa cells expressing pJSM202. These included demonstration that antisera raised against the recombinant fimbriae agglutinated B. nodosus (VCS1001) cells (see the vaccination experiment below) and, conversely, that antisera raised against B. nodosus (VCS1001) agglutinated the recombinant P. aeruginosa PKN-A1 cells. These agglutination reactions are (B.nodosus) serotype specific. Control experiments showed that anti-B. nodosus antisera did not agglutinate the host P. aeruginosa PAK/2Pfs (with or without the vector plasmid pKT240) and that antisera raised against normal P. aeruginosa fimbriae did not agglutinate B. nodosus. Similar results were obtained in standard antibody-antigen solid phase binding assays such as ELISA assays.

Diese Ergebnisse zeigen, daß P. aeruginosa PKN-A1-Zellen, die das rekombinante Plasmid pJSM202 enthalten, reife Fimbrienstrukturen erzeugen, die physikalisch, strukturell und antigenisch von denjenigen, die vom B. nodosus-Stamm, aus dem das Fimbrienuntereinheitgen ursprünglich stammte, nicht unterscheidbar sind. Wie wir im folgenden nachweisen werden, sind diese rekombinant erzeugten Fimbrien auch gleichermaßen bei der Induzierung einer protektiven Immunität gegen Fußfäule wirksam.These results demonstrate that P. aeruginosa PKN-A1 cells containing the recombinant plasmid pJSM202 produce mature fimbriae structures that are physically, structurally and antigenically indistinguishable from those produced by the B. nodosus strain from which the fimbrial subunit gene was originally derived. As we will demonstrate below, these recombinantly produced fimbriae are also equally effective in inducing protective immunity against footrot.

Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung anderer P. aeruginosa-Stämme mit Fimbrien als Wirtszelle für das rekombinante Plasmid pJSM202 erhalben. Diese umfassen P. aeruginosa PAK (ATCC 25102), den Ursprungsstamm von PAK/2Pfs, sowie P. aeruginosa PA01 (ATCC 25247), und die daraus abgeleitete Multifimbrienmutante DB-2, die normalerweise eine strukturell und serologisch unterschiedliche Form der Fimbrienuntereinheit, wie die in PAK-Stämmen gefundene, exprimiert.Similar results were obtained using other fimbriate P. aeruginosa strains as host cells for the recombinant plasmid pJSM202. These include P. aeruginosa PAK (ATCC 25102), the parent strain of PAK/2Pfs, as well as P. aeruginosa PA01 (ATCC 25247), and the derived multifimbrial mutant DB-2, which normally expresses a structurally and serologically different form of the fimbrial subunit, such as that found in PAK strains.

Die Insertion von pJSM202 in P. aeruginosa Fimbriaten hat wirksam zur vollständigen Substitution der B. nodosus Fimbrienuntereinheit für die normalerweise durch die Zellen erzeugte geführt. Die Tatsache, daß die von diesen rekombinanten Zellen erzeugten Fimbrien wenig oder keine endogene P. aeruginosa Strukturuntereinheiten enthalten, läßt vermuten, daß die hohe Expressionsstärke der B. nodosus Untereinheit entweder den Eintritt der endogenen Untereinheit in den Assemblierungsweg verhindert hat oder zu einer Rückkopplungshemmung (vermutlich über gemeinsame Signale in der konservierten Region) der Synthese der endogenen Untereinheit entweder im Stadium der Transkription oder der Translation geführt hat. In jedem Falle ist die Bereitstellung eines starken Promotors zur Erhöhung der Expression des klonierten B. nodosus Fimbrienuntereinheitgens in der P. aeruginosa- Wirtszelle klarerweise ein wichtiges Merkmal der Erfindung. Die genaue Art des verwendeten Promotors scheint jedoch nicht kritisch zu sein. Wir haben ähnliche Ergebnisse unter Verwendung alternativer Konstrukte erhalten, wobei das Fimbrienuntereinheitgen unter der transkriptionalen Kontrolle des starken PR-Promotors des Bakteriophagen Lambda ist. Die Expression des Fimbrienuntereinheitgens entweder durch den PL- oder den PR-Promotor kann durch Insertion einer klonierten Kopie des C1857 Repressorgens in das Plasmid reguliert werden, wobei der Selektivdruck gegen das Plasmid während der normalen Propagierung transformierter Zellen verringert wird. Es ist auch möglich, die Verwendung anderer starker Promotoren, wie etwa tac, in Betracht zu ziehen, die durch chemische Signale statt durch Temperaturänderung induziert werden können.Insertion of pJSM202 into P. aeruginosa fimbriate effectively resulted in complete substitution of the B. nodosus fimbrial subunit for that normally produced by the cells. The fact that the fimbriae produced by these recombinant cells contain little or no endogenous P. aeruginosa structural subunits suggests that the high expression level of the B. nodosus subunit either prevented entry of the endogenous subunit into the assembly pathway or resulted in feedback inhibition (presumably via common signals in the conserved region) of synthesis of the endogenous subunit at either the transcriptional or translational stage. In any case, the provision of a strong promoter to increase expression of the cloned B. nodosus fimbrial subunit gene in the P. aeruginosa host cell is clearly an important feature of the invention. However, the precise nature of the promoter used does not appear to be critical. We have obtained similar results using alternative constructs, with the fimbrial subunit gene under the transcriptional control of the strong PR promoter of bacteriophage lambda. Expression of the fimbrial subunit gene from either the PL or PR promoter can be regulated by inserting a cloned copy of the C1857 repressor gene into the plasmid, thereby reducing the selective pressure against the plasmid during normal propagation of transformed cells. It is also possible to consider the use of other strong promoters, such as tac, which can be induced by chemical signals rather than by temperature change.

Die hier gezeigten Ergebnisse erhärten unsere Vorhersage, daß Fimbrienuntereinheiten vom Typ 4 aus unterschiedlichen Bakterienspezies gemeinsame topogene Signale zur fimbriellen Morphogenese aufweisen und in kompatiblen Wirten ausgetauscht werden können. Dies ist sicher der Fall für B. nodosus und P. aeruginosa und sollte gleichermaßen auf andere Typ 4-Spezies anwendbar sein, welche die konservierte hydrophobe aminoterminale Region der Fimbrienuntereinheit aufweisen. Da eine Variation in der carboxyterminalen Region dieses Proteins den Prozeß der fimbriellen Assemblierung nicht zu stören scheint, ist es weiterhin möglich, daß die gemeinsame Klonierung von zwei oder mehreren Genen, die für verwandte Fimbrienuntereinheiten des Typs 4 kodieren, in derselben kompatiblen Wirtszelle zur Bildung gemischter oder Hydridfimbrien (bestehend aus einer zufälligen Anordnung der eingeführten Untereinheiten) führt, die dann eine multivalente Antigenpräparation liefern können, die gegen mehr als einen Serotyp oder möglicherweise sogar gegen mehr als eine Spezies wirksam ist.The results presented here support our prediction that type 4 fimbrial subunits from different bacterial species share common topogenic signals for fimbrial morphogenesis and can be exchanged in compatible hosts. This is certainly the case for B. nodosus and P. aeruginosa and should be equally applicable to other type 4 species that share the conserved hydrophobic amino-terminal region of the fimbrial subunit. Since variation in the carboxy-terminal region of this protein does not seem to disturb the process of fimbrial assembly, it is also possible that the co-cloning of two or more genes encoding related type 4 fimbrial subunits in the same compatible host cell results in the formation of mixed or hydride fimbriae (consisting of a random arrangement of the introduced subunits), which can then provide a multivalent antigen preparation active against more than one serotype or possibly even against more than one species.

Es gibt verschiedene andere Modifikationen des Basissystems, die man unter besonderen Umständen in Betracht ziehen kann. In manchen Fällen mag es beispielsweise möglich sein, die Expression der durch die Wirtszelle erzeugten Fimbrienuntereinheit zu eliminieren. Dies kann durch eine Reihe von Methoden erreicht werden, umfassend die traditionelle Mutantenselektion, Transposonmutagenese oder in vitro Modifizierung des Gens und anschließende Rekombinationsinsertion in vivo. Das System kann auch durch Modifizierung (die Expression) von bei dem fimbriellen Assemblierungsproezß beteiligten Genen verbessert werden. Es können auch Veränderungen innerhalb der konservierten aminoterminalen Sequenz der Fimbrienuntereinheit selbst gemacht werden, um die Wirksamkeit der Fimbrienassemblierung in einer heterologen Typ 4-Spezies zu verbessern. Dies kann beispielsweise durch Genfusionen oder ortsspezifische Mutagenese in vitro unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide zur Änderung spezifischer Aminosäurekodons erfolgen, so daß die Konsensussequenz zu einer großen Übereinstimmung mit derjenigen gebracht wird, die normalerweise im bevorzugten Wirt aktiv ist und durch ihn erkannt wird.There are various other modifications of the basic system that may be considered in special circumstances. For example, in some cases it may be possible to eliminate the expression of the fimbrial subunit produced by the host cell. This can be achieved by a number of methods including traditional mutant selection, transposon mutagenesis, or in vitro modification of the gene followed by recombination insertion in vivo. The system can also be improved by modifying (the expression of) genes involved in the fimbrial assembly process. Changes can also be made within the conserved amino-terminal sequence of the fimbrial subunit itself to improve the efficiency of fimbrial assembly in a heterologous type 4 species. This can be done, for example, by gene fusions or site-directed mutagenesis in vitro using synthetic oligonucleotides to alter specific amino acid codons so that the consensus sequence is brought into close agreement with that normally active in and recognized by the preferred host.

Für den Fachmann ist es ersichtlich, daß zahlreiche andere Variationen und Modifikationen zu der oben beschriebenen Erfindung gemacht werden können, ohne vom Gegenstand oder Umfang der Erfindung, wie im weiteren Sinne beschrieben, abzuweichen.It will be apparent to those skilled in the art that numerous other variations and modifications can be made to the invention described above without departing from the spirit or scope of the invention as broadly described.

C. ImpfversuchC. Vaccination trial

Die Wirksamkeit der von rekombinanten P. aeruginosa PKN-A1- Zellen erzeugten Fimbrien bei der Induzierung einer protektiven Immunität gegen Fußfäuleinfektion bei Schafen wurden in einem Impfversuch getestet. Der Impfversuch wurde wie folgt durchgeführt: Insgesamt 73 normale Schafe wurden statistisch auf 7 Gruppen aufgeteilt, von denen jede entweder 10 oder 11 Individuen pro Gruppe enthielt. Zwei Gruppen wurden als negative Kontrollen bezeichnet - eine erhielt keine Behandlung (Gruppe 1) und die andere wurde mit isolierten Fimbrien aus dem P. aeruginosa Wirtsstamm PAK/2Pfs geimpft (Gruppe 4). Es gab auch zwei positive Kontrollgruppen, die entweder mit ganzen Zellen (Gruppe 2) oder isolierten Fimbrien (Gruppe 3) aus B. nodosus VCS1001 geimpft wurden. Zwei experimentelle Gruppen (Gruppen 5 und 6) wurden mit unterschiedlichen Mengen an Fimbrien geimpft, die aus dem rekombinanten P. aeruginosa Stamm PKN-A1 (mit pJSM202) isoliert worden waren. Eine dritte experimentelle Gruppe (Gruppe 7) wurde ebenfalls mit Fimbrien aus PKN-A1 geimpft, die in diesem Falle durch eine alternative Prozedur isoliert worden waren (siehe unten). Gruppe Impfstoffantigen Dosis Gesamtzellen B. nodosus VCS1001 Isolierte Fimbrien B.nodosus VCS1001 Isolierte Fimbrien PAK/2Pfs Isolierte Fimbrien PKN-A1 Isolierte Fimbrien PKN-A1 (MgCl&sub2;) The efficacy of fimbriae produced by recombinant P. aeruginosa PKN-A1 cells in inducing protective immunity against footrot infection in sheep was tested in a vaccination trial. The vaccination trial was conducted as follows: A total of 73 normal sheep were randomly divided into 7 groups, each containing either 10 or 11 individuals per group. Two groups were designated as negative controls - one received no treatment (group 1) and the other was vaccinated with isolated fimbriae from the P. aeruginosa host strain PAK/2Pfs (group 4). There were also two positive control groups vaccinated with either whole cells (group 2) or isolated fimbriae (group 3) from B. nodosus VCS1001. Two experimental groups (groups 5 and 6) were vaccinated with different amounts of fimbriae isolated from the recombinant P. aeruginosa strain PKN-A1 (containing pJSM202). A third experimental group (group 7) was also vaccinated with fimbriae from PKN-A1, in this case isolated by an alternative procedure (see below). Group Vaccine antigen Dose Total cells B. nodosus VCS1001 Isolated fimbriae B.nodosus VCS1001 Isolated fimbriae PAK/2Pfs Isolated fimbriae PKN-A1 Isolated fimbriae PKN-A1 (MgCl₂)

Die Zellen wurden auf Agarplatten kultiviert und durch Abschaben in sterile phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) geerntet. Zur Fimbrienisolierung wurden diese Zellsuspensionen einem mechanischen Vermengen unterzogen und anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt. Fimbrien wurden aus dem zellfreien Überstand durch isoelektrische Präzipitation mit 0,1M Na-Acetat (pH 4,5) oder im Falle von Gruppe 7 durch Präzipitation mit 0,1M MgCl&sub2; gewonnen. Anschließend wurden die Fimbrien erneut in steriler PBS gelöst durch eine weitere Präzipitationsrunde nach der ursprünglich verwendeten Methode gereinigt. Der Gehalt und die Reinheit aller beim Impfversuch verwendeten Antigenpräparationen wurde dann durch elektrophoretische Auftrennung und Westerntransferanalyse unter Verwendung von Anti-B. nodosus VCS1001- und Anti-P. aeruginosa PAK/2Pfs-Antiseren überprüft (Tabelle 7).Cells were cultured on agar plates and harvested by scraping into sterile phosphate buffered saline (PBS). To isolate fimbriae, these cell suspensions were subjected to mechanical mixing and then cells were removed by centrifugation. Fimbriae were recovered from the cell-free supernatant by isoelectric precipitation with 0.1M Na acetate (pH 4.5) or, in the case of group 7, by precipitation with 0.1M MgCl2. Fimbriae were then redissolved in sterile PBS and purified by another round of precipitation using the method originally used. The content and purity of all antigen preparations used in the vaccination trial was then determined by electrophoretic separation and Western transfer analysis using anti-B. nodosus VCS1001 and anti-P. aeruginosa PAK/2Pfs antisera (Table 7).

Impfstoffe wurden unter Verwendung eines Standard-Alaun/Öl- Adjuvanz-Systems hergestellt: Eine entsprechende Menge an Antigen wurde in steriler PBS resuspendiert, zu der ein Siebtel Volumen von 10 %igem Kaliumalaun (AlK(SO&sub4;)&sub2;) gegeben wurde, und der pH wurde auf 6,2 eingestellt. Es wurde ein Hundertstel Volumen Tween 80 zugegeben und das Gemisch mit einem gleichen Volumen von Freund'schem unvollständigem Adjuvanz emulgiert. Jede einzelne Dosis lag in einem Volumen von 2 ml vor und enthielt die in der obigen Tabelle spezifizierte Menge an Antigen. Jedes Tier erhielt 2 Dosen - eine primäre Impfung, gefolgt von einem Auffrischungsschuß 28 Tage später. Vier Tage nach der Auffrischung wurden die Tiere für die Herausforderung vorbereitet, indem sie bei feuchten Bedingungen (auf nassen Matten) in Pferchen stehengelassen wurden. Die Herausforderung wurde drei Tage später (d.h. eine Woche nach der Auffrischung) künstlich verabreicht, indem kultivierte Zellen von B. nodosus VCS1001 auf jeden Fuß aufgetragen wurden. Tiere aller Gruppen wurden für die Dauer des Versuchs zusammen eingepfercht. Während des Versuchs wurden Blutproben entnommen, um den Agglutinierungstiter gegen B. nodosus VCS1001 im Serum zu überwachen. Das Vorhandensein und die Schwere der Infektion wurde 21 Tage nach der Herausforderung bewertet, indem jeder einzelne Fuß auf Läsionen untersucht wurde. Die Daten sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 2 Gruppe Impfstoff Befallene Schafe Schwere (unterlaufende) Läsionen (% Füße) Agglutinierungs-Titer + 2 Wochen + 3 Wochen B.nodosus Zellen (5 x 10&sup9;) B. nodosus Fimbrien 250 µg P. aeruginosa Fimbrien 250 µg PKN-A1 Fimbrien 250 µg PKN-A1 Fimbrien 500 µg PKN-A1 Fimbrien MgCl&sub2; 250 µgVaccines were prepared using a standard alum/oil adjuvant system: an appropriate amount of antigen was resuspended in sterile PBS to which one seventh volume of 10% potassium alum (AlK(SO4)2) was added and the pH was adjusted to 6.2. One hundredth volume of Tween 80 was added and the mixture emulsified with an equal volume of Freund's incomplete adjuvant. Each individual dose was in a volume of 2 ml and contained the amount of antigen specified in the table above. Each animal received 2 doses - a primary vaccination followed by a booster shot 28 days later. Four days after the booster, animals were prepared for challenge by standing in pens under humid conditions (on wet mats). The challenge was artificially administered three days later (i.e., one week after booster) by applying cultured cells of B. nodosus VCS1001 to each foot. Animals from all groups were penned together for the duration of the experiment. Blood samples were taken during the experiment to determine the agglutination titer against B. nodosus VCS1001 in serum. The presence and severity of infection was assessed 21 days after challenge by examining each individual foot for lesions. Data are summarized in Table 2. Table 2 Group Vaccine Affected sheep Severe (underfoot) lesions (% feet) Agglutination titre + 2 weeks + 3 weeks B.nodosus cells (5 x 10⁹) B. nodosus fimbriae 250 µg P. aeruginosa fimbriae 250 µg PKN-A1 fimbriae 250 µg PKN-A1 fimbriae 500 µg PKN-A1 fimbriae MgCl⁹ 250 µg

Legende zu Tabelle 2: Betroffene Tiere sind als solche definiert, die mindestens einen Fuß mit einer Läsionsbewertung von 3 oder 4, oder mindestens 2 Füße mit einer Läsionsbewertung von 2 drei Wochen nach der Herausforderung aufweisen. Die Läsionsbewertung wurde auf einer Standardskala von 2 bis 4 wie folgt bewertet: 2 erkenntbare interdigitale Dermatitis, 3 unterlaufende Läsionen des weichen Horns des Hufabsatzes und 4 unterlaufende Läsionen des harten Hornes des Hufs. (Eine Läsionsbewertung von 1 wird normalerweise für Füße verwendet, die Symptome milder interdigitaler Dermatitis zeigen. Dies kann auf andere Ursachen zurückzuführen sein und wurde deshalb in der Bewertung nicht berücksichtigt). Ernste Läsionen sind solche, die den Huf unterlaufen, d.h. eine Bewertung von entweder 3 oder 4. G.M.F.S. ist die mittlere Fußbewertung der Gruppe und wurde als Summe der Läsionsbewertungen für alle Füße aller Tiere in der Gruppe geteilt durch die Anzahl der Füße in der Gruppe berechnet. Der Agglutinierungstiter wurde als Reziprokwert der maximalen Verdünnung bestimmt, bei der sichtbare K-Agglutinierung von B. nodosus (VCS1001) Zellen beobachtet wurde. Es wurden zweifache Serienverdünnungen durchgeführt. Die Daten sind für Proben gezeigt, die 2 Wochen und 3 Wochen nach der Herausforderung (d.h. 3 und 4 Wochen nach der Auffrischung) entnommen wurden. Die Daten sind als geometrischer Mittelwert für die Gruppe (auf die nächsten Hundert abgerundet) ausgedrückt. n.b. = nicht bestimmt.Key to Table 2: Affected animals are defined as having at least one foot with a lesion score of 3 or 4, or at least 2 feet with a lesion score of 2 three weeks after challenge. The lesion score was scored on a standard scale of 2 to 4 as follows: 2 visible interdigital dermatitis, 3 underrunning lesions of the soft horn of the heel, and 4 underrunning lesions of the hard horn of the hoof. (A lesion score of 1 is normally used for feet showing symptoms of mild interdigital dermatitis. This may be due to other causes and was therefore not included in the score). Severe lesions are those that underrun the hoof, i.e. a score of either 3 or 4. G.M.F.S. is the mean foot score of the group and was calculated as the sum of the lesion scores for all feet of all animals in the group divided by the number of feet in the group. The agglutination titer was determined as the reciprocal of the maximum dilution at which visible K agglutination of B. nodosus (VCS1001) cells was observed. Two-fold serial dilutions were performed. Data are shown for samples collected 2 weeks and 3 weeks post-challenge (i.e., 3 and 4 weeks post-boost). Data are expressed as the geometric mean for the group (rounded to the nearest hundred). n.d. = not determined.

Die Ergebnisse des Impfversuchs zeigen eindeutig, daß die rekombinanten Fimbrien dasselbe Ausmaß an Schutz wie vollständige B. nodosus-Zellen oder Fimbrien gegen eine homologe Fußfäule-Herausforderung vermitteln. Es gibt keinen signifikanten Unterschied zwischen den Serumagglutinierungstitern oder dem Ausmaß der protektiven Immunität, die in entweder mit dem natürlichen oder dem rekombinanten Material geimpften Gruppen beobachtet werden. Eine vollständige Immunität gegen eine Fußfäule-Herausforderung wird in solchen Impfversuchen selten beobachtet, insbesondere wenn ein hochvirulenter Stamm, wie etwa VCS1001 beteiligt ist. Die Reaktion einzelner Tiere auf die Impfung ist ziemlich variabel. Obwohl jedoch weder das natürliche noch das rekombinante Material Vollimmunität gegen Fußfäuleinfektion in diesem Versuch vermittelte, gibt es einen großen und in praktischer Hinsicht bedeutenden Unterschied zwischen den geimpften Gruppen und den negativen Kontrollen. Alle Tiere in den negativen Kontrollgruppen (d.h. entweder unbehandelt oder mit normalen P. aeruginosa Fimbrien geimpft) wurden von schwerer Fußfäule befallen, wobei etwa 65 % aller Füße unterlaufende Läsionen aufweisen. Die mittlere Läsionsbewertung für diese Gruppen war 2,4. Solche Läsionen sind in den Gruppen relativ selten, die mit B. nodosus-Zellen oder Fimbrien oder durch rekombinante Zellen erzeugten Fimbrien geimpft wurden, wobei ernste Symptome nur bei 15 bis 20 % aller Füße beobachtet wurden. Die mittlere Läsionsbewertung in diesen Gruppen war nur 0,9. Dies bedeutet tatsächlich den Unterschied zwischen Schafen, die durch die Krankheit geschwächt werden, und solchen, die trotz einiger Ausnahmen nur leicht beeinträchtigt und belästigt wurden. Dieser praktische Unterschied ist in der Freilandsituation wichtig.The results of the vaccination trial clearly demonstrate that the recombinant fimbriae confer the same level of protection as whole B. nodosus cells or fimbriae against a homologous footrot challenge. There is no significant difference between the serum agglutination titres or the level of protective immunity observed in groups vaccinated with either the natural or the recombinant material. Complete immunity against Footrot challenge is rarely observed in such vaccination trials, particularly when a highly virulent strain such as VCS1001 is involved. The response of individual animals to vaccination is quite variable. However, although neither the natural nor the recombinant material conferred full immunity to footrot infection in this trial, there is a large and practically important difference between the vaccinated groups and the negative controls. All animals in the negative control groups (i.e., either untreated or vaccinated with normal P. aeruginosa fimbriae) were affected by severe footrot, with approximately 65% of all feet showing subcutaneous lesions. The mean lesion score for these groups was 2.4. Such lesions are relatively rare in the groups vaccinated with B. nodosus cells or fimbriae or fimbriae produced by recombinant cells, with severe symptoms observed in only 15 to 20% of all feet. The mean lesion score in these groups was only 0.9. This actually means the difference between sheep that are weakened by the disease and those that, despite some exceptions, have only been slightly affected and bothered. This practical difference is important in the field situation.

Claims (32)

1. Verfahren zur Herstellung einer Antigenpräparation zur Anwendung bei der Erzeugung von Antikörpern, die gegen eine Bakterienspezies wirksam sind, die natürlicherweise Fimbrien des Typs 4 erzeugt, umfassend das Kultivieren von genetisch manipulierten, aeroben oder fakultativ anaeroben Wirtszellen mit Fimbrien des Typs 4, welche die für die fimbriellen Untereinheitstrukturantigene von mindestens einem Stamm der Bakterienspezies kodierenden Gene und ein endogen kompatibles System zur morphogenetischen Assemblierung von Fimbrien des Typs 4 enthalten, so daß reife Fimbrien als extrazelluläre Strukturen erzeugt werden, und das teilweise oder vollständige Ernten der von den Wirtszellen im wesentlichen freien Fimbrien.1. A method for producing an antigen preparation for use in generating antibodies effective against a bacterial species that naturally produces type 4 fimbriae, comprising culturing genetically engineered aerobic or facultatively anaerobic host cells having type 4 fimbriae containing the genes encoding the fimbrial subunit structural antigens of at least one strain of the bacterial species and an endogenously compatible system for morphogenetic assembly of type 4 fimbriae so that mature fimbriae are produced as extracellular structures, and partially or completely harvesting the fimbriae substantially free from the host cells. 2. Verfahren zur Herstellung einer Antigenpräparation nach Anspruch 1, worin die für die fimbriellen Untereinheitstrukturantigene kodierenden Gene aus B. nodosus oder M. bovis stammen.2. A process for producing an antigen preparation according to claim 1, wherein the genes encoding the fimbrial subunit structural antigens are derived from B. nodosus or M. bovis. 3. Verfahren zur Herstellung einer Antigenpräparation nach Anspruch 1, worin die für die fimbriellen Untereinheitstrukturantigene kodierenden Gene aus einer Spezies, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus P. aeruginosa, N. gonorrhoea, N. meningitidis und M. nonliquefaciens, stammen.3. A process for preparing an antigen preparation according to claim 1, wherein the genes encoding the fimbrial subunit structural antigens are from a species selected from the group consisting of P. aeruginosa, N. gonorrhoea, N. meningitidis and M. nonliquefaciens. 4. Verfahren zur Herstellung einer Antigenpräparation nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die genetisch manipulierten Wirtszellen Gene für eine Vielzahl von fimbriellen Untereinheitstrukturantigenen enthalten, wobei die Gene von unterschiedlichen Spezies oder Gattungen stammen.4. A process for producing an antigen preparation according to any one of claims 1 to 3, wherein the genetically manipulated host cells contain genes for a plurality of fimbrial subunit structural antigens, the genes being derived from different species or genera. 5. Verfahren zur Herstellung einer Antigenpräparation nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die genetisch manipulierten Wirtszellen Gene für eine Vielzahl von fimbriellen Untereinheitstrukturantigenen enthalten, wobei die Gene von unterschiedlichen Serotypen einer einzigen Bakterienspezies stammen.5. A process for producing an antigen preparation according to any one of claims 1 to 3, wherein the genetically manipulated host cells contain genes for a plurality of fimbrial subunit structural antigens, the genes being derived from different serotypes of a single bacterial species. 6. Verfahren zur Herstellung einer Antigenpräparation nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die reifen Fimbrien oder Fragmente davon aus mindestens einem Serotyp von B. nodosus sind.6. A process for the preparation of an antigen preparation according to any one of claims 1 to 5, wherein the mature fimbriae or fragments thereof are from at least one serotype of B. nodosus. 7. Verfahren zur Herstellung einer Antigenpräparation nach Anspruch 1, worin die Wirtszelle ein Stamm einer genetisch manipulierten Spezies der Gattung Pseudomonas ist.7. A process for producing an antigen preparation according to claim 1, wherein the host cell is a strain of a genetically engineered species of the genus Pseudomonas. 8. Verfahren zur Herstellung einer Antigenpräparation nach Anspruch 7, worin die Wirtszelle ein Stamm von genetisch manipuliertem P. aeruginosa ist.8. A process for producing an antigen preparation according to claim 7, wherein the host cell is a strain of genetically engineered P. aeruginosa. 9. Verfahren zur Herstellung einer Antigenpräparation nach Anspruch 8, worin es sich bei dem genetisch manipulierten P. aeruginosa um P. aeruginosa PAK/2Pfs (ATCC Nr. 53308) oder einen Abkömmling davon handelt.9. A process for producing an antigen preparation according to claim 8, wherein the genetically engineered P. aeruginosa is P. aeruginosa PAK/2Pfs (ATCC No. 53308) or a derivative thereof. 10. Verfahren zur Herstellung einer Antigenpräparation nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das für das fimbrielle Untereinheitstrukturantigen kodierende Gen modifiziert worden ist, um die morphogenetische Expression in der Wirtszelle molekular zu verbessern.10. A process for producing an antigen preparation according to any one of claims 1 to 9, wherein the gene encoding the fimbrial subunit structural antigen has been modified to molecularly enhance morphogenetic expression in the host cell. 11. Verfahren zur Herstellung einer Antigenpräparation nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das für das fimbrielle Untereinheitstrukturantigen kodierende Gen unter der transkriptionellen Kontrolle eines starken Promotors ist, der im ausgewählten Wirt aktiv ist.11. A process for preparing an antigen preparation according to any one of claims 1 to 10, wherein the gene encoding the fimbrial subunit structural antigen is under the transcriptional control of a strong promoter active in the selected host. 12. Verfahren zur Herstellung einer Antigenpräparation nach Anspruch 11, worin der starke Promotor regulierbar ist.12. A process for producing an antigen preparation according to claim 11, wherein the strong promoter is regulatable. 13. Verfahren zur Herstellung einer Antigenpräparation nach Anspruch 12, worin der Promotor der aus dem Bakteriophagen Lambda stammende PL- oder PR-Promotor ist.13. A process for the preparation of an antigen preparation according to claim 12, wherein the promoter is the PL or PR promoter derived from bacteriophage lambda. 14. Verfahren zur Herstellung einer Antigenpräparation nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin das für das fimbrielle Untereinheitstrukturantigen kodierende Gen in einem Plasmid enthalten ist.14. A process for producing an antigen preparation according to any one of claims 1 to 13, wherein the gene encoding the fimbrial subunit structural antigen is contained in a plasmid. 15. Verfahren zur Herstellung einer Antigenpräparation nach Anspruch 14, worin es sich bei dem Plasmid um das Plasmid pJSM202 (ATCC Nr. 40203) handelt.15. A process for the preparation of an antigen preparation according to claim 14, wherein the plasmid is plasmid pJSM202 (ATCC No. 40203). 16. Verfahren zur Herstellung einer Antigenpräparation nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin das für das fimbrielle Untereinheitstrukturantigen kodierende Gen in das Chromosom der bakteriellen Wirtszelle insertiert wird.16. A process for producing an antigen preparation according to any one of claims 1 to 12, wherein the gene encoding the fimbrial subunit structural antigen is inserted into the chromosome of the bacterial host cell. 17. Genetisch manipuliertes, aerobes oder fakultativ anaerobes Bakterium mit Fimbrien des Typs 4, wobei das Bakterium dadurch gekennzeichnet ist, daß es exogene Gene enthält, die für die fimbriellen Untereinheitstrukturantigene von mindestens einem Bakterienstamm kodieren, der natürlicherweise Fimbrien des Typs 4 erzeugt, so daß Expression der exogenen Gene die Erzeugung von Fimbrien des mindestens einen Stammes als extrazelluläre Strukturen bewirkt.17. A genetically engineered aerobic or facultatively anaerobic bacterium having type 4 fimbriae, the bacterium being characterized by containing exogenous genes encoding the fimbrial subunit structural antigens of at least one bacterial strain that naturally produces type 4 fimbriae, such that expression of the exogenous genes results in the production of fimbriae of the at least one strain as extracellular structures. 18. Genetisch manipuliertes Bakterium mit Fimbrien des Typs 4 nach Anspruch 17, worin die exogenen Gene aus B. nodosus oder M. bovis stammen.18. A genetically engineered bacterium with fimbriae type 4 according to claim 17, wherein the exogenous genes are from B. nodosus or M. bovis. 19. Genetisch manipuliertes Bakterium mit Fimbrien des Typs 4 nach Anspruch 17, worin die exogenen Gene aus einer Spezies, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus P. aeruginosa, N. gonorrhoea, N. meningitidis und M. nonliquefaciens, stammen.19. A genetically engineered type 4 fimbriated bacterium according to claim 17, wherein the exogenous genes are from a species selected from the group consisting of P. aeruginosa, N. gonorrhoea, N. meningitidis and M. nonliquefaciens. 20. Genetisch manipuliertes Bakterium mit Fimbrien des Typs 4 nach einem der Ansprüche 17 bis 19, worin die exogenen Gene von unterschiedlichen Spezies oder Gattungen stammen.20. A genetically engineered bacterium with fimbriae of type 4 according to any of claims 17 to 19, wherein the exogenous genes originate from different species or genera. 21. Genetisch manipuliertes Bakterium mit Fimbrien des Typs 4 nach einem der Ansprüche 17 bis 20, worin die exogenen Gene für fimbrielle Untereinheitstrukturantigene von unterschiedlichen Serotypen einer einzigen Bakterienspezies kodieren.21. A genetically engineered bacterium with type 4 fimbriae according to any one of claims 17 to 20, wherein the exogenous genes encode fimbrial subunit structural antigens from different serotypes of a single bacterial species. 22. Genetisch manipuliertes Bakterium mit Fimbrien des Typs 4 nach einem der Ansprüche 17 bis 21, worin die exogenen Gene aus mindestens einem Serotyp von B. nodosus stammen.22. A genetically engineered bacterium with type 4 fimbriae according to any one of claims 17 to 21, wherein the exogenous genes are from at least one serotype of B. nodosus. 23. Genetisch manipuliertes Bakterium mit Fimbrien des Typs 4 nach einem der Ansprüche 17 bis 22, worin das genetisch manipulierte Bakterium aus der Gattung Pseudomonas ist.23. A genetically engineered bacterium with fimbriae type 4 according to any one of claims 17 to 22, wherein the genetically engineered bacterium is from the genus Pseudomonas. 24. Genetisch manipuliertes Bakterium mit Fimbrien des Typs 4 nach Anspruch 23, worin das genetisch manipulierte Bakterium ein Stamm von P. aeruginosa ist.24. A genetically engineered bacterium having type 4 fimbriae according to claim 23, wherein the genetically engineered bacterium is a strain of P. aeruginosa. 25. Genetisch manipuliertes Bakterium mit Fimbrien des Typs 4 nach einem der Ansprüche 17 bis 24, worin die exogenen Gene modifiziert worden sind, um die morphogenetische Expression in der genetisch manipulierten Zelle molekular zu verbessern.25. A genetically engineered bacterium with type 4 fimbriae according to any one of claims 17 to 24, wherein the exogenous genes have been modified to molecularly enhance morphogenetic expression in the genetically engineered cell. 26. Genetisch manipuliertes Bakterium mit Fimbrien des Typs 4 nach einem der Ansprüche 17 bis 25, worin die exogenen Gene unter der transkriptionellen Kontrolle eines starken Promotors sind, der im genetisch manipulierten Bakterium aktiv ist.26. A genetically engineered bacterium with type 4 fimbriae according to any one of claims 17 to 25, wherein the exogenous genes are under the transcriptional control of a strong promoter active in the genetically engineered bacterium. 27. Genetisch manipuliertes Bakterium mit Fimbrien des Typs 4 nach Anspruch 26, worin der starke Promotor regulierbar ist.27. A genetically engineered bacterium with type 4 fimbriae according to claim 26, wherein the strong promoter is regulatable. 28. Genetisch manipuliertes Bakterium mit Fimbrien des Typs 4 nach Anspruch 27, worin der Promotor der aus dem Bakteriophagen Lambda stammende PL- oder PR-Promotor ist.28. A genetically engineered bacterium with type 4 fimbriae according to claim 27, wherein the promoter is the PL or PR promoter derived from bacteriophage lambda. 29. Genetisch manipuliertes Bakterium mit Fimbrien des Typs 4 nach einem der Ansprüche 17 bis 28, worin die exogenen Gene in einem Plasmid enthalten sind.29. A genetically engineered bacterium with fimbriae of type 4 according to any of claims 17 to 28, wherein the exogenous genes are contained in a plasmid. 30. Genetisch manipuliertes Bakterium mit Fimbrien des Typs 4 nach Anspruch 29, worin es sich bei dem Plasmid um pJSM202 (ATCC Nr. 40203) handelt.30. A genetically engineered bacterium with fimbriae type 4 according to claim 29, wherein the plasmid is pJSM202 (ATCC No. 40203). 31. Genetisch manipuliertes Bakterium mit Fimbrien des Typs 4 nach einem der Ansprüche 17 bis 28, worin die exogenen Gene in das Chromosom des genetisch manipulierten Bakteriums insertiert sind.31. A genetically engineered bacterium with fimbriae of type 4 according to any of claims 17 to 28, wherein the exogenous genes are inserted into the chromosome of the genetically engineered bacterium. 32. Pseudomonas aeruginosa PAK/2Pfs (ATCC Nr. 53308), transformiert mit dem Plasmid pJSM202 (ATCC Nr. 40203).32. Pseudomonas aeruginosa PAK/2Pfs (ATCC No. 53308) transformed with plasmid pJSM202 (ATCC No. 40203).
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