DE3526969A1 - Method for the electrically induced fusion of cells - Google Patents
Method for the electrically induced fusion of cellsInfo
- Publication number
- DE3526969A1 DE3526969A1 DE19853526969 DE3526969A DE3526969A1 DE 3526969 A1 DE3526969 A1 DE 3526969A1 DE 19853526969 DE19853526969 DE 19853526969 DE 3526969 A DE3526969 A DE 3526969A DE 3526969 A1 DE3526969 A1 DE 3526969A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- cells
- membrane
- cell
- breakthroughs
- suspension
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
- C12N15/04—Fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur elektrisch induzierten Fusion von Zellen, wobei die Zellen einem elektrischen Feld mit einer Stärke oberhalb der für einen elektrischen Durchbruch der Zellmembran charakteristischen Feldstärke ausgesetzt werden und wobei die zu fusionierenden Zellen während der Fusion in einer isotonischen Lösung in hoher Suspensionsdichte vorliegen.The invention relates to a method for electrical induced fusion of cells, the cells being a electric field with a strength above that for one electrical breakthrough characteristic of the cell membrane Field strength will be exposed and the ones to be merged Cells in an isotonic solution during fusion are present in high suspension density.
Bei herkömmlichen Verfahren werden die zu fusionierenden Zellen entlang von elektrischen Feldlinien ausgerichtet und auf einen bestimmten Kontaktabstand der Membranen gebracht, wobei der dielektrophoretische Effekt ausgenutzt wird, der auf Polarisationserscheinungen in den Zellen im elektrischen Feld beruht. Sehr häufig wird der dielektrophoretische Effekt durch ein elektrisches Wechselfeld erzeugt, das vor und nach einem elektrischen Feldpuls die zu fusionierenden Zellen in einem bestimmten Kontaktabstand der Membranen hält, so daß durch gegenüberliegende Poren oder Durchbrüche von Zellmembranen zweier verschiedener Zellen ein Austausch des Zellplasmas und eine nachfolgende Verschmelzung der beiden Zellmembranen miteinander erfolgen kann. Für das Auftreten des dielektrophoretischen Effekts ist die Inhomogenität des elektrischen Feldes Voraussetzung, da sonst kein Orientierungs- und Transportprozeß stattfindet.In conventional methods, the ones to be fused Cells aligned along electric field lines and to a certain contact distance of the membranes brought, taking advantage of the dielectrophoretic effect which is due to polarization phenomena in the cells in the electrical field. The dielectrophoretic is very common Effect created by an alternating electric field, that before and after an electric field pulse fusing cells at a certain contact distance of the membranes holds so that through opposite pores or breakthroughs of cell membranes of two different ones Cells an exchange of the cell plasma and a subsequent one Fusion of the two cell membranes with each other can be done. For the appearance of the dielectrophoretic The effect is the inhomogeneity of the electric field Requirement, since otherwise no orientation and Transport process takes place.
Bei einem anderen bekannten Verfahren der eingangs beschriebenen Art werden die zu fusionierenden Zellen in einer sehr hohen Suspensionsdichte vorgelegt und einem makroskopisch homogenen elektrischen Feld ausgesetzt. Die hohe Suspensionsdichte genügt, um lokale Inhomogenitäten im elektrischen Feld zu erzeugen, die für das Auftreten des dielektrophoretischen Effekts ausreichend sind. Dieses bekannte Verfahren verzichtet auf die Anwendung eines elektrischen Wechselfeldes zur Orientierung und Annäherung der Zellen und setzt dafür Feldpulse von so hoher Intensität ein, daß auch während der kurzen Dauer der Pulse (einige Mikrosekunden) die für die Fusion notwendige Orientierung und Annäherung der Zellen erfolgt.In another known method that described at the beginning The cells to be fused become in a very kind submitted high suspension density and a macroscopic exposed to homogeneous electric field. The high suspension density suffices to local inhomogeneities in the electrical Generate field for the occurrence of the dielectrophoretic Effect are sufficient. This well known The method dispenses with the use of an electrical Alternating field for orientation and approximation of the cells and sets field pulses of such high intensity a that even during the short duration of the pulses (some Microseconds) the orientation necessary for the fusion and cells approach.
Aus der Literatur (Biochimica et Biophysica Acta 694 (1982), 227-277) ist ein Verfahren zur Elektrofusion bekannt, das mit extrem hohen Suspensionsdichten arbeitet. Hierbei werden die Zellen bereits vor dem Applizieren der Feldpulse durch Zentrifugation auf den Kontaktabstand gebracht. (Abstand der Zentren zweier Zellen ist gleich dem Zelldurchmesser). From the literature (Biochimica et Biophysica Acta 694 (1982), 227-277) a method for electrofusion is known which works with extremely high suspension densities. Here are through the cells before applying the field pulses Centrifugation brought to the contact distance. (Distance the center of two cells is equal to the cell diameter).
Nachteilig bei den Methoden, die die Feldpulse nur auf Zellen in hoher Suspensionsdichte anwenden, ist, dass die Zellen einem Feld von sehr unterschiedlicher Stärke ausgesetzt sind, da die näher bei den Elektroden befindlichen Zellen die anderen Zellen gegenüber dem elektrischen Feld abschirmen. Auf die abgeschirmten Zellen wirken häufig Felder, deren Feldstärke unterhalb dem für die Erzielung von Durchbrüchen kritischen Wert liegen. Dem kann durch eine Erhöhung des Spannungspulses nicht abgeholfen werden, da sonst die weniger stark abgeschirmten Zellen irreversibel geschädigt werden.A disadvantage of the methods that the field pulses only on Applying cells in high suspension density is that the Cells exposed to a field of very different strengths because the ones closer to the electrodes Cells the other cells opposite the electric field shield. The shielded cells often act Fields whose field strength is below that for achieving breakthroughs are critical. This cannot be done by increasing the voltage pulse be remedied, otherwise the less shielded Cells are irreversibly damaged.
Bei der Fusion ist der kritische Zeitpunkt stets die Phase, in der die ursprünglichen und die neuen Zellen noch Membrandurchbrüche aufweisen, wodurch ein Austausch zwischen Zellinnerem und umgebender Lösung unter Umgehung des sonst vorhandenen Selektionsmechanismus der Membran möglich wird, In diesem Zeitbereich muss der Zusammensetzung der die Zellen umgebenden Lösung besondere Aufmerksamkeit gewidmet werden, da viele Substanzen, die normalerweise für die Zelle gut verträglich sind, ins Zellinnere gelangen können und dort toxisch wirken können. Insbesondere bei der Anwendung des dielektrophoretischen Effekts zur Sammlung und Orientierung der Zellen ist grösste Sorgfalt darauf zu verwenden, dass keine Elektrolyseprodukte auftreten, da diese sehr häufig für die Zellen toxisch wirken.The critical point in the merger is always the phase in which the original and the new cells still have membrane breakthroughs, causing an exchange bypassing the interior of the cell and the surrounding solution the otherwise existing selection mechanism of the membrane Is possible in this time range the composition the special solution surrounding the cells Attention should be paid to many substances that are normally well tolerated by the cell Can get inside the cells and have a toxic effect there. Especially when using the dielectrophoretic Effect for the collection and orientation of the cells Great care should be taken to ensure that no electrolysis products occur because these are very common for the cells act toxic.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur elektrisch induzierten Fusion von Zellen zu schaffen, bei dem die einzelnen Zellen während der Erzeugung der Membrandurchbrüche möglichst gleichen Feldbedingungen unterworfen sind. Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs beschriebenen Art erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass die Suspensionsdichte der Zellen nach der Erzeugung der Membrandurchbrüche so weit erhöht wird, dass ein Membrankontakt der zu fusionierenden Zellen hergestellt ist. Die zum Einsatz gelangende Zellsuspension kann deshalb zuerst sehr kleine Zelldichten aufweisen.The object of the invention is a method for electrical induced cell fusion in which the individual cells during the creation of the membrane breakthroughs subject to the same field conditions as possible. This task is initiated in a procedure described type according to the invention solved in that the suspension density of the cells after the generation of the Membrane breakthroughs are increased so far that a membrane contact of the cells to be fused is produced. The Cell suspension used can therefore be used first have very low cell densities.
Die Erhöhung der Suspensionsdichte kann in an sich bekannter Weise mittels Dielektrophorese erfolgen.The increase in suspension density can in itself in a known manner by means of dielectrophoresis.
Besonders vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemässen Verfahrens minimieren den Einsatz elektrischer Energie, wodurch sowohl das Entstehen von Elektrolyseprodukten als auch ein Aufheizen der Lösung durch die Leitung des elektrischen Stromes auf ein unvermeidliches Mass zurückgedrängt wird.Particularly advantageous embodiments of the inventive Procedures minimize the use of electrical Energy, causing both the emergence of electrolysis products as well as heating the solution through the Conducting the electric current to an inevitable Mass is pushed back.
Eine besonders einfache Methode zur Erhöhung der Suspensionsdichte stellt die Zentrifugation dar, bei der durch eine genaue Abstufung der Beschleunigungswerte eine gewünschte Suspensionsdichte der zu fusionierenden Zellen erreicht wird.A particularly simple method to increase the Suspension density represents centrifugation at which through a precise gradation of the acceleration values a desired suspension density of the to be fused Cells is reached.
Eine andere Möglichkeit zur Erhöhung der Zelldichte besteht darin, in die zu fusionierenden Zellen magnetische Partikel einzuschleusen oder an den Zellmembranen zu adsorbieren, beispielsweise Eisenoxid-Partikel, und die Suspensionsdichte solcher vorbehandelter Zellen mittels magnetischer Felder zu erhöhen.Another way to increase cell density is magnetic in the cells to be fused Introduce particles or to the cell membranes adsorb, for example iron oxide particles, and the Suspension density of such pretreated cells using to increase magnetic fields.
Ebenfalls vorteilhaft ist die Erhöhung der Suspensionsdichte mittels Schallwellen, insbesondere aus dem Ultraschallbereich, in Bereichen von senkrecht zur Ausbreitungsrichtung der Schallwellen stehenden und einem Abstand von einer halben Wellenlänge aufweisenden Ebenen. Diese Methode wird ausführlich in der deutschen Patentanmeldung P 35 05 161.2 beschrieben, auf die wegen Einzelheiten verwiesen wird.Increasing the suspension density is also advantageous by means of sound waves, in particular from the Ultrasonic range, in areas from perpendicular to the Direction of propagation of the standing sound waves and one Distance from half a wavelength plane. This method is described in detail in the German patent application P 35 05 161.2 described on the for details is referred.
Eine deutlich verbesserte Fusionsausbeute lässt sich dadurch erzielen, dass die Temperatur der Zellsuspension während der Erzeugung der Membrandurchbrüche und während der Erhöhung der Zelldichte so weit erniedrigt wird, dass Ausheilprozesse der Membrandurchbrüche eingefroren oder stark verlangsamt sind. Dabei ist zu beachten, dass die zur Erzeugung der Membrandurchbrüche notwendige Feldstärke mit sinkender Temperatur zunimmt.A significantly improved fusion yield can be thereby achieve that the temperature of the cell suspension during membrane breakthrough generation and during the increase in cell density is reduced so much that Healing processes of the membrane breakthroughs frozen or are greatly slowed down. It should be noted that the for Generation of membrane openings necessary field strength increases with falling temperature.
Die optimale Temperatur ist vom einzelnen Zelltyp bzw. von dessen Membraneigenschaften abhängig, liegt jedoch regelmäßig zwischen 4°C und 20°C. Insbesondere hat sich eine Temperatur von grösser 4°C und kleiner 10°C als günstig erwiesen, da bei diesen Temperaturbedingungen einerseits sehr häufig die Ausheilprozesse der Membran noch so langsam sind, dass die Membrandurchbrüche eine genügend lange Lebensdauer aufweisen und andererseits aber die Beweglichkeit der Membranbestandteile noch gross genug ist, so dass der Verschmelzungsprozess von Membranen zweier benachbarter Zellen einsetzt, wenn deren jeweilige Poren oder Durchbrüche einander zugewandt zu liegen kommen.The optimal temperature depends on the individual cell type or depends on its membrane properties, however regularly between 4 ° C and 20 ° C. In particular a temperature of greater than 4 ° C and less than 10 ° C than proved to be favorable because at these temperature conditions on the one hand very often the healing processes of the membrane are so slow that the membrane breakthroughs have a sufficiently long service life and on the other hand but the mobility of the membrane components is still great is enough so that the merger process of Uses membranes of two neighboring cells, if their respective pores or openings face each other come to lie.
Eine weitere Steigerung der Fusionsausbeuten ist dadurch möglich, dass die Feldbedingungen so gewählt werden, dass in den Zellmembranen mehrere über die gesamte Oberfläche statistisch verteilte Membrandurchbrüche auftreten.This is a further increase in fusion yields possible that the field conditions are chosen so that in the cell membranes several over the entire surface statistically distributed membrane breakthroughs occur.
Dies läßt sich vorteilhaft dadurch erreichen, daß ein einzelner elektrischer Feldimpuls appliziert wird, der Membrandurchbrüche auch außerhalb der von den elektrischen Feldlinien ungefähr senkrecht durchsetzten Membranbereichen erzeugt.This can advantageously be achieved in that a single electrical field pulse is applied, the Membrane breakthroughs also outside of the electrical ones Field lines penetrate membrane areas approximately vertically generated.
Vorteilhaft können mehrere Membrandurchbrüche auch dadurch erzeugt werden, daß mehrere elektrische Feldpulse in einem zeitlichen Abstand appliziert werden, wobei die Pulshöhe der einzelnen Pulse so begrenzt wird, daß nur in den von den elektrischen Feldlinien ungefähr senkrecht durchsetzten Membranbereichen Durchbrüche auftreten und der zeitliche Abstand der elektrischen Feldimpulse so gewählt wird, daß die Zellen bei jedem folgenden Puls eine andere Orientierung zu den elektrischen Feldlinien aufweisen.Several membrane breakthroughs can also be advantageous as a result generated that several electrical field pulses in be applied at a time interval, the pulse height of the individual pulses is limited so that only in the penetrated approximately vertically by the electric field lines Breakthroughs occur in the membrane areas The time interval between the electrical field pulses is chosen in this way is that the cells have a different pulse on each successive pulse Have orientation to the electrical field lines.
Der Fusionsvorgang läßt sich besonders günstig dadurch beschleunigen, daß die verdichtete Zellsuspension erwärmt wird. Dadurch wird nicht nur der Fusionsvorgang als solcher beschleunigt, sondern es werden zudem die Ausheilprozesse der nicht zur Fusion führenden Durchbrüche beschleunigt, so daß in kurzer Zeit eine fusionierte Zelle mit einer intakten Membran vorliegt. Dieses Vorgehen trägt erheblich zur Steigerung der Ausbeute an lebensfähigen fusionierten Zellen bei. The fusion process can be particularly favorable speed up that compacted Cell suspension is heated. This will not only the fusion process as such accelerates it, but it the healing processes of the will not become a fusion leading breakthroughs accelerated so that in a short time there is a fused cell with an intact membrane. This procedure significantly increases the yield on viable fused cells.
Verlaufen die Ausheilungsprozesse in den Zellmembranen besonders schnell ab, beispielsweise weil der Temperaturbereich in dem die Fusion durchgeführt werden kann durch die Überlebensfähigkeit der Zelle beschränkt ist, kann die Fusionsausbeute dadurch verbessert werden, dass man auf die verdichtete Zellsuspension einen oder mehrere elektrische Feldpulse einwirken lässt.The healing processes run in the cell membranes particularly quickly, for example because of the temperature range in which the fusion can be carried out by cell viability may be limited the fusion yield can be improved by: one or more on the compressed cell suspension electrical field pulses.
Bei den bisher bekannten Verfahren war man in der Wahl der Zusammensetzung der isotonischen Lösung stets dadurch beschränkt, dass bei einer zu grossen elektrischen Leitfähigkeit eine zu starke Wärmeentwicklung in der Lösung auftrat. Deshalb war es notwendig, Zellen, die normalerweise in physiologischer Elektrolytlösung gehalten werden, für den Fusionsvorgang in ein anderes Medium mit geringerer Leitfähigkeit zu überführen. Abgesehen von dem Arbeitsaufwand hatte diese Überführung bei den empfindlicheren Zellstämmen auch negative Auswirkungen auf deren Überlebensrate. Nach der Fusion musste das Medium wieder gegen eine physiologische Elektrolytlösung ausgetauscht werden.With the previously known methods, the choice was made the composition of the isotonic solution limited that if the electrical conductivity is too high too much heat in the solution occurred. This is why it was necessary to have cells that normally are kept in physiological electrolyte solution, for the fusion process in another medium to transfer lower conductivity. Except for the This overpass had a workload on the more sensitive ones Cell strains also have a negative impact on them Survival rate. After the merger, the medium had to be used again exchanged for a physiological electrolyte solution will.
Besonders vorteilhaft ist nun bei dem erfindungsgemässen Verfahren, dass die Zellsuspension mit einer reinen Elektrolytlösung hergestellt werden kann. Die Zellen können also in dem für sie günstigsten Medium fusioniert werden. Temperaturprobleme treten nicht mehr auf, da die Anwendung von elektrischen Feldern bei dem erfindungsgemässen Verfahren auf ein Minimum begrenzt wird. It is now particularly advantageous in the case of the invention Procedure that the cell suspension with a pure electrolyte solution can be manufactured. The cells can thus be merged in the medium that is most favorable to them Temperature problems no longer occur since the application of electric fields in the inventive Procedure is kept to a minimum.
Insbesondere kann der Elektrolytgehalt dahigehend optimiert werden, dass eine optimale Adhäsion oder Membrankontakt der Zellen erhalten wird. Dazu sind beispielsweise Zusätze von Polykationen, wie z. B. Proteine, sowie von Mg- und Ca-Salzen geeignet.In particular, the electrolyte content can be optimized accordingly that optimal adhesion or membrane contact of cells is preserved. These include, for example Additions of polycations, such as. B. proteins, as well as Mg and Ca salts are suitable.
Gegenüber bekannten Verfahren, die mit Suspensionsdichten von 20% bis 30% arbeiten, können beim erfindungsgemässen Verfahren sehr viel verdünntere Zellsuspensionen bei der Erzeugung der Membrandurchbrüche vorliegen; die Suspensionsdichte liegt hier typischerweise bei ungefähr 1%.Compared to known methods with suspension densities from 20% to 30% can work in the inventive Process much more dilute cell suspensions at the Generation of membrane breakthroughs present; the suspension density is typically around 1%.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist neben der Fusion von jeweils zwei Zellen insbesondere auch zum Herstellen von Hybriden geeignet und erlaubt durch eine Abstimmung in der Wahl der Feldbedingungen zur Erzeugung der Membrandurchbrüche, der Verdichtungsbedingungen und der dabei über die Temperatur gesteuerten Ausheilprozesse der Membran die Elektrofusion in besonders schonender Weise.In addition to the fusion of two cells each, especially for the production of Suitable for hybrids and allowed by voting in the choice of the field conditions for generating the membrane breakthroughs, the compression conditions and thereby temperature controlled healing processes of the membrane electrofusion in a particularly gentle manner.
Wenn elektrische Felder nur zur Erzeugung der Membrandurchbrüche verwendet werden, nicht jedoch zur Sammlung und Orientierung der Zellen, lassen sich Elektrolyseeffekte auf ein besonders geringes Mass zurückdrängen. Die erforderlichen Membrankontakte der Zellen werden ohne Anwendung elektrischer Felder hergestellt, wodurch gegenüber dem Stand der Technik wesentlich kleinere Probleme mit der Leitfähigkeit der Lösung gegeben sind. Insgesamt Läuft die erfindungsgemäss durchgeführte Fusion für die zu fusionierenden Zellen unter wesentlich schonenderen Bedingungen ab als bei den bekannten Verfahren. If electrical fields only to produce membrane breakthroughs used, but not for collection and Orientation of the cells, electrolysis effects can be seen push back to a particularly low level. The required membrane contacts of the cells are without application electrical fields produced, making opposite the prior art with much smaller problems the conductivity of the solution are given. A total of Runs the fusion carried out according to the invention for the fusing cells under much gentler Conditions from than with the known methods.
Gegenüber bekannten Verfahren sind die erzielbaren Fusionsausbeuten zwar geringer, jedoch wird dies bei weitem dadurch kompensiert, dass das erfindungsgemässe Verfahren sehr viel einfacher und vor allem mit grösseren Durchsätzen durchgeführt werden kann. Besondere Anforderungen an Homogenität oder Inhomogenität der elektrischen Felder entfallen gegenüber dem Stand der Technik ebenfalls.The achievable fusion yields are compared to known processes Although less, this will make it far more compensates that the inventive method much easier and above all with larger throughputs can be carried out. Special requirements homogeneity or inhomogeneity of the electric fields are also eliminated compared to the prior art.
Dieses wird des weiteren anhand von Beispielen noch näher gezeigt. This is further illustrated by examples shown in more detail.
Fusion von Protoplasten zweier verschiedener, genetisch markierter Hefenstämme Saccharomyces cerevisiae AH 22 und Saccharomyces cerevisiae AH 215:Fusion of protoplasts of two different genetically labeled yeast strains Saccharomyces cerevisiae AH 22 and Saccharomyces cerevisiae AH 215:
Verhältnis der Zellen in der Suspension:
1 : 1 (jeweils etwa 1000 Zellen)
Suspensionsdichte: 1000 Zellen/mlRatio of cells in the suspension:
1: 1 (about 1000 cells each)
Suspension density: 1000 cells / ml
Feldbedingungen:
Ein Plattenkondensator mit einem Plattenabstand von
1 cm erzeugt ein ungefähr homogenes elektrisches
Feld, appliziert werden sechs Pulse von 14 kV/cm.Field conditions:
A plate capacitor with a plate spacing of 1 cm creates an approximately homogeneous electric field, six pulses of 14 kV / cm are applied.
Pulsdauer:
20 Mikrosekunden
Zeitlicher Abstand zwischen den Pulsen:
1 SekundePulse duration:
20 microseconds
Time interval between the pulses:
1 second
Temperatur während der Einwirkung des elektrischen Feldes:
grösser 4°C und kleiner 10°C; während der Zentrifugation
langsamer Anstieg auf 20°CTemperature during exposure to the electric field:
greater than 4 ° C and less than 10 ° C; during the centrifugation slow rise to 20 ° C
Zentrifugation:
Dauer 10 min bei 800 g
Nach der Zentrifugation
Erwärmung der Zellsuspension auf 30°CCentrifugation:
Duration 10 min at 800 g
After centrifugation, warm the cell suspension to 30 ° C
Zusammensetzung der für die Zellsuspension verwendeten
Lösungen:
Lösung A:
1,2 M Sorbit
0,1 mM Calciumacetat oder -chlorid
0,5 mM Magnesiumacetat oder -chlorid
1 mg/ml Albumin
Lösung B:
1,1 M Sorbit
30 mM Natriumchlorid
1,5 mM Kaliumchlorid
0,1 mM Calciumchlorid
0,5 mM Magnesiumchlorid
1 mg/ml AlbuminComposition of the solutions used for the cell suspension:
Solution A:
1.2 M sorbitol
0.1 mM calcium acetate or chloride
0.5 mM magnesium acetate or chloride
1 mg / ml albumin
Solution B:
1.1 M sorbitol
30 mM sodium chloride
1.5 mM potassium chloride
0.1 mM calcium chloride
0.5 mM magnesium chloride
1 mg / ml albumin
Nach einer Übertragung der Zellen auf ein Agar-Nährmedium
wurden nach elf Tagen folgende Ausbeuten an Zellhybriden
gefunden:
Ausbeute in Lösung A: 4%
Ausbeute in Lösung B: 10%.After transferring the cells to an agar culture medium, the following yields of cell hybrids were found after eleven days:
Yield in solution A: 4%
Yield in solution B: 10%.
Gleiche Bedingungen und Zellstämme wie Beispiel 1 ausser
der Pulshöhe: 20 kV
Ausbeute in Lösung B: 18%.Same conditions and cell strains as example 1 except for the pulse height: 20 kV
Yield in solution B: 18%.
Herstellung von Hybridom-Zellen aus Lymphozyten- und Myelomzellen der MausProduction of hybridoma cells from Mouse lymphocyte and myeloma cells
Verhältnis der Zellen in der Suspension:
5 : 1 (1500 Lymphozytenzellen: 300 Myelomzellen)
Suspensionsdichte: 1000 Zellen/mlRatio of cells in the suspension:
5: 1 (1500 lymphocyte cells: 300 myeloma cells)
Suspension density: 1000 cells / ml
Feldbedingungen wie in Beispiel 1, mit Ausnahme der Pulshöhe, die in diesem Beispiel 4 kV/cm betrug.Field conditions as in example 1, with the exception of the pulse height, which was 4 kV / cm in this example.
Temperatur während der Feldeinwirkung:
grösser 4°C und kleiner 10°C; während dem Zentrifugieren:
langsamer Anstieg auf 20°C.Temperature during exposure to the field:
greater than 4 ° C and less than 10 ° C; during centrifugation:
slow rise to 20 ° C.
Dauer der Zentrifugation:
10 Minuten 500 g.
Danach erfolgte eine Erhöhung der Temperatur auf 37°C.Centrifugation time:
500 g for 10 minutes.
The temperature was then increased to 37 ° C.
Zusammensetzung der für die Suspensionen verwendeten
Lösungen:
Lösung C:
0,28 M Inosit
0,1 mM Calciumacetat
0,5 mM Magnesiumacetat
Phosphatpuffer.
Lösung D:
130 mM Kaliumchlorid
10 mM Natriumchlorid
0,1 mM Calciumacetat oder -chlorid
0,5 mM Magnesiumacetat oder -chlorid
Phosphatpuffer.
Composition of the solutions used for the suspensions:
Solution C:
0.28 M inositol
0.1 mM calcium acetate
0.5 mM magnesium acetate
Phosphate buffer.
Solution D:
130 mM potassium chloride
10 mM sodium chloride
0.1 mM calcium acetate or chloride
0.5 mM magnesium acetate or chloride
Phosphate buffer.
Die Zellen werden für 30 Minuten in ein Nachbehandlungsmedium überführt (Temperatur: 37°C); danach wird ein Nährmedium zugesetzt; daran anschliessend wurden die Zellen auf ein Selektionsmedium übertragen.The cells are placed in an aftertreatment medium for 30 minutes transferred (temperature: 37 ° C); after that will be a Nutrient medium added; then the Transfer cells to a selection medium.
Folgende Ausbeuten wurden erzielt:
Lösung C: 15%
Lösung D: 20%
(bezogen auf die eingesetzten Myelomzellen).The following yields were achieved:
Solution C: 15%
Solution D: 20%
(based on the myeloma cells used).
Gleiche Bedingungen und Zellstämme wie in Beispiel 3
Pulshöhe: 6 kV
Ausbeute in Lösung D: 30%
(bezogen auf die eingesetzten Myelomzellen).Same conditions and cell strains as in example 3 pulse height: 6 kV
Yield in solution D: 30%
(based on the myeloma cells used).
Claims (14)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19853526969 DE3526969A1 (en) | 1985-07-27 | 1985-07-27 | Method for the electrically induced fusion of cells |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19853526969 DE3526969A1 (en) | 1985-07-27 | 1985-07-27 | Method for the electrically induced fusion of cells |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3526969A1 true DE3526969A1 (en) | 1987-01-29 |
Family
ID=6276973
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19853526969 Withdrawn DE3526969A1 (en) | 1985-07-27 | 1985-07-27 | Method for the electrically induced fusion of cells |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE3526969A1 (en) |
-
1985
- 1985-07-27 DE DE19853526969 patent/DE3526969A1/en not_active Withdrawn
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69533474T2 (en) | DEVICE AND METHOD FOR THE EFFICIENT INKORPORATION OF MOLECULES IN CELLS | |
Gahwiler et al. | Spontaneous bioelectric activity of cultured cerebellar Purkinje cells during exposure to agents which prevent synaptic transmission | |
Cleffmann | Regulierung der DNS-Menge im Makronucleus von Tetrahymena | |
DE2512885C2 (en) | Process for the production of an electrically charged fiber filter | |
Vienken et al. | Electric field-induced fusion: electro-hydraulic procedure for production of heterokaryon cells in high yield | |
EP2399985B1 (en) | Method and electrode assembly for treating adherent cells | |
DE3317415A1 (en) | CHAMBER FOR TREATING CELLS IN THE ELECTRICAL FIELD | |
EP1390518A2 (en) | Buffer solution for electroporation and a method comprising the use of the same | |
DE2651685A1 (en) | PROCEDURE FOR SERIOUS BREEDING OF KERATINOCYTES | |
EP0226740A1 (en) | Apparatus for thrombosing by means of shock waves | |
EP1476537B1 (en) | Container with at least one electrode | |
DE3323415A1 (en) | USE OF A METHOD AND DEVICE FOR DETERMINING CELL INGREDIENTS SECONDING CELLS | |
DE1496471B2 (en) | ||
EP0128565B1 (en) | Process and device for cell fusion | |
Mayr et al. | Elektronenmikroskopische Untersuchungen an unterschiedlich innervierten Muskelfasern der äußeren Augenmuskulatur des Rhesusaffen | |
DE3526969A1 (en) | Method for the electrically induced fusion of cells | |
DE3321226C2 (en) | Method for the fusion of cells | |
DE3321239A1 (en) | CHAMBER FOR TREATING CELLS IN THE ELECTRICAL FIELD | |
DE69922270T2 (en) | DEVICE FOR ELECTROPORATION | |
Von Karl et al. | Ultrastruktur mariner Amöben IV. Corallomyxa chattoni n. sp. | |
DE3505147A1 (en) | Process and apparatus for specific fusion of cells | |
DE2513848A1 (en) | METHOD OF OBTAINING UNINTERRUPTED STRAINS OF TUMOR CELLS IN VITRO | |
DE3437470A1 (en) | MEDIUM FOR THE PRODUCTION OF LIVABLE, FUSIONED CELLS | |
DE3437469A1 (en) | MEDIUM FOR THE PRODUCTION OF LIVABLE, FUSIONED CELLS | |
DE3327690C2 (en) | Method for the fusion of cells |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8128 | New person/name/address of the agent |
Representative=s name: ANDRAE, S., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT., 8000 MUENCHEN |
|
8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: B. BRAUN MELSUNGEN AG, 3508 MELSUNGEN, DE |
|
8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |