DE3525428A1 - Polypeptides with anticoagulant effect, process for their preparation or isolation, their use and compositions containing these - Google Patents

Polypeptides with anticoagulant effect, process for their preparation or isolation, their use and compositions containing these

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DE3525428A1
DE3525428A1 DE19853525428 DE3525428A DE3525428A1 DE 3525428 A1 DE3525428 A1 DE 3525428A1 DE 19853525428 DE19853525428 DE 19853525428 DE 3525428 A DE3525428 A DE 3525428A DE 3525428 A1 DE3525428 A1 DE 3525428A1
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Abstract

The invention relates to polypeptides of the formula I <IMAGE> in which m = 0-50, n = 0-100 and R is the phenolic hydrogen or a phenol ester group, X represents identical or different residues of naturally occurring alpha -amino acids, A represents Ile or the absence of amino acid, B represents Ile or Thr or the absence of amino acid, C represents Thr or Val, Ile, Leu, Phe, D represents Glu or the absence of amino acid, E is Glu or Pro and F is Thr or Ile, Z represents identical or different residues of naturally occurring alpha -amino acids, and in which the Cys residues are linked pairwise by disulphide bridges, process for their preparation or isolation, and compositions containing these.

Description

Antikoagulantien dienen der Prophylaxe und Therapie thrombo-embolischer Prozesse; ihr Haupteinsatzgebiet liegt dabei vor allem bei venösen Thromboembolien. Antikoagulantien werden ferner bei der Herstellung von Blutkonserven benötigt. Derivate des 4-Hydroxycumarins oder des 1,4-Indandions, die beispielsweise für diesen Zweck angewendet werden, weisen trotz weitgehender Optimierung eine Reihe von Nachteilen auf.Anticoagulants are used for prophylaxis and therapy thrombo-embolic processes; their main area of application is mainly associated with venous thromboembolism. Anticoagulants are also used in the production of blood products needed. Derivatives of 4-hydroxycoumarins or of 1,4-indanedione, for example, for this purpose are applied, despite extensive optimization has a number of disadvantages.

Es ist daher wünschenswert, besonders in der Humanmedizin Blutgerinnungshemmer zur Verfügung zu haben, die eine geringe Toxizität und wenig Nebenwirkungen aufweisen und die durch ihren Metabolismus keine Belastung des erkrankten Organismus darstellen.It is therefore desirable, especially in human medicine Having anticoagulants available that are low Toxicity and few side effects and which, due to their metabolism, do not burden the sick person Represent organism.

Außer den körpereigenen plasmatischen Hemmstoffen wie Antithrombin III besitzen auch viele andere Proteine blutgerinnungshemmende Wirkung, wie z. B. der Kunitz- Inhibitor, der aus Sojabohnen gewonnen wird. Dieser Hemmstoff blockt die Blutgerinnungskaskade durch Inhibition des aktivierten Faktors X, aber die Spezifität des Inhibitors ist so gering, daß viele Nebenwirkungen entstehen: Hemmung des Plasmakallikreins, des Plasmins, des Trypsins, so daß die therapeutischen Anwendungen ausgeschlossen sind. Auch andere Wirkstoffe, wie der Ascaris- oder der Kazals-Inhibitor, konnten wegen mangelnder Spezifität keine Bedeutung erlangen.Besides the body's own plasmatic inhibitors such as Antithrombin III also has many other proteins anticoagulant effect, such as B. the Kunitz Inhibitor obtained from soybeans. This inhibitor blocks the blood coagulation cascade through inhibition of the activated factor X, but the specificity of the inhibitor is so minor that there are many side effects: Inhibition of plasma kallikrein, plasmin, trypsin, so that the therapeutic uses are excluded are. Other active ingredients, such as the Ascaris or the Kazals inhibitor, due to lack of specificity gain no meaning.

Hirudin ein aus Hirudo medicinalis gewonnenes Polypeptid, zeigt dagegen eine spezifische Antithrombin-Aktivität Hirudin a polypeptide obtained from Hirudo medicinalis, on the other hand shows a specific antithrombin activity

Das aufwendige Verfahren zu seiner Isolierung und Reinigung hat sich bisher nachteilig auf seine praktische Anwendung ausgewirkt.The laborious process for its isolation and purification has so far been detrimental to its practical application impacted.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß sich aus Blutegeln hochaktive Polypeptide der Formel I, isolieren lassen.It has now surprisingly been found that Leeches isolate highly active polypeptides of the formula I permit.

Die Erfindung betrifft daher Polypeptide der Formel I in welcher m = 0-50,
n = 0-100 und
R phenolischen Wasserstoff oder eine Phenolestergruppe bedeuten,
X für gleiche oder verschiedene Reste natürlich vorkommende α-Aminosäuren steht,
Z für gleiche oder verschiedene Reste natürlich vorkommender α-Aminosäuren steht und
A für Ile oder die Abwesenheit von Aminosäure steht
B für Ile oder Thr oder die Abwesenheit von Aminosäure steht
C Thr oder Val, Ile, Leu, Phe bedeutet
D Glu oder die Abwesenheit von Aminosäure
E Glu oder Pro und
F Thr oder Ile bedeutet,
in der die 6 Cys-Reste über Disulfid-Brücken verknüpft sind, sowie deren physiologisch verträgliche Salze.The invention therefore relates to polypeptides of the formula I. in which m = 0-50,
n = 0-100 and
R denotes phenolic hydrogen or a phenol ester group,
X stands for identical or different residues of naturally occurring α-amino acids,
Z stands for identical or different residues of naturally occurring α-amino acids and
A stands for Ile or the absence of amino acid
B stands for Ile or Thr or the absence of amino acid
C means Thr or Val, Ile, Leu, Phe
D Glu or the absence of amino acid
E Glu or Pro and
F Thr or Ile means
in which the 6 Cys residues are linked via disulfide bridges, as well as their physiologically compatible salts.

  • Natürlich vorkommende α-Aminosäuren sind insbesondere Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Arg, Lys, Hyl, Orn, Cit, Tyr, Phe, Trp, His, Pro und Hyp.Naturally occurring α-amino acids are particularly Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Arg, Lys, Hyl, Orn, Cit, Tyr, Phe, Trp, His, Pro and Hyp.
  • R bedeutet vorzugsweise Wasserstoff, SO3H oder PO3H2.R preferably denotes hydrogen, SO 3 H or PO 3 H 2 .
  • Als Salze kommen insbesondere Alkali- und Erdalkalisalze, Salze mit physiologisch verträglichen Aminen sowie Salze mit physiologisch verträglichen Säuren, wie HC1, H2SO4, Maleinsäure oder Essigsäure in Frage.Particularly suitable salts are alkali and alkaline earth salts, salts with physiologically compatible amines and salts with physiologically compatible acids, such as HCl, H 2 SO 4 , maleic acid or acetic acid.
  • Bevorzugt sind Polypeptide der Formel I, in denen C für Thr steht; ferner solche, bei denen C für Thr und A für Ile steht. R bedeutet vorzugsweise Wasserstoff, SO3H oder PO3H2. Speziell gegeignete Peptide sind solche mit
    - A = Ile, B = Thr, C = Thr, D = Glu, E = Glu, F = Thr, m = null, n = null, R = H oder SO3H;
    - m = Null, n = null, R = H oder SO3H, A = Ile, B = direkte Bindung, C = Thr, D = Glu, E = Glu, F = Thr;
    - m = null; n = null; R = H oder SO3H, A = Ile, B = direkte Bindung, C = Thr, D = Glu, E = Glu, F = Ile;
    - m = Null, n = null, R = H oder SO3H, A = Ile, B = direkte Bindung, C = Thr, D = Glu, E = Pro, F = Thr;
    - m = null, n = null, R = H oder SO3H, A = Ile, B = direkte Bindung, C = Thr, D = Glu, E = Pro, F = Ile;
    - m = null, n = null, R = H oder SO3H, A = direkte Bindung, B = direkte Bindung, C = Thr, D = direkte Bindung, E = Glu, F = Thr Die Erfindung betrifft auch die biologisch aktiven peptidischen Spaltprodukte, die durch chemische oder enzymatische Spaltung dieser Polypeptide erhalten werden.Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Gewinnung eines gereinigten Polypeptids der obengenannten Formel, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Polypeptid aus Würmern des Stammes Annelida mit Hilfe einer Kombination von Extraktionsmethoden, Fällungsmethoden, Membranfiltration und/oder chromatographischen Verfahren isoliert und das erhaltene Peptid gegebenenfalls in seine physioligisch verträglichen Salze überführt.Das Polypeptid wird vorzugsweise aus den Halsdrüsen von Würmern der Klasse Hirudinea, insbesondere aus solchen der Ordnung Gnathobdellida gewonnen. Bevorzugt sind die Gattungen Hirudo, Gnathobdella, Haemadipsa und Philaemon. Neben den Halsdrüsen des Blutegels kann auch dessen vordere Körperregion oder der ganze Blutegel Verwendung finden.Ein Verfahren zur Gewinnung eines Rohextraktes aus Blutegeln ist in Enzymology, Band 5 "Hirudin as an Inhibitor of Thrombin" beschrieben. Ein Reinigungsverfahren für Hirudin ist aus Bull. Soc. Chim. Biol. 45 (1963) 55 bekannt.Beim erfindungsgemäßen Verfahren hat sich insbesondere eine Kombination von Fällungsmethoden und von Gel-Permeations- Chromatographie oder Ultrafiltration, Affinitätschromatographie und von hoch auflösender Verteilungschromatographie an "Reverse-Phase" -Material und Chromatographie an Kieselgel oder Aluminiumoxid als nützlich erwiesen. Je nach Beschaffenheit des Rohextraktes können aber auch andere Chromatographie-Verfahren vorteilhaft angesetzt werden (evtl. auch in Kombination mit dem obengenannten Verfahren), wie z. B. Kationen- oder Anionen- Austausch-Chromatographie, Chromatographie an unspezifischen Absorbentien, insbesondere Hydroxylapatit.Um beispielsweise einen für die Chromatographie geeigneten Rohextrakt zu gewinnen, können die Kopfteile des Blutegels in gefrorenem Zustand zerkleinert und mittels einer wäßrigen Puffer-Lösung (z. B. Phosphorpuffer) extrahiert werden. Das unlösliche Material wird z. B.durch kurzes Zentrifugieren oder durch Filtration über Gaze abgetrennt und das Polypeptid aus dem so erhaltenen Extrakt abgetrennt und isoliert. Es ist vorteilhaft, diesen Extrakt schnell auf 70°C bis 90°C zu erhitzen, weil dadurch die Hauptmenge der proteolytischen Enzyme denaturiert und ausfällt, deren Abtrennung dann z. B. durch Zentrifugation erfolgen kann. Man isoliert aus dem Extrakt die Proteinfraktion, die das erfindungsgemäße Peptid enthält, z. B. durch Fällung in der Weise, daß man den Extrakt in ein wassermischbares organisches Lösungsmittel gibt. Z. B. kann Aceton in einer mehrfachen Menge des Extraktvolumen, vorzugsweise der etwa 10-fachen Menge eingesetzt werden, wobei die Fällung in der Kälte, üblicherweise bei 0 bis -40°C, vorzugsweise bei etwa -20°C, vorgenommen wird.Eine andere Möglichkeit, die Fällung durchzuführen, ist die Zugabe von Salzen, wie z. B. Ammoniumsulfat. Durch pH-Steuerung erreicht die Fällung eine gewisse Selektivität. Die erfindungsgemäßen Peptide, die isoelektrische Punkte von 3,5-4 haben, können im pH-Bereich zwischen 3 und 5, vorzugsweise etwa 4, durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von etwa 50% ausgefällt werden, wobei eine Vielzahl von Begleitproteinen dabei in der Lösung bleibt. Auch diese Fällung wird unter Kühlung bei etwa -5 bis +15°C vorzugsweise zwischen 0 und +4°C durchgeführt.Aus diesem Rohextrakt können Proteine mit höherem Molekulargewicht z. B. durch Ultrafiltration oder durch Gel- Permeations-Chromatographie abgetrennt werden. Bei größeren Ansätzen kann die Ultrafiltration z. B. in zwei Stufen erfolgen: In der ersten Stufe arbeitet man mit einer Kapillarmembran mit einer Ausschlußgrenze von 50 000 Dalton und dann in der zweiten Stufe mit einer Flachmembran mit einer Ausschlußgrenze von 10 000 Dalton. Mit Hilfe der Kapillarmembran erreicht man eine schnelle Abtrennung von höhermolekularem Material, welches den Durchfluß durch die selektiv arbeitende Flachmembran verhindern würde. Bei kleinen Mengen kann man auch auf die erste Stufe der Ultrafiltration verzichten.Das so erhaltene Material besteht aus einer Mischung der erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren und anderen Polypeptiden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung der Inhibitoren der Formel I mit R = H bzw. SO3H besteht darin, daß die Thrombininhibitoren aufgrund der Eigenschaften der Komplexbildung mit am Träger gebundenen Thrombin von Produkten, die keine Komplexe mit Thrombin bilden, getrennt werden. Die Fraktionen, die aufgrund ihrer Thrombinaffinität gewonnen worden sind, können wiederum durch ein zweites hochauflösendes chromatographisches System in einzelne Komponenten aufgelöst werden. So werden die Inhibitoren der Formel I isoliert. Für die Affinitätschromatographie hat sich die Benützung von Thrombin-Sepharose besonders bewährt. Thrombin-Sepharose wurde nach dem Verfahren von Brosstad (Thrombose Res. II. 119, 1977) hergestellt.Für die Trennung schüttet man Thrombin-Sepharose in eine Säule mit einem geeigneten Puffer, wie z. B. 0,1 M N- Methylmorpholinacetatpuffer pH 8.0 oder Tris/HC1 0.1 M pH 8.0). Nach Equilibrierung der Säule wird das Gemisch aus der Fällung in gleichem Puffer gelöst und auf die Säule aufgebracht. Die Peptide, die keine Thrombinaffinität haben, werden durch Spülung mit dem Puffer entfernt. Danach wird der Komplex Thrombin/Thrombin-Inhibitor durch Spülung der Säule mit einem Puffer aus 0,5-2M Benzamidin oder 4-Amino-Benzamidin in 0,1 M N-Methylmorpholinacetat pH 8.0 aufgelöst. Die verschiedenen aktiven Fraktionen werden zusammen gepoolt und durch übliche Gel-Permeations- Chromatographie auf Sephadex G 25 mit 0.05 N-Methylmorpholinacetat pH 8.0 entsalzt.Die Trennung der verschiedenen Thrombin-Inhibitoren voneinander wird durch hoch auflösende chromatographische Verfahren besorgt. Dafür hat sich besonders die HPLC bewährt.Durch das hohe Auflösungsvermögen der HPLC-Technologie ist es möglich, die Inhibitoren der Formel I voneinander und von geringfügigen Mengen von Begleitprotein zu trennen und rein darzustellen.Für die stationäre Phase haben sich derivatisierte Kieselgele mit geeigneter Korngröße (z. B. zwischen 3 und 20 µm) vorteilhaft erwiesen. Für die Derivatisierung des Kieselgels eignen sich neben den verbreiteten Octadecylsilanresten auch eine Vielzahl anderer Silanreste oder deren Mischungen, wie Silanreste mit niedrigem Alkyl, Phenylalkyl- oder amino-substituiertem Alkyl, wobei letztere eine gewisse Kombination von Ionenaustausch- und "Reverse- Phase" Chromatographie bieten. Es können beispielsweise Trennsäulen von 5 bis 25 cm Länge und einem Durchmesser von 3 bis 10 mm verwendet werden. Als gepuffertes Elutionsmittel kommen alle sekundären oder tertiären Mischungen zwischen Wasser, organischen Lösungsmitteln geeigneter Lipophilie in Frage, wie z. B. niedrige Alkohole, Ketone, Nitrile, Ether, Säure, Amine, Glykolether, Amide und deren Derivate. Als Puffersubstanz können organische und anorganische Salze oder andersartige Zusätze verwendet werden. Die Elution erfolgt vorteilhaft bei einem pH-Wert zwischen 2 und 8.Die Benutzung von flüchtigen Puffersubstanzen, wie Ammoniumacetat oder Ammoniumhydrogencarbonat, erlaubt die Gewinnung der Inhibitoren aus dem Eluat durch einfache Gefriertrocknung.Die erfindungsgemäßen Polypeptide der Formel I sind farblos, in Wasser und in wäßrigen Puffern löslich, zeigen sich homogen in der Polyacrylamid-Elektrophorese und besitzen isoelektrische Punkte von 3.5 bis 4 bestimmt durch isoelektrische Fokussierung). Bestimmt man die Aminosäurezusammensetzung nach der Methode von Moore und Stein (Methods of Enzymology Band VI, 819-831, herausgegeben von Rolovick und Kaplan, Academic Press, New York, London, 1963), findet man die in Tabelle 1 angegebenen Werte: Tabelle 1 Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der obengenannten Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
    a) es in an sich bekannter Weise mittels Festphasensynthese hergestellt oder
    b) zur Herstellung eines Polypeptids, in welchem m = 0 ist,
    I. Hirudin einem zweifachen Edman-Abbau unterwirft,
    II. das so erhalten Peptid mit einem Aktivester einer Aminosäure oder eines Peptids der FormelU (X) m -A-B-C-OH, in welcher m, X und A, B, C wie oben definiert sind und U für eine säuren- oder basenlabile Urethanschutz gruppe steht, umsetzt,
    III. die Phenylthiocarbamoyl-Gruppe an der ε-Amino-Funktion von Lys mittels Hydrazin
    IV. und die Urethan-Schutzgruppe U mit Hilfe einer Säure oder Base abspaltet und das a) oder b) erhaltene Polypeptid gegebenenfalls in sein physiologisch verträgliches Salz überführt.Bei der Festphasensynthese (vgl. hierzu Atherton, Sheppard, Perspectives in Peptide Chemistry, Karger Basel 1981, Seiten 101-117) kann in der Regel auf eine OH-Schutzgruppe für Thr verzichtet werden.Die Synthese des Polypeptids der Formel I erfolgt z. B. schrittweise an hydroxymethyliertem Polystyrol-Harz. Das Polystyrol ist mit beispielsweise 1% Divinylbenzol quervernetzt. Es liegt gewöhnlich in Form kleiner Kügelchen vor.Die Aminosäuren werden N-terminal geschützt eingesetzt. Die erste N-geschützte Aminosäure wird per Esterbildung am Träger angebracht. Nach Beseitigung der Aminoschutzgruppe wird die nächste N-geschützte Aminosäure unter Verwendung eines Kupplungsreagenzes wie Dicyclohexylcarbodiimid angeknüpft. Entschützen und Zufügen weiterer Aminosäuren wird fortgesetzt, bis die gewünschte Sequenz erreicht ist.Die Auswahl der Schutzgruppen richtet sich nach den Aminosäuren und Kupplungsmethoden.Als Aminoschutzgruppen kommen z. B. die bekannten urethanischen Schutzgruppen wie Benzyloxycarbonyl(Z), p-Methoxycarbobenzoxy, p-Nitroncarbobenzoxy, t-Butyloxycarbonyl(Boc), Fmoc und ähnliche in Frage.Die Boc-Gruppe wird bevorzugt, da sie unter relativ milden Bedingungen (z. B. mit Triflouressigsäure oder HC1 in organischen Lösungsmitteln) abspaltbar ist.Threonin kann als Benzylether blockiert werden und die ε-Aminofunktion des Lysins als Z-Derivat. Diese beiden Schutzgruppen sind gegen die Abspaltungsreagenzien für die Boc-Gruppe weitestgehend resistent und können hydrogenolytisch mit einem Hydrierkatalysator (Pd/Aktivkohle) oder z. B. mit Natrium in flüssigem Ammoniak entfernt werden.Das geschützte Peptid kann z. B. mit Hydranzin vom Harz genommen werden. Dabei entsteht das Hydranzid, welches z. B. mit N-Bromsuccinimid nach Int. J. Pept. Prot. Research 17 (1981) 6-11 in die freie Carbonsäure überführt werden kann. Falls erforderlich, müssen die Disulfid-Brücken oxidativ geschlossen werden (vgl. König, Geiger, Perspectives in Peptide Chemistry, Karger Basel Seiten 31-44).Bei der Verfahrensvariante b) unterwirft man Hirudin einem zweifachen Edman-Abbau, indem man dieses Polypeptid in einer geeigneten Pufferlösung, wie Pyridin/ Wasser oder Dioxan/Wasser gegebenenfalls unter Zusatz einer Base wie Dimethylbenzylamin (DMBA), Dimethylallylamin (DMAA) oder Triethylamin, vorzugsweise bei etwa 50°C und einem pH-Wert von 8-9 mit einem Isothiocyanat, vorzugsweise Phenylisothiocyanat umsetzt. Nach Entfernung des überschüssigen Puffers und des überschüssigen Phenylisothiocyanats wird das N-terminale Valin durch Behandeln mit einer Säure (Heptafluorbuttersäure oder Trifluoressigsäure) während 10 Minuten bei 50°C als Phenylthiazolinon abgespalten. Man wiederholt diese Reaktionsfolge zur Spaltung des zweiten Valins am N-Terminus.Das auf diese Weise erhaltene Des-(Val)2-Hirudin-Derivat wird mit einem Aktivester einer Aminosäure oder eines Peptids der Formel U-(X)m-A-B-C-OH, umgesetzt. Geeignet sind z. B. p-Nitronphenyl-, Cyanomethyl-, N-Hydroxyphtahlimid oder insbesondere N-Hydroxysuccinimid-Ester. Geeignete Urethanschutzgruppen U sind solche, die sauer oder alkalisch abspaltbar sind, wie z. B. Boc oder Msc. Falls erforderlich, so können auch evtl. vorhandene Funktionen in den Seitenketten von B und C durch geeignete Schutzgruppen vorübergehend geschützt werden.Die auf diese Weise erhaltene geschützte Vorstufe des Polypeptids der Formel I (m = 0) wird zur Abspaltung der Phenylthiocarbamoyl-Gruppe am Lysin in einem geeignetem Lösungsmittel, wie einem niedrigen Alkohol oder dessen Gemisch mit Wasser mit Hydrazin-Hydrat behandelt.Man spaltet aus diesem Polypeptid nun noch die restliche(n) Schutzgruppe(n) in geeigneter Weise ab (Boc z. B. mit Trifluoressigsäure, Msc mit einer Base) und erhält so das erfindungsgemäße Polypeptid der Formel I.Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind spezifische stöchiometrische Hemmer des Thrombins. Die quantitative Messung der Thrombin-Hemmung durch die erfindungsgemäßen Inhibitoren zeigte, daß der Komplex Thrombin-Inhibitor/Thrombin praktisch nicht dissoziiert. Mit Hilfe dieser Meßmethode kann während der Aufarbeitung und Reinigung die Aktivität und damit der Reinheitsgrad der erfindungsgemäßen Polypeptide bestimmt werden. Die so gereinigten Polypeptide der obengenannten Formel I können dabei eine Thrombinhemmung von über 10 000 antithrombine units/mg aufweisen und damit die des herkömmlichen Hirudins übertreffen.Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung von Polypeptiden der Formel I, in welcher m, n, R, X, Z, A, B, C, D, E und F die obengenannte Bedeutung haben als Blutgerinnungshemmer zur Anwendung bei der Therapie thromboembolischer Prozesse sowie deren Anwendung als Diagonstika und Reagentien.Die Erfindung betrifft weiterhin Mittel, die ein Polypeptid der Formel I in einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger enthalten.Die erfindungsgemäßen Verbindungen können parenteral oder topisch in entsprechender pharmazeutischer Zubereitung verabreicht werden.Zur subkutanen oder intravenösen Applikation werden die aktiven Verbindungen oder deren physiologisch verträgliche Salze, gewünschtenfalls mit den dafür üblichen Substanzen wie Lösungsvermittler, Emulgatoren, Isotoniemittel, Konservierungsstoffe oder weitere Hilfsstoffe in Lösung, Suspension oder Emulsion gebracht. Als Lösungsmittel für die neuen aktiven Verbindungen und die entsprechenden physiologisch verträglichen Salze kommen z. B. in Frage: Wasser, physiologische Kochsalzlösungen oder Alkohole, z. B. Ethanol, Propandiol, oder Glycerin, daneben auch Zuckerlösungen wie Glucose- oder Mannitlösungen, oder auch eine Mischung aus den verschiedenen genannten Lösungsmitteln. Die topischen Trägerstoffe können organische oder anorganische Verbindungen sein. Typische pharmazeutisch gebrauchte Trägerstoffe sind wäßrige Lösungen, die z. B. Puffersysteme oder isotonische Mischungen von Wasser und wassermischbaren Lösungsmitteln sind, wie z. B. Alkohole oder Arylalkohole, Öle, Polyalkylenglykole, Ethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon oder Isopropylmyristat. Geeignete Puffersubstanzen sind z. B. Natriumborat, Natiumphosphat, Natriumacetat oder auch Gluconatpuffer. Die topische Anwendungsform kann auch nicht toxische Hilfsstoffe enthalten wie z. B. emulgierende Konservierungsstoffe, Vernetzer, wie z. B. Polyethylenglykole und antibakterielle Verbindungen. Beispiel 1 Bestimmung der Inhibitor-Konzentration durch Thrombin- Titration
    10 bis 100 µl der Inhibitor-Lösung mit einem vorher bestimmten Proteingehalt werden mit 200 µl Natriumhydrogencarbonat- Lösung (pH = 7,0; 0,5 M) versetzt. Man addiert 0,1 ml Fibrinogen-Lösung (0,5 bis 1%) oder verdünntes Citrat-Plasma; in regelmäßigem Abstand, unter Rühren, bei Zimmertemperatur, wird ein aliquoter Teil (50-100 µl) der Thrombin-Lösung zugefügt (ca. 100 NIH Einheiten pro ml). Als Umschlagpunkt kann beim halbquantitativen Arbeiten das Gerinnen der Flüssigkeit innerhalb des gewählten Zeitabstandes dienen, oder, für quantitative Bestimmungen, die Turbimetrie-Messung bei 546 nm. Beispiel 2 Es werden freilebende Blutegel (keine Zuchttiere) der Art Hirudo medicinalis verwendet, die in Deutschland gesammelt worden sind. Ca. 150-200 g gefrorene Blutegelvorderteile werden in einem Mixer mit 2 l eiskalter 0,09% Natriumchlorid-Lösung und 10 ml Octanol innerhalb von 3 Minuten homogenisiert. Nach 30 minütiger Zentrifugation bei 0°C und 10 000 Upm wird der Überstand mittels Filtration über 2 Lagen Gaze weitergeklärt und anschließend unter Rühren innerhalb von 15 Minuten auf 80°C erhitzt. Die entstandene Fällung wird durch Filtration über 4 Lagen Gaze getrennt. Das Filtrat wird durch Rühren in einem Eisbad schnell auf 4°C heruntergekühlt und in 7,5 l vorgekühltes Aceton (-20°C) gegeben. Es entsteht erneut eine Fällung, die nach 5 Minuten auf einer Glasfilternutsche abfiltriert und mit 1 l kaltem Aceton (-20°C) nachgewaschen wird. Nach Trocknung im Vakuum entsteht 520 mg leicht gelbliches Pulver mit einem Proteingehalt von 62% (bestimmt nach der Methode von Lowry). Die Antithrombinaktivität beträgt ca. 400 Einheiten pro mg. Beispiel 3 520 mg Pulver gemäß Beispiel 2 werden in 75 ml Wasser gelöst, dann mit 5 N Ammoniak auf pH 8,0 eingestellt und 1 Stunde bei 0-4°C gerührt. Der unlösliche Anteil wird innerhalb von 30 Minuten mit einer Becher-Zentrifuge bei 5000 Upm abgeschleudert. Nach Einstellung des Proteingehaltes durch Wasserzugabe auf 25 mg/ml (Lowry), wird die Lösung mit 35 ml gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung versetzt und 1 Stunde bei 4°C gerührt. Der erste Niederschlag wird schnell durch Zentrifugation (5000 Upm/30 Minuten) abgetrennt. Man löst noch ca. 26 g Ammoniumsulfat dazu und stellt den pH-Wert mit Eisessig auf pH 4 ein. Nach 5 Stunden Stehen wird die gesamte Suspension zentrifugiert und der erhaltene Feuchtniederschlag wie folgt weiterverarbeitet. Beispiel 4 Der gemäß Beispiel 3 erhaltenen Feuchtniederschlag wird in 200 ml 0,1 M. Ammoniumhydrogencarbonat-Lösung vom pH 8 gelöst und in einer 250 ml AmiconR-Zelle mit einer 5PM 10-Flachmembran (Ausschlußgrenze 10 000 Dalton) ultrafiltriert. Dabei wird die Lösung auf ca. 40 ml eingeengt, wobei gegen Ende zweimal 150 ml 0,1 Ammoniumhydrogencarbonat- Lösung vom pH 8,0 nachgefüllt werden. Gefriertrocknung des Rückstandes ergibt ca. 350 mg Material mit einem Proteingehalt von 89%. Beispiel 5 Man schüttet eine Säule (0.9 × 15 cm) mit Thrombin- Sepharose in 0.1 m Tris-Puffer (HCl) pH 8. Die Substanz aus Beispiel 3 wird im gleichen Puffer gelöst, und die Säule wird mit dieser Probe beschickt. Durch Spülung der Säule mit dem Equilibrierungspuffer werden inaktive Begleitsubstanzen entfernt. Danach mit einer Lösung von Benzamidin (1,5 M Tris Puffer pH 7) oder mit 4- Aminobenzamidin (0,2 M Tris Puffer pH 7) läßt sich das Hirudin von dem Komplex Thrombin-Hirudin verdrängen und wird portionsweise eluiert. Zum Testen der Antithrombinaktivität muß zuerst der kompetitive Inhibitor durch Gel-Filtration Sephadex G 20 vom Hirudin getrennt werden. Gewicht-Ausbeute 55%;
    Aktivität 6000 bis 12 000 ATU/mg. Beispiel 6 20 mg Inhibitor gemäß Beispiel 3 werden in 200 µl Wasser von pH 2,16 (eingestellt mit Triflouressigsäure + 5% Acetonitril) gelöst und auf eine mit Octadecylsilan- Kieselgel (5 µm) gefüllte Stahl-Säule eingespritzt (ShandonRODS). Die Säule wird durch einen Gradienten von maximal 2%/Minute zwischen dem Startpuffer (Wasser-pH = 2,16 + 5% Acetonitril) und Acetonitril eluiert. Die Fraktionen werden einzeln gesammelt. Nach Trocknung haben die erfindungsgemäßen Inhibitoren der Formel I (R = H bzw. SO3H) eine spezifische Aktivität, die der Stöchiometrie eines 1 : 1-Komplexes mit Thrombin entspricht.    Polypeptides of the formula I in which C stands for Thr are preferred; also those in which C stands for Thr and A for Ile. R preferably denotes hydrogen, SO 3 H or PO 3 H 2 . Particularly suitable peptides are those with
    - A = Ile, B = Thr, C = Thr, D = Glu, E = Glu, F = Thr, m = zero, n = zero, R = H or SO 3 H;
    - m = zero, n = zero, R = H or SO 3 H, A = Ile, B = direct bond, C = Thr, D = Glu, E = Glu, F = Thr;
    - m = zero; n = zero; R = H or SO 3 H, A = Ile, B = direct bond, C = Thr, D = Glu, E = Glu, F = Ile;
    - m = zero, n = zero, R = H or SO 3 H, A = Ile, B = direct bond, C = Thr, D = Glu, E = Pro, F = Thr;
    - m = zero, n = zero, R = H or SO 3 H, A = Ile, B = direct bond, C = Thr, D = Glu, E = Pro, F = Ile;
    - m = zero, n = zero, R = H or SO 3 H, A = direct bond, B = direct bond, C = Thr, D = direct bond, E = Glu, F = Thr The invention also relates to the biologically active peptidic cleavage products obtained by chemical or enzymatic cleavage of these polypeptides. The invention further relates to a process for obtaining a purified polypeptide of the above formula, which is characterized in that the polypeptide is obtained from worms of the Annelida strain using a combination of extraction methods, Precipitation methods, membrane filtration and / or chromatographic processes are isolated and the peptide obtained is optionally converted into its physiologically acceptable salts. The polypeptide is preferably obtained from the cervical glands of worms of the Hirudinea class, in particular from those of the Gnathobdellida order. The genera Hirudo, Gnathobdella, Haemadipsa and Philaemon are preferred. In addition to the leech's throat glands, the anterior region of the body or the entire leech can also be used. A method for obtaining a crude extract from leeches is described in Enzymology, Volume 5, "Hirudin as an Inhibitor of Thrombin". A purification method for hirudin is from Bull. Soc. Chim. Biol. 45 (1963) 55 known. In the method according to the invention, a combination of precipitation methods and gel permeation chromatography or ultrafiltration, affinity chromatography and high-resolution partition chromatography on "reverse phase" material and chromatography on silica gel or aluminum oxide has proven to be in particular proved useful. Depending on the nature of the crude extract, other chromatography methods can also be used advantageously (possibly also in combination with the above-mentioned method), such as. B. cation or anion exchange chromatography, chromatography on unspecific absorbents, especially hydroxyapatite. For example, to obtain a crude extract suitable for chromatography, the head parts of the leech can be crushed in the frozen state and using an aqueous buffer solution (e.g. B. Phosphor Buffer) can be extracted. The insoluble material is e.g. B. separated by brief centrifugation or by filtration through gauze and the polypeptide separated and isolated from the extract obtained in this way. It is advantageous to heat this extract quickly to 70 ° C to 90 ° C, because this denatures the majority of the proteolytic enzymes and precipitates. B. can be done by centrifugation. The protein fraction containing the peptide according to the invention is isolated from the extract, e.g. B. by precipitation in such a way that the extract is placed in a water-miscible organic solvent. For example, acetone can be used in a multiple amount of the extract volume, preferably about 10 times the amount, the precipitation being carried out in the cold, usually at 0 to -40 ° C, preferably at about -20 ° C. Another possibility To carry out the precipitation, the addition of salts, such as. B. ammonium sulfate. The precipitation achieves a certain selectivity through pH control. The peptides according to the invention, which have isoelectric points of 3.5-4, can be precipitated in the pH range between 3 and 5, preferably about 4, by adding ammonium sulfate to a concentration of about 50%, with a large number of accompanying proteins remains in solution. This precipitation is also carried out with cooling at about -5 to + 15 ° C, preferably between 0 and + 4 ° C. Proteins with a higher molecular weight, e.g. B. separated by ultrafiltration or by gel permeation chromatography. For larger batches, the ultrafiltration z. B. take place in two stages: In the first stage one works with a capillary membrane with an exclusion limit of 50,000 Daltons and then in the second stage with a flat membrane with an exclusion limit of 10,000 Daltons. With the help of the capillary membrane, a rapid separation of higher molecular weight material is achieved, which would prevent the flow through the selectively operating flat membrane. In the case of small amounts, the first stage of ultrafiltration can also be dispensed with. The material thus obtained consists of a mixture of the thrombin inhibitors according to the invention and other polypeptides. A preferred process for obtaining the inhibitors of the formula I with R = H or SO 3 H consists in separating the thrombin inhibitors from products which do not form complexes with thrombin due to the properties of complex formation with thrombin bound to the carrier. The fractions that have been obtained on the basis of their affinity for thrombin can in turn be resolved into individual components by a second high-resolution chromatographic system. The inhibitors of the formula I are isolated in this way. The use of Thrombin-Sepharose has proven particularly useful for affinity chromatography. Thrombin-Sepharose was prepared by the method of Brosstad (Thrombose Res. II. 119, 1977). For the separation, thrombin-Sepharose is poured into a column with a suitable buffer, such as e.g. B. 0.1 M N-methylmorpholine acetate buffer pH 8.0 or Tris / HCl 0.1 M pH 8.0). After equilibration of the column, the mixture from the precipitation is dissolved in the same buffer and applied to the column. The peptides that have no affinity for thrombin are removed by rinsing with the buffer. The thrombin / thrombin inhibitor complex is then dissolved by rinsing the column with a buffer of 0.5-2M benzamidine or 4-amino-benzamidine in 0.1M N-methylmorpholine acetate pH 8.0. The various active fractions are pooled together and desalted by conventional gel permeation chromatography on Sephadex G 25 with 0.05 N-methylmorpholine acetate pH 8.0. The different thrombin inhibitors are separated from one another by high-resolution chromatographic processes. HPLC has proven to be particularly effective for this purpose. Due to the high resolution of HPLC technology, it is possible to separate the inhibitors of the formula I from one another and from small amounts of accompanying protein and to present them in pure form. For the stationary phase, derivatized silica gels with a suitable particle size ( e.g. between 3 and 20 µm) have proven advantageous. In addition to the common octadecylsilane radicals, a large number of other silane radicals or mixtures thereof, such as lower-alkyl, phenylalkyl- or amino-substituted alkyl, are suitable for derivatizing the silica gel, the latter offering a certain combination of ion exchange and "reverse phase" chromatography . For example, separation columns 5 to 25 cm in length and 3 to 10 mm in diameter can be used. All secondary or tertiary mixtures between water, organic solvents, suitable lipophilicity, such as e.g. B. lower alcohols, ketones, nitriles, ethers, acids, amines, glycol ethers, amides and their derivatives. Organic and inorganic salts or other types of additives can be used as the buffer substance. The elution is advantageously carried out at a pH between 2 and 8. The use of volatile buffer substances, such as ammonium acetate or ammonium hydrogen carbonate, allows the inhibitors to be obtained from the eluate by simple freeze-drying. The polypeptides of the formula I according to the invention are colorless, in water and in soluble in aqueous buffers, are shown to be homogeneous in polyacrylamide electrophoresis and have isoelectric points from 3.5 to 4 (determined by isoelectric focusing). If the amino acid composition is determined by the Moore and Stein method (Methods of Enzymology Volume VI, 819-831, edited by Rolovick and Kaplan, Academic Press, New York, London, 1963), the values given in Table 1 are found: Table 1 The invention also relates to a process for the preparation of a polypeptide of the above formula I, which is characterized in that
    a) it is produced in a manner known per se by means of solid phase synthesis or
    b) for the production of a polypeptide in which m = 0,
    I. Subjecting Hirudin to a double Edman degradation,
    II. The peptide thus obtained with an active ester of an amino acid or a peptide of the formula U (X) m -ABC-OH, in which m , X and A, B, C are as defined above and U is an acid- or base-labile urethane protective group stands, implements,
    III. the phenylthiocarbamoyl group on the ε-amino function of Lys using hydrazine
    IV. And the urethane protective group U is split off with the aid of an acid or base and the polypeptide obtained a) or b) is optionally converted into its physiologically acceptable salt. In solid phase synthesis (cf. Atherton, Sheppard, Perspectives in Peptide Chemistry, Karger Basel 1981, pages 101-117) can generally be dispensed with an OH protective group for Thr. The synthesis of the polypeptide of the formula I takes place, for. B. stepwise on hydroxymethylated polystyrene resin. The polystyrene is cross-linked with, for example, 1% divinylbenzene. It is usually in the form of small spheres and the amino acids are N-terminally protected. The first N-protected amino acid is attached to the carrier by ester formation. After removal of the amino protecting group, the next N-protected amino acid is attached using a coupling reagent such as dicyclohexylcarbodiimide. Deprotection and addition of further amino acids is continued until the desired sequence is achieved. The choice of protecting groups depends on the amino acids and coupling methods. The well-known urethane protecting groups such as benzyloxycarbonyl (Z), p-methoxycarbobenzoxy, p-nitrone carbobenzoxy, t-butyloxycarbonyl (Boc), Fmoc and the like can be used. The Boc group is preferred because it acts under relatively mild conditions (e.g. With trifluoroacetic acid or HC1 in organic solvents), threonine can be blocked as a benzyl ether and the ε-amino function of lysine as a Z derivative. These two protective groups are largely resistant to the cleavage reagents for the Boc group and can be hydrogenolytically treated with a hydrogenation catalyst (Pd / activated carbon) or z. Be removed with sodium in liquid ammonia. The protected peptide can e.g. B. can be removed from the resin with hydrazine. This creates the hydranzide, which z. B. with N-bromosuccinimide according to Int. J. Pept. Prot. Research 17 (1981) 6-11 can be converted into the free carboxylic acid. If necessary, the disulfide bridges must be closed by oxidation (see König, Geiger, Perspectives in Peptide Chemistry, Karger Basel, pages 31-44). In process variant b), hirudin is subjected to double Edman degradation by converting this polypeptide into a suitable buffer solution, such as pyridine / water or dioxane / water, optionally with the addition of a base such as dimethylbenzylamine (DMBA), dimethylallylamine (DMAA) or triethylamine, preferably at about 50 ° C. and a pH of 8-9 with an isothiocyanate, preferably Reacts phenyl isothiocyanate. After removing the excess buffer and the excess phenyl isothiocyanate, the N-terminal valine is split off as phenylthiazolinone by treatment with an acid (heptafluorobutyric acid or trifluoroacetic acid) for 10 minutes at 50.degree. This sequence of reactions is repeated to cleave the second valine at the N-terminus. The des- (Val) 2 -hirudin derivative obtained in this way is treated with an active ester of an amino acid or a peptide of the formula U- (X) m -ABC-OH , implemented. Suitable are e.g. B. p-nitrophenyl, cyanomethyl, N-hydroxyphtahlimide or especially N-hydroxysuccinimide esters. Suitable urethane protecting groups U are those which can be split off under acidic or alkaline conditions, such as, for. B. Boc or Msc. If necessary, any functions present in the side chains of B and C can also be temporarily protected by suitable protective groups. The protected precursor of the polypeptide of the formula I ( m = 0) obtained in this way is used to split off the phenylthiocarbamoyl group on the lysine treated with hydrazine hydrate in a suitable solvent, such as a lower alcohol or its mixture with water. The remaining protective group (s) are now split off from this polypeptide in a suitable manner (Boc e.g. with trifluoroacetic acid, Msc with a base) and thus obtains the polypeptide according to the invention of the formula I. The polypeptides according to the invention are specific stoichiometric inhibitors of thrombin. The quantitative measurement of the thrombin inhibition by the inhibitors according to the invention showed that the complex thrombin inhibitor / thrombin practically does not dissociate. With the aid of this measuring method, the activity and thus the degree of purity of the polypeptides according to the invention can be determined during work-up and purification. The polypeptides of the above formula I purified in this way can have a thrombin inhibition of over 10,000 antithrombine units / mg and thus exceed that of conventional hirudin. The invention therefore also relates to the use of polypeptides of the formula I in which m , n , R, X, Z, A, B, C, D, E and F have the abovementioned meaning as anticoagulants for use in the therapy of thromboembolic processes and their use as diagonists and reagents. The invention further relates to agents which contain a polypeptide of the formula I in one The compounds according to the invention can be administered parenterally or topically in an appropriate pharmaceutical preparation. For subcutaneous or intravenous administration, the active compounds or their physiologically acceptable salts, if desired with the usual substances such as solubilizers, emulsifiers, isotonic agents, preservatives, etc. the other auxiliaries brought into solution, suspension or emulsion. As a solvent for the new active compounds and the corresponding physiologically acceptable salts come z. B. in question: water, physiological saline solutions or alcohols, e.g. B. ethanol, propanediol, or glycerine, as well as sugar solutions such as glucose or mannitol solutions, or a mixture of the various solvents mentioned. The topical carriers can be organic or inorganic compounds. Typical pharmaceutically used excipients are aqueous solutions which, for. B. buffer systems or isotonic mixtures of water and water-miscible solvents, such as. B. alcohols or aryl alcohols, oils, polyalkylene glycols, ethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, polyvinylpyrrolidone or isopropyl myristate. Suitable buffer substances are, for. B. sodium borate, sodium phosphate, sodium acetate or gluconate buffer. The topical application form can also contain non-toxic auxiliaries such as. B. emulsifying preservatives, crosslinkers, such as. B. polyethylene glycols and antibacterial compounds. Example 1 Determination of the inhibitor concentration by thrombin titration
    10 to 100 µl of the inhibitor solution with a previously determined protein content are mixed with 200 µl of sodium hydrogen carbonate solution (pH = 7.0; 0.5 M). 0.1 ml of fibrinogen solution (0.5 to 1%) or diluted citrate plasma are added; at regular intervals, with stirring, at room temperature, an aliquot (50-100 μl) of the thrombin solution is added (approx. 100 NIH units per ml). In semiquantitative work, the turning point can be the coagulation of the liquid within the selected time interval, or, for quantitative determinations, the turbimetry measurement at 546 nm. Example 2 Free-living leeches (no breeding animals) of the species Hirudo medicinalis collected in Germany are used have been. Approx. 150-200 g of frozen leech front parts are homogenized in a mixer with 2 l of ice-cold 0.09% sodium chloride solution and 10 ml of octanol within 3 minutes. After centrifugation for 30 minutes at 0 ° C. and 10,000 rpm, the supernatant is further clarified by filtration through 2 layers of gauze and then heated to 80 ° C. within 15 minutes with stirring. The resulting precipitate is separated by filtration through 4 layers of gauze. The filtrate is quickly cooled to 4 ° C. by stirring in an ice bath and poured into 7.5 l of precooled acetone (-20 ° C.). Another precipitate is formed which, after 5 minutes, is filtered off on a glass suction filter and washed with 1 l of cold acetone (-20 ° C.). After drying in vacuo, 520 mg of slightly yellowish powder with a protein content of 62% (determined by the Lowry method) is obtained. The antithrombin activity is approx. 400 units per mg. Example 3 520 mg of powder according to Example 2 are dissolved in 75 ml of water, then the pH is adjusted to 8.0 with 5N ammonia and the mixture is stirred at 0-4 ° C. for 1 hour. The insoluble fraction is spun off within 30 minutes using a beaker centrifuge at 5000 rpm. After adjusting the protein content to 25 mg / ml (Lowry) by adding water, 35 ml of saturated ammonium sulfate solution are added and the mixture is stirred at 4 ° C. for 1 hour. The first precipitate is quickly separated off by centrifugation (5000 rpm / 30 minutes). Approx. 26 g of ammonium sulfate are also dissolved and the pH value is adjusted to 4 with glacial acetic acid. After standing for 5 hours, the entire suspension is centrifuged and the resulting moist precipitate is processed further as follows. Example 4 The moist precipitate obtained according to Example 3 is dissolved in 200 ml of 0.1 M ammonium hydrogen carbonate solution of pH 8 and ultrafiltered in a 250 ml Amicon R cell with a 5PM 10 flat membrane (exclusion limit 10,000 Dalton). The solution is concentrated to approx. 40 ml, 150 ml of 0.1 ammonium hydrogen carbonate solution with a pH of 8.0 being refilled twice towards the end. Freeze-drying the residue yields approx. 350 mg of material with a protein content of 89%. Example 5 A column (0.9 × 15 cm) with thrombin-Sepharose is poured into 0.1 M Tris buffer (HCl) pH 8. The substance from Example 3 is dissolved in the same buffer and the column is charged with this sample. Inactive accompanying substances are removed by rinsing the column with the equilibration buffer. Then with a solution of benzamidine (1.5 M Tris buffer pH 7) or with 4-aminobenzamidine (0.2 M Tris buffer pH 7) the hirudin can be displaced from the thrombin-hirudin complex and is eluted in portions. To test the antithrombin activity, the competitive inhibitor must first be separated from the hirudin by gel filtration Sephadex G 20. Weight yield 55%;
    Activity 6,000 to 12,000 ATU / mg. Example 6 20 mg of inhibitor according to Example 3 are dissolved in 200 μl of water at pH 2.16 (adjusted with trifluoroacetic acid + 5% acetonitrile) and injected onto a steel column filled with octadecylsilane silica gel (5 μm) (Shandon R ODS). The column is eluted by a gradient of a maximum of 2% / minute between the starting buffer (water pH = 2.16 + 5% acetonitrile) and acetonitrile. The fractions are collected individually. After drying, the inhibitors of the formula I (R = H or SO 3 H) according to the invention have a specific activity which corresponds to the stoichiometry of a 1: 1 complex with thrombin.

Claims (17)

1. Polypeptid der Formel I in welcher m = 0-50,
n = 0-100 und
R phenolischen Wasserstoff oder eine Phenolestergruppe bedeuten,
X für gleiche oder verschiedene Reste natürlich vorkommende α-Aminosäuren steht,
Z für gleiche oder verschiedene Reste natürlich vorkommender α-Aminosäuren steht und
A für Ile oder die Abwesenheit von Aminosäure steht
B für Ile oder Thr oder die Abwesenheit von Aminosäure steht
C Thr oder Val, Ile, Leu, Phe bedeutet
D Glu oder die Abwesenheit von Aminosäure
E Glu oder Pro und
F Thr oder Ile bedeutet,
in der die 6 Cys-Reste über Disulfid-Brücken verknüpft sind, sowie deren physiologisch verträgliche Salze. 1. Polypeptide of the formula I in which m = 0-50,
n = 0-100 and
R denotes phenolic hydrogen or a phenol ester group,
X stands for identical or different residues of naturally occurring α-amino acids,
Z stands for identical or different residues of naturally occurring α-amino acids and
A stands for Ile or the absence of amino acid
B stands for Ile or Thr or the absence of amino acid
C means Thr or Val, Ile, Leu, Phe
D Glu or the absence of amino acid
E Glu or Pro and
F Thr or Ile means
in which the 6 Cys residues are linked via disulfide bridges, as well as their physiologically compatible salts. 2. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß C Thr ist.2. Polypeptide according to claim 1, characterized in that that C is Thr. 3. Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß A Ile ist.3. Polypeptide according to claim 2, characterized in that that A is Ile. 4. Verbindung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-3, in welcher R Wasserstoff, SO3H oder PO3H2 bedeuten.4. A compound according to at least one of claims 1-3, in which R is hydrogen, SO 3 H or PO 3 H 2 . 5. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
A für Ile,
B für Thr
C für Thr
D für Glu
E für Glu
F für Thr
m für null
n für null
R für H oder SO3H
steht.5. Polypeptide according to claim 1, characterized in that
A for Ile,
B for Thr
C for Thr
D for Glu
E for Glu
F for Thr
m for zero
n for zero
R for H or SO 3 H
stands. 6. Polypeptid I nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
m = null
n = null
R = H oder SO3H
A = Ile
B = direkte Bindung
C = Thr
D = Glu
E = Glu
F = Thr ist. 6. Polypeptide I according to claim 1, characterized in that
m = zero
n = zero
R = H or SO 3 H
A = Ile
B = direct bond
C = Thr
D = Glu
E = Glu
F = Thr. 7. Polypeptid I nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
m = null
n = null
R = H oder SO3H
A = Ile
B = direkte Bindung
C = Thr
D = Glu
E = Glu
F = Ile ist.7. Polypeptide I according to claim 1, characterized in that
m = zero
n = zero
R = H or SO 3 H
A = Ile
B = direct bond
C = Thr
D = Glu
E = Glu
F = Ile is. 8. Polypeptid I nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
m = null
n = null
R = H oder SO3H
A = Ile
B = direkte Bindung
C = Thr
D = Glu
E = Pro
F = Thr ist.8. Polypeptide I according to claim 1, characterized in that
m = zero
n = zero
R = H or SO 3 H
A = Ile
B = direct bond
C = Thr
D = Glu
E = Pro
F = Thr. 9. Polypeptid I nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
m = null
n = null
R = H oder SO3H
A = Ile
B = direkte Bindung
C = Thr
D = Glu
E = Pro
F = Ile ist. 9. Polypeptide I according to claim 1, characterized in that
m = zero
n = zero
R = H or SO 3 H
A = Ile
B = direct bond
C = Thr
D = Glu
E = Pro
F = Ile is. 10. Polypeptid I nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
m = null
n = null
R = H oder SO3H
A = abwesend
B = abwesend
C = Thr
D = abwesend
E = Glu
F = Thr ist.10. Polypeptide I according to claim 1, characterized in that
m = zero
n = zero
R = H or SO 3 H
A = absent
B = absent
C = Thr
D = absent
E = Glu
F = Thr. 11. Biologisch aktives Spaltprodukt eines Polypeptids gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-10.11. Biologically active cleavage product of a polypeptide according to at least one of claims 1-10. 12. Verfahren zur Gewinnung eines gereinigten Polypeptides gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß man das Polypeptid aus Würmern der Ordnung Gnathobdellida, vorzugsweise aus Würmern der Gattung Hirudo mit Hilfe einer Kombination von Extraktionsmethoden, Fällungsmethoden, Membranfiltration und/oder chromatographischen Verfahren isoliert und das erhaltene Peptid gegebenenfalls in seine physiologisch verträglichen Salze überführt.12. Method of Obtaining a Purified Polypeptide according to at least one of claims 1-10, characterized characterized in that the polypeptide from worms of the Order Gnathobdellida, preferably from worms of the Genus Hirudo using a combination of extraction methods, Precipitation methods, membrane filtration and / or chromatographic method isolated and the peptide obtained optionally in its physiological compatible salts transferred. 13. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der Formel I gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) es in an sich bekannter Weise mittels Festphasensynthese herstellt oder
b) zur Herstellung eines Polypeptids, in welchem m = 0 ist,
I. Hirudin einem zweifachen Edman-Abbau unterwirft,
II. das so erhalten Peptid mit einem Aktivester einer
Aminosäure oder eines Peptids der Formel in welcher m, X, A, B und C wie oben definiert sind und U für eine Urethanschutzgruppe steht, umsetzt,
III. die Phenylthiocarbamoyl-Gruppe an der ε-Amino-Funktion von Lys mittels Hydrazin
IV. und die Urethan-Schutzgruppe U mit Hilfe einer Säure oder Base abspaltet und das a) oder b) erhaltene Polypeptid gegebenenfalls in sein physiologisch verträgliches Salz überführt.13. Process for the preparation of a polypeptide of the formula I according to claim 1, characterized in that one
a) it produces it in a manner known per se by means of solid phase synthesis or
b) for the production of a polypeptide in which m = 0,
I. Subjecting Hirudin to a double Edman degradation,
II. The peptide obtained in this way with an active ester
Amino acid or a peptide of the formula in which m , X, A, B and C are as defined above and U stands for a urethane protective group,
III. the phenylthiocarbamoyl group on the ε-amino function of Lys using hydrazine
IV. And the urethane protective group U is split off with the aid of an acid or base and the polypeptide obtained a) or b) is optionally converted into its physiologically acceptable salt. 14. Polypeptid gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-10 zur Anwendung als Heilmittel.14. Polypeptide according to at least one of claims 1-10 for use as a remedy. 15. Verwendung eines Polypeptids gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-10 zur Anwendung als Antikoagulans,15. Use of a polypeptide according to at least one of claims 1-10 for use as an anticoagulant, 16. Mittel enthaltend ein Polypeptid gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-10 und einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger.16. Means containing a polypeptide according to at least one of claims 1-10 and a pharmaceutically acceptable one Carrier. 17. Verwendung eines Polypeptids gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-10 zur Herstellung eines Medikaments.17. Use of a polypeptide according to at least one of Claims 1-10 for the manufacture of a medicament.
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