DE3518527A1 - Pulse-based fluorometer - Google Patents

Pulse-based fluorometer

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Abstract

The invention relates to a pulse-based fluorometer which is capable with the aid of a selective pulse-amplifying system of detecting rapid variations in the fluorescence yield in the case of irradiation by strong, unfiltered white light. The measurement system comprises a periodically pulsed light source, e.g. a light-emitting diode, for fluorescence excitation, a photodetector, e.g. a photodiode, for detecting the fluorescence pulses and a pulsed-amplifying system which processes the fluorescence pulse signals selectively even against a large background of superimposed signals. The fluorometer is particularly suitable for measuring the light-induced variations in the chlorophyll fluorescence of living plants in the event of exposure to unfiltered strong light, e.g. sunlight.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Fluorometer zur Messung The invention relates to a fluorometer for measurement

lichtinduzierter Veränderungen der Fluoreszenzausbeute gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.light-induced changes in the fluorescence yield according to the generic term of claim 1.

Eine derartige Einrichtung ist aus der US Patentschrift 4084905 bekannt. Bei dieser Einrichtung dient dasselbe, kontinuierliche Starklicht, welches die Chlorophyllfluoreszenz pflanzlicher Untersuchungsobjekte verändert, gleichzeitig als Meßlicht zur Anregung der Fluoreszenz. Dabei kann das Detektorsystem nicht zwischen der durch das Meßlicht angeregten Fluoreszenz einerseits und gestreutem Starklicht bzw. der von externem Starklicht angeregten Fluoreszenz andererseits unterscheiden, wenn diese als längerwellige Strahlung das optische Langpaßfilter durchdringen. Damit ist diese Einrichtung nicht dazu geeignet, externes, ungefiltertes Starklicht zur Belichtung des pflanzlichen Untersuchungsobjektes einzusetzen. Ein weiterer Nachteil dieses bekannten Fluorometers besteht darin, daß aufgrund der gegebenen Meßkopfgeometrie die Verwendung eines optischen Kurzpaßfilters zwischen der internen LED Lichtquelle und dem Untersuchungsobjekt verhindert ist, sodaß in der Praxis ein erheblicher Teil des Meßsignals auf den längerwelligen Anteil des Meßlichtes zurückzuführen ist, welches vom Untersuchungsobjekt über den transparenten LED Kunstharz körper und das optische Langpaßfilter in den Photodetektor reflektiert wird. Such a device is known from US Pat. No. 4,084,905. With this device the same, continuous strong light is used as the chlorophyll fluorescence Plant objects of investigation changed, at the same time as measuring light for excitation of fluorescence. In this case, the detector system cannot switch between that caused by the measuring light excited fluorescence on the one hand and scattered strong light or that from external Strongly excited fluorescence on the other hand distinguish if this as longer-wave Radiation penetrate the optical long-pass filter. So this facility is not suitable for external, unfiltered strong light to illuminate the plant To use the examination object. Another disadvantage of this known fluorometer is that due to the given measuring head geometry, the use of a optical short-pass filter between the internal LED light source and the examination subject is prevented, so that in practice a significant part of the measurement signal on the longer-wave portion of the measurement light is due, which from the examination subject via the transparent LED synthetic resin body and the optical long-pass filter into the Photodetector is reflected.

Das in der PaUentschrift DE-PE 2914147 beschriebene Impulsfluorometer arbeitet mit starkem Impulslicht von einer Blitzentladungslampe, welches bei lichtempfindlichen Untersuchungsobjekten zu deren Veränderung während des Meßvorgangs führt. Diese Veränderungen treten in noch verstärktem Maße auf, wenn die Impulsblitz-Frequenz hoch ist. Damit ist die bekannte Einrichtung nicht in der Lage, zeitliche Veränderungen in der Fluoreszenzausbeute lichtempfindlicher Untersuchungsobjekte messend zu verfolgen. Weiterhin ist diese Einrichtung nicht geeignet, die Impulssignale von überlagernden Fremdsignalen zu trennen, wenn die Intensität der Fremdlichteinstrahlung im Größenbereich der Impulsblitzintensität liegt und wenn schnelle Änderungen in der Intensität der Fremdbelichtung auftreten. The pulse fluorometer described in the German patent DE-PE 2914147 works with strong pulsed light from a flash discharge lamp, which is sensitive to light Examination objects leads to their change during the measurement process. These Changes occur to an even greater extent when the pulse flash frequency is high. This means that the known device is not able to change changes over time to track the fluorescence yield of light-sensitive examination objects. Furthermore, this device is not suitable for interfering with the pulse signals Separate extraneous signals when the intensity of extraneous light irradiation is within the size range the pulse flash intensity is and if quick changes in the intensity of the external exposure.

Bei der Beobachtung bestimmter Untersuchungsobjekte ist es jedoch erforderlich, Meßlicht sehr geringer Intensität bei gleichzeitiger Überlagerung von sehr starker, in der Intensität schnell veränderlicher Fremdeinstrahlung anzuwenden. Ein Beispiel aus der Photobiologie ist die Beobachtung lichtinduzierter Chlorophyllfluoreszenz-Veränderungen (Kautsky-Effekt), wobei Verhältnisse von Meßlicht/Starklicht von 1/10 4 bisl/10 7 gefordert sind. However, when observing certain objects to be examined, it is required, measuring light of very low intensity with simultaneous superimposition of very strong external radiation with rapidly changing intensity. An example from photobiology is the observation of light-induced chlorophyll fluorescence changes (Kautsky effect), with ratios of measuring light / strong light from 1/10 4 to 1/10 7 are required.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Fluorometer zu schaffen, welches ein genügend schwaches Meßlicht verwendet, das selbst sehr lichtempfindliche Untersuchungsobjekte nicht verändert und das trotzdem in der Lage ist, selektiv zwischen der schwachen, vom Meßlicht angeregten Fluoreszenz und wesentlich stärkerem Störlicht zu unterscheiden. The present invention is therefore based on the object To create fluorometer, which uses a sufficiently weak measuring light that Even very light-sensitive examination objects are not changed and that anyway is able to selectively between the weak fluorescence excited by the measuring light and to distinguish much stronger stray light.

Bei Anwendung extrem kurzer Lichtimpulse, die periodisch die Fluoreszenz anregen, kann die Impulsintensität relativ hoch sein, ohne daß das Untersuchungsobjekt im zeitlichen Mittel einer starken Lichteinwikung ausgesetzt ist, sofern der Abstand zwischen zwei Meßimpulsen relativ zur Impulsdauer groß ist. Weiterhin lassen sich kurze Impulssignale vorteilhaft durch selektive Verstärkungssysteme von überlagernden Fremdsignalen trennen. When using extremely short light pulses, the periodic fluorescence stimulate, the pulse intensity can be relatively high without the examination subject is exposed to strong light exposure on average over time, provided the distance between two measuring pulses is large relative to the pulse duration. Furthermore you can short pulse signals advantageous through selective amplification systems of overlapping Separate external signals.

Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen geschildert. Advantageous refinements are described in the subclaims.

Die Verwendung einer PIN-Photodiode als Photodetektor gemäß Anspruch 2 ist vorteilhaft zur Anwendung bei hohen Impulsfrequenzen und bei hohen Starklichtintensitäten. Die Umschaltung von niedrigen zu hohen Impulsfrequenzen gemäß Anspruch 3 bewirkt die Erhöhung des Signal/Rauschverhältnisses. Das Kurzschließen des Phodiodenvorverstärkers gemäß Anspruch 4 ist erforderlich, um bei Einstrahlung sehr starker, kurzer Blitzbelichtung eine Übersättigung des Verstärkersystems zu verhindern. Die automatische Nullwertkompensation des Meßsignals gemäß Anspruch 5 dient der Unterdrückung des nichtvariablen vom variablen Teil des Fluoreszenzlichtes. The use of a PIN photodiode as a photodetector according to claim 2 is advantageous for use at high pulse frequencies and high light intensities. The switching from low to high pulse frequencies according to claim 3 causes the increase in the signal-to-noise ratio. Shorting the phodiode preamplifier according to claim 4 is required to with very strong, short flash exposure when irradiated an oversaturation of the amplifier system. The automatic Zero compensation of the measurement signal according to claim 5 is used to suppress the non-variable from the variable part of the fluorescent light.

Gemäß Anspruch 6 ein zweiarmiges Lichtfaserbündel zu verwenden bringt an Vorteilen, daß die Hauptelemente des Meßkopfes flexibel und beabstandet vom Untersuchungsobjekt angeordnet werden können, bei hoher Ausnutzung des gegebenen Meßlichtes und der entstehenden Fluoreszenz. According to claim 6 to use a two-armed fiber optic bundle brings of advantages that the main elements of the measuring head are flexible and spaced from the object to be examined can be arranged, with high utilization of the given measuring light and the resulting fluorescence.

Die zentralen Öffnungen gemäß Anspruch 7 ermöglichen eine besonders kompakte Anordnung der Einzelteile und eine damit verbundene hohe Effizienz der Lichtsendung und der Fluoreszenzsammlung. The central openings according to claim 7 allow a particular compact arrangement of the individual parts and an associated high efficiency of the Light emission and fluorescence collection.

Die Verwendung einer LED gemäß Anspruch 8 mit höherer Lichtintensität macht eine zusätzliche Starklichtquelle entbehrlich. Von Vorteil ist es, daß diese Lichtquelle trägheitslos und synchron geschaltet werden kann. The use of an LED according to claim 8 with a higher light intensity makes an additional strong light source unnecessary. It is advantageous that this Light source can be switched synchronously and without inertia.

Gemäß Anspruch 9 ein einarmiges Lichtfaserbündel zu verwenden bringt den Vorteil. daß dieses unbeabstandet an das Untersuchungsobjekt herangedrückt werden kann und daß damit die gesamte Fluoreszenzstrahlung ohne Streuverlust in den Meßkopf geführt werden kann. According to claim 9 to use a one-armed fiber optic bundle brings the advantage. that these are pressed towards the examination object at no distance can and that thus the entire fluorescence radiation without scatter loss in the measuring head can be performed.

Durch die Ancrdnung der Stark lichtquelle gemäß Anspruch 10 unmittelbar unter dem Untersuchungsobjekt und ohne Zwischenschaltung eines optischen Filters ergibt sich eine besonders intensive Starklichtwirkung. Directly through the connection of the strong light source according to claim 10 under the examination subject and without the interposition of an optical filter the result is a particularly intense strong light effect.

Ein bevorzugtes Anwendungsfeld der Erfindung bezieht sich auf die Messung lichtinduzierter Veränderungen der Chlorophyllfluoreszenz (Kautsky-Effekt) an lebenden Pflanzen. Diese Veränderungen erlauben einen Einblick in das Photosyntheseverhalten der lebenden Pflanzen und damit eine Diagnose des pflanzlichen Zustands. Jede Schädigung der Pflanze drückt sich in einer charakteristischen Veränderung der Fluoreszenz-Induktionskurve aus. A preferred field of application of the invention relates to Measurement of light-induced changes in chlorophyll fluorescence (Kautsky effect) on living plants. These changes allow an insight into the photosynthetic behavior of living plants and thus a diagnosis of the plant condition. Any harm of the plant is expressed in a characteristic change in the fluorescence induction curve the end.

Nachfolgend wird anhand der Zeichnungen eine Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Fluorometers auf Impulsbasis beschrieben. In den Zeichnungen zeigt Figur 1 ein Funktions-Blockschema des Fluorometers, Figur 2 a,b ein Prinzipschaltbild des Fluorometers, Figur 3 ein Zeitdiagramm zur Erläuterung der Schalterstellungen im selektiven Ausschnittsverstärker, Figur 4 ein Prinzipschaltbild der automatischen Nullwertkompensation, Figur 5 eine schematische Darstellung einer Meßkopfausführung mit Meßlichtführung durch zentrale Öffnungen in der Photodiode und im Langpaßfilter, Figur 7 eine schematische Darstellung einer Meßkopfausführung mit einarmiger Fiberoptik, Figur 8 eine schematische Darstellung einer Meßkopfausführung mit zwei hintereinander angeordneten LEDs mit Meßlicht- und Starklichtfunktionen und Figur 9 Meßkurve der zeitabhängigen Veränderung der Chlorophyllfluoreszenz - Ausbeute beim Dunkel/Licht Übergang.An embodiment of a Pulse-based fluorometer according to the invention described. In the drawings shows Figure 1 is a functional block diagram of the fluorometer, Figure 2 a, b a basic circuit diagram of the fluorometer, Figure 3 is a timing diagram to explain the switch positions in the selective section amplifier, Figure 4 is a schematic diagram of the automatic Zero value compensation, FIG. 5 a schematic representation of a measuring head design with measuring light guidance through central openings in the photodiode and in the long-pass filter, FIG. 7 a schematic representation of a measuring head design with one-armed fiber optics, Figure 8 is a schematic representation of a measuring head design with two in a row arranged LEDs with measuring light and strong light functions and Figure 9 measurement curve of the time-dependent change in chlorophyll fluorescence - yield in the dark / light Crossing.

Das in Fig. 1 in einem Funktions-Blockschema dargestellte Fluorometer besteht aus einem Meßkopf M , einer Steuer- und Regeleinrichtung STR und wahlweise hinzuschaltbaren Einrichtungen für automatische Nullwertkompensation 23 und für Starklicht-Belichtung 18a, 18b,19 . Eine spezifische Messung der Impulsfluoreszanz ist durch die Kombination optischer Filter 4,6 und selektiver Verstärkerelemente 8,11 erreicht. Die LED Lichtquelle 1 wird durch den Impulstreiber 2 über den Dezimalzähler 12 mit 1/10 der Frequenz des Taktgenerators 9 betrieben und bestrahlt das Untersuchungsobjekt 5 durch ein optisches Kurzpaßfilter 4. Das kurzwellige Anregungslicht regt im Untersuchungsobjekt 5 gleichtaktig und gleichphasig langwellige Fluoreszenz an. Das optische Langpaßfilter 6 , welches sich zwischen dem Untersuchungsobjekt 5 und der Photodiode 7 befindet, läßt die längerwellige Fluoreszenz passieren, während es das kürzerwellige Anregungslicht absorbiert. Auch der längerwellige Anteil der bei gleichzeitiger Belichtung mit einer Starklichtquelle 19 bzw. bei unkontrolliertem Fremdlichteinfall auftretenden Streu-, Reflektions-und Fluoreszenz-Strahlung erreicht über das optische Langpaßfilter 6 die Photodiode 7 und erzeugt dort ein Meßsignal, welches sich dem Impulsfluoreszenzsignal überlagert. Das Gesamtmeßsignal wird dem Vorverstärker 8 zugeführt, der als schneller Impulsverstärker ausgelegt ist und dadurch eine weitgehende Trennung von getaktetem Impulsfluoreszenzsignal und ungetaktetem Stark- bzw. Fremdlichtsignal bewirkt. Bei Anwendung von Starklichtquellen mit steilen Schaltflanken ist die Trennung von Impulssignal und dem schnell veränderlichen Störsignal jedoch noch nicht ausreichend. Eine vollständige Trennung erfolgt erst im anschließenden selektiven Ausschnittsverstärker 11 . Für die Funktion des Verstärkersystems ist entscheidend, daß sowohl der LED Impulstreiber 2 , als auch der selektive Ausschnittsverstärker 11 , als auch der Ein/Ausschalter 18a,18b der Starklichtquelle 19 , sowie der Austastschalter S3 im Vorverstärker 8 (Fig. 2a) über den Dezimalzähler 12 und die logischen Schaltelemente in einer Synchronisierungseinheit 10 in zeitlich definierter Weise funktionell mit dem Taktgenerator 9 gekoppelt sind. The fluorometer shown in FIG. 1 in a functional block diagram consists of a measuring head M, a control and regulating device STR and optionally Additional facilities for automatic zero compensation 23 and for High light exposure 18a, 18b, 19. A specific measurement of pulse fluorescence is due to the combination of optical filters 4.6 and selective amplifier elements Reached 8.11. The LED light source 1 is driven by the pulse driver 2 via the decimal counter 12 operated with 1/10 the frequency of the clock generator 9 and irradiates the examination subject 5 through an optical short-pass filter 4. The short-wave excitation light excites in the examination subject 5 in-phase and in-phase long-wave fluorescence. The optical long-pass filter 6, which is located between the examination object 5 and the photodiode 7, lets the longer-wave fluorescence pass, while the shorter-wave Excitation light absorbed. Also the longer-wave portion of the simultaneous exposure with a strong light source 19 or occurring in the event of uncontrolled incidence of extraneous light Scattered, reflected and fluorescent radiation is achieved through the optical long-pass filter 6 the photodiode 7 and generates a measurement signal there, which is the pulsed fluorescence signal superimposed. The total measurement signal is fed to the preamplifier 8, which is faster Pulse amplifier is designed and thus an extensive separation of clocked Impulse fluorescence signal and unclocked strong or external light signal caused. at The use of strong light sources with steep switching edges is the separation of the pulse signal and the rapidly changing interfering signal are not yet sufficient. A complete Separation only takes place in the subsequent selective section amplifier 11. For The function of the amplifier system is crucial to that of both the LED pulse driver 2, as well as the selective section amplifier 11, as well as the on / off switch 18a, 18b of the strong light source 19, and the blanking switch S3 in the preamplifier 8 (Fig. 2a) via the decimal counter 12 and the logic switching elements in one Synchronization unit 10 in a time-defined manner functionally with the clock generator 9 are coupled.

Gemäß Fig. 2a und 2b steuert der Taktgenerator 9 über einen Dezimalzähler 12 zum einen den LED Impulstreiber 2 und zum anderen den selektiven Ausschnittsverstärker 11 an. Ferner werden von demselben Dezima'zähler 12 an seinem Ausgang 5 Synchronimpulse zur Ansteuerung der Synchronisierungseinheit 10 geliefert. Die Fluoreszenzimpulse werden von der Photodiode 7 empfangen, im Vorverstärker 8 verarbeitet und das Impulsignal dem selektiven Ausschnittsverstärker 11 zugeführt. Im Vorverstärker 8 wird durch das RC-Hochpaßfilter R1,C1 das Impulssignal von überlagernden Störsignalen getrennt. Der Ausschalter S3 dient der kurzfristigen Kurzschließung des Verstärkereingangs zur Verhinderung einer Übersättigung des Verstärkersystems bei Anwendung sättigender Lichtblitze. According to FIGS. 2a and 2b, the clock generator 9 controls a decimal counter 12 on the one hand the LED pulse driver 2 and on the other hand the selective section amplifier 11 at. In addition, the same decima counter 12 receives 5 sync pulses at its output for controlling the synchronization unit 10 supplied. The fluorescence pulses are received by the photodiode 7, processed in the preamplifier 8 and the pulse signal the selective section amplifier 11 is supplied. In the preamplifier 8 is through the RC high-pass filter R1, C1 separates the pulse signal from superimposed interference signals. The switch S3 is used to short-circuit the amplifier input to prevent oversaturation of the amplifier system when using saturating Flashes of light.

Im selektiven Ausschnittsverstärker 11 , der dem Vorverstärker 8 nachgeschaltet ist, steuern zwei vom Taktgenerator 9 über den Dezimalzähler 12 an seinem Ausgang "O" erhaltene Schaltimpulse nach geeigneter Verzögerung in den Elementen V1 und V2 zwei Schalter S1 und S2 an, zum Zwecke der zeitlich selektiven Übernahme des vom Vorverstärker 8 kommenden Fluoreszenzimpulssignals.In the selective section amplifier 11, which is the preamplifier 8 downstream is, control two of the clock generator 9 via the decimal counter 12 at its output "O" received switching pulses after a suitable delay in the elements V1 and V2 two switches S1 and S2 on, for the purpose of time-selective takeover of the fluorescence pulse signal coming from the preamplifier 8.

Die relative zeitliche Lage des LED Impulslichtes 3 , des vom Vorverstärker 8 kommenden Fluoreszenzimpulssignals 13 und der von den Verzögerungsgliedern V1 und V2 kommenden Schaltimpulse ist in Fig.3 dargestellt. The relative temporal position of the LED pulse light 3, that of the preamplifier 8 coming fluorescence pulse signal 13 and that of the delay elements V1 and V2 coming switching impulses is shown in Fig.3.

Den Schaltern S1 und S2 nachgeschaltet sind zwei Halteglieder C2 und C3, die bei jedem Meßimpuls die Ausschnittssignalwerte 15 und 16 (Fig.3) übernehmen und bis zum nächsten Meßimpuls an den beiden Eingängen eines nachgeschalteten Instrumentenverstärkers 14 speichern. The switches S1 and S2 are followed by two holding members C2 and C3, which take over the segment signal values 15 and 16 (Fig. 3) with each measuring pulse and until the next measuring pulse at the two inputs of a downstream instrumentation amplifier 14 save.

Am Ausgang des Instrumentenverstärkers 14 liegt das Meßsignal jeweils als Differenzsignal zwischen den Extremwerten 15 und 16 des Lade- und Entladeimpulses vor, welches ein Maß für die jeweilige Fluoreszenzausbeute des Untersuchungsobjektes ist.The measurement signal is present at the output of the instrumentation amplifier 14 as a difference signal between the extreme values 15 and 16 of the charge and discharge pulse before, which is a measure of the respective fluorescence yield of the examination object is.

Der Taktgenerator 9 wird mittels des Schalters 21 durch einen Impuls von der Synchronisierungseinrichtung 10 von einer niedrigen auf eine hohe Frequenz und umgekehrt geschaltet. Eine Umschaltung des Taktgenerators 9 von niedriger auf hohe Frequenz dient zur Erhöhung des Signal/Rausch Verhältnisses. Die damit verbundene Erhöhung der Meßlichtintensität ist bei gleichzeitiger Einstrahlung von Starklicht in ihrer Wirkung zu vernachlässigen. The clock generator 9 is by means of the switch 21 by a pulse from the synchronizer 10 from a low to a high frequency and vice versa. Switching the clock generator 9 from lower to high frequency is used to increase the signal / noise ratio. The Associated The measuring light intensity is increased with simultaneous exposure to strong light negligible in their effect.

Damit die beim Ein- und Ausschalten von Starklichtquellen mit steilen Schaltflanken auftretenden steilen Signalflanken nicht mit den Fluoreszenzimpulssignalen 13 zeitlich zusammenfallen können, werden vom Dezimalzähler 12 am Ausgang "5" erzeugte Synchronimpulse zum Ein- und Ausschalten der Starklichtquelle 19 genutzt, wobei eine Logikschaltung L1 dafür sorgt, daß die Synchronimpulse nur dann einen Einschalt-Triggerimpuls auslösen, wenn der Starttaster 17 betätigt ist und wobei eine zweite Logikschaltung L2 in Verbindung mit einem digital-einstellbaren Verzögerungsglied 20 einen Synchronimpuls zur Auslösung des Ausschalt-Triggerimpulses selektioniert. So that when switching strong light sources on and off with steep Switching edges occurring steep signal edges not with the fluorescence pulse signals 13 can coincide in time, are generated by the decimal counter 12 at the output "5" Synchronous pulses used to switch the strong light source 19 on and off, wherein a logic circuit L1 ensures that the sync pulses only one Switch-on trigger pulse trigger when the start button 17 is pressed and a second logic circuit L2 in conjunction with a digitally adjustable delay element 20 generates a sync pulse selected to trigger the switch-off trigger pulse.

Am Ausgang des Instrumentenverstärkers 14 in der Steuer- und Regeleinrichtung 11 (Fig. 2a) befindet sich eine wahlweise zuschaltbare Zusatzeinrichtung 23 zur automatischen Nullwertkompensation des Meßsignals. Die Zusatzeinrichtung gemäß Fig. 4 besteht aus einem Taster 24 über den bei Betätigung ein Binärzähler 25 angesteuert wird. Diesem ist eine Widerstandskette 26 nachgeschaltet, welche an ihrem Ausgang variable Spannungen zur Kompensation des vorliegenden Meßsignals erzeugt. Diese Spannungen werden in einem Komparator 27 jeweils mit den gegebenen Meßsignal-Spannungen verglichen und das Vergleichsergebnis veranlaßt den Binärzähler zu einer Aufwärts- oder zu einer Abwärtszählung und der damit verbundenen Korrektur der Kompensationsspannung am Ausgang der Widerstandskette 26. Dieser Zählvorgang läuft solange ab, bis die Nullwertkompensation erreicht ist. Der Kompensationswert bleibt erhalten, sobald der Taster 24 sich wieder öffnet. At the output of the instrumentation amplifier 14 in the control and regulating device 11 (Fig. 2a) is an optionally switchable additional device 23 for automatic zero compensation of the measuring signal. The additional device according to Fig. 4 consists of a button 24 via which a binary counter 25 is controlled when actuated will. This is followed by a resistor chain 26, which is at its output variable voltages generated to compensate for the present measurement signal. These Voltages are in a comparator 27 in each case with the given measurement signal voltages compared and the comparison result causes the binary counter to an upward or to a down counting and the associated correction of the compensation voltage at the output of the resistor chain 26. This counting process continues until the Zero compensation has been achieved. The compensation value is retained as soon as the button 24 opens again.

Die Kompensationsspannung und das Meßsignal werden am Differenzverstärker 28 voneinander abgezogen und das Differenzsignal gelangt zur Auswertung.The compensation voltage and the measuring signal are transmitted to the differential amplifier 28 are subtracted from each other and the difference signal is used for evaluation.

In Fig. 5 ist eine Ausführungsform des Meßkopfes M mit zweiarmiger Fiberoptik 30,31 dargestellt. Im Abschirmgehäuse 29 fällt das Licht einer lichtemittierenden Diode (LED) 1 durch ein optisches Kurzpaßfilter 4 auf den einen Arm 30 des Lichtfaserbündels und bestrahlt ein Untersuchungsobjekt 5. Ferner enthält das Abschirmgehäuse 29 eine Photodiode 7 mit einem optischen Langpaßfilter 6, die durch den zweiten Arm 31 des Lichtfaserbündels das Fluoreszenzimpulssignal empfängt. In Fig. 5 is an embodiment of the measuring head M with two-armed Fiber optics 30,31 shown. In the shielding case 29, the light falls from a light emitting Diode (LED) 1 through an optical short-pass filter 4 onto one arm 30 of the optical fiber bundle and irradiates an examination subject 5. The shield case 29 further includes a Photodiode 7 with an optical long-pass filter 6 through the second arm 31 of the Optical fiber bundle receives the fluorescence pulse signal.

Die Fasern der beiden Arme 30,31 des Lichtfaserbündels sind an einem gemeinsamen Ende 32 zusammengefaßt und durchmischt.The fibers of the two arms 30,31 of the light fiber bundle are on one common end 32 combined and mixed.

In der Fig. 6 ist eine weitere Ausführungsmöglichkeit des Meßkopfes M dargestellt. Es zeigen 1 eine LED, 4 ein Kurzpaßfilter, 35 eine Photodiode mit zentraler Öffnung 33 , sowie 36 ein Langpaßfilter mit zentraler Öffnung 34 in einem Abschirmgehäuse 29, durch dessen Öffnung 37 die Fluoreszenz des Untersuchungsobjektes 5 angeregt wird. Die Anordnung der Photodiode 35 und des Langpaßfilters 36 mit jeweils zentralen Öffnungen ermöglicht die'Bestrahlung des Teiles 5 aus kurzer Entfernung, mit der damit verbundenen optimalen Ausnutzung der gegebenen LED Lichtstärke und gleichzeitiger effektiver Sammlung des Fluoreszenzlichtes. 6 shows another possible embodiment of the measuring head M shown. 1 shows an LED, 4 a short-pass filter, 35 a photodiode central opening 33, and 36 a long-pass filter with central opening 34 in one Shielding housing 29, through the opening 37 of which the fluorescence of the examination object 5 is suggested. The arrangement of the photodiode 35 and the long-pass filter 36 with each central openings enables the part 5 to be irradiated from a short distance, with the associated optimal utilization of the given LED light intensity and simultaneous effective collection of fluorescent light.

Fig. 7 zeigt eine Ausführungsform des Meßkopfes M analog der Fig. 6 jedoch mit einem an die Öffnung 37 angekoppelten, einarmigen Lichtfaserbündel 38, welches an das Teil 5 ohne Abstand angedrückt ist. FIG. 7 shows an embodiment of the measuring head M analogous to FIG. 6, however, with a one-armed fiber optic bundle coupled to the opening 37 38, which is pressed against the part 5 without a gap.

Aufgrund dieser Anordnung sind Fluoreszenzmessungen an schwer zugänglichen Untersuchungsobjekten ermöglicht, bei gleichzeitiger optimaler Ausnutzung von gegebener LED Lichtstärke und effektiver Sammlung des Fluoreszenzlichtes.Due to this arrangement, fluorescence measurements are difficult to access Examination objects enabled, while at the same time making optimal use of the given LED light intensity and effective collection of fluorescent light.

In der Fig. 8 ist der Meßkopf M analog dem der Fig. 6 dargestellt, jedoch befindet sich zwischen der Öffnung 34 und der Öffnung 37 eine zweite LED 39 mit transparentem Kunstharzkörper. Die zweite LED 39 kann in dieser Anordnung von der LED 1 durchstrahlt werden. Außerdem liefert die zweite LED 39 ungefiltertes Starklicht zur Belichtung des Untersuchungsobjektes 5 aus nächster Nähe. Gleichzeitig ist bei dieser Anordnung ein ausreichender Einfall von Fluoreszenzimpulslicht auf die Photodiode 35 gewährleistet. In FIG. 8, the measuring head M is shown analogously to that of FIG. 6, however, there is a second LED between opening 34 and opening 37 39 with transparent synthetic resin body. The second LED 39 can be in this arrangement can be penetrated by the LED 1. In addition, the second LED 39 provides unfiltered Strong light for exposing the examination object 5 from close proximity. Simultaneously With this arrangement, there is sufficient incidence of pulsed fluorescent light the photodiode 35 ensures.

Fig. 9 zeigt eine mit dem erfindungsgemäßen Fluorometer gemessene Chlorophyllfluoreszenz-Induktionskurve von einem Spinat-Blatt beim Übergang vom Dunkel- in den Lichtzustand. Im vorliegenden Meßbeispiel verhalten sich die Intensitäten von Meßlicht/Starklicht/Sättigungsblitzen wie 1/105/106. Das Starklicht bewirkt Veränderungen der Fluoreszenzausbeute in Verbindung mit dem Ablauf der Photosynthese im Blatt; die Sättigungsblitze dienen zur Ermittlung der maximalen Fluoreszenzausbeute. 9 shows a measured with the fluorometer according to the invention Chlorophyll fluorescence induction curve from a spinach leaf at the transition from Dark to the light state. In the present measurement example, the intensities behave of measuring light / strong light / saturation flashes such as 1/105/106. The strong light causes Changes in the fluorescence yield in connection with the course of photosynthesis in the leaf; the saturation flashes are used to determine the maximum fluorescence yield.

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Claims (10)

Patentansprüche t Fluorometer zur Messung lichtinduzierter Veränderungen der Fluoreszenzausbeute bestehend aus einem Meßkopf und einer Steuer-und Regeleinrichtung, wobei der Meßkopf in einem Abschirmgehäuse untergebracht ist, das neben einer LED Lichtquelle einen Photodetektor mit Vorverstärker enthält, gekennzeichnet durch folgende Merkmale: a) die LED Lichtquelle (1) wird von einem Impulstreiber (2) getrieben und liefert periodisch rechteckförmige Lichtimpulse (3) im psec-Bereich; b) das LED Impulslicht durchdringt ein optisches Kurzpaßfilter (4) bevor es auf das Untersuchungsobjekt (5) fällt und dort längerwellige Fluoreszenz-Impulse anregt, welche durch ein optisches Langpaßfilter (6) von dem LED Impulslicht getrennt und auf den Photodetektor geleitet werden; c) im Vorverstärker (8) werden mittels eines RC-Hochpaß-Filters (F31, C1) die schnellen Impulssignale von langsameren, überlagernden Fremd signalen getrennt; d) in der Steuer- und Regeleinrichtung (STR) liefert ein Taktgenerator (9) Steuerimpulse für den LED Impulstreiber (2) und die zugehörigen Steuerilllpulse für einen selektiven Ausschnittsverstärker (11), sowie über eine Synchronisierungseinheit (10) Synchronisierungspulse für die Ansteuerung einer Starklichtquelle (19) und Austastimpulse zum kurzfristigen Kurzschließen des Vorverstärker (8); e) im selektiven Ausschnittsverstärker (11) dienen zwei vom Taktgenerator (9) über den Dezimalzähler (12) und die Verzögerungsglieder (V1, V2) erzeugte Schaltimpulse zur Betätigung der Schalter (S1, S2) zum Zwecke der zeitlich selektiven Übernahme des vom Vorverstärker (8) eintreffenden Signals (13) durch zwei Speicherkondensatoren (C2, C3) an den beiden Eingängen eines Instrumenten- Verstärkers (14), wobei die Schalter jeweils nur für kurze Zeiträume im Maximum des Ladeimpulses (15) und im Minimum des folgenden Entladeimpulses (16) geschlossen sind; f) die Synchronisierungseinrichtung (10) löst bei Betätigung eines Start-Tasters (17) Triggerimpulse für die Betätigung eines Ein/Aus Schalters (18 a,b) einer Starklichtquelle (19) aus, wobei die vom Taktgenerator (9) erzeugten Synchronimpulse mittels des Dezimalzählers (12) zeitlich verschoben sind, sodaß sie jeweils in die Mitte zwischen zwei LED Meßlicht-Impulse (3) fallen, und wobei eine Logikschaltung (L1) dafür sorgt, daß die Synchronimpulse nur dann einen Einschalt-Triggerimpuls auslösen, wenn der Start-Taster (17) betätigt wird, und wobei eine zweite Logikschaltung (L2) in Verbindung mit einem digital einstellbaren Verzögerungsglied (20) einen Synchronimpuls zur Auslösung des Ausschalt-Triggerimpulses selektioniert. Claims t fluorometer for measuring light-induced changes the fluorescence yield consisting of a measuring head and a control and regulating device, wherein the measuring head is housed in a shielding housing next to an LED Light source containing a photodetector with preamplifier, characterized by the following features: a) the LED light source (1) is driven by a pulse driver (2) and periodically supplies rectangular light pulses (3) in the psec range; b) that LED pulsed light penetrates an optical short-pass filter (4) before it hits the examination subject (5) falls and there excites longer-wave fluorescence pulses, which are generated by an optical Long-pass filter (6) separated from the LED pulsed light and directed to the photodetector will; c) in the preamplifier (8), an RC high-pass filter (F31, C1) the fast pulse signals are separated from slower, superimposed external signals; d) in the control and regulating device (STR) a clock generator (9) supplies control pulses for the LED pulse driver (2) and the associated control pulse for a selective one Section amplifier (11), as well as synchronization pulses via a synchronization unit (10) for controlling a strong light source (19) and blanking pulses for short-term Short-circuiting the preamplifier (8); e) in the selective section amplifier (11) serve two from the clock generator (9) via the decimal counter (12) and the delay elements (V1, V2) generated switching pulses for actuating the switches (S1, S2) for the purpose the time-selective takeover of the signal arriving from the preamplifier (8) (13) through two storage capacitors (C2, C3) at the two inputs of an instrument Amplifier (14), the switches only for short periods of time at the maximum of the charging pulse (15) and are closed in the minimum of the following discharge pulse (16); f) the The synchronization device (10) triggers trigger pulses when a start button (17) is pressed for operating an on / off switch (18 a, b) of a high-intensity light source (19) off, the synchronizing pulses generated by the clock generator (9) by means of the decimal counter (12) are shifted in time so that they are each in the middle between two LEDs Measuring light pulses (3) fall, and a logic circuit (L1) ensures that the sync pulses only trigger a switch-on trigger pulse when the start button (17) is actuated, and wherein a second logic circuit (L2) in connection with a digitally adjustable delay element (20) a sync pulse for triggering of the switch-off trigger pulse selected. 2. Fluorometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Photodetektor eine PIN-Photodiode (7) ist, mit ausreichend schneller Ansprechzeit zur Erfassung von Fluoreszenzimpulsen im psec-Bereich und mit hoher Linearität des Ausgangsstroms über einen weiten Lichtintensitätsbereich.2. Fluorometer according to claim 1, characterized in that the photodetector a PIN photodiode (7) with a sufficiently fast response time for detection of fluorescence pulses in the psec range and with high linearity of the output current over a wide range of light intensities. 3. Fluorometer nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei Einsatz der Starklichtquelle (19) der Taktgenerator (9) mittels eines von der Synchronisierungseinheit (10) angesteuerten Umschalters (21) von einer niedrigen auf eine hohe Frequenz und umgekehrt geschaltet wird.3. Fluorometer according to Claims 1 and 2, characterized in that when using the strong light source (19) the clock generator (9) by means of one of the Synchronization unit (10) controlled switch (21) from a low is switched to a high frequency and vice versa. 4. Fluorometer nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die externe Starklichtquelle (19) eine Blitzentladungslampe ist, und daß der bei Betätigung des Start-Tasters (17) ausgelöste Triggerimpuls über einen Impulsgenerator (22) einen Impuls definierter Dauer zur Betätigung eines Schalters (S3) für die Kurzschließung des Photodiodenvorverstärkers (8) erzeugt.4. Fluorometer according to Claims 1 to 3, characterized in that the external strong light source (19) is a flash discharge lamp, and that the at Actuation of the start button (17) triggered Trigger pulse over a pulse generator (22) a pulse of a defined duration for actuating a switch (S3) generated for short-circuiting the photodiode preamplifier (8). 5. Fluorometer nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Steuer- und Regeleinrichtung (STR) mit einer wahlweise zuschaltbaren Zusatzeinrichtung (23) zur automatischen Nullwertkompensation des Meßsignals ergänzt ist, bestehend aus einem vom Taktgenerator (9) bei Betätigung eines Tasters (24)angesteuerten Binärzähler (25) mit nachgeschalteter Widerstands kette (26), welche Ausgangsspannungen zur Kompensation des vorliegenden Meßsignals erzeugt, die zunächst in einem Komparator (27) mit dem Meßsignal verglichen werden, um den Binärzähler (25) zu einer Aufwärts- oder Abwärtszählung zu veranlassen, und daß dann in einem Differenzverstärker (28) die Differenzspannung zwischen Meßsignal und Kompensationsspannung gebildet wird, wobei nach ausreichender Zähldauer die Differenzspannung statistisch um den Nullwert schwankt und wobei nach Abschalten der Taktimpulse der jeweils vorliegende Kompensationswert erhalten bleibt.5. fluorometer according to claims 1 to 4, characterized in that the control and regulation device (STR) with an optional additional device (23) is supplemented for automatic zero value compensation of the measurement signal, consisting from a binary counter controlled by the clock generator (9) when a button (24) is pressed (25) with a downstream resistor chain (26), which output voltages for Compensation of the present measurement signal is generated, initially in a comparator (27) are compared with the measurement signal in order to convert the binary counter (25) to an upward or to cause downward counting, and that then in a differential amplifier (28) the differential voltage between the measuring signal and the compensation voltage is formed, after a sufficient counting time, the differential voltage is statistically around the zero value fluctuates and the compensation value present in each case after the clock pulses have been switched off preserved. 6. Fluorometer nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß im Meßkopf (M) die LED (1) und die Photodiode (7) mit den entsprechenden Filtern (4, 6) nebeneinander in parallelen Achsen in einem Abschirmgehäuse (29) angeordnet sind, und daß die LED (1) und die Photodiode (7) über getrennte Lichtleiterfaserbündel (30, 31) an einem gemeinsamen Austrittsende (32) zusammengeführt und gemischt sind, und daß das Austrittsende der zusammengefaßten Lichtleiterbündel (32) in geringem Abstand vom Untersuchungsobjekt (5) gehalten ist.6. fluorometer according to claims 1 to 5, characterized in that in the measuring head (M) the LED (1) and the photodiode (7) with the corresponding filters (4, 6) arranged side by side in parallel axes in a shielding housing (29) are, and that the LED (1) and the photodiode (7) via separate optical fiber bundles (30, 31) are brought together and mixed at a common outlet end (32), and that the exit end of the combined light guide bundles (32) in a small amount Distance from the examination subject (5) is kept. 7. Fluorometer nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die LED Impulslichtquelle (1) durch das optische Kurzpaßfilter (4) und durch zentrale Öffnungen (33, 34) einer darüberliegenden Photodiode (35) und eines optischen Langpaßfilters (36) auf ein über der Öffnung (37) des Abschirmgehäuses (29) befindliches Untersuchungsobjekt (5) scheint, und daß die dort angeregte Fluoreszenz durch das optische Langpaßfilter (36) vom kürzerwelligen LED Licht getrennt wird und dann auf die Photodiode (35) trifft.7. fluorometer according to claims 1 to 5, characterized in that the LED pulsed light source (1) through the optical short-pass filter (4) and through central openings (33, 34) of an overlying photodiode (35) and an optical long pass filter (36) on one over the opening (37) of the shield case (29) located examination object (5) appears, and that the fluorescence excited there is separated from the shorter-wave LED light by the optical long-pass filter (36) and then hits the photodiode (35). 8. Fluorometer nach Ansprüchen 1 bis 5 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die LED (1) zusätzlich zu den periodischen Meßlichtpulsen auch kontinuierliches Licht höherer Intensität liefert, wobei die Ein/Aus Schaltung des kontinuierlichen Lichtanteils höherer Intensität durch die Synchronisierungseinrichtung (10) gesteuert ist.8. fluorometer according to claims 1 to 5 and 7, characterized in that that the LED (1) in addition to the periodic measuring light pulses also continuous Provides higher intensity light, with the on / off switching of the continuous Light component of higher intensity controlled by the synchronization device (10) is. 9. Fluorometer nach Ansprüchen 1 bis 5 und 7 - 8, dadurch gekennzeichnet, daß die LED (1) und die Photodiode (35) über das eine Ende eines gemeinsamen Lichtleiterfaserbündels (38) mit dem Untersuchungsobjekt (5) verbunden sind, und daß das andere Ende des Bündels unbeabstandet auf das Untersuchungsobjekt angedrückt ist, sodaß sowohl Anregungslicht als auch Starklicht von der LED (1) über den Lichtleiter (38) auf ein vom Meßkopf entfernt befindliches Untersuchungsobjekt (5) strahlt und die dort angeregte Fluoreszenz über dieselben Fasern zurück in den Meßkopf geleitet wird.9. Fluorometer according to claims 1 to 5 and 7-8, characterized in that that the LED (1) and the photodiode (35) via one end of a common optical fiber bundle (38) are connected to the examination object (5), and that the other end of the Bundle is pressed non-spaced on the examination subject, so that both excitation light as well as strong light from the LED (1) via the light guide (38) to a from the measuring head remotely located examination object (5) radiates and the fluorescence excited there is fed back into the measuring head via the same fibers. 10. Fluorometer nach Ansprüchen 1 bis 5 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß das gefilterte Meßpulslicht der LED (1) nach Passieren der zentralen Öffnungen (33, 34) in der Photodiode (35) und dem optischen Langpaßfilter (36) durch eine zweite LED (39) mit transparentem Kunstharz körper hindurch die Fluoreszenz des direkt darüberliegenden Untersuchungsobjekts (5) anregt, und daß die transparente LED (39) das Untersuchungsobjekt (5) aus nächster Nähe mit ungefiltertem Starklicht bestrahlt.10. Fluorometer according to Claims 1 to 5 and 7, characterized in that that the filtered measuring pulse light of the LED (1) after passing through the central openings (33, 34) in the photodiode (35) and the optical long-pass filter (36) through a second LED (39) with transparent synthetic resin body through the fluorescence of the directly overlying examination object (5) stimulates, and that the transparent LED (39) the examination object (5) at close range with unfiltered strong light irradiated.
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