DE3518211A1 - Culture broth of Myxococcus fulvus NCIB 12064, active substance extract, active substance mixture, active substances and preparation processes - Google Patents
Culture broth of Myxococcus fulvus NCIB 12064, active substance extract, active substance mixture, active substances and preparation processesInfo
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Abstract
Description
KulturbrUhe von Myxococcus fulvus NCIB 12064, Wirkstoff-Culture broth from Myxococcus fulvus NCIB 12064, active ingredient
extrakt, Wirkstoffgemisch, Wirkstoffe und Herstellungsverfahren.extract, mixture of active ingredients, active ingredients and manufacturing process.
Gemäß einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine KulturbrUhe von Myxococcus fulvusNCIB 12064r, die dadurch erhältlich ist, daß man Myxococcus fulvus NCIB 12064 unter submersen aeroben Bedingungen in einem Kohlenstoff und Stickstoff sowie Mineralsalze enthaltenden wässrigen Nährmedium bei 15 bis 40°C kultiviert. Vorzugsweise kultiviert man Myxococcus fulvus NCIB 12064 bei 25 bis 35 und insbesondere etwa 30 °C.According to one embodiment, the invention relates to a culture broth from Myxococcus fulvus NCIB 12064r, which is obtainable by calling Myxococcus fulvus NCIB 12064 under submerged aerobic conditions in a carbon and nitrogen and aqueous nutrient medium containing mineral salts are cultivated at 15 to 40 ° C. Myxococcus fulvus NCIB 12064 is preferably cultivated at 25 to 35 and especially about 30 ° C.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Wirkstoffextrakt, der dadurch erhältlich ist, daß man (a) ggf. die Zellen von Myxococcus fulvus NCIB 12064 von erfindungsgemäßer KulturbrUhe abtrennt und (b) die Kulturbrühe mit einem mit Wasser nicht unbegrenzt mischbaren organischen Lösungsmittel oder Adsorberharzen (z.B. Amberlite wie XAD 2, XAD 4, oder ER 180) extrahiert.According to a further embodiment, the invention relates to a Active ingredient extract which is obtainable by (a) possibly the cells of Myxococcus fulvus NCIB 12064 is separated from the culture broth according to the invention and (b) the culture broth with one with water not unlimited miscible organic solvents or adsorber resins (e.g. Amberlite such as XAD 2, XAD 4, or ER 180) extracted.
Vorzugsweise verwendet man fUr die Stufe (b) Essigsäureethylester als organisches Lösungsmittel.Ethyl acetate is preferably used for stage (b) as an organic solvent.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Wirkstoffgemisch, das dadurch erhältlich ist, daß man (a) einen mit Essigsäureethylester erhaltenen Wirkstoffextrakt zwischen Methanol und Hexan verteilt, (b) die Methanolphase an vernetztem Polysaccharid (wie Sephadex LH-20) chromatographiert und (c) die wirkstoffhaltige Fraktion an Umkehrphasen-Kieselgel mit Methanol/Wasser/Essigsäure chromatographiert.According to a further embodiment, the invention relates to an active substance mixture, obtainable by (a) one obtained with ethyl acetate Active ingredient extract distributed between methanol and hexane, (b) the methanol phase cross-linked polysaccharide (such as Sephadex LH-20) and (c) the active ingredient-containing Fraction chromatographed on reverse phase silica gel with methanol / water / acetic acid.
Ausserdem betrifft die Erfindung zwei Wirkstoffe mit den im folgenden angegebenen Eigenschaften.In addition, the invention relates to two active ingredients with the following specified properties.
Gemäß weiteren Ausführungsformen betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung der Kulturbrühe, des Wirkstoffextraktes und des Wirkstoffgemischs mit den vorstehend angegebenen Maßnahmen.According to further embodiments, the invention relates to methods for the production of the culture broth, the active substance extract and the active substance mixture with the measures specified above.
Die beiden Wirkstoffe lassen sich dadurch gewinnen, daß man das erfindungsgemäße Wirkstoffgemisch durch präparative Hochleistungsflüssigehromatographie an Umkehrphasen-Kieselgel ab- und auftrennt und danach die einzelnen Wirkstoffe durch Abdampfen des flüssigen Mediums gewinnt. Vorzugsweise trennt man das flüssige Medium durch Gefriertrocknen ab.The two active ingredients can be obtained by using the inventive Mixture of active ingredients by preparative high-performance liquid chromatography on reversed-phase silica gel separates and then separates the individual active ingredients by evaporating the liquid Medium wins. The liquid medium is preferably separated by freeze-drying away.
Nachstehend wird die Erfindung durch experimentelle Daten anhand von 10 Figuren noch näher erläutert.In the following, the invention is illustrated by experimental data based on FIG 10 figures explained in more detail.
A. Produktionsbedingungen A 1. Produktionsstamm: Das Bakterium Myxococcus fulvus Stamm Mx f50 = NCIB 12064, Familie Myxococcaceae, Ordnung Myxobacterales, Klasse Flexibacteriae.A. Production conditions A 1. Production strain: The bacterium Myxococcus fulvus strain Mx f50 = NCIB 12064, family Myxococcaceae, order Myxobacterales, Class Flexibacteriae.
A 2. Herkunft des Produktionsstamms: Isoliert im August 1977 von Kaninchenmist, gesammelt in der Umgebung von Calpe, Provinz Alicante, Spanien.A 2. Origin of the production strain: isolated in August 1977 from rabbit dung, collected in the area of Calpe, Alicante province, Spain.
A 3. Beschreibung des Produktionsstamms: Die vegetativen Zellen sind schlanke Stäbchen, 3,5-6 /um lang und 0,8 /um dick, mit leicht verjüngten Enden. Auf geeigneten Nährböden, z.B. auf Wasseragar mit Ausstrichen des Bakteriums Escherichia coli, bildet der Organismus rotbraune tropfenförmige weichschleimige Fruchtkörper von rund 200 /um Durchmesser. In diesen befinden sich kugelige, im Phasenkontrast stark lichtbrechende Myxosporen von 1,2-1,5 /um Durchmesser. Das Bakterium be wegt sich gleitend fort. Die Kolonien oder Schwärme breiten sich deshalb allmählich über die Kulturplatte aus.A 3. Description of the production strain: The vegetative cells are slender rods, 3.5-6 µm long and 0.8 µm thick, with slightly tapered ends. On suitable culture media, e.g. on water agar with smears of the bacterium Escherichia coli, the organism forms red-brown, teardrop-shaped, soft slimy fruiting bodies of around 200 / µm in diameter. These are spherical, in phase contrast strongly refractive myxospores with a diameter of 1.2-1.5 μm. The bacterium moves sliding away. The colonies or swarms therefore gradually spread the culture plate.
Der Organismus wächst gut auf Peptonagar, z.B. cy-Agar (Casitone, Difco, 0,3 %; Hefeextrakt, Difco, 0,1 %; CaCl2.2H20 0,1 %; Agar 1,5 %; pH 7,2) oder auf Hefeagar, z.B. vy/2-Agar (Backhefe 0,5 %, bezogen auf Frischgewicht; CaCl2.2H20 0,1 %; Agar 1,5 %; pH 7,2). The organism grows well on peptone agar, e.g. cy-agar (Casitone, Difco, 0.3%; Yeast extract, Difco, 0.1%; CaCl2.2H20 0.1%; Agar 1.5%; pH 7.2) or on yeast agar, e.g. vy / 2 agar (baker's yeast 0.5%, based on fresh weight; CaCl2.2H20 0.1%; Agar 1.5%; pH 7.2).
In Flussigmedien wächst DSM 2549 in homogener Zellsuspension, sowohl in Schttelkolben (bei etwa 160 Upm), als auch in Bioreaktoren (bis 700 1 getestet). Als Kulturmedium ist z.B. geeignet f50 Pep l.m.: Pepton aus Casein, tryptisch verdaut, Merck (Darmstadt) 0,6 %; Hefeextrakt, Difco, 0,05 %; MgS04.7H20 0,2 %; CaCl2.2H20 0,04 X; pH 7,2. In liquid media, DSM 2549 grows in homogeneous cell suspension, both in shake flasks (at around 160 rpm), as well as in bioreactors (tested up to 700 1). A suitable culture medium is e.g. f50 Pep l.m .: Peptone from casein, tryptically digested, Merck (Darmstadt) 0.6%; Yeast extract, Difco, 0.05%; MgS04.7H20 0.2%; CaCl2.2H20 0.04 X; pH 7.2.
NCIB 12064 wächst streng aerob. Alle Kulturen wurden bei 30 0C gehalten. Die Generationszeit liegt um 10 Stunden (/u = 0,1 Stunden 1). In f50 Pep 1.m. erhält man pro Liter 4,5-5,6 g Zellmasse (Feuchtgewicht). NCIB 12064 ist auf die Verwertung von Proteinen und Peptonen eingestellt und besitzt Enzyme zum Abbau anderer Mikroorganismen (Bakterien und Hefen). NCIB 12064 grows strictly aerobically. All cultures were kept at 30 ° C. The generation time is around 10 hours (/ u = 0.1 hours 1). In f50 pep 1.m. receives man pro Liters 4.5-5.6 g cell mass (wet weight). NCIB 12064 is adjusted to the utilization of proteins and peptones and has enzymes for Breakdown of other microorganisms (bacteria and yeast).
NCIB 12064 läßt sich konservieren: 1. Durch Einfrieren vegetativer Zellen von Platten oder Flüssigkulturen in Pepton-Lösung bei -80 C (mehrere Jahre lebensfähig).NCIB 12064 can be preserved: 1. Vegetative freezing Cells from plates or liquid cultures in peptone solution at -80 C (several years viable).
2. Durch Trocknen von Fruchtkörpern auf Filterpapier (mehrere Jahre bei Zimmertemperatur lebensfähig). 3.2. By drying fruit bodies on filter paper (several years viable at room temperature). 3.
Durch Trocknen von Myxosporen in Milch, Lagerung unter Stickstoff bei Zimmertemperatur (mehrere Jahre lebensfähig).By drying myxospores in milk, storing under nitrogen at room temperature (viable for several years).
A 4. Leistungen: Die zellfreien Oberstände von Flüssigkulturen von NCIB 12064 zeigten antibiotische Aktivität gegen gram-positive Bakterien (z.B. Staphylococcus aureus). Die im folgenden gemachten Angaben gelten jeweils für ein gemisch aus zwei aktiven Substanzen, die als AB-Mx f50-A)und AB-Mx f50-B)bezeichnet werden. A 4. Achievements: The cell-free supernatants of liquid cultures from NCIB 12064 showed antibiotic activity against gram-positive bacteria (eg Staphylococcus aureus). The information given below applies to a mixture of two active substances, which are referred to as AB-Mx f50-A) and AB-Mx f50-B).
A 5. Zugänglichkeit des Stamms: Der Produktionsstamm ist unter Nr. NCIB 12064 hinterlegt.A 5. Accessibility of the trunk: The production trunk is listed under No. NCIB 12064 deposited.
A 6. Produktionsbedingungen für die Antibiotika: In Schüttelkolben
und Bioreaktoren kann antibiotische Aktivität, gemessen gegen Staphylococcus aureus,
schon während
- /o.D. (623 nm, 1 cm LichtwaR) aer logalinmiscnen wacnstumspnase aD einer voner;wa
U,d-U,/ nacugewiesen werden. Die maximal erreichbare o.D. beträgt etwa 3. Die höchsten
Aktivitäten werden während der späten logarithmischen Wachstumsphase erreicht.
Ein typischer Kulturverlauf unter Antibiotikabildung in Schüttelkolben ist im folgenden dargestellt: 11 Erlenmeyer Kolben Wrden mit je 200 ml Medium beschickt. Das Medium enthielt Pepton aus Casein, tryptisch verdaut, Merck (Darmstadt) 0,6 %; Hefeextrakt, Difco, 0,1 %; MgS04.7H20 0,2 t; CaCl2.2H20 0,04 X; pH 7,2. Die Kolben wurden aus einer Vorkultur bis zu einer o.D. von 0,175 beimpft. Bei einer o.D. von 0,355 war noch kein Hemmhof zu sehen. Die nächste Probe bei einer o.D. von 1,15 ergab im üblichen Plattendiffusionstest gegen StaphylococcusaureuseinenHemmhofdurchmesser von 9 mm. In den ersten 35 Stunden betrug die Generationszeit (gemessen als Zunahme der o.D.) etwa 10 .A typical culture course with formation of antibiotics in shake flasks is shown below: 11 Erlenmeyer flasks were filled with 200 ml of medium each. The medium contained peptone from casein, tryptically digested, Merck (Darmstadt) 0.6 %; Yeast extract, Difco, 0.1%; MgS04.7H20 0.2 t; CaCl2.2H20 0.04 X; pH 7.2. The pistons were from a preculture up to an o.D. inoculated from 0.175. With an undated from 0.355 there was still no inhibition zone to be seen. The next rehearsal at an O.D. of 1.15 gave a zone of inhibition in the usual plate diffusion test against Staphylococcus aureus of 9 mm. In the first 35 hours, the generation time was (measured as an increase the undated) about 10.
Stunden. Danach flacht die o.D.-Kurve allmählich ab. Zwischen der 47. und 52.Hours. After that, the O.D. curve gradually flattens out. Between the 47th and 52nd
Stunde änderte sich die maximale o.D. von 3 nicht mehr. Die Kultursuspension zeigte dann einen pH von 7,8. Der Hemmhofdurchmesser betrug 14 mm.Hour changed the maximum o.D. of 3 no more. The culture suspension then showed a pH of 7.8. The diameter of the zone of inhibition was 14 mm.
Eine typische Fermentation unter Antibiotikabildung verläuft wie folgt: Der Bioreaktor (Firma Giovanola, Manthey, Schweiz, mit Umwurfsystem) enthielt 320 1 f50 Pep l.m. und wurde mit 35 1 aus einem 70 1 Vorfermenter beimpft. Die Luftzufuhr wurde auf 1800 Nl/h, die Drehzahl auf 400 Upm eingestellt. Der P02 erreichte zu Beginn der Fermentation 90-95 % Sättigung. Im Verlauf der Fermentation sank der p02 kontinuierlich ab und erreichte nach 30-33 Stunden das Minimum von etwa 40 % Sauerstoffsättigung. Dieser Wert blieb etwa 3-4 Stunden lang konstant und stieg danach langsam wieder an. Die Fermentation wurde nach einer Gesamtdauer von etwa 40 Stunden während der Phase des ansteigenden p02 abgebrochen, indem die Zellen aus der Kulturbrühe abzentrifugiert wurden. Die End-o.D. betrug 2,5, der End-pH 7,7, der Antibiotikagehalt 10 mg/l Kulturüberstand.A typical fermentation with the formation of antibiotics proceeds as follows: The bioreactor (company Giovanola, Manthey, Switzerland, with overturning system) contained 320 1 f50 pep l.m. and was inoculated with 35 1 from a 70 1 pre-fermenter. The air supply was set to 1800 Nl / h, the speed to 400 rpm. The P02 reached to Start of fermentation 90-95% saturation. In the course of the fermentation the p02 decreased continuously and reached the minimum of about 40% after 30-33 hours Oxygen saturation. This value remained constant for about 3-4 hours and increased then slowly back on. The fermentation was after a total time of about 40 hours during the phase of increasing p02 canceled by the cells were centrifuged from the culture broth. The end o.D. was 2.5, the final pH 7.7, the antibiotic content 10 mg / l culture supernatant.
B. Biologische Charakterisierung der Antibiotika aus NCIB 12064 B 1. Wirkungsspektrum: Die reine Komponente A des Antibiotikums wurde zu 2 mg/ml in Methanol gelöst. Diese Lösung wurde stufenweise verdünnt, von jeder Verdünnung wurden 5 pl auf ein Filterblättchen übertragen und die Aktivität im Plattentest anhand des Hemmhofdurchmessers bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.B. Biological characterization of antibiotics from NCIB 12064 B 1. Spectrum of activity: The pure component A of the antibiotic was 2 mg / ml in Dissolved methanol. This solution was gradually diluted, each dilution being made Transfer 5 pl onto a filter disc and determine the activity in the plate test the diameter of the inhibition zone is determined. The results are shown in Table 1.
Zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) wurde das Antibiotikum zu 100 pg/ml einem geeigneten Flüssigmedium zugesetzt. Diese Ausgangslösung wurde dann in Zweierschritten verdünnt, die einzelnen Röhrchen wurden jeweils mit dem Testorganismus (etwa 105 Zellen/ml) beimpft und 18 Stunden bei 300lauf einem Schütteltisch inkubiert. Als Medien wurden verwendet: 1. für Bakterien: Pepton aus Casein, tryptisch verdaut, Merck (Darmstadt) 0,5 t; Proteose Pepton, Difco, 0,5 %; Fleischextrakt, Oxoid, 0,1 %; Agar 1,5 %; pH 7,0. The antibiotic was used to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) added at 100 pg / ml to a suitable liquid medium. This starting solution was then diluted in two steps, the individual tubes were each with the Test organism (about 105 cells / ml) inoculated and run for 18 hours on a shaking table incubated. The media used were: 1. for bacteria: peptone from casein, tryptic digested, Merck (Darmstadt) 0.5 t; Proteose Peptone, Difco, 0.5%; Meat extract, Oxoid, 0.1%; Agar 1.5%; pH 7.0.
2. für Hefen und Pilze: Mycophil Agar (Phytone Pepton, BBL, 1 %; Glucose 1 t; Agar 1,6 %). 2. for yeasts and fungi: Mycophil Agar (Phytone Pepton, BBL, 1%; Glucose 1 t; Agar 1.6%).
Für die Bestimmung der MHK wurden dieselben Medien ohne Agar benutzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Ferner wurde die MHK für die Komponente B des Antibiotikums in Flüssigkulturen für Staphylococcus aureus bestimmt. Sie betrug etwa 0,29 pg/ml. The same media without agar were used to determine the MIC. The results are shown in Table 1. Furthermore, the MIC for the component B of the antibiotic in liquid cultures intended for Staphylococcus aureus. You scam about 0.29 pg / ml.
B 2. Wirkungsweise des AntibiotikuDer Einfluß des Antibiotikums auf die DNS-, RNS- und Protein-Synthese wurde bei Staphylococcus aureus anhand des Einbaus von 14C-markierten Vorstufen dieser Makromoleküle studiert. Durchführung des Versuchs: Eine Obernachtkultur von Staphylococcus aureus wurde auf eine o.D. (623 weg nm,lem LlChtVon u,i veraunnt. mealum: repton aus xaseln, tryptiscn verdaut, Merck (Darmstadt) 0,3 %; Hefeextrakt, Difco, 0, OS %; MgS04.7H20 0,2 %; CaCl2.2H20 0,05 t; pH 7,0. Die verdünnten Kulturen wurden bei 370Cweiterinkubiert, bis sie eine o.D. von 0,4 erreicht hatten. Dann wurden sie erneut auf eine o.D. von 0,1 verdünnt, 10 Min. inkubiert und darauf die radioaktiven Vorstufen zugegeben (jeweils 0,1 pCi/ml von U-14C-Leucin bzw. U-14C-Uracil bzw. U-14C-Thymidin). Nach weiteren 6 Min. wurden jeweils 3 ug Antibiotikum, reine Komponente A/ml zugegeben. Die Kontrolle erhielt eine entsprechende Menge Methanol. Sofort nach Zugabe des Antibiotikums wurde eine erste Probe entnommen. In Abständen von einigen Minuten wurden weitere Proben entnommen.B 2. Mode of action of the antibioticuThe influence of the antibiotic on DNA, RNA and protein synthesis in Staphylococcus aureus was based on the incorporation of 14C-labeled precursors of these macromolecules were studied. Implementation of the Attempt: An overnight culture of Staphylococcus aureus was based on a n.d. (623 path nm, lem LlChtVon u, i anonymous. mealum: repton from xaseln, tryptiscn digested, Merck (Darmstadt) 0.3%; Yeast extract, Difco, 0, OS%; MgS04.7H20 0.2%; CaCl2.2H20 0.05 t; pH 7.0. The diluted cultures were further incubated at 37 ° C until an O.D. of 0.4 had achieved. Then they were again on a n.d. diluted by 0.1, 10 min. incubated and then added the radioactive precursors (0.1 pCi / ml each of U-14C-leucine or U-14C-uracil or U-14C-thymidine). After a further 6 min. Were 3 ug each antibiotic, pure component A / ml added. Got control a corresponding amount of methanol. Immediately after adding the antibiotic, a first sample taken. Further samples were taken at intervals of a few minutes.
Jede Probe bestand aus 0,5 ml. Sie wurde in 2 ml kalte 3 %ige Perchlorsäure gegeben und die entstandene Fällung auf Glasfaserfiltern (Whatman GF/B) gesammelt. Die Filter wurden dann viermal mit 5 ml Perchlorsäure und zweimal mit 4 ml 95 %igem Ethanol gewaschen, getrocknet und die Radioaktivität im Szintillationszähler bestimmt.Each sample consisted of 0.5 ml. It was dissolved in 2 ml of cold 3% perchloric acid given and the resulting precipitate collected on glass fiber filters (Whatman GF / B). The filters were then washed four times with 5 ml of perchloric acid and twice with 4 ml of 95% Washed ethanol, dried and determined the radioactivity in the scintillation counter.
Ergebnis: 1. Die DNS-Synthese (Einbau von 14C-Thymidin) wird nicht beeinflußt (Abb. 1).Result: 1. DNA synthesis (incorporation of 14C-thymidine) does not work influenced (Fig. 1).
2. Die Protein- und RNS-Synthese werden beide gehemmt. Nach 40 Min. erreicht der Einbau von Uracil (RNS-Synthese) in Anwesenheit des Antibiotikums nur etwa 10 % des Kontrollwertes (Abb. 2). Die Hemmung der Protein-Synthese (Einbau von 14C-Leucin) erfolgt langsamer, so daß nach 40 Min. prozentual erheblich mehr Radioaktivität eingebaut ist als bei der RNS-Synthese (Abb. 3).2. Protein and RNA synthesis are both inhibited. After 40 min. the incorporation of uracil (RNA synthesis) can only be achieved in the presence of the antibiotic about 10% of the control value (Fig. 2). The inhibition of protein synthesis (incorporation of 14C-leucine) takes place more slowly, so that after 40 minutes the percentage is considerably higher Radioactivity is incorporated than in the RNA synthesis (Fig. 3).
Daraus ist zu schließen, daß Myxopyroniniunmittelbar die die RNS-Synthese hemmt und die Protein-Synthese erst als Folge davon abnimmt. From this it can be concluded that myxopyronini is directly involved in the synthesis of RNA inhibits and protein synthesis only declines as a result.
Zur Bestätigung dieser Aussage wurde ein Hemmtest mit isolierter RNS-Polymerase (aus Escherichia coli; Boehringer, Mannheim) durchgeführt. Das Enzym wurde stark gehemmt. Bei einer Konzentration von 4 tug/ml des Antibiotikums war die halbmaximale Hemmung erreicht. Die Konzentrationsabhängigkeit der Hemmung ist in Abb. 4 dargestellt.An inhibition test with isolated RNA polymerase was used to confirm this statement (from Escherichia coli; Boehringer, Mannheim). The enzyme became strong inhibited. At a concentration of 4 tg / ml of the antibiotic it was half maximal Inhibition reached. The concentration dependence of the inhibition is shown in Fig. 4.
Tabelle 1. Das Hemmspektrum von Myxopyronin Testorganismus Durchmesser der Hemmzone im Minimale Hemm-Plattentest bei verschiedenen konzentration Antibiotikum-Konzentrationen pg/Blättchen Jug/ml Gram-positive Bakterien 1 2 5 10 Mycobacterium phlei 0 0 0 0 Corynebacterium mediolanum 0 9 13 17 Bacillus megaterium 0 10 13 17 6 Bacillus subtilis 0 0 8 9 50 Brevibacterium ammoniagenes 0 0 8 10 Staphylococcus aureus 11 16 19 22 1,0 Micrococcus luteus 0 0 8 10 12 Arthrobacter simplex 0 9 10 12 6 Gram-negative Bakterien Acinetobacter calcoaceticus 20 24 28 30 0,8 Agrobacterium tumefaciens 10 16 20 24 0,8 Serratia marcescens 0 0 0 0 Salmonella typhimuriun 0 0 0 0 >100 Pseudomonas fluorescens 0 0 0 0 Pseudomonas aeruginosa >100 Proteus mirabilis >100 Escherichia coli 0 0 0 0 >100 Mucor hiemalis 0 0 0 0 Hefen Candida albicans 0 0 0 0 Schizosaccharomyces pombe 0 0 0 0 Saccharomyces cerevisiae >100 EXTRAKT Der Wirkstoff-Extrakt wird erhalten durch Abtrennen der Zellen von Myxococcus fulvus NCIB 12064 von der Kulturbrühe und Extraktion der letzteren mit einem organischen Lösungsmittel z.B. Essigester oder mit Hilfe von Adsorberharzen (z.B. Amberlite wie XAD2, XAD4 oder ER180).Table 1. The spectrum of inhibitions of myxopyronin Test organism Diameter of the inhibition zone in the minimal inhibition plate test at different concentrations of antibiotic concentrations pg / leaflet Jug / ml Gram-positive bacteria 1 2 5 10 Mycobacterium phlei 0 0 0 0 Corynebacterium mediolanum 0 9 13 17 Bacillus megaterium 0 10 13 17 6 Bacillus subtilis 0 0 8 9 50 Brevibacterium ammoniagenes 0 0 8 10 Staphylococcus aureus 11 16 19 22 1.0 Micrococcus luteus 0 0 8 10 12 Arthrobacter simplex 0 9 10 12 6 Gram-negative bacteria Acinetobacter calcoaceticus 20 24 28 30 0.8 Agrobacterium tumefaciens 10 16 20 24 0.8 Serratia marcescens 0 0 0 0 Salmonella typhimuriun 0 0 0 0> 100 Pseudomonas fluorescens 0 0 0 0 Pseudomonas aeruginosa> 100 Proteus mirabilis> 100 Escherichia coli 0 0 0 0> 100 Mucor hiemalis 0 0 0 0 Yeasts Candida albicans 0 0 0 0 Schizosaccharomyces pombe 0 0 0 0 Saccharomyces cerevisiae> 100 EXTRACT The active ingredient extract is obtained by separating the cells of Myxococcus fulvus NCIB 12064 from the culture broth and extracting the let with an organic solvent, e.g. ethyl acetate, or with the help of adsorber resins (e.g. Amberlite such as XAD2, XAD4 or ER180).
ISOLIERUNG DES WIRKSTOFFGEMISCHES Das Wirkstoffgemisch wird aus dem Extrakt der Kulturbrühe isoliert durch: a. Verteilung zwischen Methanol und Hexan b. Chromatographie der Methanol phase an Sephadex LH-20 c. Chromatographie der das Wirkstoffgemisch enthaltenden Fraktion an Reversed-Phase-Kieselgel mit Methanol/Wasser/Essigsäure. ISOLATION OF THE ACTIVE INGREDIENT MIXTURE The active ingredient mixture is isolated from the extract of the culture broth by: a. Distribution between methanol and hexane b. Chromatography of the methanol phase on Sephadex LH-20 c. Chromatography of the fraction containing the active substance mixture on reversed-phase silica gel with methanol / water / acetic acid.
Auf diese Weise erhält man das zu etwa 90% reine Wirkstoffgemisch, dasszwei Komponenten A und B enthält (HPLC-Diagramm s. Abb. X). Das Mengenverhältnis der beiden Komponenten variiert von Ansatz zu Ansatz.In this way, the approximately 90% pure active ingredient mixture is obtained, that two Contains components A and B (HPLC diagram, see Fig. X). The proportion of the two components varies from batch to batch.
Auf Kieselgeldünnschichtplatten können die beiden Wirkstoffe durch Anfärbung mit Joddampf oder Besprühen mit Anisaldehyd-Sprühreagenz (Gelb- bis Blaugraufärbung je nach Konzentration, Temperatur und Einwirkungsdauer) sichtbar gemacht werden.The two active substances can penetrate on thin-layer silica gel plates Staining with iodine vapor or spraying with anisaldehyde spray reagent (yellow to blue-gray color depending on the concentration, temperature and duration of exposure).
Durch präparative HPLC an Reversed-Phase-Kieselgel können die beiden Wirkstoffkomponenten getrennt und völlig rein erhalten werden.By preparative HPLC on reversed-phase silica gel, the two Active ingredient components are obtained separately and completely pure.
CHARAKTERISIERUNG DES WIRKSTOFFES A 1. Chromatographisches Verhalten auf Kieselgelplatten: Laufmittelsystem Rf-Wert CH2Cl2/MeOH 95:5 0.8 EE 0.9 Totuol/Aceton 80:20 0.4 CH2C12/iPrOH 98:2 0.4 Hex/Ac/AcOH 80:20:4 0.2 2. Retentionszeit in der HPLC auf Kieselgel RP-18 (s. Abb. @ : 3.86 min 3. Massenspektru: m/e 417, 374, 342, 255, 233; 219, 175, 149 Elementarzusamzensetzung (Hochauflösung): r U yn C23H31NO6 4. UV-Spektrum: Lösungsmittel Methanol,/# max = 295 nm ( # = 20 624), 213 nm ( E = 34 772) (s. b 5. IR-Spektrum: (s.CHARACTERIZATION OF THE ACTIVE SUBSTANCE A 1. Chromatographic behavior on silica gel plates: solvent system Rf value CH2Cl2 / MeOH 95: 5 0.8 EE 0.9 Totuene / Acetone 80:20 0.4 CH2C12 / iPrOH 98: 2 0.4 Hex / Ac / AcOH 80: 20: 4 0.2 2. Retention time in HPLC on silica gel RP-18 (see Fig. @: 3.86 min 3. mass spectrum: m / e 417, 374, 342, 255, 233; 219, 175, 149 elementary composition (high resolution): r U yn C23H31NO6 4th UV spectrum: solvent methanol, / # max = 295 nm (# = 20 624), 213 nm (E = 34 772) (see b 5. IR spectrum: (see p.
6. lH-NMR-Spektrum: (s.¼)bb.6. 1 H-NMR spectrum: (s.¼) bb.
7. 13C-NMR-Spektrum: (#/ppm): 11-8(q), 14.0(q), 17.2(q), 18.4(q),
22.0(t), 28.5(t), 35.8(t), 39.0(d), 43.8(t), 52.6(q), 102,4(s), 102.7(d), 110.8(d),
122.3(d), 125.9(d), 135.4(s), 137.8(d), 150.5(s), 156.8(s), 165.3(s), 172.5(s),
176.5(s), 199.6(s) 8. Drehwert: [0C]D = -65.8 Grad, Lösungsmittel Methanol CHARAKTERISIERUNG
DES WIRKSTOFFES B: 1. Chromatographisches Verhalten auf Kieselgelplatten: s. Wirkstoff
A 2. Retentionszeit in der HPLC auf RP-18
8. Drehwert: = = -74.9 Grad, Lösungsmittel Methanol BEISPIEL 1 Die
Aufarbeitung wird am Beispiel eines 320 1 Fermenters erläutert: Die Zellen wurden
vom Nährmedium abfiltriert und dieses im Geaenstrom mit Essigester extrahiert. Der
Extrakt wurde
90%iges Wirkstoffgemisch erhalten wurde, das etwa gleiche Mengen der Komponenten A und B enthielt. Zur chemischen und spektroskopischen Charakterisierung und zur Bestimmung der biologischen Daten wurde das Gemisch durch präparative HPLC an 16 mm-RP-18-Säulen mit MeOH/H20/Essigsäure 80:20:4 als Eluens aufgetrennt.90% active ingredient mixture was obtained, the approximately equal amounts of the Components A and B contained. For chemical and spectroscopic characterization and to determine the biological data, the mixture was analyzed by preparative HPLC on 16 mm RP-18 columns with MeOH / H20 / acetic acid 80: 20: 4 as eluent.
BEISPIEL 2 Der Oberstand eines 320 1 Fermenter wurde durch eine Chromatographiesäule mit 8 1 Amberlite XAD 4 gepumpt, wobei das Antibiotikum quantitativ gebunden wurde.EXAMPLE 2 The supernatant of a 320 liter fermenter was passed through a chromatography column pumped with 8 1 Amberlite XAD 4, the antibiotic being bound quantitatively.
Die Elution erfolgte mit Methanol/Wasser Gemischen (von 1:1 bis reinem Methanol).The elution took place with methanol / water mixtures (from 1: 1 to pure Methanol).
Antibiotika-haltige Fraktionen wurden im Vakuum eingedampft und das erhaltene Rohgemisch (6 g), wie bei Beispiel 1 beschrieben, durch Chromatographie an LH-20 und RP-8 gereinigt.Fractions containing antibiotics were evaporated in vacuo and the obtained crude mixture (6 g), as described in Example 1, by chromatography purified on LH-20 and RP-8.
EE = Essigsäureethylester iPr OH = i-Propanol Hex = Hexan Ac = Aceton AcOH = Essigsäure HPLC = HochleistungsflUssigchromatographie uCi = /u Curie cpm = Counts per minute (d.h.EE = ethyl acetate iPr OH = i-propanol Hex = hexane Ac = acetone AcOH = acetic acid HPLC = high performance liquid chromatography uCi = / u Curie cpm = Counts per minute (i.e.
Zählerereignisse pro min)
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19853518211 DE3518211A1 (en) | 1985-05-21 | 1985-05-21 | Culture broth of Myxococcus fulvus NCIB 12064, active substance extract, active substance mixture, active substances and preparation processes |
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DE19853518211 DE3518211A1 (en) | 1985-05-21 | 1985-05-21 | Culture broth of Myxococcus fulvus NCIB 12064, active substance extract, active substance mixture, active substances and preparation processes |
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