DE3508906A1

DE3508906A1 - Method for the stabilisation of xanthine oxidase by immobilisation on hydrophobic carrier resins

Info

Publication number: DE3508906A1
Application number: DE19853508906
Authority: DE
Inventors: Peter Dr. Egerer; Günter Prof. Dr. 5600 Wuppertal Schmidt-Kastner
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1985-03-13
Filing date: 1985-03-13
Publication date: 1986-09-18

Abstract

The invention relates to a method for the immobilisation of xanthine oxidase on carrier resins with hydrophobic properties and to the use of these products as biocatalysts for preparative or analytical purposes (biosensors). The products obtained according to the invention have a considerably improved stability, in particular under continuous catalysis conditions.

Description

Verfahren zur Stabilisierung von Xanthin Oxidase durchProcess for the stabilization of xanthine oxidase by

Immobilisierung an hydroPhoben Träaerharzen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Xanthin Oxidase an Trägerharzen mit hydrophoben Eigenschaften und die Verwendung dieser Präparate als Biokatalysatoren zu präparativen oder zu analytischen Zwecken (Biosensoren). Die erfindungsgemäß erhaltenen Präparate besitzen eine wesentlich verbesserte Stabilität insbesondere unter Bedingungen der kontinuierlichen Katalyse.Immobilization on hydrophobic carrier resins The invention relates to a method for the immobilization of xanthine oxidase on carrier resins with hydrophobic Properties and the use of these preparations as biocatalysts to be preparative or for analytical purposes (biosensors). The preparations obtained according to the invention have a significantly improved stability especially under the conditions of continuous catalysis.

Die Bedeutung von Enzymen in der Analytik, zur präparativen Synthese von Grammengen wertvoller, sonst schwer zugänglicher Chemikalien, und im industriellen Maßstab zur Herstellung von Zwischen- oder Endprodukten, wie z.B. 6-Aminopenicillansäure, ist in den letzten Jahren immer größer geworden. Insbesondere für präparative Techniken werden die Enzyme bevorzugt in immobilisierter Form eingesetzt. Eine industrielle Anwendung aber setzt eine genügende Langzeit-Stabilität des Biokatalysators voraus. Während bei immobilisierten Hydrolasen oder Isomerasen ohne weiteres Betriebszeiten von mehreren Monaten bis zu zwei Jahren zu erzielen sind, scheitert die industrielle Anwendung von Oxidoreduktasen häufig an mangelnder Stabilität. Insbesondere Oxidoreduktasen mit komplexen, proteingebundenen Cofaktorsystemen, beispielsweise Hydrogenasen, Dehydrogenasen oder Oxidasen werden unter Bedingungen des kontinuierlichen Umsatzes rasch inaktiviert.The importance of enzymes in analytics, for preparative synthesis of grams of valuable, otherwise difficult to access chemicals, and in industrial applications Scale for the production of intermediate or end products, such as 6-aminopenicillanic acid, has got bigger and bigger in the last few years. Especially for preparative techniques the enzymes are preferably used in immobilized form. An industrial one However, application requires sufficient long-term stability of the biocatalyst. While in the case of immobilized hydrolases or isomerases, there are no further operating times from several months to two years can be achieved, the industrial fails Use of oxidoreductases frequently lack of stability. In particular Oxidoreductases with complex, protein-bound cofactor systems, for example Hydrogenases, dehydrogenases or oxidases are produced under conditions of continuous Turnover quickly inactivated.

Die Xanthin Oxidase ist ein konjugiertes Molybdän-Eisen-Schwefel-Flavoprotein, das die Oxidation von Xanthin zu Harnsäure mit Hilfe von molekularem Sauerstoff oder künstlichen Elektronenakzeptoren wie z.B. Ferricyanid katalysiert. Dieses Enzym weist eine geringe Substratspezifität auf. So wird die Oxidation verschiedenster Azaheterozyklen oder auch die Oxidation von Aldehyden zu Carbonsäuren katalysiert - vgl. van der Plas et al. (1984) in: Innovations in Biotechnology, eds. Houwink, E.H., van der Meer, R.R., Elsevier Science Publishers B.V. Amsterdam, S. 93-101, oder Pelsy, G., Klibanov, A.M. (1983) Biochem. Biophys. Atta 742, 352-357; geben darüber hinaus noch einen Uberblick über Immobilisierungen in hydrophilen Trägern.Xanthine oxidase is a conjugated molybdenum-iron-sulfur flavoprotein, the oxidation of xanthine to uric acid with the help of molecular oxygen or artificial electron acceptors such as ferricyanide. This enzyme has a low substrate specificity. So the oxidation becomes the most diverse Azaheterocycles or the oxidation of aldehydes to carboxylic acids catalyzes - see van der Plas et al. (1984) in: Innovations in Biotechnology, eds. Houwink, E.H., van der Meer, R.R., Elsevier Science Publishers B.V. Amsterdam, pp. 93-101, or Pelsy, G., Klibanov, A.M. (1983) Biochem. Biophys. Atta 742, 352-357; give in addition, an overview of immobilizations in hydrophilic carriers.

Die Xanthin Oxidase zeichnet sich vor allem durch ihre hohe Regiospezifität aus und kann daher für den präparativen Chemiker ein wertvoller Biokatalysator sein.The main feature of xanthine oxidase is its high level of regional specificity and can therefore be a valuable biocatalyst for the preparative chemist.

Die Halbwertszeit der Aktivität immobilisierter Präparate von Xanthin Oxidase aus Milch liegt unter Bedingungen der kontinuierlichen Katalyse bei etwa maximal 24 h. Durch Zusatz von Superoxid Dismutase und Katalase zum Schutz vor Inaktivierung durch H202 oder durch Superoxid-Radikalanion gelingt es, die Halbwertszeit etwa zu verdoppeln. In gefriergetrockneten Buttermilchpräparaten, immobilisiert in Gelatine, besitzt die Xanthin Oxidase eine Halbwertzeit von etwa 5 Tagen.The half-life of the activity of immobilized preparations of xanthine Oxidase from milk is around under conditions of continuous catalysis a maximum of 24 hours. By adding superoxide dismutase and catalase to protect against inactivation by H202 or by Superoxide radical anion manages the half-life about double. In freeze-dried buttermilk preparations, immobilized in gelatin, the xanthine oxidase has a half-life of about 5 days.

Für industrielle Zwecke sind jedoch diese Standzeiten unzureichend und kostenungünstig.However, these service lives are insufficient for industrial purposes and inexpensive.

Desweiteren kann Xanthin Oxidase als analytisches Hilfsmittel eingesetzt wrden. Beispielsweise lassen sich die Hypoxanthin- und Inosin-Konzentrationen in Fisch oder Fischprodukten mittels eines Enzymsensorsystems bestimmen. Dabei werden Xanthin Oxidase und Nukleosid Phosphorylase in einer Membran coimmobilisiert (Watanabe et al (1984) Appl. Microbiol. Biotechnol. 19, 18-22; Karube et al. (1984) J.Agric. Food Chem. 32, 314-319).Xanthine oxidase can also be used as an analytical aid would. For example, the hypoxanthine and inosine concentrations in Identify fish or fish products using an enzyme sensor system. Be there Xanthine oxidase and nucleoside phosphorylase co-immobilized in a membrane (Watanabe et al (1984) Appl. Microbiol. Biotechnol. 19, 18-22; Karube et al. (1984) J. Agric. Food Chem. 32, 314-319).

Es wurde nun ein Verfahren zur Stabilisierung von Xanthin Oxidase gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Xanthin Oxidase an eine hydrophobe Trägermatrix immobilisiert wird.There has now been found a method for stabilizing xanthine oxidase found, which is characterized in that the xanthine oxidase to a hydrophobic Carrier matrix is immobilized.

Bevorzugt sind hydrophobe Trägermaterialien auf Potystyrolbasis. Für die Herstellung von Biosensoren sind Membranen und Folien besonders geeignet, während für Biokatalysatoren Träger in Perlform bevorzugt werden. Vorteilhaft ist die Verwendung von porösen Trägern, da bei solchen eine größere Oberfläche für die Immobilisierung der Xanthin Oxidase zur Verfügung steht. Besonders geeignet sind handelsübliche oder chemisch modifizierte Ionenaustauscherharze.Hydrophobic carrier materials based on potystyrene are preferred. For membranes and foils are particularly suitable during the manufacture of biosensors for biocatalysts, carriers in bead form are preferred. Use is advantageous of porous supports, since such a larger surface for the immobilization the xanthine oxidase is available. Commercially available ones are particularly suitable or chemically modified ion exchange resins.

Beispielsweise eignen sich die Produktgruppen Diaione, Amberlite1, Dowex, Ionac ReliteB, LewatitB, Duolitee, ZerolitB, J Imago.For example, the product groups Diaione, Amberlite1, Dowex, Ionac ReliteB, LewatitB, Duolitee, ZerolitB, J Imago.

Die Xanthin Oxidase kann zuerst ionisch oder adsorptiv gebunden werden und nachträglich mit einem üblichen Vernetzungsmittel wie z.B. Glutaraldehyd fixiert werden.The xanthine oxidase can first be bound ionically or adsorptively and subsequently fixed with a common crosslinking agent such as glutaraldehyde will.

Besonders vorteilhaft ist die kovalente Bindung der Xanthin Oxidase an modifizierte Polystyrolharze, die freie Aminogruppen tragen. Die freien Aminogruppen werden zuerst mit Glutaraldehyd analog dem aus der Literatur bekannten Verfahren bei Aminoalkyl-Glas (z.B.The covalent bond of the xanthine oxidase is particularly advantageous to modified polystyrene resins that carry free amino groups. The free amino groups are first with glutaraldehyde analogous to the method known from the literature in the case of aminoalkyl glass (e.g.

Aminoalkyl-CPG1) modifiziert und der so erhaltene Glutaraldehyd-modifizierte Träger mit der Enzymlösung inkubiert (vgl. Beispiele).Aminoalkyl-CPG1) modified and the glutaraldehyde-modified one obtained in this way Carrier incubated with the enzyme solution (see examples).

Die so erhaltenen immobilisierten Xanthin Oxidase Präparate wurden zur Oxidation von 3-Nitrobenzaldehyd zu 3-Nitrobenzoesäure eingesetzt. Sie weisen wesentlich längere Halbwertszeiten (t112) unter katalytischen Bedingungen auf als Xanthin Oxidase Präparate, die durch vergleichbare Immobilisierungsverfahren an Glutaraldehyd-aktivierte hydrophile Aminoalkyl-Träger, wie z.B.The immobilized xanthine oxidase preparations thus obtained were used for the oxidation of 3-nitrobenzaldehyde to 3-nitrobenzoic acid. You wise significantly longer half-lives (t112) under catalytic conditions than Xanthine oxidase preparations obtained by comparable immobilization processes Glutaraldehyde activated hydrophilic aminoalkyl carriers, e.g.

CPGl, Silikate, wie z.B. Promaxon hergestellt werden (siehe Tabelle 1).CPGl, silicates such as Promaxon can be produced (see table 1).

Die Halbwertszeiten für Lewatitl-gebundene Xanthin Oxidase lagen bei etwa 10 Tagen im Vergleich zu wenigen Stunden für CPG- oder PromaxonB-gebundene Xanthin Oxidase.The half-lives for Lewatitl-bound xanthine oxidase were included about 10 days compared to a few hours for CPG- or PromaxonB-bound Xanthine oxidase.

Vergleichbar zu in Gelatine immobilisierten gefriergetrocknetem Milchpulver (t1l2 Xanthin Oxidase etwa 120 h) wurde an hydrophoben Trägerharzen eine Halbwertzeit von > 10 d beobachtet. Somit zeigen die erfindungsgemäBen Präparate eine wesentlich bessere Stabilität als das freie Enzym bzw. in hydrophilen Trägern immobilisierte Präparate.Comparable to freeze-dried milk powder immobilized in gelatine (t1l2 xanthine oxidase about 120 h) has a half-life on hydrophobic carrier resins observed from> 10 d. Thus, the preparations according to the invention show an essential better stability than the free enzyme or immobilized in hydrophilic carriers Preparations.

Die erfindungsgemäß an hydrophoben Trägerharzen immobilisierte Xanthin Oxidase kann als Biokatalysator zu Biotransformationen oder als Enzymsensor für analytische Zwecke wiederholt eingesetzt werden.The xanthine immobilized according to the invention on hydrophobic carrier resins Oxidase can be used as a biocatalyst for biotransformations or as an enzyme sensor for analytical purposes are used repeatedly.

Die in den nachstehenden Beispielen verwendete Xanthin Oxidase aus Kuhmilch ist handelsüblich oder wurde selbst isoliert. Die Isolierung kann nach verschiedenen bekannten Methoden durchgeführt werden: a) durch proteolytische, lipolytische Enzyme und organische Reagentien (vgl. Avis, P.G. et al.The xanthine oxidase used in the examples below Cow's milk is commercially available or has been isolated itself. The isolation can after various known methods can be carried out: a) by proteolytic, lipolytic Enzymes and organic reagents (cf. Avis, P.G. et al.

(1955) J. Chem. Soc. 1100; Massey, V. et al (1972) Biochem. J. 127, 10; Gilbert, D.A., Bergel, F. (1955) J. Chem. Soc. 1100; Massey, V. et al (1972) Biochem. J. 127, 10; Gilbert, D.A., Bergel, F.

(1964) Biochem. J. 90, 350), b) nicht-proteolytisch durch milde chemische Reagentien (vgl. Zikakis, J.P., Silver, M.R. (1984) J. Agric. Food Chem. 32, 340-343). (1964) Biochem. J. 90, 350), b) non-proteolytic by mild chemical Reagents (see Zikakis, J.P., Silver, M.R. (1984) J. Agric. Food Chem. 32, 340-343).

Im Handel ist die Xanthin Oxidase in Form einer Suspension in Ammoniumsulfat z.B. von Boehringer Mannheim (FRG) oder Sigma Chemical Co. (USA) erhältlich.Xanthine oxidase is commercially available in the form of a suspension in ammonium sulfate e.g. available from Boehringer Mannheim (FRG) or Sigma Chemical Co. (USA).

Handelsübliche Präparate wurden vor der Verwendung zuerst zentrifugiert, das Xanthin Oxidase Präzipitat in 0.1 M Kaliumphosphat pH 7,4 aufgenommen und bei +4vC gegen den gleichen Puffer dialysiert. Die so erhaltenen Xanthin Oxidase Lösungen wurden direkt für die Immobilisierungen verwendet.Commercial preparations were first centrifuged before use, the xanthine oxidase precipitate was taken up in 0.1 M potassium phosphate pH 7.4 and at + 4vC dialyzed against the same buffer. The xanthine oxidase solutions obtained in this way were used directly for the immobilizations.

An hydrophile Trägermatrizen gebundene Xanthin Oxidase ist unter Katalysebedingungen wesentlich instabiler als an hydrophobe Träger immobilisiertes Enzym, wie die folgenden Beispiele deutlich zeigen.Xanthine oxidase bound to hydrophilic support matrices is under catalytic conditions much more unstable than enzyme immobilized on a hydrophobic carrier, such as the following Show examples clearly.

Die Herstellungsverfahren der immobilisierten Präparate nach 1 a-c) sind untereinander vergleichbar und wurden ausgearbeitet in Anlehnung an literaturbekannte Verfahren für poröses Glas.The manufacturing process of the immobilized preparations according to 1 a-c) are comparable with each other and have been worked out on the basis of what is known from the literature Process for porous glass.

Beispiel 1 Immobilisierung von Xanthin Oxidase an Lewatit1 MP64ZII, an Controlled Pore Klass# und an Promaxon#.Example 1 Immobilization of Xanthine Oxidase on Lewatit1 MP64ZII, to Controlled Pore Klass # and to Promaxon #.

la) Immobilisierung an Lewatit# MP64ZII 2,5 a Lewatit MP64ZII wurden in 25 ml 0.1 M Tris.HCl, pH 8,0 aufgenommen, nach Zugabe von 5 ml 25 % Glutaraldehyd (Fa. Merck) am Wasserstrahlvakuum für 10 min. entgast und 24 h bei +4"C auf einem Schüttelinkubator inkubiert.la) Immobilization on Lewatit # MP64ZII 2.5 a Lewatit MP64ZII were taken up in 25 ml of 0.1 M Tris.HCl, pH 8.0, after adding 5 ml of 25% glutaraldehyde (Merck) degassed in a water jet vacuum for 10 min. And 24 h at +4 "C on a Shaking incubator incubated.

Danach wurden die Harzperlen abgesaugt und mit insgesamt 1 1 H20 portionsweise gewaschen. Then the resin beads were sucked off and with a total of 1 1 H20 washed in portions.

50 mg der dialysierten Xanthin Oxidase-Lösung (1 U/mg, Fa. Boehringer Mannheim) in 60 ml 0.1 M Tris.HCl, pH 8,0, wurden mit 2,5 g Glutaraldehydmodifiziertem Lewatit MP64ZII nach 10-minUtigem Entgasen am Wasserstrahlvakuum für 72 h bei +4"C auf einem Schüttelinkubator inkubiert. Der Uberstand enthielt noch 23 ma Restprotein. Die Harzperlen mit der gebundenen Xanthin Oxidase wurden portionsweise mit 1 1 kaltem 0.1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4, gewaschen und das immobilisierte Präparat im gleichen Puffer bei +40C gelagert. 50 mg of the dialyzed xanthine oxidase solution (1 U / mg, Boehringer Mannheim) in 60 ml of 0.1 M Tris.HCl, pH 8.0, were modified with 2.5 g of glutaraldehyde Lewatit MP64ZII after 10 minutes of degassing in a water jet vacuum for 72 h at +4 "C incubated on a shaking incubator. The supernatant still contained 23 ma residual protein. The resin beads with the bound xanthine oxidase were in portions with 1 l of cold 0.1 M potassium phosphate buffer, pH 7.4, washed and the immobilized preparation in same buffer stored at + 40C.

lb) Immobilisierung an Promaxonb Gemäß der Herstellervorschrift für Aminopropyl-Glas wurde zunächst Aminopropyl-Promaxon hergestellt, Hierzu wurden 8,7 g Calcium-freies Promaxone mit 4 ml gamma-Aminopropyltrlethoxysilan in 140 ml Toluol für 2 h bei Raumtemperatur yeschüttelt, danach das Toluol abgesaugt, der Rückstand portionsweise mit 1 1 Aceton gewaschen und im Trockenschrank bei 100"C getrocknet.lb) Immobilization on Promaxonb According to the manufacturer's instructions for Aminopropyl glass was first produced aminopropyl promaxon, for this purpose were 8.7 g calcium-free Promaxone with 4 ml gamma-aminopropyltrlethoxysilane in 140 ml The toluene is shaken for 2 h at room temperature, then the toluene is suctioned off, the The residue is washed in portions with 1 l of acetone and dried in a drying cabinet at 100.degree dried.

7,9 g des so hergestellten Aminopropyl-Promaxon werden in 100 ml 0.1 M Natriumphosphat, pH 7,0, mit 20 ml 25 % Glutaraldehyd (Fa. Merck) nach kurzem Entgasen an der Wasserstrahlpumpe für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert, nach Absaugen des Uberstandes mit 1 1 H20 portionsweise gewaschen und an der Luft getrocknet. 7.9 g of the aminopropyl promaxone thus prepared are in 100 ml 0.1 M sodium phosphate, pH 7.0, with 20 ml of 25% glutaraldehyde (Merck) after a short time Degassing at the water jet pump incubated for 2 h at room temperature, after aspiration the supernatant was washed in portions with 1 l of H 2 O and dried in the air.

1 g des so hergestellten Glutaraldehyld-aktivierten Aminopropyl-PromaxonF wurden mit 50 mg Xanthin Oxidase (1 U/mg, Fa. Boehringer Mannheim) in 100 ml 0,05 M Tris.HCl, pH 8,0 nach Entgasen an der Wasserstrahlpumpe für 18 h bei 4"C inkubiert. Nach dem Absaugen des proteinfreien Uberstandes wurde das Präparat portionsweise mit 1 1 0.1 M Kaliumphosphat pH 7,4 gewaschen und im gleichen Puffer als Suspension bei 4"C gelagert. 1 g of the glutaraldehyde-activated aminopropyl-promaxonF thus prepared were with 50 mg xanthine oxidase (1 U / mg, Boehringer Mannheim) in 100 ml 0.05 M Tris.HCl, pH 8.0, incubated at 4 ° C. for 18 h after degassing on the water jet pump. After the protein-free supernatant had been suctioned off, the preparation was added in portions Washed with 1 1 0.1 M potassium phosphate pH 7.4 and in the same buffer as a suspension stored at 4 "C.

lc) Immobilisierung an Controlled Pore Glases1 48,14 g CPG-Glass, 530 A (Fa. Serva, Heidelberg 120-200 mesh) wurden in 700 ml 5 % HNO3 für 2 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurden die Glasperlen abgesaugt und mit 8 1 H20 portionsweise gewaschen, bis kein HN03 mehr nachweisbar war, und uber Nacht bei 100°C getrocknet.lc) Immobilization on Controlled Pore Glasses1 48.14 g CPG-Glass, 530 A (from Serva, Heidelberg 120-200 mesh) were added to 700 ml of 5% HNO3 for 2 h Shaken room temperature. The glass beads were then suctioned off and treated with 8 1 H20 Washed in portions until no more HN03 was detectable, and overnight at 100 ° C dried.

46,5 g so gereinigtes CPG-Glas wurden in 700 ml Toluol p.A. und 22 ml gamma-Aminopropyltriethoxysilan für 2 h bei Raumtemperatur geschüttelt, anschließend abgesaugt, mit 5 1 Aceton portionsweise gewaschen und uber Nacht bei 100"C getrocknet. 46.5 g of CPG glass cleaned in this way were dissolved in 700 ml of toluene p.A. and 22 ml of gamma-aminopropyltriethoxysilane shaken for 2 h at room temperature, then suctioned off, washed with 5 l acetone in portions and dried at 100 ° C. overnight.

43,8 g des so erhaltenen Aminopropyl-Glases wurden in 100 ml 0.1 M Natriumphosphat, pH 7,0, mit 20 ml 25 % Glutaraldehd-Lösung kurz an der Wasserstrahlpumpe entgast, dann 2 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach Absaugen des Uberstandes wurden die Glasperlen portionsweise mit insgesamt 8 1 H20 gewaschen und an der Luft getrocknet. 43.8 g of the aminopropyl glass thus obtained were 0.1 in 100 ml M sodium phosphate, pH 7.0, with 20 ml 25% glutaraldehyde solution briefly on the water pump degassed, then shaken at room temperature for 2 h. After suctioning off the supernatant the glass beads were washed in portions with a total of 8 1 H 2 O and in the air dried.

1 g des so hergestellten Glutaraldehyd-aktivierten Aminopropyl-Glases wurden mit 50 mg Xanthin Oxidase (1 U/mg, Fa. Boehringer, Mannheim) in 100 ml 0.05 M Tris.HCl, pH 8,0, nach Entgasen an der Wasserstrahlpumpe für 18 h bei 4"C inkubiert. Nach dem Absaugen des proteinfreien Uberstandes wurden die Glasperlen portionsweise mit 2 1 0.1 M Tris.HCl, pH 7,4, gewaschen und im gleichen Puffer bei 4"C gelagert. 1 g of the glutaraldehyde-activated aminopropyl glass produced in this way were with 50 mg xanthine oxidase (1 U / mg, Boehringer, Mannheim) in 100 ml 0.05 M Tris.HCl, pH 8.0, incubated at 4 ° C. for 18 h after degassing with the water jet pump. After the protein-free supernatant had been filtered off with suction, the glass beads were added in portions Washed with 2 1 0.1 M Tris.HCl, pH 7.4, and stored at 4 ° C. in the same buffer.

ld) Stabilitätsvergleich der Präparate la-lc unter Katalysebedingungen - Oxidation von 3-Nitrobenzaldehyd zu 3-Nitrobenzoesäure mit 02 als Elektronenakzeptor.ld) Stability comparison of the preparations la-lc under catalytic conditions - Oxidation of 3-nitrobenzaldehyde to 3-nitrobenzoic acid with 02 as electron acceptor.

1 g des Präparats la (etwa 9,5 mg Xanthin Oxidase an Lewatitb gebunden), 200 mg des Präparats lb (10 mg Xanthin Oxidase an Promaxonb gebunden), 200 mg des Präparats 1c (10 mg Xanthin Oxidase an CPG gebunden) wurden Jeweils in verschiedenen Batch-Ansätzen unter Schütteln bei 25"C wie folgt inkubiert: 10 ml 0.1 M Tris.HCl, pH 7,4, lmM 3-Nitrobenzaldehyd, 10 % Methanol.1 g of preparation la (about 9.5 mg xanthine oxidase bound to Lewatitb), 200 mg of preparation lb (10 mg xanthine oxidase bound to Promaxonb), 200 mg des Preparation 1c (10 mg xanthine oxidase bound to CPG) were each in different Batch batches incubated with shaking at 25 ° C as follows: 10 ml 0.1 M Tris.HCl, pH 7.4, 1mM 3-nitrobenzaldehyde, 10% methanol.

Nach jeweils etwa 90 % Substratumsatz (3-Nitrobenzaldehydkonzentration unter 10 % des Ausgangswertes) wurde der Biokatalysator mit Puffer gewaschen und mit frischer Reaktionslösung versetzt und erneut inkubiert.After about 90% substrate conversion (3-nitrobenzaldehyde concentration below 10% of the initial value) the biocatalyst was washed with buffer and mixed with fresh reaction solution and incubated again.

In Abb. 1 sind die gemessenen Initlalgeschwindigkeiten der Präparate la-lc gegen die Anzahl der Ansätze aufgetragen.The measured initial speeds of the preparations are shown in Fig. 1 la-lc plotted against the number of approaches.

Das Lewatitpräparat la wies auch nach dem 10. Wiederholungsansatz etwa 90 % Restaktivität auf, während das Promaxon- und das Glaspräparat schon im 2. bzw. 3.The Lewatit preparation la also showed after the 10th repetition about 90% residual activity, while the Promaxon and the glass preparations are already in 2nd or 3rd

Wiederholungsansatz inaktiv waren.Replicate were inactive.

Beispiel 2 Immobilisierung von Xanthin Oxidase an Diaione HP 20 durch Adsorption und Vernetzung mit Glutaraldehyd.Example 2 Immobilization of Xanthine Oxidase on Diaione HP 20 by Adsorption and cross-linking with glutaraldehyde.

Aus Buttermilch nach Gilbert und Bergel (1964) gereinigte Xanthin Oxidase 0,24 Ulmg (Xanthin als Substrat) wurde gegen 0.1 M Kaliumphosphat, pH 7,4, dialysiert.Xanthine purified from buttermilk according to Gilbert and Bergel (1964) Oxidase 0.24 Ulmg (xanthine as substrate) was against 0.1 M potassium phosphate, pH 7.4, dialyzed.

50 ml dieses dialysierten Präparats (2,70 mg/ml) wurden lanasam über eine mit gleichem Puffer vorbehandelte Säulenpackung von 2 g Diaionß HP 20 (Fließrate geringer als 10 mllh) rezirkulierend gepumpt, bis die Proteinkonzentration des Eluats auf 1,95 mglml abgenommen hatte.50 ml of this dialyzed preparation (2.70 mg / ml) were lanasam over a column packing of 2 g Diaionß HP 20 (flow rate less than 10 mlh) recirculating until the protein concentration of the eluate had decreased to 1.95 mglml.

Die Differenz zur eingesetzten Menge von etwa 37,5 mg Protein war somit adsorptiv am Diaionl HP 20 gebunden worden. Nun wurden dem Eluat 2 ml 25 Glutaraldehyd-Lösung zugesetzt und rezirkulierend für 16 h über die Diaion-Säule gepumpt. Alle Vorgänge wurden bei +4"C durchgeführt. Die Proteinkonzentration des Eluats nahm dadurch auf 1,42 mg/ml ab, was einer Beladung von etwa 32 mg Protein Diaionß HP 20 entspricht. In Abb. 2 ist wie in Abb. 1 die Aktivität in 4 gegen die Anzahl der durchgeführten Inkubationen aufgetragen.The difference to the amount used was about 37.5 mg of protein thus adsorptively bound to the Diaionl HP 20. 2 ml of 25 glutaraldehyde solution were then added to the eluate added and pumped recirculating for 16 h over the Diaion column. All operations were carried out at +4 "C. The protein concentration of the eluate thereby increased 1.42 mg / ml, which corresponds to a load of about 32 mg protein Diaionß HP 20. In Fig. 2, as in Fig. 1, the activity in 4 is plotted against the number of performed Incubations applied.

Beispiel 3 Immobilisierung von Xanthin Oxidase an Glutaraldehydaktiviertes Lewatit MP64ZII nach vorheriger Behandlung des Harzes mit 3-Nitrobenzaldehyd.Example 3 Immobilization of Xanthine Oxidase on Glutaraldehyde Activated Lewatit MP64ZII after previous treatment of the resin with 3-nitrobenzaldehyde.

Glutaraldehyd-aktiviertes Lewatit MP64ZII absorbierte in einem Versuch etwa 25 mg 3-Nitrobenzaldehyd pro Gramm Harz.Glutaraldehyde-activated Lewatit MP64ZII absorbed in one experiment about 25 mg of 3-nitrobenzaldehyde per gram of resin.

25 g des mit 3-Nitrobenzaldehyd belegten Harzes wurden in einer Mischung aus 50 ml Dialysat Xanthin Oxidase (4,4 mg/ml) und 150 ml Tris.HCl, pH 7,4, nach Entgasen an der Wasserstrahlpumpe bei +4"C fur 72 h geschüttelt.25 g of the resin coated with 3-nitrobenzaldehyde were in a mixture from 50 ml of dialysate xanthine oxidase (4.4 mg / ml) and 150 ml of Tris.HCl, pH 7.4, after Degas with the water jet pump at +4 "C for 72 h, shaken.

Von den eingesetzten 220 mg Protein waren noch 32 mg im Uberstand nachweisbar.Of the 220 mg protein used, 32 mg were still in the supernatant verifiable.

1 9 dieses Xanthin Oxidase Präparats wurden wiederholt batchweise in 10 ml 0.1 M Tris.HCl, pH 7,4, 1 mM 3-Nitrobenzaldehyd, 10 Methanol, bei 25"C unter Schütteln inkubiert.19 of this xanthine oxidase preparation were repeated in batches in 10 ml 0.1 M Tris.HCl, pH 7.4, 1 mM 3-nitrobenzaldehyde, 10% methanol, at 25 "C. incubated with shaking.

In Abb. 3 ist die Aktivität in % gegen die Anzahl der durchgeführten Inkubationen aufgetragen.In Fig. 3 the activity in% versus the number of performed Incubations applied.

In allen vorstehenden Beispielen erfolgte die Analyse von 3-Nitrobenzaldehyd und 3-Nitrobenzoesäure per HPLC (Säule RPC18, Laufmitel 50 % Acetonitril, 0,5 % Ameisensäure, 49,5 % Wasser).3-Nitrobenzaldehyde was analyzed in all of the above examples and 3-nitrobenzoic acid by HPLC (column RPC18, mobile phase 50% acetonitrile, 0.5% Formic acid, 49.5% water).

Tabelle 1 Halbwertszeiten immobilisierter Xanthin Oxidase Präparate (gemäß Beispiele 1 bis 3) unter Katalysebedingungen.Table 1 Half-lives of immobilized xanthine oxidase preparations (according to Examples 1 to 3) under catalytic conditions.

Substrat: 3-Nitrobenzaldehyd, Luftsauerstoff als Elektronenakzeptor.Substrate: 3-nitrobenzaldehyde, atmospheric oxygen as electron acceptor.

Träger Halbwertszeit Beispiel t1/2 Lewatit MP64ZII, > 12 d la Glutaraldehyd-modifiziert Promaxonl, nach Modifizierung < 1 d 1b mit t-Aminopropyltriethoxysilan und Glutaraldehyd Controlled-Pore Glas1, nach < 1 d 1c Modifizierung mit t-Aminopropyltriethoxysilan Diaion HP 20, nach Adsorption > 25 d 2 und Vernetzung mit Glutaraldehyd LewatitB MP64ZII, Glutaraldehyd- > 25 d 3 modifiziert, nach Sättigung mit 3-Nitrobenzolaldehyd Leqende zu den Abbildungen 1-3 Abb. 1: Vergleich Stabilität verschiedener immobilisierter Xanthin Oxidase-Präparate unter Katalysebedingungen.Carrier half-life example t1 / 2 Lewatit MP64ZII,> 12 d la glutaraldehyde-modified Promaxonl, after modification <1 d 1b with t-aminopropyltriethoxysilane and glutaraldehyde Controlled-Pore Glas1, after <1 d 1c modification with t-aminopropyltriethoxysilane Diaion HP 20, after adsorption> 25 d 2 and crosslinking with glutaraldehyde LewatitB MP64ZII, glutaraldehyde-> 25 d 3 modified, after saturation with 3-nitrobenzene aldehyde Legends to Figs. 1-3 Fig. 1: Comparison of the stability of different immobilized Xanthine oxidase preparations under catalytic conditions.

2 Ansätze pro Tag: 1mM 3-Nitrobenzaldehyd, 10 % MeOH, aerob (02 als Elektronenakzeptor), 0.1 M K-Phosphat, pH 7.4, 25"C. 2 approaches per day: 1mM 3-nitrobenzaldehyde, 10% MeOH, aerobic (02 as electron acceptor), 0.1 M K-phosphate, pH 7.4, 25 ° C.

Xanthin Oxidase an Lewatit MP64 ZII immobilisiert (la) Xanthin Oxidase an Promaxon# immobilisiert (lb) an CPG# immobilisiert (1c) Aufgetragen ist die Restaktivität in % (Ordinate) gegen die Zahl der durch geführten Inkubationen bzw. Wiederholungsansätze (Abszisse).Xanthine oxidase immobilized on Lewatit MP64 ZII (la) xanthine oxidase Immobilized on Promaxon # (lb) immobilized on CPG # (1c) The residual activity is shown in% (ordinate) against the number of incubations or repetitions carried out (Abscissa).

Abb. 2: Stabilität der nach Beispiel 2 an Diaionl MP 20 immobilisierten Xanthin Oxidase unter Katalysebedingungen. 1 Ansatz pro Tag, 1mM 3-Nitrobenzaldehyd, 10 % Methanol, 0,1 M K-Phosphat, pH 7.4, 25 es.Fig. 2: Stability of the immobilized on Diaionl MP 20 according to Example 2 Xanthine oxidase under catalytic conditions. 1 approach per day, 1mM 3-nitrobenzaldehyde, 10% methanol, 0.1 M K phosphate, pH 7.4, 25 es.

Es wurde die gleiche Auftragung wie in Abb. 1 gewählt.The same plot as in Fig. 1 was chosen.

Abb.3: Stabilität der nach Beispiel 3 an Lewatit MP 64 ZII immobilisierten Xanthin Oxidase unter Katalysebedingungen. 1 Ansatz pro Tag, 1mM 3-Nitrobenzaldehyd, 10 4 Methanol, 0.1 M K-Phosphat, pH 7.4, 25°C.Fig.3: Stability of the immobilized on Lewatit MP 64 ZII according to Example 3 Xanthine oxidase under catalytic conditions. 1 approach per day, 1mM 3-nitrobenzaldehyde, 10 4 methanol, 0.1 M K phosphate, pH 7.4, 25 ° C.

Claims

Claims 1. A method for immobilizing xanthine oxidase, characterized in that the xanthine oxidase on a carrier with hydrophobic Surface is immobilized.

2. The method according to claim 1, characterized in that the hydrophobic The carrier matrix is porous.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the hydrophobic carrier matrix is present in pearl form.

4. The method according to claim 1 and 3, characterized in that the hydrophobic carrier matrix is a crosslinked polystyrene resin.

5. The method according to claim 1 to 4, characterized in that the hydrophobic carrier matrix is chemically modified.

6. The method according to claim 1 to 5, characterized in that the hydrophobic carrier matrix carries amino groups.

7. The method according to claim 1 to 6, characterized in that the Xanthine oxidase adsorptively or ionically bound to hydrophobic carriers and then is treated with bi- or polyfunctional crosslinking agents.

8. The method according to claim 1 to 7, characterized in that xanthine Oxidase is covalently bound to chemically modified polystyrene-based carriers.

9. The method according to claim 1 to 8, characterized in that the Xanthine oxidase is bound to a polystyrene-based carrier containing amino groups wearing.

10. The method according to claim 1 to 9, characterized in that the Amino-group-bearing carrier matrix is activated with glutaraldehyde and then the xanthine oxidase is covalently bound.

11. The method according to claim 1 to 10, characterized in that Superoxide dismutase and / or catalase can be co-immobilized with xanthine oxidase.

12. A method for stabilizing xanthine oxidase, characterized in that that the xanthine oxidase on a carrier with a hydrophobic surface according to claim 1 to 11 is immobilized.

13. Use of the xanthine immobilized according to claims 1 to 11 Oxidase as biocatalysts or biosensors.