DE3505161A1

DE3505161A1 - Process and apparatus for electrofusion with the aid of sound waves

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Publication number: DE3505161A1
Application number: DE19853505161
Authority: DE
Inventors: Erfinder Wird Nachtraeglich Benannt Der
Original assignee: GCA Corp
Current assignee: B Braun Melsungen AG
Priority date: 1985-02-15
Filing date: 1985-02-15
Publication date: 1986-08-21

Abstract

In order, where possible, to avoid damage to cells on fusion in a process for the electrofusion of cells in which the cells contained in a cell suspension are exposed to a field pulse which perforates the membrane of these cells, and are then, at the latest, brought into membrane contact with one another so that these cells fuse, it is proposed that sound waves are generated in the cell suspension, owing to which the cells are collected in regions of planes standing at right angles to a direction of propagation of the sound waves and having a spacing of half a wavelength, and thus the membrane contact necessary for fusion is set up.

Description

Beschreibung description

Verfahren und Vorrichtung zur Elektrofusion mit Hilfe von Schallwellen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Elektrofusion von Zellen, bei dem die in einer Zellsuspension enthaltenen Zellen einem eine Membran dieser Zellen durchlöchernden Feldimpuls ausgesetzt werden und spätestens anschliessend miteinander in Membrankontakt gebracht werden, so dass diese Zellen fusionieren. Method and device for electrofusion with the aid of sound waves The invention relates to a method for electrofusion of cells, in which the in a cell suspension containing cells perforating a membrane of these cells Are exposed to a field pulse and then at the latest in membrane contact with each other so that these cells fuse.

Des weiteren betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens mit einem Behältnis zur Aufnahme einer die Zellen enthaltenden Zellsuspension und mit mindestens zwei mit der Zellsuspension in Kontakt stehenden Elektroden, zwischen denen ein elektrischer Feldimpuls zum Durchlöchern einer Membran der Zellen erzeugbar ist.The invention also relates to an implementation device of the method with a container for receiving a cell suspension containing the cells and with at least two electrodes in contact with the cell suspension, between which an electric field pulse to perforate a membrane of the cells can be generated.

Bei der Fusion von Zellen sind prinzipiell zwei Forderungen zu erfüllen. Zum einen müssen die Zellen einander so weit angenähert werden, dass die Membranen Berührungskontakt miteinander haben und zum anderen sind die Membranen dann möglichst im Bereich der Kontaktzone zu "durchlöchern", damit sich aus den Membranen der ursprünglichen Zellen eine neue Membran einer fusionierten, die ursprünglichen Zellen umfassende Membran bilden kann.When cells are fused, two basic requirements have to be met. On the one hand, the cells must be brought so close together that the membranes Have touch contact with each other and on the other hand, the membranes are then as possible in the area of the contact zone to "perforate" so that the membranes of the original Cells one new membrane of a fused, the original Can form membrane encompassing cells.

Es ist bekannt, dass sich in einer Suspension enthaltene Zellen aufgrund der Brown'schen Bewegung und der negativen elektrostatischen Ladung auf einer Aussenseite der Membran nicht aneinander annähern und somit ein für die Elektrofusion notwendiger Membrankontakt nicht hergestellt werden kann (U.Zimmermann und J.Vienken, J.Membran Biol.67, 175 bis 182 (1982) und U.Zimmermann "Biochimica et Biophysica Acta, 694, 227 bis 277, (1982)). Aus diesem Grunde wurde zur Herstellung des Membrankontakts zwischen den Zellen die Methode der Dielektrophorese verwendet, die darauf beruht, dass ein neutrales Teilchen in einem inhomogenen Feld polarisiert wird und sich längs der Feldlinien in Richtung zunehmender Feldstärke bewegt. Im allgemeinen werden dabei die Elektroden so angeordnet, dass im Bereich der Elektroden ein inhomogenes Feld entsteht, so dass sich, ausgehend von den Elektroden,längs der Feldlinien sogenannte Perlenketten von Zellen bilden, bei denen die Zellen miteinander in Membrankontakt stehen. Hierzu wird bei der Dielektrophorese mit einem Wechselfeld bei Frequenzen in einem Bereich zwischen 104 bis 106 Hz gearbeitet.It is known that cells contained in a suspension are due to Brownian motion and the negative electrostatic charge on an outside of the membrane do not approach each other and thus a necessary for the electrofusion Membrane contact cannot be established (U. Zimmermann and J.Vienken, J.Membran Biol. 67, 175 to 182 (1982) and U. Zimmermann "Biochimica et Biophysica Acta, 694, 227-277, (1982)). For this reason, the membrane contact was made the method of dielectrophoresis is used between the cells, which is based on that a neutral particle is polarized in an inhomogeneous field and becomes moved along the field lines in the direction of increasing field strength. Generally will The electrodes are arranged in such a way that an inhomogeneous Field arises, so that, starting from the electrodes, along the field lines so-called Strings of pearls are formed by cells, in which the cells are in membrane contact with one another stand. This is done in dielectrophoresis with an alternating field at frequencies worked in a range between 104 to 106 Hz.

Nachdem die Zellen miteinander in Membrankontakt stehen, wird der die Membran durchlöchernde Feldimpuls appliziert, so dass die miteinander in Membrankontakt stehenden Zellen fusionieren können.After the cells are in membrane contact with each other, the the membrane perforating field pulse is applied so that the membrane contacts with each other standing cells can fuse.

Das Aneinanderreihen der Zellen mittels Dielektrophorese hat grosse Nachteile. So ist es notwendig, mit Suspensionen zu arbeiten, die nichtleitende Medien enthalten, da ansonsten aufgrund der Leitfähigkeit eine starke Erwärmung der Suspension auftreten würde. Eine derartige Erwärmung hätte zur Folge, dass die Zellen überhitzt und dadurch geschädigt würden und dass ausserdem Turbulenzen in der Suspension aufträten, die eine Bildung der Perlenketten verhinderten.The lining up of the cells by means of dielectrophoresis has great Disadvantage. So it is necessary to work with suspensions, the non-conductive ones Contains media, otherwise strong heating due to the conductivity the suspension would occur. Such a warming would have the consequence that the Cells would be overheated and damaged as a result and that turbulence in the suspension occurred, which prevented the formation of the pearl necklaces.

Es ist ebenfalls bekannt, dass durch in einer Suspension sich fortpflanzende Schallwellen nichtlineare Kräfte auf darin enthaltene Partikel wirken, die diese in senkrecht zu einer Ausbreitungsrichtung der Schallwellen stehenden Ebenen zusammenführen. Dabei sammeln sich die Partikel, je nach ihrer Dichte und Kompressibilität, entweder in Knotenebenen oder in Ebenen maximaler Schallgeschwindigkeit, r ' die jeweils untereinander einen Abstand von einer halben Wellenlänge der Schallwelle aufweisen. Ein derartiges Sammeln der Partikel erfolgt sowohl in sich ausbreitenden Schallwellen wie auch in stehenden Schallwellen, wobei stehende Schallwellen den Vorteil bieten, dass die Teilchen durch diese noch näher zusammengeführt werden. Es, konnte experimentell gezeigt werden, dass in einer Suspension enthaltene Erythrozyten durch Einwirkung eines Schallwellenfeldes in den obengenannten Ebenen konzentriert werden können.It is also known that by reproducing in suspension Sound waves have non-linear forces acting on particles contained therein, which these merge in planes perpendicular to a direction of propagation of the sound waves. The particles either collect, depending on their density and compressibility in nodal planes or in planes of maximum sound velocity, r 'each have a distance of half a wavelength of the sound wave from one another. Such a collection of the particles takes place both in propagating sound waves as well as in standing sound waves, whereby standing sound waves offer the advantage that the particles are brought together even closer by this. It could, experimentally be shown that erythrocytes contained in a suspension by action a sound wave field can be concentrated in the above-mentioned planes.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren der gattungsgemässen Art so zu führen, dass die Zellen beim Fusionieren möglichst wenig geschädigt werden.It is the object of the invention to provide a method of the generic type to lead in such a way that the cells are damaged as little as possible when they fuse.

Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs beschriebenen Art erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass in der Zellsuspension Schallwellen erzeugt werden, durch welche die Zellen in Bereichen von senkrecht auf einer Ausbreitungsrichtung der Schallwellen stehenden und einen Abstand von einer halben Wellenlänge aufweisenden Ebenen gesammelt werden und somit der zur Fusion erforderliche Membrankontakt hergestellt wird.In a method, this task is described at the outset Art solved according to the invention in that in the Cell suspension Sound waves are generated through which the cells in areas of perpendicular standing on a direction of propagation of the sound waves and a distance of half a wavelength having planes are collected and thus the for Fusion required membrane contact is established.

Die Vorteile bei dieser Verfahrensführung liegen darin, dass sämtliche, bei der Dielektrophorese auftretenden Probleme gelöst werden, da es nicht mehr wesentlich ist, dass das Medium der Zellsuspension zur Vermeidung von Erwärmungseffekten weitgehend nichtleitend ist. Damit kann die Suspension ein physiologischen Bedingungen angepasstes Medium enthalten, so dass die vor allem unmittelbar nach der Fusion sehr labilen fusionierten Zellen nicht mehr durch die nichtphysiologischen Bedigungen geschädigt werden. Des weiteren hat sich gezeigt, dass die im Bereich der genannten Ebenen auftretenden Kräfte ausreichend gross sind, um einen für eine Fusion ausreichenden Membrankontakt zwischen den Zellen herbeizuführen, deren Membranen durch den Feldimpuls durchlöchert wurden.The advantages of this procedure are that all, Problems occurring in dielectrophoresis can be solved, since it is no longer essential is that the medium of the cell suspension to avoid warming effects largely is non-conductive. The suspension can thus be adapted to physiological conditions Medium included, so that it is very unstable, especially immediately after the fusion fused cells are no longer damaged by the non-physiological conditions will. It has also been shown that in the area of the levels mentioned occurring forces are sufficiently large to be sufficient for a fusion Bring membrane contact between the cells, their membranes by the field pulse were riddled with holes.

Zunächst ist jede Art von in der Zellsuspension entstehenden Schallwellen zum Sammeln der Zellen in der Zellsuspension denkbar. Insbesondere treten bei einer endlichen Ausdehnung der Zellsuspension in Ausbreitungsrichtung der Schallwellen stets Reflexionen auf, so dass in den Fällen, in denen Reflexionen nicht gezielt vermieden werden, in der Zellsuspension eine Uberlagerung gegenläufiger Schallwellen vorliegt.First of all, there is any type of sound wave that arises in the cell suspension conceivable for collecting the cells in the cell suspension. In particular, occur at a finite expansion of the cell suspension in the direction of propagation of the sound waves always reflections on, so that in those cases where reflections are not targeted be avoided, a superposition of opposing sound waves in the cell suspension is present.

Wenn diese einander überlagerten Wellen ein Schallwellenfeld mit "Knoten" und Bäuche" ergeben, das mit einer ihm eigenen Geschwindigkeit durch die Zellsuspension hindurchläuft, so kann dies zum Sammeln der Zellen in seinen Knotenebenen eingesetzt werden. Dabei kann ein schnell durch die Zellsuspension wanderndes Schallwellenfeld nur bei sehr kleinen Zellen Anwendung finden, da diese durch die Zähigkeit des Wassers nicht sehr stark abgebremst werden und folglich durch das Schallwellenfeld mitgetragen werden können.If these superimposed waves create a sound wave field with "knots" and bellies "result, that with its own speed through the cell suspension runs through so can do this to collect the cells in its nodal levels can be used. A sound wave field can move quickly through the cell suspension Can only be used for very small cells, as these are due to the viscosity of the water are not slowed down very strongly and are consequently carried along by the sound wave field can be.

Grosse Zellen erfordern dagegen ein langsam durch die Zell suspension wanderndes Schallwellenfeld.Large cells, on the other hand, require a slow suspension through the cell wandering sound wave field.

Besonders bevorzugt wird eine Verfahrensführung derart, dass als Schallwellen stehende Wellen verwendet werden, da in diesem Fall die Zellen noch näher zusammengeführt werden, so dass der für die Fusion notwendige Membrankontakt in den genannten Ebenen sichergestellt ist.It is particularly preferred to conduct the process in such a way that the sound waves are used standing waves are used, as in this case the cells are brought even closer together so that the membrane contact necessary for the fusion is in the mentioned levels is ensured.

Prinzipiell kann die Ausbreitungsrichtung der Schallwelle innerhalb des Fusionsmediums beliebig gewählt werden. Um jedoch ein Absinken der in den genannten Ebenen sich sammelnden Zellen aufgrund der Einwirkung der Schwerkraft zu verhindern, ist es vorteilhaft, wenn die Ausbreitungsrichtung der Schallwellen parallel zur Richtung der Schwerkraft verläuft, so dass ein Absetzen der Zellen in der Suspension vermieden werden kann und sich die Zellen in horizontal verlaufenden Ebenen sammeln. Dabei ist jedoch zu berücksichtigen, dass eine Amplitude der Schallwelle einen Mindestwert oder Schwellwert aufweisen muss, damit die Zellen in den jeweiligen Ebenen gehalten werden können.In principle, the direction of propagation of the sound wave can be within of the fusion medium can be chosen arbitrarily. However, in order to decrease the in the mentioned Levels to prevent cells from accumulating due to the action of gravity it is advantageous if the direction of propagation of the sound waves is parallel to the Direction of gravity runs, so that a settling of the cells in the suspension can be avoided and the cells collect in horizontal planes. However, it must be taken into account that an amplitude of the sound wave has a minimum value or threshold value must have so that the cells are kept in the respective levels can be.

Aber auch das elektrische Feld kann zunächst bezüglich der Ausbreitungsrichtung der Schallwelle in beliebiger Richtung verlaufen, da die Zellen in den einzelnen Ebenen nicht eine einzige Perlenkette bilden, sondern in mehreren Schichten oder auch in statistischer Anordnung zusammengeführt werden.But the electrical field can also initially be related to the direction of propagation the sound wave travel in any direction as the cells in each Layers do not form a single pearl necklace, but in several layers or can also be merged in a statistical arrangement.

Vorteilhaft ist es jedoch, wenn der Feldimpuls im wesentlichen senkrecht zur Ausbreitungsrichtung der Schallwelle gerichtet ist, da die Zellanhäufnngen in den jeweiligen Ebenen in dieser Richtung die grösste Ausdehnung aufweisen, so dass die Wahrscheinlichkeit für eine Fusion der durch den Feldimpuls in der genannten Richtung durchlöcherten Zellen bei einer derartigen Anordnung des elektrischen Feldes zur Ausbreitungsrichtung der Schallwelle am grössten ist.However, it is advantageous if the field pulse is essentially perpendicular is directed towards the direction of propagation of the sound wave, since the cell clusters in the respective levels have the greatest extent in this direction, so that the probability of a fusion of the field momentum mentioned in the Direction of perforated cells with such an arrangement of the electric field to the direction of propagation of the sound wave is greatest.

Bei den bisher bekannten Verfahren zur Fusion der Zellen wurde der Membrankontakt bereits vor einem Applizieren des die Zellen durchlöchernden Feldimpulses hergestellt, da ein Aneinanderreihen der durchlöcherten Zellen durch Dieelektrophorese mit Schwierigkeiten verbunden ist. Diese Notwendigkeit ist bei dem hier beschriebenen Verfahren nicht mehr unbedingt gegeben, denn für die die Zellen zusammenführenden Kräfte ist die Polarisierbarkeit der Zell membran ohne Bedeutung. Entscheidend ist allein, dass der Membrankontakt nach dem Durchlöchern der Zellen durch den Feldimpuls hergestellt wird. So kann es vom Typus der jeweils zu fusionierenden Zellen oder anderen Randbedingungeii des Verfahrens abhängig gemacht werden, ob die Zellen vor Applizieren des Feldimpulses durch das Schallwellenfeld in Membrankontakt miteinander gebracht werden, oder ob die Zellen, spätestens nachdem sie dem Feldimpuls ausgesetzt wurden, durch das Schallwellenfeld miteinander in Membran kontakt gebracht und gehalten werden.In the previously known method for fusing cells, the Membrane contact already before application of the field pulse that perforates the cells produced because the perforated cells were aligned by electrophoresis is fraught with difficulty. This need is with the one described here The procedure is no longer necessarily given, because for those who bring the cells together Forces, the polarizability of the cell membrane is irrelevant. What matters is only that the membrane contact after the perforation of the cells by the field impulse will be produced. So it can be of the type of the cells to be fused or other boundary conditionseii the method are made dependent on whether the cells Application of the field impulse through the sound wave field in membrane contact with each other be brought, or whether the cells, at the latest after being exposed to the field pulse were brought into contact with one another and held in membrane by the sound wave field will.

Da die Mengen der zur Verfügung stehenden Suspensionen bei Zellfusionsexperimenten in der Regel sehr klein sind, ist es ebenfalls von Vorteil, wenn eine Schallfrequenz im Bereich von Ultraschallfrequenzen gewählt wird, da die Wellenlänge entsprechend klein wird, so dass selbst in einem kleinen Volumen noch mehrere der obengenannten Ebenen, in denen die Zellen zusammengeführt werden, zur Verfügung stehen.As the quantities of suspensions available in cell fusion experiments are usually very small, it is also advantageous if a sound frequency in the area of ultrasonic frequencies is chosen because the wavelength becomes correspondingly small, so that even in a small volume several of the Above-mentioned levels in which the cells are merged are available stand.

Des weiteren ist es ebenfalls vorteilhaft, wenn nur ein kleines Volumen von Zellsuspension zur Fusion verwendet wird, da in einem derartigen Fall innerhalb der Suspension Turbulenzen durch die ebenfalls auf die sich sammelnden Zellen wirkende Schwerkraft vermieden werden und sich somit die Zellen in nahezu ungestörter Weise in den genannten Ebenen sammeln.Furthermore, it is also advantageous if only a small volume of cell suspension is used for fusion, since in such a case within of the suspension turbulence through which also acts on the collecting cells Gravity can be avoided and thus the cells in an almost undisturbed manner collect in the mentioned levels.

Des weiteren liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur Durchführung des beschriebenen Verfahrens zu schaffen.Another object of the invention is to provide a device to carry out the process described.

Diese Aufgabe wird bei einer Vorrichtung der eingangs beschriebenen Art erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass zur Erzeugung von die Zellen in Membrankontakt bringenden Schallwellen ein an die Zellsuspension angekoppelter Schallgeber vorgesehen ist. Die Vorteile dieser Vorrichtung zeichnen sich besonders durch ihre Einfachheit aus, vor allem da bei der Konzeption des Behältnisses und der Anordnung der Elektroden nicht mehr darauf Rücksicht genommen werden muss, dass ein für die Dielektrophorese notwendiger Feldgradient entsteht.In the case of a device, this object is described at the outset Art solved according to the invention in that for the generation of the cells in membrane contact A sound generator coupled to the cell suspension is provided to bring sound waves is. The advantages of this device are particularly characterized by its simplicity especially in the conception of the container and the arrangement of the electrodes no longer has to be taken into account that one for dielectrophoresis necessary field gradient arises.

Eine besonders vorteilhafte Funktion der erfindungsgemässen Vorrichtung ergibt sich dann, wenn eine Erstreckung der Zellsuspension in dem Behältnis in einer Ausbreitungsrichtung der Schallwellen in Verbindung mit einer Schallgeschwindigkeit in der Suspension und einer Frequenz der Schallwellen derart wählbar ist, dass in der Suspension ein stehendes Schallwellenfeld auftritt. Bei einer derartigen Anordnung wandern die senkrecht zur Ausbreitungsrichtung der Schallwelle stehenden Ebenen nicht mehr durch das Behältnis hindurch, sondern bleiben relativ zum Behältnis stehen, so dass sich relativ zu diesem feststehende Schichten mit zusammengeführten Zellen bilden.A particularly advantageous function of the device according to the invention arises when an extension of the cell suspension in the container in a Direction of propagation of sound waves in connection with a Speed of sound in the suspension and a frequency of the sound waves such it can be selected that a stationary sound wave field occurs in the suspension. at In such an arrangement, the migrate perpendicular to the direction of propagation of the sound wave standing levels no longer pass through the container, but remain relative stand to the container so that there are layers with fixed relative to it merged cells form.

Wie bereits erwähnt, kann das elektrische Feld prinzipiell relativ zu der Ausbreitungsrichtung der Schallwellen beliebige Richtungen aufweisen. Es ist jedoch von Vorteil, wenn Kontaktflächen zwischen den Elektroden und der Zellsuspension im wesentlichen parallel zu der Ausbreitungsrichtung der Schallwellen verlaufen, so dass das elektrische Feld parallel zu den Ebenen verläuft und folglich die Zellen in einer Richtung durchlöchert werden, in welcher eine möglichst grosse Wahrscheinlichkeit für eine Fusion mit einer benachbarten Zelle besteht.As already mentioned, the electric field can in principle be relative have any directions in relation to the direction of propagation of the sound waves. It however, it is advantageous if there are contact areas between the electrodes and the cell suspension run essentially parallel to the direction of propagation of the sound waves, so that the electric field is parallel to the planes and consequently the cells be perforated in a direction in which the greatest possible probability for a fusion with a neighboring cell.

Des weiteren wird die Ausbildung von Turbulenzen durch Einwirkung der Schwerkraft am besten dadurch ausgeschaltet, dass der Schallgeber so ausgerichtet ist, dass die Ausbreitungsrichtung der Schallwellen parallel zur Richtung der Schwerkraft verläuft und mithin die Zellen durch die Schallwellen in horizontalen Ebenen gehalten werden können.Furthermore, the formation of turbulence is caused by action The best way to turn off gravity is to orient the sounder in this way is that the direction of propagation of sound waves is parallel to the direction of gravity runs and thus the cells are held in horizontal planes by the sound waves can be.

Da die Zellsuspension in dem Behältnis aufgrund einer Grösse des Behältnisses nicht immer direkt mit dem Schallgeber in Verbindung stehen kann, ist es in diesen Fällen zweckmässig, wenn die Zellsuspension über eines oder mehrere Ubertragungsmedien an den Schallgeber angekoppelt ist. Hierbei können alle Stoffe Verwendung finden, die eine gute Übertragung des Ultraschalls gewährleisten und sich auf die Zellsuspension nicht nachteilig auswirken.Because the cell suspension in the container due to the size of the container cannot always be directly connected to the sounder, it is in these Appropriate cases when the cell suspension is via one or more transmission media is coupled to the sounder. All substances can be used here, which ensure a good transmission of the ultrasound and affect the cell suspension do not have an adverse effect.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung sowie der beigefügten zeichnerischen Darstellung einer Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung. In der Zeichnung zeigen: Fig. 1 eine teilweise aufgebrochene Seitenansicht einer erfindungsgemässen Vorrichtung und Fig. 2 einen vergrösserten Ausschnitt eines mit A gekennzeichneten Bereichs in Fig. 1.Further features and advantages of the invention emerge from the following Description and the accompanying drawings of an embodiment the device according to the invention. In the drawing: Fig. 1 shows a partial broken side view of a device according to the invention and FIG. 2 a enlarged section of an area marked with A in FIG. 1.

Fig. 1 zeigt im einzelnen einen scheibenförmigen Schallgeber 10, beispielsweise eine Scheibe aus Blei-Zirkonat PZT 4, welcher mit einem Frequenzgenerator 12 verbunden ist und durch eine von diesem erzeugte hochfrequente Spannung erregt wird. Der Frequenzgenerator schwingt bei dem hier beschriebenen Ausführungsbeispiel mit einer Frequenz von 1 MHz.Fig. 1 shows in detail a disc-shaped sound generator 10, for example a disc made of lead-zirconate PZT 4, which is connected to a frequency generator 12 and is excited by a high-frequency voltage generated by it. The frequency generator In the exemplary embodiment described here, it oscillates at a frequency of 1 MHz.

Der Schallgeber 10 trägt eine Platte 14, welche zur Übertragung eines von dem Schallgeber 10 erzeugten Schalls auf eine Probe dient. Diese Platte 14 besitzt in ihrer Mitte eine Vertiefung 15, in welcher eine rohrförmige Küvette 16 steht, die ihrerseits an einem der Platte 14 zugewandten Ende 18 mit einer dünnen Folie 20 verschlossen ist. Diese Folie 20 ist auf einer Aussenseite 22 der Küvette 16 nach oben, von der Platte 14 weg, gezogen und wird dort durch einen Haltering 24 gegen die Aussenseite 22 der Küvette 16 gepresst und dadurch mit Reibschluss an der Aussenseite 22 gehalten. Vorzugsweise findet eine elastische Folie Verwendung, welche derart über das Ende 18 gezogen werden kann, dass ein die Küvette 16 verschliessender Teil 26 der Folie 20 straff gespannt ist.The sounder 10 carries a plate 14 which is used to transmit a The sound generated by the sounder 10 is used on a sample. This plate 14 has in its center a recess 15 in which a tubular cuvette 16 stands, which in turn at one of the plate 14 facing end 18 with a thin film 20 is closed. This film 20 is on an outside 22 of the cuvette 16 upwards, away from the plate 14, and is there by a retaining ring 24 pressed against the outside 22 of the cuvette 16 and thereby with frictional engagement the outside 22 held. An elastic film is preferably used, which can be pulled over the end 18 in such a way that a Part 26 of the film 20 is stretched taut.

Damit eine ausreichend gute Übertragung der Schallwellen von der Platte 14 auf eine in der Küvette 16 enthaltene erste Ubertragungsflüssigkeit 28 erfolgt, ist in der Vertiefung 15 zur Ankopplung des Teils 26 der Folie 20 an die Platte 14 eine zweite Ubertragungsflüssigkeit 30 vorgesehen, welche zwischen der Platte 14 und der Folie 20 einen dünnen Film bildet und sämtliche Hohlräume zwischen der Platte 14 und dem Teil 26 der Folie ausfüllt. Die übertragung der Schallwelle erfolgt somit in einer senkrecht auf der Platte 14 stehenden Richtung von dieser auf die zweite Ubertragungsflüssigkeit 30, dann auf den Teil 26 der Folie 20 und von diesem auf die darüber stehende erste Ubertragungsflüssigkeit 28.This ensures a sufficiently good transmission of the sound waves from the plate 14 takes place on a first transfer liquid 28 contained in the cuvette 16, is in the recess 15 for coupling the part 26 of the film 20 to the plate 14 a second transmission fluid 30 is provided, which between the plate 14 and the foil 20 forms a thin film and all voids between the Plate 14 and the part 26 of the film fills. The transmission of the sound wave takes place thus in a direction perpendicular to the plate 14 from this to the second transfer liquid 30, then onto the part 26 of the film 20 and from this onto the first transmission liquid 28 above it.

Entsprechend der Frequenz der Schallwellen und einer Ausbreitungsgeschwindigkeit dieser Schallwellen in der ersten übertragungsflüssigkeit 28 ist eine Höhe der in der Küvette 16 stehenden Übertragungsflüssigkeit 28, vorgegeben durch einen Abstand eines Flüssigkeitsspiegels 32 der ersten übertragungsflüssigkeit 28 von dem Teil 26 der Folie 20, so zu wählen, dass diese ein ganzzahliges Vielfaches einer halben Wellenlänge der Schallwelle in der ersten bertragungsflüssigkeit 28 darstellt. Dies hat zur Konsequenz dass die Schallwelle an dem Flüssigkeitsspiegel 32 reflektiert wird und sich eine stehende Schallwelle in der ersten übertragungsflüssigkeit 28 ausbilden kann.According to the frequency of the sound waves and a speed of propagation of these sound waves in the first transmission liquid 28 is a height of in the cuvette 16 standing transfer liquid 28, predetermined by a distance a liquid level 32 of the first transfer liquid 28 from the part 26 of the film 20 to be selected so that this is an integral multiple of a half Represents the wavelength of the sound wave in the first transmission liquid 28. this has the consequence that the sound wave at the liquid level 32 is reflected and a standing sound wave is in the first transmission liquid 28 can train.

Zur Aufnahme einer zu fusionierende Zellen enthaltenden Zellsuspension 34 ist ein Behältnis 36 vorgesehen, welches einen Hohlzylinder 38 und einen koaxial in diesem angeordneten Zylinder 40 umfasst, wobei ein Innendurchmesser des Hohlzylinders 38 grösser als ein Aussendurchmesser des Zylinders 40 ist, so dass zwischen dem Hohlzylinder 38 und dem Zylinder 40 ein zylindrischer Zwischenraum 42 entsteht, welcher die Zellsuspension 34 aufnimmt. Um die koaxiale Anordnung des Zylinders 40 in dem Hohlzylinder 38 zu sichern sind in dem Zwischenraum 42 Abstandsstücke 44 vorgesehen.For receiving a cell suspension containing cells to be fused 34 a container 36 is provided which has a hollow cylinder 38 and a coaxial comprises cylinder 40 arranged in this, with an inner diameter of the hollow cylinder 38 is larger than an outer diameter of the cylinder 40, so that between the Hollow cylinder 38 and the cylinder 40 a cylindrical space 42 is created, which the cell suspension 34 takes up. About the coaxial arrangement of the cylinder 40 to be secured in the hollow cylinder 38 are spacers in the space 42 44 provided.

Bei dem hier beschriebenen bevorzugten Ausführungsbeispiel beträgt die Differenz zwischen dem Innendurchmesser des Hohlzylinders 38 und dem Aussendurchmesser des Zylinders 40 400 i, d.h. eine Ausdehnung des Zwischenraums 42, in radialer Richtung des Zylinders 40 gesehen, beträgt 200 .In the preferred embodiment described here, the difference between the inner diameter of the hollow cylinder 38 and the outer diameter of the cylinder 40 400 i, i.e. an extension of the gap 42 in the radial direction of the cylinder 40 is 200.

Damit die Zellsuspension 34 in geeigneter Weise in das Behältnis 36 eingesaugt werden kann, ist dieses sowohl an einem unteren Ende 46, wie auch an einem oberen Ende 48 offen. Das Behältnis 36 ist in der Regel so weit in die erste Übertragungsflüssigkeit 28 in der Küvette 16 eingetaucht, dass die Zellsuspension 34 den Zwischenraum 42 über eine ganze, sich in axialer Richtung erstreckende Länge des Behältnisses 36 ausfüllt und aufgrund der Kapillarwirkung auch beim Eintauchen in die erste Ubertragungsflüssigkeit 28 in dieser verbleibt. Die Übertragung der Schallwellen des Ultraschalls erfolgt dabei direkt über einen Flüssigkeit- Flüssigkeit-Kontakt zwischen der Zellsuspension 34 und der ersten Übertragungsflüssigkeit 28 am unteren Ende 46 des Behältnisses 36. Bevorzugterweise ist auch die Länge des Behältnisses 36 so gewählt, dass sie einem ganzen Vielfachen der halben Wellenlänge der Schallwelle in der Zellsuspension 34 entspricht, so dass auch hier die Ausbildung stehender Wellen gewährleistet ist.So that the cell suspension 34 can be transferred to the container 36 in a suitable manner can be sucked in, this is both at a lower end 46, as well as at an upper end 48 open. The container 36 is usually so far into the first Transfer liquid 28 immersed in the cuvette 16 that the cell suspension 34 the gap 42 over a whole length extending in the axial direction of the container 36 fills and due to the capillary effect also when immersed in the first transmission liquid 28 remains in this. The transfer of the The sound waves of the ultrasound are transmitted directly via a liquid Liquid contact between the cell suspension 34 and the first transfer liquid 28 at the bottom End 46 of the container 36. The length of the container is also preferred 36 chosen so that they are a whole multiple of half the wavelength of the sound wave corresponds in the cell suspension 34, so that here too the formation of standing Waves is guaranteed.

Der Hohlzylinder 38 sowie der Zylinder 40 dienen gleichzeitig als Elektroden zur Applikation von Fusionsimpulsen für die Elektrofusion und sind daher aus einem leitenden Material herzustellen. Zur Applikation der Fusionsimpulse ist ein Spannungsgenerator 50 vorgesehen, welcher über zwei Leitungen 52, 54 mit dem Zylinder 40 bzw. dem Hohlzylinder 38 verbunden ist.The hollow cylinder 38 and the cylinder 40 also serve as Electrodes for the application of fusion pulses for electrofusion and are therefore made of a conductive material. To apply the fusion pulse is a voltage generator 50 is provided, which via two lines 52, 54 with the Cylinder 40 or the hollow cylinder 38 is connected.

Das erfindungsgemässe Verfahren funktioniert nun folgendermassen: Das Behältnis 36 wird zuerst von der übrigen Vorrichtung getrennt mit der Zellsuspension 34 gefüllt, wobei vorzugsweise diese von dem unteren Ende 46 eingesaugt wird. Die Zellsuspension enthält dabei die zu fusionierenden Zellen in der gewünschten Konzentration. Aufgrund der Kapillarwirkung verbleibt die Zellsuspension 34 in dem Zwischenraum 42 und läuft nicht aus dem Behältnis 36 aus. Anschliessend wird das Behältnis 36 entsprechend Fig. 1 in die Ubertragungsflüssigkeit 38 in der Küvette 16 eingetaucht und danach der Frequenzgenerator 12 eingeschaltet. Die dabei erzeugten Schallwellen werden, wie bereits beschrieben, auf die Ubertragungsflüssigkeit 28 übertragen und bilden in dieser bevorzugterweise eine stehende Welle aus, an welche die Zellsuspension 34 aufgrund des Flüssigkeit-Flüssigkeit-Kontaktes am unteren Ende 46 des Behältnisses 36 angekoppelt ist. Somit bildet sich auch in der Zellsuspension 34 in dem Zwischenraum 42 eine stehende Welle aus, deren Ausbreitungsrichtung parallel zu dem Hohlzylinder 38 und dem Zylinder 40 verläuft. Dabei treten im Abstand von einer halben Wellenlänge der Schallwellenlänge aufeinanderfolgende senkrecht auf der Ausbreitungsrichtung stehende Ebenen auf, die Druckbäuchen 56 (Fig. 2) zuzuordnen sind, und zu diesen Ebenen parallele, um eine viertel Wellenlänge versetzte, ebenfalls in Abständen von einer halben Wellenlänge aufeinanderfolgende Ebenen, die Druckknoten 58 der Schallwelle zuzuordnen sind und auch als Knotenebenen bezeichnet werden. Die zunächst homogen in der Zellsuspension 34 verteilten Zellen werden in den den Druckbäuchen 56 zuge ordneten, quer zur Ausbreitungsrichtung der Schallwelle stehenden Ebenen ständig wechselnden Drucken ausgesetzt und somit beschleunigt, wohingegen Zellen, welche sich in Bereichen der ebenfalls senkrecht zur Ausbreitungsrichtung der Schallwelle stehenden Ebenen befinden, die den Knoten 58 zugeordnet sind, keine Beschleunigungen erfahren. Dies führt dazu, dass sich die zunächst homogen in der Zellsuspension 34 verteilten Zellen im Laufe der Zeit in den Knotenebenen ansammeln und dort Bereiche sehr hoher Zellkonzentration bilden. Durch entsprechende Wahl einer Amplitude der Schallwelle wird die Verdichtung der Zellen in den Knotenebenen so stark, dass die Zellen miteinander in Membrankontakt kommen.The method according to the invention now works as follows: The container 36 is first separated from the rest of the device with the cell suspension 34 filled, this preferably being sucked in from the lower end 46. the The cell suspension contains the cells to be fused in the desired concentration. Due to the capillary action, the cell suspension 34 remains in the space 42 and does not run out of the container 36. The container 36 immersed in the transmission liquid 38 in the cuvette 16 in accordance with FIG. 1 and then the frequency generator 12 is switched on. The generated sound waves are, as already described, transferred to the transfer fluid 28 and preferably form a standing wave in this, to which the Cell suspension 34 due to the liquid-liquid contact at the lower end 46 of the container 36 is coupled. This also forms in the cell suspension 34 in the space 42 from a standing wave whose direction of propagation is parallel runs to the hollow cylinder 38 and the cylinder 40. Thereby occur at a distance of half a wavelength of the sound wavelength successive perpendicular to the direction of propagation on planes to assign the pressure bulges 56 (Fig. 2) are, and parallel to these planes, offset by a quarter wavelength, also successive planes at intervals of half a wavelength, the pressure knots 58 are assigned to the sound wave and are also referred to as nodal levels. The cells, which are initially homogeneously distributed in the cell suspension 34, are transferred to the Pressure bellies 56 assigned, standing transversely to the direction of propagation of the sound wave Layers exposed to constantly changing pressures and thus accelerated, whereas Cells, which are in areas also perpendicular to the direction of propagation the sound wave standing planes, which are assigned to the node 58, none Experience accelerations. This leads to the fact that the initially homogeneous in the Cell suspension 34 dispersed cells accumulate in the nodal planes over time and there form areas of very high cell concentration. By appropriate choice an amplitude of the sound wave becomes the compression of the cells in the nodal planes so strong that the cells come into membrane contact with one another.

Nachdem sich die Zellen in den Knotenebenen angesammelt haben, werden durch die Spannungsquelle 50 ein oder mehrere Span nungsimpulse erzeugt, so dass sich zwischen dem Hohlzylinder 38 und dem Zylinder 40 in radialer Richtung des Zylinders 40 gerichtete elektrische Felder ausbilden, die dazu führen, dass die Membranen der Zellen durchlöchert werden.After the cells have accumulated in the nodal planes, will one or more voltage pulses generated by the voltage source 50, so that between the hollow cylinder 38 and the cylinder 40 in the radial direction of the cylinder 40 Form directed electric fields that lead to the membranes of the cells become perforated.

Aufgrund der Tatsache, dass der Membrankontakt bereits hergestellt ist, ist es nur noch notwendig, die Zellen weiterhin durch die Schallwelle in Membrankontakt zu halten, so dass sich nach einer gewissen Zeit Brücken zwischen den Membranen der Zellen ausgebildet haben und fusionierte Zellen entstehen.Due to the fact that the membrane contact has already been made it is only necessary for the cells to continue in membrane contact through the sound wave to hold, so that after a certain time there are bridges between the membranes of cells have formed and fused cells arise.

Anschliessend wird das Behältnis 36 aus der Küvette 16 entnommen und die Zellsuspension 34, die jetzt die Fusionsprodukte enthält, kann aus dem Behältnis 36 ausgespült oder in anderer geeigneter Weise entfernt werden.The container 36 is then removed from the cuvette 16 and the cell suspension 34, which now contains the fusion products, can out of the container 36 can be rinsed out or removed in some other suitable manner.

Weitere Einzelheiten des erfindungsgemässen Verfahrens können aus den nachfolgend beschriebenen detaillierten Ausführungsbeispielen entnommen werden.Further details of the method according to the invention can be found in can be taken from the detailed exemplary embodiments described below.

Bei den folgenden Ausführungsbeispielen wird bis auf das dritte Beispiel als erste bertragungsflüssigkit 28 eine isotone Kochsalzlösung verwendet. Bei allen Ausführungsbeispielen dient als zweite Übertragungsflüssigkeit 30 in die Vertiefung 15 eingefülltes Wasser.In the following exemplary embodiments, except for the third example an isotonic saline solution is used as the first transfer fluid kit 28. At all Exemplary embodiments serve as the second transfer fluid 30 into the depression 15 filled water.

Die Frequenz der Schallwellen liegt im Bereich von Ultraschallfrequenzen, d.h. bei ungefähr 1 MHz, wobei eine Spannungsamplitude des Frequenzgenerators 12 bei Verwendung des obengenannten Schallgebers 25 V beträgt.The frequency of the sound waves is in the range of ultrasonic frequencies, i.e. at approximately 1 MHz, where a voltage amplitude of the frequency generator 12 when using the above sounder is 25 V.

Bezüglich der Amplitude der erzeugten Schallwellen ist noch anzumerken, dass diese einen bestimmten Schwellwert übersteigen muss, damit die Zellen durch die stehenden Schallwellen in den Knotenebenen gehalten werden können und sich nicht durch Einwirkung der Schwerkraft in Richtung des unteren Endes 46 des Behältnisses 36 bewegen oder gar aus diesem austreten.Regarding the amplitude of the generated sound waves, it should be noted that that these exceed a certain threshold value must, so the cells are held in the nodal planes by the standing sound waves can and cannot move towards the lower end by the action of gravity 46 of the container 36 move or even exit from it.

Entsprechend der Schallgeschwindigkeit in den Zellsuspensionen beträgt die Wellenlänge der Schallwellen ungefähr 1500 ßm und folglich liegt der Abstand zwischen den Knotenebenen bei 750 Am.Corresponds to the speed of sound in the cell suspensions the wavelength of the sound waves is about 1500 µm and hence the distance between the nodal levels at 750 am.

1.Beispiel Fusion von Erythrozyten Eine Menge von 100 Al gepackter, d.h. als Pellet abzentrifugierter,Erythrozyten (rote Blutzellen) wird in isotoner Kochsalzlösung gewaschen und 5 Minuten lang in einer Lösung inkubiert, die 1 mg/ml Pronase (zu beziehen über die Firma SERVA GmbH, Heidelberg) enthält. Im Anschluss an die Inkubation werden die Zellen erneut in isotoner Kochsalzlösung gewaschen und entweder in 1 ml der Lösung 1 oder in 1 ml der Lösung 2 aufgenommen. Example 1 Fusion of erythrocytes A quantity of 100 Al packed, i.e. erythrocytes (red blood cells) centrifuged off as pellets become isotonic Washed saline and incubated for 5 minutes in a solution containing 1 mg / ml Pronase (available from SERVA GmbH, Heidelberg). In connection After the incubation, the cells are washed again in isotonic saline solution and taken up either in 1 ml of solution 1 or in 1 ml of solution 2.

Die Lösungen sind aus folgenden Bestanateilen zusammengesetzt: Lösung 1 enthält: Inosit : 0.28 M, Mg-Azetat: 0.25 mM, Ca-Azetat: 0,1 mM, KH2PO4: 0,36 mM und K2HP04 : 0,86 mM.The solutions are made up of the following components: Solution 1 contains: Inositol: 0.28 M, Mg acetate: 0.25 mM, Ca acetate: 0.1 mM, KH2PO4: 0.36 mM and K2HP04: 0.86 mM.

Lösung 2 enthält: Lösung 1 und zusätzlich eine mit PBS bezeichnete Lösung im Verhältnis 3:1.Solution 2 contains: Solution 1 plus one labeled PBS Solution in a ratio of 3: 1.

Die mit PBS bezeichnete Lösung enthält im wesentlichen ungefähr 10 mM Phosphatpuffer + eine isotone Lösung von NaCl und KCl. The solution labeled PBS contains essentially about 10 mM phosphate buffer + an isotonic solution of NaCl and KCl.

Lösung 1 stellt dabei ein typisches Beispiel für eine Fusionslösung dar, wie sie bei den eingangs beschriebenen Fusionsexperimenten mit Dielektrophorese aufgrund ihrer sehr geringen Leitfähigkeit verwendet werden muss, damit das angelegte Wechselfeld keine, die Zellen schädigende Erwärmung der Zellsuspension hervorruft. Lösung 2 stellt dagegen ein wesentlich mehr den physiologischen Umgebungsbedingungen der Zellen angepasstes Fusionsmedium dar«, das bei Experimenten mit Dielektrophorese aufgrund der starken Erwärmung der Suspension nicht verwendet werden kann, jedoch beim Sammeln der Zellen mit Ultraschall ohne weiteres verwendbar ist.Solution 1 is a typical example of a fusion solution as in the above-described fusion experiments with dielectrophoresis must be used due to their very low conductivity so that the applied Alternating field does not cause the cell suspension to heat up which is damaging to the cells. Solution 2, on the other hand, is much more physiological fusion medium adapted to the cells «which is used in experiments with dielectrophoresis cannot be used due to the strong heating of the suspension, however is readily usable when collecting the cells with ultrasound.

Im Anschluss daran werden 20 Al der in Lösung 1 oder in Lösung 2 aufgenommenen Erytrozyten in das Behältnis 36 überführt und dieses, wie bereits beschrieben, in die Küvette 16 eingetaucht.Subsequently, 20 μl are taken up in solution 1 or in solution 2 Erytrozyten transferred into the container 36 and this, as already described, in the cuvette 16 is immersed.

Vor dem Versuch sollte das Behältnis 26 mit einer Lösung aus 1 mg/ml Albumin in Wasser durchgespült werden, um sämtliche Oberflächen des Behältnisses 26 mit einer Beschichtung zu versehen, welche ein Haften der Zellen an diesen Oberflächen verhindern soll.Before the experiment, the container 26 should be filled with a solution of 1 mg / ml Albumin is flushed in water to cover all surfaces of the container 26 to be provided with a coating that prevents the cells from adhering to these surfaces should prevent.

Unmittelbar nach dem Eintauchen des Behältnisses 26 in die übertragungsflüssigkeit 28 wird der Frequenzgenerator 12 eingeschaltet, so dass sich das bereits beschriebene stehende Ultraschallfeld in der Zellsuspension 34 ausbildet. Nach ungefähr 10 Sekunden dauernder Einwirkung des stehenden Schallfeldes haben sich die Zellen in den Knotenebenen gesammelt.Immediately after the container 26 is immersed in the transfer liquid 28, the frequency generator 12 is switched on, so that what has already been described standing Ultrasonic field in the cell suspension 34 forms. After about 10 seconds it will take longer The cells in the node planes have the effect of the standing sound field collected.

Im Anschluss daran werden durch den Spannungsgenerator 50 drei Gleichspannungsimpulse von 80 V und einer Pulslänge von 20 As appliziert, die zu einer Durchlöcherung der Membranen der Zellen führen. Following this, three DC voltage pulses are generated by the voltage generator 50 of 80 V and a pulse length of 20 As is applied, which leads to perforation of the Cell membranes.

Zur Brückenbildung zwischen den durchlöcherten Zellmembranen wird das Schallwellenfeld für weitere 45 Sekunden aufrecht erhalten, so dass sich die Fusionsprodukte bilden können. To form bridges between the perforated cell membranes maintain the sound wave field for another 45 seconds so that the Can form fusion products.

Bei dem gesamten Fusionsprozess tritt durch die Einwirkung der Schallwellen eine Temperaturerhöhung auf, die in der Küvette 16 bei ungefähr 20C liegt, wenn bei Zimmertemperatur gearbeitet wird. Diese Temperaturerhöhung schadet den Zellen jedoch nicht. During the entire fusion process occurs through the action of the sound waves a temperature increase which is in the cuvette 16 at about 20C when is worked at room temperature. This increase in temperature damages the cells However not.

Die Endausbeute an Fusionsprodukten beträgt sowohl bei Verwendung der Lösung 1, wie auch bei Verwendung der Lösung 2, etwa 15 %. The final yield of fusion products is both when used of solution 1, as well as when using solution 2, about 15%.

2.Beispiel Herstellung von Hybridomzellen Hierzu werden Lymphozyten und Myelomzellen im Verhältnis 5:1 gemischt und mit einer Zelldichte von etwa 107 Zellen/ml entweder in der Lösung 1 oder der Lösung 2 (siehe erstes Ausführungsbeispiel) suspendiert. 20 l dieser Zellsuspension werden analog zum Beispiel 1 in das Behältnis 36 eingeführt, welches seinerseits in die erste Übertragungsflüssigkeit 28 eingetaucht wird. Nach einer Einwirkung der Schallwellen von ungefähr 15 Sekunden werden durch den Spannungsgenerator 50 drei Feldimpulse mit einer Spannung von 60 V und einer Pulslänge von 20 ßs appliziert. Analog zum ersten Ausführungsbeispiel werden die Zellen im Anschluss daran durch fortdauernde Einwirkung der Schallwellen für weitere 45 Sekunden in den Knotenebenen festgehalten, so dass die Fusionsprodukte entstehen können. Example 2: production of hybridoma cells For this purpose, lymphocytes and myeloma cells mixed in a ratio of 5: 1 and with a cell density of about 107 Cells / ml in either solution 1 or solution 2 (see first Embodiment) suspended. Analogously to example 1, 20 l of this cell suspension are put into the container 36 introduced, which in turn is immersed in the first transmission liquid 28 will. After about 15 seconds of exposure to the sound waves, the voltage generator 50 three field pulses with a voltage of 60 V and one Pulse length of 20 ßs applied. Analogously to the first embodiment, the Cells then continue to act on the sound waves for others 45 seconds held in the nodal planes, so that the fusion products arise can.

Im Anschluss daran kann die Zellsuspension 34 mit den nunmehr enthaltenen Fusionsprodukten in bereits beschriebener Weise aus dem Behältnis 36 entfernt werden.Subsequently, the cell suspension 34 can with the now contained Fusion products are removed from the container 36 in the manner already described.

Die Ausbeute an gebildeten Hybridomzellen beträgt ungefähr 10 %.The yield of hybridoma cells formed is approximately 10%.

3.Beispiel Fusion von Hefezellen Hierzu wird eine Zellsuspension aus einer 1,2 molaren Sorbi-9 tollösung hergestellt, welche ungefähr 10 Hefeprotoplasten pro ml enthält. 20 ßl dieser Zellsuspension werden wie bei den vorhergehenden Beispielen in das Behältnis 36 überführt und der Einwirkung der Schallwellen ausgesetzt. Dabei ist im Gegensatz zu den Beispielen 1 und 2 zu erwähnen, dass die erste Übertragungsflüssigkeit 28 keine isotone Kochsalzlösung, sondern eine 1,2 molare Sorbitollösung ist. 3. Example fusion of yeast cells A cell suspension is used for this made from a 1.2 molar Sorbitol solution containing approximately 10 yeast protoplasts per ml contains. 20 μl of this cell suspension are as in the previous examples transferred into the container 36 and exposed to the action of the sound waves. Included In contrast to Examples 1 and 2, it should be mentioned that the first transfer liquid 28 is not an isotonic saline solution, but a 1.2 molar sorbitol solution.

Vor Applikation dreier Fusionsimpulse von 220 V und einer Pulslänge von 10 ßs wirken die Schallwellen 10 bis 15 Sekunden auf die Zellsuspension ein und sammeln die Zellen in den Knotenebenen und im Anschluss daran wird die Einwirkung der Schallwellen wie in den bereits beschriebenen Ausführungsbeispielen noch für 45 Sekunden aufrecht erhalten.Before applying three fusion pulses of 220 V and one pulse length from 10 ßs the sound waves act on the cell suspension for 10 to 15 seconds and collect the cells in the nodal planes and then the action of the sound waves as in the exemplary embodiments already described for Maintained for 45 seconds.

Die Ausbeute an fusionierten Zellen beträgt ungefähr 5 80The yield of fused cells is approximately 580

Claims

Claims 1. A method for electrofusion of cells in which the cells contained in a cell suspension create a membrane of these cells exposed to the piercing field pulse and then at the latest with each other Membrane contact are brought, so that these cells fuse, characterized by that sound waves are generated in the cell suspension through which the cells in areas of standing perpendicular to a direction of propagation of the sound waves and planes half a wavelength apart are collected and thus the membrane contact required for fusion is established.

2. The method according to claim 1, characterized in that as sound waves standing waves are used.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the direction of propagation of the sound waves parallel to the direction of gravity runs.

4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in, that the field pulse is essentially perpendicular to the direction of propagation of the sound wave is directed.

5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that that the cells are in contact with the membrane through the sound wave field before the field pulse is applied be brought together.

6. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that that the cells, at the latest after they have been exposed to the field pulse, through the sound wave field are brought into membrane contact with one another.

7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in, that a sound frequency in the range of ultrasonic frequencies is chosen.

8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that that a small volume of cell suspension is used for fusion.

9. Device for carrying out the method. with a container for receiving a cell suspension containing the cells and with at least two electrodes in contact with the cell suspension, between which an electrical Field pulse for perforating a membrane of the cells can be generated, characterized in that that to generate sound waves that bring the cells into membrane contact a sound generator (10) coupled to the cell suspension (34) is provided.

10. The device according to claim 9, characterized in that a Extension of the cell suspension (34) in the container (36) in a direction of propagation of the sound waves in connection with the speed of sound in the suspension and a frequency of the sound waves can be selected such that that in the suspension (34) a standing sound wave field occurs.

11. The device according to claim 9 or 10, characterized in that Contact areas between the electrodes (hollow cylinder 38, cylinder 40) and the cell suspension (34) run essentially parallel to the direction of propagation of the sound waves.

12. Device according to one of the preceding claims, characterized in that that the sounder (10) is aligned so that the direction of propagation of the Sound waves running parallel to the direction of gravity.

13. Device according to one of the preceding claims, characterized in that that the cell suspension (34) via one or more transmission media (first transmission fluid 28, second transmission fluid 30, film 20) coupled to the sound generator (10) is.