DE3446997C2

DE3446997C2 -

Info

Publication number: DE3446997C2
Application number: DE3446997A
Authority: DE
Inventors: Tamas Dipl.-Agr.-Ing. Szekszard Hu Gulyas; Aniko Dipl.-Chem. Dr. Horvath; Gyoergy Dipl.-Chem. Dr. Keri; Karoly Dipl.-Chem. Dr. Nikolics; Balazs Dipl.-Chem. Dr. Szoeke; Istvan Dipl.-Chem. Dr. Budapest Hu Teplan
Original assignee: KOEZPONTI VALTO- ES HITELBANK RT INNOVACIOS ALAP BUDAPEST HU
Current assignee: KOEZPONTI VALTO- ES HITELBANK RT INNOVACIOS ALAP BUDAPEST HU
Priority date: 1983-12-23
Filing date: 1984-12-21
Publication date: 1989-12-07
Also published as: SE469032B; FI82255C; ES8607992A1; FI82255B; IT1178775B; CZ1021084A3; DK164875C; ZA849985B; FI845051A0; AT394727B; GB8432495D0; AU583803B2; NO845193L; CA1268897A; DE3446997A1; FI845051L; JPS60226898A; SE8406554L; GR82556B; DD255164A5

Description

Die Erfindung betrifft neue Gonadoliberinderivate einschließlich ihrer Salze und Komplexe, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel gemäß den voranstehenden Patentansprüchen.The invention relates to new gonadoliberin derivatives including of their salts and complexes, a process too their manufacture and pharmaceutical compositions containing them according to the preceding claims.

Diese Verbindungen sind Sexualhormone, die beispielsweise zur Verwendung bei der Vermehrung von Fischen geeignet sind.These compounds are sex hormones that are used, for example Use in the reproduction of fish are suitable.

Das Gonadoliberin (im Fachschrifttum auch als gonadotropes Hormon, Gn-RH, luteinisierendes und follikelstimulierendes Hormon, freisetzendes Hormon [releasing hormon] und LH/FSH-RH bezeichnet) und seine bekannten Derivate haben die allgemeine Eigenschaft, das luteinisierende und follikelstimulierende Hormon (LH und FSH) freisetzen zu können.Gonadoliberin (also known as gonadotropes in technical literature Hormone, Gn-RH, luteinizing and follicle stimulating Hormone, releasing hormone and LH / FSH-RH) and its known derivatives the general property, the luteinizing and follicle stimulating hormone (LH and FSH) release too can.

Zu Beginn der achtziger Jahre wurde bekannt, daß sich die Struktur des Gonadoliberins mancher Fische von der Struktur des Gonadoliberines der Säugetiere unterscheidet (J. A. King und R. P. Millar, J. Biol. Chem. 257 [1982], 10 722 bis 10 728; South-African Journal of Science 78 [1982], 124; N. Sherwood und Mitarbeiter, Proc. Natl. Acad Sci. 80 [1983], 2794 bis 2798). Dieser Unterschied wird von der in der 7- beziehungsweise 8-Stellung befindlichen Aminosäure verursacht.At the beginning of the eighties it became known that the structure of the gonadoliberin of some fish from the Structure of the gonadoliberine of mammals differs (J.A. King and R.P. Millar, J. Biol. Chem. 257 [1982], 10 722 to 10 728; South-African Journal of Science 78 [1982], 124; N. Sherwood and co-workers, Proc. Natl. Acad Sci. 80 [1983], 2794 to 2798). That difference will from the one in the 7- or 8-position Causes amino acid.

Ferner ist es aus dem Schrifttum bekannt, daß die statt des Restes von Glykokoll in der 6-Stellung Reste von bestimmten D-Aminosäuren aufweisenden Gonadoliberinderivate eine stärkere Wirkung als das Gonadoliberin selbst haben (J. Sandow und Mitarbeiter: Control of Ovulation, Butterworth, London 1978, Seiten 49 bis 70). Furthermore, it is known from the literature that the instead of the rest of glycocoll in the 6-position residues of certain Gonadoliberin derivatives containing D-amino acids have a stronger effect than the gonadoliberin itself (J. Sandow and co-workers: Control of Ovulation, Butterworth, London 1978, pages 49 to 70).

Weiterhin ist es bekannt, daß durch Austauschen des Gly cinamidrestes in der 10-Stellung gegen Amidreste mit aliphatischen Ketten die bioligische Wirksamkeit des Gonadoliberins weiter erhöht werden kann (M. Fujino und Mitarbeiter, J. Med. Chem. 16 [1973], 1144 bis 1147).Furthermore, it is known that by exchanging the Gly cinamidrestes in the 10-position against amide residues with aliphatic Chains the biological effectiveness of gonadoliberin can be further increased (M. Fujino and co-workers, J. Med. Chem. 16 [1973], 1144 to 1147).

Außerdem sind aus der US-PS 44 10 514 Gonadoliberinderivate der FormelIn addition, from US-PS 44 10 514 gonadoliberin derivatives of the formula

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-R₆-Trp-Leu- Pro-R₁₀-NHR,pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-R₆-Trp-Leu- Pro-R₁₀-NHR,

worin
R₆ (6-Stellung) auch einen Rest von D-Phenyl alanin und
R₁₀-NHR (10-Stellung) auch einen Rest von Glycinamid oder einen Alkylamidrest mit 1 bis 4 Kohlenstoff atom(en)wherein
R₆ (6-position) also a residue of D-phenyl alanine and
R₁₀-NHR (10-position) also a residue of glycinamide or an alkylamide residue with 1 to 4 carbon atoms

bedeuten können, bekannt. Diese weisen aber zwingend in der 7-Stellung einen Rest von L-Tryptophan und in der 8-Stellung einen Rest von L-Leucin auf. Als Wirkung dieser Verbindungen ist auch die Förderung des Laichens von Fischen als vage Vermutung (Spalte 7, Zeile 62 bis Spalte 8 Zeile 8) angegeben. Von ihrer Verwendung zur Herstellung von zur natürlichen oder künstlichen Befruchtung geeigneten Geschlechtsprodukten aus geschlechtsreifen Fischen ist in der genannten Druckschrift nicht einmal andeutungsweise die Rede.can mean known. But these are mandatory in a residue of L-tryptophan in the 7-position and in the 8-position a residue of L-leucine. As an effect of this Connections is also promoting fish spawning as a vague guess (column 7, line 62 to column 8 Line 8) specified. From their use to their manufacture of suitable for natural or artificial fertilization Sex products from sexually mature fish is not even hinted at in the cited publication the speech.

Weiterhin ist aus Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 [1983], Seiten 2794 bis 2798 das GonadoliberinderivatProc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 [1983], pages 2794 to 2798 the gonadoliberine derivative

<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Pro-Gly-NH₂<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Pro-Gly-NH₂

bekannt, wobei seine biologische Wirkung bei Lachsen erwähnt ist. Auch in dieser Druckschrift ist keine Rede von der Verwendung dieser Verbindung zur Herstellung von zur natürlichen oder künstlichen Befruchtung geeigneten Geschlechtsprodukten aus geschlechtsreifen Fischen.known, mentioning its biological effects on salmon is. There is no mention of this document either the use of this compound for the preparation of suitable or natural fertilization suitable sex products from sexually mature fish.

Schließlich sind in der nicht vorveröffentlichten EP 1 45 258 A1 Gonadoliberinderivate der allgemeinen FormelFinally, in the unpublished EP 1 45 258 A1 gonadoliberin derivatives of the general formula

(pyro)Glu-His-A-Ser-B-C-D-E-Pro-F,(pyro) Glu-His-A-Ser-B-C-D-E-Pro-F,

worin
A (3-Stellung) für einen Rest von L-Tryptophan,
B (5-Stellung) für einen Rest von L-Tyrosin,
C (6-Stellung) für einen Rest einer D-Amino säure von spezieller Art mit einer Guanidinogruppe, 2 Aminogruppen oder einem heterocyclischen Ring,
D (7-Stellung) für einen Rest von L-Leucin oder L-Tryptophan,
E (8-Stellung) für einen Rest von L-Glutamin oder L-Leucin und
F (10-Stellung) für einen Rest von Glycinamid oder einen niederen Alkylamid restwherein
A (3-position) for a residue of L-tryptophan,
B (5-position) for a residue of L-tyrosine,
C (6-position) for a residue of a D-amino acid of a special kind with a guanidino group, 2 amino groups or a heterocyclic ring,
D (7-position) for a residue of L-leucine or L-tryptophan,
E (8-position) for a residue of L-glutamine or L-leucine and
F (10-position) for a residue of glycinamide or a lower alkylamide residue

stehen können, beschrieben, wobei als Wirkung derselben ihre LH-RH-Agonistwirksamkeit bei Nennung der Ovulationsinduktion der Therapie bei Unfruchtbarkeit und sexueller Anregung nur bei Menschen und Säugetieren erwähnt ist. Keine der Verbindungen dieser Druckschrift hat in der 6-Stellung einen Rest von D-Phenylalanin oder D-Tyrosin.can stand, described, as an effect of the same their LH-RH agonist activity when mentioning ovulation induction Therapy for infertility and sexual Suggestion is only mentioned in humans and mammals. None of the connections in this document has in the 6-position a residue of D-phenylalanine or D-tyrosine.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Gonadoliberinderivate mit überlegenen pharmakologischen Wirkungen, insbesondere Sexualhormonwirkungen, und dabei auch Derivate der Grundverbindungen mit noch vorteilhafteren biologischen Wirkungen, ein Verfahren zur Herstellung derselben und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel zu schaffen.The invention has for its object new gonadoliberin derivatives with superior pharmacological effects, especially sex hormone effects, and also Derivatives of the basic compounds with even more advantageous ones biological effects, a process for producing the same and drugs containing these compounds create.

Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung erreicht.The above was surprisingly accomplished by the invention reached.

Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung, daß durch Austausch der in der beziehungsweise den 7- und/oder 8-Stellung(en) befindlichen Aminosäurereste des Gonadoliberins beziehungsweise durch Kombinationen dieses Austausches sich Gonadoliberinderivate mit überlgenene pharmakologischen Wirkungen, insbesondere Sexualhormonwirkungen, beispielsweise die Vermehrung von Fischen betreffend, ergeben. Ferner beruht die Erfindung auf der überraschenden Feststellung, daß die biologische Wirksamkeit der durch Austausch der in der beziehungsweise den 7- und/oder 8-Stellung(en) befindlichen Reste von Aminosäuren des Gonadoliberins sich ergebenden Gonadoliberinderivate durch Austausch des Restes von Glykokoll in der 6-Stellung gegen bestimmte D-Aminosäuren und/oder des Glycinamidrestes in der 10-Stellung gegen Alkylamidreste noch erhöht werden kann. The invention is based on the surprising finding that that by exchanging the in the 7- and / or 8-position (s) located amino acid residues of the Gonadoliberins or by combinations of these Exchanges gonadoliberin derivatives with superior pharmacological Effects, especially sex hormone effects, for example regarding the multiplication of fish. Furthermore, the invention is based on the surprising Finding that the biological effectiveness of the by Exchange of the in the 7 and / or 8 position (s) residues of amino acids of gonadoliberin resulting gonadoliberine derivatives by exchange the rest of glycocoll in the 6-position against certain D-amino acids and / or the glycinamide residue in the 10-position against alkyl amide residues can still be increased.

Bei den erfindungsgemäßen Gonadoliberinderivaten handelt es sich also um Nonapeptid-äthylamide beziehungsweise Decapeptidamide.The gonadoliberin derivatives according to the invention act So it is nonapeptide-ethylamides respectively Decapeptide amides.

Die in diesem Text verwendeten Symbole entsprechen der in der Peptidchemie üblichen Nomenklatur (siehe zum Beispiel J. Biol. Chem. 241 [1966], 527).The symbols used in this text correspond to the nomenclature common in peptide chemistry (see for example J. Biol. Chem. 241 [1966], 527).

Zweckmäßig sind die Säureadditionssalze der erfindungsgemäßen Gonadoliberinderivate solche mit pharmazeutisch beziehungsweise physiologisch brauchbaren Säuren. The acid addition salts of the invention are expedient Gonadoliberin derivatives with pharmaceutical or physiologically usable acids.

Vorteilhaft sind die Komplexe der erfindungsgemäßen Gonadoliberinderivate Metallkomplexe.The complexes of the invention are advantageous Gonadoliberin derivatives metal complexes.

Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Gonadoliberinderivate sindParticularly preferred gonadoliberin derivatives according to the invention are

<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly-NH₂ und
<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHC₂H₅<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly-NH₂ and
<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHC₂H₅

sowie ihre Säureadditionssalze und Komplexe. as well as their acid addition salts and complexes.

Zweckmäßig wird bei der Variante a) des erfindungsgemäßen Verfahrens als fester Träger ein Benzhydrylaminharz oder ein Polystyrol/Divinylbenzol-Harz mit angekuppeltem BOC-Prolin verwendet.The variant a) of the invention is useful Process as a solid support a benzhydrylamine resin or a polystyrene / divinylbenzene resin with coupled BOC proline used.

Ferner ist es bei der Variante a) des erfindungsgemäßen Verfahrens vorteilhaft, das Ablösen des geschützten Peptidproduktes vom Träger durch Behandeln mit Fluorwasserstoff und/oder durch Äthylammonolyse durchzuführen. It is also the case with variant a) of the invention Procedure advantageous, the detachment of the protected Peptide product from the carrier by treatment with hydrogen fluoride and / or to carry out by ethylammonolysis.

Das Überführen der erhaltenen Gonadoliberinderivate der allgemeinen Formel I in ihre Säureadditionssalze kann durch Umsetzen derselben mit Säuren in an sich bekannter Weise bewerkstelligt werden. Umgekehrt kann das Freisetzen der freien Gonadoliberinderivatbasen durch Umsetzen ihrer Säureadditionssalze mit Basen durchgeführt werden.The transfer of the obtained gonadoliberin derivatives of the general formula I in their acid addition salts by reacting them with acids in known per se Way to be accomplished. Conversely, the release the free gonadoliberin derivative bases by reacting their Acid addition salts can be carried out with bases.

Die Variante a) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann nach allgemein üblichen Verfahrensweisen der Peptidsynthese in der festen Phase (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc. 85 [1963], 2149 bis 2151) durchgeführt werden. Zweckmäßig wird je nach der Struktur der herzustellenden Verbindung die Art des Ausgangsmateriales gewählt, und zwar im Falle von Peptidalkylamiden chlormethylierte Polystyrol/Divinylbenzol-Harze und im Falle von Peptidsäureamiden Benzhydrylaminharze. Die einzelnen Aminosäuren können mit Hilfe von Diisopropylcarbodiimid (DIC) beziehungsweise Dicyclohexyl carbodiimid (DCC) in Form ihrer mit tert.-Butoxycarbonylgruppen (BOC) geschützten Derivate beziehungsweise nach der Verfahrensweise der aktiven Ester schrittweise an das Harz gekuppelt werden.Variant a) of the method according to the invention can according to generally accepted methods of peptide synthesis in the solid phase (Merrifield, R.B., J. Am. Chem. Soc. 85 [1963], 2149 to 2151). Appropriately depending on the structure of the connection to be made Type of raw material chosen, in the case of Peptide alkyl amides chloromethylated polystyrene / divinylbenzene resins and in the case of peptide acid amides, benzhydrylamine resins. With the help of Diisopropylcarbodiimide (DIC) or dicyclohexyl carbodiimide (DCC) in the form of their with tert-butoxycarbonyl groups (BOC) protected derivatives or according to the Procedure of the active esters gradually to the resin be coupled.

Der Verlauf der Kupplungsreaktion kann mit dem Nin hydrin-Prüfversuch (Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I., Anal. Biochem. 34 [1970], 595 bis 598 verfolgt werden. Im Falle der Anzeige freier Aminogruppen ist die Acylierung zu wiederholen. Die Zeitdauer der Kupplungsreaktionen kann je nach den Aminosäuren 1 bis 16 Stunden betragen.The course of the coupling reaction can be done with the Nin hydrin test (Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C.D., Cook, P.I., Anal. Biochem. 34 [1970], 595 to 598 are tracked. If free amino groups are displayed the acylation must be repeated. The duration of the Coupling reactions can range from 1 to depending on the amino acids 16 hours.

Das Abspalten der Schutzgruppen und das Abspalten des Peptides vom Harz kann mit flüssigem wasserfreiem Fluorwasserstoff in einem Schritt erfolgen (Sakakibara S., Shimonishi Y., Kishida Y., Okada M., Sugikara H., Bull Soc. Japan 40 [1967], 2164 bis 2167). Vorteilhaft wird das geschützte Peptidharz in propylaminhaltigem Dimethylformamid verrührt und nach der Entfernung des Lösungsmittels in der üblichen Weise mit Fluorwasserstoff behandelt. Bei Verwendung der N^im-Dinitrophenylschutzgruppe wird die Entfernung derselben zweckmäßig noch vor der mit Fluorwasserstoff vorgenommenen Abspaltung durchgeführt. Im Falle von Peptidalkylamiden werden diese vorteilhaft durch Alkylammonolyse vom Harz abgetrennt und dann je nach dem Charakter der Schutzgruppen katalytisch hydriert und/oder sauer hydrolysiert.The protecting groups and the peptide can be removed from the resin in one step using liquid anhydrous hydrogen fluoride (Sakakibara S., Shimonishi Y., Kishida Y., Okada M., Sugikara H., Bull Soc. Japan 40 [1967]), 2164 to 2167). The protected peptide resin is advantageously stirred in dimethylformamide containing propylamine and, after removal of the solvent, treated in the usual manner with hydrogen fluoride. If the N ^im dinitrophenyl protective group is used, the removal of the same is expediently carried out before the cleavage with hydrogen fluoride. In the case of peptide alkyl amides, these are advantageously separated from the resin by alkylammonolysis and then, depending on the nature of the protective groups, catalytically hydrogenated and / or hydrolyzed under acid conditions.

Das Rohprodukt kann nach dem mit Fluorwasserstoff vorgenommenen Abtrennen durch Gelfiltration gereinigt werden. Dazu kann eine Säule aus Sephadex®G25 dienen, wobei vorzugsweise mit essigsauren Lösungen eluiert wird.The crude product can be made after that with hydrogen fluoride Separation can be cleaned by gel filtration. A column made of Sephadex®G25 can be used for this, preferably is eluted with acetic acid solutions.

Zur weiteren Reinigung können Hochdruckflüssigkeits chromatographiesäulen (HPLC-Säulen) und/oder die Sili cagelchromatographie herangezogen werden.High pressure liquid can be used for further cleaning chromatography columns (HPLC columns) and / or the sili cagelchromatographie be used.

Die Reinheit der Peptide kann durch Aminosäureanalyse und mittels Dünnschichtchromatographie untersucht werden.The purity of the peptides can be determined by amino acid analysis and be examined by means of thin layer chromatography.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können in Form von Arzneimittelpräparaten vorliegen. Beispiele für Arzneimittel präparate beziehungsweise pharmazeutische Präparate sind Tabletten, Dragees, Kapseln, Suppositorien, Injektionslösungen und Nasensprays. Diese können als pharmazeutische Konfektionierungsmittel in der pharmazeutischen Industrie übliche Träger- und/oder Hilfsstoffe enthalten. Ihre Herstellung kann nach in der pharmazeutischen Technik üblichen Verfahrensweisen erfolgen.The medicaments according to the invention can be in the form of Medicinal products are available. Examples of drugs preparations or pharmaceutical preparations Tablets, dragees, capsules, suppositories, solutions for injection and nasal sprays. These can be called pharmaceutical Packaging agents in the pharmaceutical industry Contain customary carriers and / or auxiliaries. Your manufacture can according to usual in pharmaceutical technology Procedures take place.

Die erfindungsgemäßen Gonadoliberinderivate können vorteilhaft Fischen durch intramuskuläre oder subkutane Injektion verabreicht werden. Ihre zweckmäßige Dosis beträgt 0,1 µg bis 5 mg/Tier. Dies ist dem Stand der Technik für die dort beschriebenen Verbindungen nicht zu entnehmen, geschweige denn diese Indizierung zur Herstellung von zur natürlichen oder künstlichen Befruchtung geeigneten Geschlechtsprodukten aus geschlechtsreifen Fischen. Dies ist um so mehr überraschend, als alle erfindungsgemäßen Verbindungen keine Fisch- Gonadoliberin-Analoge sind. Dabei ist auch ein großer Vorteil der erfindungsgemäßen Verbindungen, daß sie bei beliebigen Fischen, also allgemein anwendbar sind.The gonadoliberin derivatives according to the invention can beneficial fishing by intramuscular or subcutaneous Injection. Your appropriate dose is 0.1 µg to 5 mg / animal. This is the state of the art for those there not to be described connections, let alone because this indexing for the production of the natural or artificial insemination of suitable sex products from sexually mature fish. This is all the more surprising than all compounds according to the invention no fish Gonadoliberin analogs are. It is also a big advantage of the compounds of the invention that they are at any Fishing, i.e. generally applicable.

Der Hauptvorteil der erfindungsgemäßen Gonadoliberinderivate besteht darin, daß sie in den 7- und 8-Stellungen für Fische charakteristische Aminosäurekombinationen aufweisen und deshalb zur Vermehrung dieser Tiergattung erfolgreich eingesetzt werden können.The main advantage of the gonadoliberin derivatives according to the invention is that they are in the 7- and 8-positions have characteristic amino acid combinations for fish and therefore successful in multiplying this species can be used.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert. Gemäß den Beispielen 1 und 2 wurden die Verbindungen nach allgemein üblichen Verfahrensweisen der Peptidsynthese in der festen Phase hergestellt. Die in den Beispielen angegebenen R_f-Werte der Dünnschichtchromatographie wurden an Kieselgel (DC, Alufolie, Merck) mit den Lösungsmittelgemischen aus den folgenden Bestandteilen in den folgenden Volumverhältnissen bestimmt:The invention is illustrated by the following examples. According to Examples 1 and 2, the compounds were prepared by generally customary methods of peptide synthesis in the solid phase. The R _f values of the thin layer chromatography given in the examples were determined on silica gel (TLC, aluminum foil, Merck) with the solvent mixtures from the following constituents in the following volume ratios:

1. Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 30 : 20 : 6 : 11
2. Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 60 : 20 : 6 : 11
3. Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 120 : 20 : 6 : 11
4. Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 240 : 20 : 6 : 11
5. n-Butanol/Essigsäure/Wasser/Äthylacetat 1 : 1 : 1 : 1
6. n-Butanol/Essigsäure/Wasser 4 : 1 : 1
7. Isopropanol/m Essigsäure 2 : 1
8. Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 5 : 5 : 1 : 3
9. n-Butanol/Essigsäure/Ammoniak
(konzentriertes Ammoniak und Wasser im Volum verhältnis von 1 : 4)/Wasser 6 : 1 : 1 : 2
10. Methyläthylketon/Essigsäure/Wasser 125 : 15 : 201. Ethyl acetate / pyridine / acetic acid / water 30: 20: 6: 11
2. Ethyl acetate / pyridine / acetic acid / water 60: 20: 6: 11
3. Ethyl acetate / pyridine / acetic acid / water 120: 20: 6: 11
4. Ethyl acetate / pyridine / acetic acid / water 240: 20: 6: 11
5. n-Butanol / acetic acid / water / ethyl acetate 1: 1: 1: 1
6. n-butanol / acetic acid / water 4: 1: 1
7. Isopropanol / m acetic acid 2: 1
8. Ethyl acetate / pyridine / acetic acid / water 5: 5: 1: 3
9. n-Butanol / acetic acid / ammonia
(Concentrated ammonia and water in a volume ratio of 1: 4) / water 6: 1: 1: 2
10. Methyl ethyl ketone / acetic acid / water 125: 15: 20

Die Beispiele 4 bis 10 betreffen die Herstellung von zur natürlichen oder künstlichen Befruchtung geeigneten Geschlechts produkten aus geschlechtsreifen Fischen unter Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen. Examples 4 to 10 relate to the production of suitable sex for natural or artificial fertilization products from sexually mature fish using of compounds according to the invention.

Example 1 D-Phe⁶, Gln⁸-Gonadoliberin respectively <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly-NH₂ M: 1243 a) Synthesis

1,25 g (1 mMol) Benzhydrylaminhydrochloridharz [0,8 mM/g, Pierce] werden 2 Stunden lang in Dichlormethan gequollen. Bei der Acylierung mit den Aminosäuren wird jeweils der folgende Zyklus wiederholt:1.25 g (1 mmol) of benzhydrylamine hydrochloride resin [0.8 mM / g, Pierce] are in dichloromethane for 2 hours swollen. Acylation with amino acids the following cycle is repeated:

Nach dem letzten Schritt beträgt das Gewicht des <Glu-His(Tos)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-D-Phe-Leu-Gln-Pro- Gly-Peptidharzes 2,28 g.
Ausbeute [ΔW]: 1,05 g (66%).
(M_{gesch. Peptid}: 1577).After the last step, the weight of the <Glu-His (Tos) -Trp-Ser (OBzl) -Tyr (OBzl) -D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly peptide resin is 2.28 g.
Yield [ Δ W]: 1.05 g (66%).
(M _peptide : 1577).

b) split off with HF

Zu dem Harz werden 3 ml Anisol und 100 mg Dithiothreit zugegeben, dann werden in dem Gemisch 30 ml HF kondensiert. Das Gemisch wird bei 0°C eine Stunde lang gerührt. Anschließend wird der Fluorwasserstoff im Stickstoffstrom entfernt, der Rückstand wird in absolutem Äther suspendiert und dann filtriert. Der feste Rückstand wird im 50 vol.-%iger Essigsäure gewaschen. Das Filtrat wird bei 37°C eingedampft. Der Rückstand wurde unmittelbar der Gelchromatographie zugeführt (s. folgenden Punkt).3 ml of anisole and 100 mg of dithiothreitol are added to the resin added, then 30 ml of HF are condensed in the mixture. The mixture is kept at 0 ° C for one hour touched. Then the hydrogen fluoride in the nitrogen stream removed, the residue is in absolute Ether suspended and then filtered. The solid residue is washed in 50 vol .-% acetic acid. The filtrate is evaporated at 37 ° C. The backlog became immediate supplied to the gel chromatography (see following point).

c) gel chromatography

Die gemäß dem vorhergehenden Punkt erhaltene Substanz wurde an einer Säule aus Sephadex®G25 (2,5×100 cm) mit 50 vol.-%iger Essigsäure als Elutionsflüssigkeit gereinigt. Die Elution wurde mittels der Absorption von UV-Licht der Wellenlänge 280 nm sowie mittels Dünnschichtchromatographie verfolgt. Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt 15 ml/h. Die Fraktionen zwischen 300 ml und 350 ml werden gesammelt und lyophilisiert. Gewicht: 690 mg (55%). The substance obtained according to the previous point was on a column made of Sephadex®G25 (2.5 × 100 cm) 50 vol .-% acetic acid purified as an elution liquid. The elution was carried out by means of the absorption of UV light Wavelength 280 nm and by means of thin layer chromatography tracked. The elution rate is 15 ml / h. The fractions between 300 ml and 350 ml are collected and lyophilized. Weight: 690 mg (55%).

d) Preparative high pressure liquid chromatography

Es wurde eine präparative HPLC-Säule der Maße 2,5×45 cm (C₁₈-Silikagel LRP-1, 13-24 µm; Whatman) verwendet. Diese wurde mit einem Gemisch aus 25 Vol.-% Methanol und 75 Vol.-% 30 vol.-%iger Essigsäure äquilibriert. Nach einstellen des Gleichgewichtes werden 230 mg der gelchromatisch gereinigten Substanz, gelöst in dem gleichen Lösungsmittelgemisch, auf die Säule aufgebracht. Eluiert wurde mit einem Methanol/Essigsäure-Gradienten, dessen Zusammensetzung sich zwischen 25 Vol.-% Methanol/75 Vol.-% 30 vol.-%iger Essigsäure und 40 Vol.-% Methanol/60 Vol.-% 30 vol.-%ige Essigsäure linear ändert.It became a preparative HPLC column of dimensions 2.5 × 45 cm (C₁₈ silica gel LRP-1, 13-24 µm; Whatman) used. This was with a mixture of 25 vol .-% methanol and 75 vol .-% 30 vol .-% acetic acid equilibrated. After adjust the equilibrium becomes 230 mg of the gel chromatic purified substance, dissolved in the same solvent mixture, applied to the column. Was eluted with a methanol / acetic acid gradient, its composition between 25 vol .-% methanol / 75 vol .-% 30 vol .-% acetic acid and 40 vol .-% methanol / 60 vol .-% 30 vol .-% acetic acid changes linearly.

Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt 2 ml/min, der Druck 3,5 · 10⁵ Pa. Die Fraktionen werden mit UV-Licht der Wellenlänge 280 nm nachgewiesen, ihr Gehalt wird dünnschicht chromatographisch kontrolliert. Das Gewicht des reinen Endproduktes D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH beträgt nach dem Lyophilisieren 133 mg. Das entspricht, auf die Gesamtmenge der Substanz bezogen, 399 mg (32%) an gereinigtem Endprodukt.
R_f¹ = 0,76; R_f⁵ = 0,68 R_f⁶ = 0,33 R_f⁷ = 0,93 R_f⁸ = 0,83The elution rate is 2 ml / min, the pressure 3.5 · 10⁵ Pa. The fractions are detected with UV light of wavelength 280 nm, their content is checked by thin layer chromatography. The weight of the pure end product D-Phe⁶, Gln⁸-GnRH after lyophilization is 133 mg. Based on the total amount of the substance, this corresponds to 399 mg (32%) of the purified end product.
R _f 1 = 0.76; R _f ⁵ = 0.68 R _f ⁶ = 0.33 R _f ⁷ = 0.93 R _f ⁸ = 0.83

Aminosäureanalyse:
Gly: 1,02, Pro: 0,95, Leu: 1,00, Phe: 1,02,
Tyr: 1,01, Ser: 0,93, His: 0,99, Glu: 1,96.
Schmp.: 175-178°C; [α] = -68° (c = 0,1, 0,1 m AcOH). Amino acid analysis:
Gly: 1.02, Pro: 0.95, Leu: 1.00, Phe: 1.02,
Tyr: 1.01, Ser: 0.93, His: 0.99, Glu: 1.96.
M.p .: 175-178 ° C; [ α ] = -68 ° ( c = 0.1, 0.1 M AcOH).

Example 2 D-Phe⁶, Gln⁸, the GlyN₂¹⁰-gonadoliberin-ethylamide respectively <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHC₂H₅ (M = 1198) a) BOC-His (DNP) -Trp-OMe (M = 622.52)

21,12 g (50 mMol) BOC-His(DNP)-CH werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0°C gekühlt und unter Rühren mit 10,32 g (50 mMol) Dicyclo hexylcarbodiimid und 7,66 g (50 mMol) N-Hydroxybenztriazol versetzt. Das Gemisch wird bei 0°C 10 Minuten lang gerührt, dann wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert.21.12 g (50 mmol) of BOC-His (DNP) -CH are dissolved in 100 ml Dimethylformamide dissolved. The solution is cooled to 0 ° C and while stirring with 10.32 g (50 mmol) of dicyclo hexylcarbodiimide and 7.66 g (50 mmol) of N-hydroxybenzetriazole transferred. The mixture is at 0 ° C for 10 minutes long stirred, then the excreted dicyclohexylurea filtered off.

12,74 g (50 mMol) H-Trp-OMe · HCl werden in 70 ml Di methylformamid gelöst, und die Lösung wird auf 0°C gekühlt. Man gibt 6,94 ml (50 mMol) Triäthylamin zu der Lösung und filtriert nach 5minütigem Rühren das ausgeschiedene Triäthylamin-hydrochlorid ab.12.74 g (50 mmol) of H-Trp-OMe · HCl are dissolved in 70 ml of Di Dissolved methylformamide, and the solution is cooled to 0 ° C. 6.94 ml (50 mmol) of triethylamine are added to the Solution and after 5 minutes stirring the separated Triethylamine hydrochloride.

Die beiden Lösungen werden vereinigt und über Nacht bei 0°C gerührt. Anderntags wird der ausgeschiedene Dicyclo hexylharnstoff [DCU] abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Das zurückbleibende Öl wird in 500 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird zuerst mit 3×100 ml eiskalter m KHSO₄-Lösung, dann mit 5×100 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung und schließlich mit 2×100 ml 10gew.-%iger NaCl-Lösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und nach dem Filtrieren zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit Petroläther verrieben, filtriert und dann getrocknet. Die erhaltene kristalline Substanz wurde in Äthylacetat gelöst und mit Petroläther ausgefällt.
Ausbeute: 27,70 g (89%).
Schmp.: 119-122°C.
[α] = +14,1° (c = 1, in Dimethylformamid). R_f⁴ = 0,62; R_f⁵ = 0,41. The two solutions are combined and stirred at 0 ° C. overnight. The next day, the excreted dicyclohexylurea [DCU] is filtered off and the filtrate is evaporated to dryness. The remaining oil is dissolved in 500 ml of ethyl acetate. The solution is first shaken with 3 × 100 ml ice-cold m KHSO₄ solution, then with 5 × 100 ml saturated sodium bicarbonate solution and finally with 2 × 100 ml 10% by weight NaCl solution. The organic phase is dried over magnesium sulfate and, after filtering, evaporated to dryness. The oily residue is triturated with petroleum ether, filtered and then dried. The crystalline substance obtained was dissolved in ethyl acetate and precipitated with petroleum ether.
Yield: 27.70 g (89%).
Mp: 119-122 ° C.
[ α ] = + 14.1 ° ( c = 1, in dimethylformamide). R _f ⁴ = 0.62; R _f ⁵ = 0.41.

b) H-His (DNP) -Trp-OMe.2 HCl M = 522.49 (free base) 595.4 l (.2 HCl)

24,9 g (40 mMol) des Dipeptids BOC-His(DNP)-Trp-OMe werden in 100 ml Methanol gelöst. Zu der Lösung werden 100 ml 4 n methanolische Salzsäure zugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 30 Minuten lang stehen gelassen. Das in dieser Zeit auskristallisierende Dipeptidester hydrochlorid wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und dann getrocknet.
Ausbeute: 21,91 g (92%).
Schmp.: 198-202°C.
[α] = 0,49° (c = 1, in Dimethylformamid). R_f³ = 0,46; R_f⁴ = 0,18.24.9 g (40 mmol) of the dipeptide BOC-His (DNP) -Trp-OMe are dissolved in 100 ml of methanol. 100 ml of 4N methanolic hydrochloric acid are added to the solution. The mixture is left at room temperature for 30 minutes. The dipeptide ester hydrochloride which crystallizes out during this time is filtered off, washed with ether and then dried.
Yield: 21.91 g (92%).
Mp: 198-202 ° C.
[ α ] = 0.49 ° ( c = 1, in dimethylformamide). R _f ³ = 0.46; R _f ⁴ = 0.18.

c) <Glu-His (DNP) -Trp-OMe M = 633.60

4,85 g (36,8 mMol) L-Pyroglutaminsäure, 7,58 g Dicyclohexylcarbodiimid und 5,63 g N-Hydroxybenztriazol werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst. Das Gemisch wird bei 5-10°C 10 Minuten lang gerührt und dann der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff [DCU] abfiltriert.4.85 g (36.8 mmol) L-pyroglutamic acid, 7.58 g Dicyclohexylcarbodiimide and 5.63 g of N-hydroxybenzetriazole are dissolved in 100 ml of dimethylformamide. The mixture is stirred at 5-10 ° C for 10 minutes and then the filtered out precipitated dicyclohexylurea [DCU].

20,84 g (35 mMol) H-His(DNP)-Trp-OMe · 2 HCl werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst und zu der Lösung werden 9,72 ml (70 mMol) Triäthylamin zugegeben. Nach 5minütigem Rühren wird das ausgeschiedene Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert. Die beiden Lösungen werden vereinigt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anderntags wird das Gemisch mit 90 ml Aceton versetzt, die sich ausscheidende unlösliche Substanz wird abfiltriert. Das Filtrat wird eingedampft. Das zurückbleibende Öl wird mit Äthylacetat verrieben und dann getrocknet. Die trockene kristalline Substanz wird mit 3×25 ml Wasser gewaschen und erneut getrocknet. Die Substanz kann durch kochendes Lösen in Äthylacetat und Abkühlen der Lösung umkristallisiert werden.
Ausbeute: 18,42 g (83,1%).
Schmp.: 148-151°C.
[α] = +5,2° (c = 1, in Dimethylformamid). R_f³ = 0,53; R_f⁴ = 0,38. 20.84 g (35 mmol) of H-His (DNP) -Trp-OMe · 2 HCl are dissolved in 100 ml of dimethylformamide and 9.72 ml (70 mmol) of triethylamine are added to the solution. After stirring for 5 minutes, the precipitated triethylamine hydrochloride is filtered off. The two solutions are combined and stirred overnight at room temperature. The next day, 90 ml of acetone are added to the mixture, and the insoluble substance which separates out is filtered off. The filtrate is evaporated. The remaining oil is triturated with ethyl acetate and then dried. The dry crystalline substance is washed with 3 × 25 ml of water and dried again. The substance can be recrystallized by boiling it in ethyl acetate and cooling the solution.
Yield: 18.42 g (83.1%).
Mp: 148-151 ° C.
[ α ] = + 5.2 ° ( c = 1, in dimethylformamide). R _f ³ = 0.53; R _f ⁴ = 0.38.

d) <Glu-His-Trp-OMe M = 466.50

15,84 g des geschützten Tripeptids <Glu-His(DNP)- Trp-OMe werden in einem Gemisch aus 100 ml Dimethylformamid und 40 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 4 ml Mercaptoäthanol versetzt und dann mit Triäthylamin auf pH 8 eingestellt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 30 Minuten lang stehengelassen und dann im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit Äther verrieben, filtriert und getrocknet. Die erhaltene Substanz wird in wenig Methanol gelöst und durch Zusatz von Äther ausgefällt. Die Kristalle werden abfiltriert und getrocknet.
Ausbeute: 10,92 g (93,6%)
Schmp.: 228-232°C
[α] = +4,04° (c = 0,42, in Dimethylformamid). R_f² = 0,30.15.84 g of the protected tripeptide <Glu-His (DNP) - Trp-OMe are dissolved in a mixture of 100 ml of dimethylformamide and 40 ml of water. The solution is mixed with 4 ml of mercaptoethanol and then adjusted to pH 8 with triethylamine. The mixture is left at room temperature for 30 minutes and then evaporated to dryness in vacuo. The oily residue is triturated with ether, filtered and dried. The substance obtained is dissolved in a little methanol and precipitated by adding ether. The crystals are filtered off and dried.
Yield: 10.92 g (93.6%)
Mp: 228-232 ° C
[ α ] = + 4.04 ° ( c = 0.42, in dimethylformamide). R _f ² = 0.30.

e) <Glu-His-Trp-N₂H₃ M = 466.51

9,33 g (20 mMol) des Tripeptids <Glu-His-Trp-OMe werden in 250 ml Methanol und zu der Lösung werden 20 ml 98 vol-.%iges Hydrazinhydrat zugegeben. Das Reaktiongemisch wird 3 Stunden lang bei 40°C, dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anderntags wird die ausgeschiedene Substanz abfiltriert, mit kaltem Methanol gewaschen und dann getrocknet.
Ausbeute: 7,58 g (81,2%)
Schmp.: 166-169°C
[α] = -22,3° (c = 0,5, in Dimethylformamid). R_f¹ = 0,50; R_f² = 0,14.9.33 g (20 mmol) of the tripeptide <Glu-His-Trp-OMe are added in 250 ml of methanol and 20 ml of 98% by volume hydrazine hydrate are added to the solution. The reaction mixture is stirred at 40 ° C for 3 hours, then at room temperature overnight. The next day the separated substance is filtered off, washed with cold methanol and then dried.
Yield: 7.58 g (81.2%)
Mp: 166-169 ° C
[ α ] = -22.3 ° ( c = 0.5, in dimethylformamide). R _f 1 = 0.50; R _f ² = 0.14.

f) <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OMe M = 716.8

7,0 g (15 mMol) <Glu-His-Trp-N₂H₃ (Produkt des Schrittes e) werden in 60 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0°C gekühlt und unter Rühren mit 7,5 ml (45 mMol) 6n HCl versetzt. Dann tropft man langsam die gesättigte wäßrige Lösung von 1,035 g (15 mMol) NaNO₂ zu dem Gemisch und rührt weitere 15 Minuten bei 0°C. Dann versetzt man das Gemisch mit der Lösung von 4,78 g (15 mMol) H-Ser-Tyr-OMe · HCl in 15 ml Dimethylformamid und stellt den pH-Wert mit 6,25 ml (45 mMol) Triäthylamin auf neutral ein. Das Gemisch wird über Nacht bei 0-4°C gerührt, anderntags im Vakuum zur Trockne eingedampft und der ölige Rückstand wird mit Äther verrieben.7.0 g (15 mmol) <Glu-His-Trp-N₂H₃ (product of Step e) are in 60 ml of dimethylformamide solved. The solution is cooled to 0 ° C and 7.5 ml (45 mmol) of 6N HCl were added with stirring. Then slowly drop the saturated aqueous solution of 1.035 g (15 mmol) NaNO₂ to the mixture and stirred further 15 minutes at 0 ° C. Then the mixture is added with the solution of 4.78 g (15 mmol) of H-Ser-Tyr-OMe · HCl in 15 ml of dimethylformamide and adjusts the pH 6.25 ml (45 mmol) of triethylamine to neutral. The mixture is stirred overnight at 0-4 ° C, the next day in vacuo evaporated to dryness and the oily residue triturated with ether.

Das Gewicht des pulverförmigen Produktes beträgt 12,1 g (100%). Das Chromatogramm zeigt Flecken von zwei geringfügigen Verunreinigungen, jedoch dann das Produkt ohne zwischenzeitliche Reinigung zum Hydrazid umgesetzt werden, welches gut kristallisiert. Physikalische Daten der zur Kontrolle aus Methanol umkristallisierten Substanz:
Schmp.: 188-190°C
[α] = -3,48° (c = 1, Dimethylformamid). R_f¹ = 0,58; R_f² = 0,26.The weight of the powdered product is 12.1 g (100%). The chromatogram shows spots of two minor impurities, but then the product can be converted to the hydrazide without intermediate cleaning, which crystallizes well. Physical data of the substance recrystallized from methanol for control:
Mp: 188-190 ° C
[ α ] = -3.48 ° ( c = 1, dimethylformamide). R _f 1 = 0.58; R _f ² = 0.26.

g) <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-N₂H₃ M = 716.8

12 g des rohen, pulverisierten Pentapeptidesters <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OMe werden in 200 ml Methanol gelöst und zu der Lösung 10 ml 98 vol.-%iges Hydrazinhydrat zugegeben. Das Gemisch wird bei 40°C drei Stunden lang und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, die ausgefallenen Kristalle werden abfiltriert und im Exsikkator über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Die getrocknete kristalline Substanz wird in 250 ml 0,5 n HCl gelöst, die Lösung mit konzentrierter Sodalösung auf pH 8 eingestellt und bei 0°C zwei Stunden lang stehen gelassen. Die ausgefallenen Kristalle werden abfiltriert, mit eiskaltem Wasser gewaschen und dann getrocknet.
Ausbeute: 6,12 g (auf beide Schritte bezogen 56,9%).
Schmp.: 205-206°C.
[α] = -21,51° (c = 1, Dimethylformamid). R_f¹ = 0,39; R_f² = 0,14.12 g of the crude, pulverized pentapeptide ester <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OMe are dissolved in 200 ml of methanol and 10 ml of 98% by volume hydrazine hydrate are added to the solution. The mixture is stirred at 40 ° C. for three hours and then overnight at room temperature, the precipitated crystals are filtered off and dried in a desiccator over concentrated sulfuric acid. The dried crystalline substance is dissolved in 250 ml of 0.5N HCl, the solution is adjusted to pH 8 with concentrated sodium carbonate solution and left to stand at 0 ° C. for two hours. The precipitated crystals are filtered off, washed with ice-cold water and then dried.
Yield: 6.12 g (56.9% based on both steps).
Mp: 205-206 ° C.
[ α ] = -21.51 ° ( c = 1, dimethylformamide). R _f 1 = 0.39; R _f ² = 0.14.

Hydrazinstickstoff:
berechnet: 3,91%
gefunden: 3,79%, 3,76%.Hydrazine nitrogen:
calculated: 3.91%
found: 3.79%, 3.76%.

h) Z-Gln-Pro-NHC₂H₅ M = 405.4

3,242 g Prolinäthylamid (hergestellt aus 22,8 mMol Z-Pro-NHC₂H₅ durch Hydrieren) werden in 70 ml Tetrahydrofuran gelöst und zu der Lösung 5,60 g (20 mMol) Z-Gln-OH und 1,034 g N-Hydroxybenztriazol zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird auf dem Eisbad gekühlt und unter Rühren mit der Lösung von 5,34 g (25,9 mMol) Dicyclo hexylcarbodiimid in 50 ml Tetrahydrofuran versetzt. Das Reaktionsgemisch wird auf dem Eisbad 5 Stunden lang, dann bei Raumtemperatur noch 20 Stunden lang gerührt, filtriert und das Filter mit Tetrahydrofuran nachgewaschen. Das Filtrat wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand in Chloroform gelöst. Die Lösung wird mit 3×35 ml mit der fünffachen Menge Wasser verdünntem Ammoniak, dann mit 2×20 ml Wasser, anschließend mit 3×35 ml Salzsäure und schließlich erneut mit 2×20 ml Wasser gewaschen. Dann wird die organische Phase über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filter wird mit Chloroform nachgewaschen. Dann wird die Lösung zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wird in einem Gemisch aus 35 ml Tetrahydrofuran und 50 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung filtriert. Nach Abdampfen des Lösungsmittels bleibt ein Öl zurück, das mit 100 ml Äther kristallisiert wird. Die feste Substanz wird auf dem Filter mit Äther gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Man erhält 7,68 g (95%) Produkt.
R_f⁶ = R_f¹ = 0,73.3.242 g of proline ethyl amide (made from 22.8 mmol of Z-Pro-NHC₂H₅ by hydrogenation) are dissolved in 70 ml of tetrahydrofuran and 5.60 g (20 mmol) of Z-Gln-OH and 1.034 g of N-hydroxybenzotriazole are added. The reaction mixture is cooled on an ice bath and the solution of 5.34 g (25.9 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide in 50 ml of tetrahydrofuran is added with stirring. The reaction mixture is stirred on the ice bath for 5 hours, then at room temperature for a further 20 hours, filtered and the filter is washed with tetrahydrofuran. The filtrate is evaporated in vacuo and the residue is dissolved in chloroform. The solution is washed with 3 × 35 ml of ammonia diluted with five times the amount of water, then with 2 × 20 ml of water, then with 3 × 35 ml of hydrochloric acid and finally again with 2 × 20 ml of water. Then the organic phase is dried over anhydrous sodium sulfate and filtered. The filter is washed with chloroform. Then the solution is evaporated to dryness. The oily residue is dissolved in a mixture of 35 ml of tetrahydrofuran and 50 ml of ethyl acetate and the solution is filtered. After evaporation of the solvent, an oil remains, which is crystallized with 100 ml of ether. The solid substance is washed on the filter with ether and then dried in vacuo. 7.68 g (95%) of product are obtained.
R _f ⁶ = R _f ¹ = 0.73.

i) Z-Leu-Gln-Pro-NHC₂H₅ M = 518.57

4,5 g (11 mMol) des geschützten Dipeptidamids Z-Gln-Pro-NHC₂H₅ werden in 30 ml Eisessig gelöst. Zu der Lösung werden 55 ml 4n eisessigsaure Bromwasserstoffsäure zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 1 1/2 Stunden lang stehen gelassen, dann mit 250 ml Äther versetzt und wieder eine Stunde stehen gelassen. Die über dem Niederschlag stehende Flüssigkeit wird dekantiert, der Rückstand mit 100 ml Äther aufgeschlämmt, nach 15 Minuten abfiltriert und reichlich mit Äther gewaschen. Die hygroskopische feste Substanz wird im Vakuum über Phosphorpentoxyd und Natriumhydroxyd getrocknet. Ausbeute: 4,9 g (hygroskopisch).4.5 g (11 mmol) of the protected dipeptide amide Z-Gln-Pro-NHC₂H₅ are dissolved in 30 ml of glacial acetic acid. To the 55 ml of 4N glacial hydrobromic acid are added to the solution. The reaction mixture is at room temperature Let stand for 1 1/2 hours, then with 250 ml ether moved and left again for an hour. The liquid standing above the precipitation is decanted, the residue slurried with 100 ml ether, after Filtered off for 15 minutes and washed thoroughly with ether. The hygroscopic solid substance is vacuumed over Dried phosphorus pentoxide and sodium hydroxide. Yield: 4.9 g (hygroscopic).

3.8 g (11mMol) des erhaltenen Dipeptidäthylamid hydrobromids werden in 150 ml Chloroform suspendiert. Zu der Suspension werden 7,0 ml Triäthylamin zugegeben. Dann wird das Reaktionsgemisch mit der Lösung von 6,4 g Z-Leu-pentachlorphenylester in 65 ml Chloroform versetzt und über Nacht gerührt. Anderntags wird das Reaktionsgemisch mit n Salzsäure, gesättigter Kochsalzlösung, 2n Ammoniak und schließlich wieder mit gesättigter Kochsalzlösung extrahiert. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther verrieben, die Festsubstanz abfiltriert, mit Äther gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Man erhält 4,6 g (81%) Rohprodukt.3.8 g (11 mmol) of the dipeptideethylamide obtained hydrobromids are suspended in 150 ml of chloroform. 7.0 ml of triethylamine are added to the suspension. Then the reaction mixture with the solution of 6.4 g Z-Leu-pentachlorophenyl ester in 65 ml of chloroform and stirred overnight. The next day the reaction mixture with n hydrochloric acid, saturated saline, 2n ammonia and finally again with saturated saline extracted. The organic phase is over dried anhydrous sodium sulfate and then in vacuo evaporated. The residue is triturated with ether Solid substance filtered off, washed with ether and then dried in vacuo. 4.6 g (81%) of crude product are obtained.

j) H-Leu-Gln-Pro-NHC₂H₅ · HBr M = 465.5

Von dem auf die unter Punkt i) beschriebene Weise hergestellten Tripeptid Z-Leu-Gln-Pro-NHC₂H₅ wird die Schutzgruppe ohne zwischenzeitliche Reinigung entfernt. Zu diesem Zweck wird das Produkt in 10 ml 4n eisessigsaurer Bromwasserstofflösung gelöst. Die Lösung wird bei Raumtemperatur eine Stunde lang gerührt und dann das Produkt durch Zusatz von 100 ml wasserfreiem Äther ausgefällt. Die Substanz wird abfiltriert und im Exsikkator getrocknet. Das Produkt ist ein gelbes hygroskopisches Pulver.
Ausbeute: 3,54 g (76%)
R_f⁸ = 0,42; R_f⁶ = 0,13; R_f⁵ = 0,55; R_f¹ = 0,1.The protective group is removed from the tripeptide Z-Leu-Gln-Pro-NHC₂H₅ prepared in the manner described under point i) without intermediate cleaning. For this purpose, the product is dissolved in 10 ml of 4N glacial hydrogen bromide solution. The solution is stirred at room temperature for one hour and then the product is precipitated by adding 100 ml of anhydrous ether. The substance is filtered off and dried in a desiccator. The product is a yellow hygroscopic powder.
Yield: 3.54 g (76%)
R _f ⁸ = 0.42; R _f ⁶ = 0.13; R _f ⁵ = 0.55; R _f 1 = 0.1.

k) BOC-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHC₂H₅ M = 631.74

2,33 g (5 mMol) des Tripeptidhydrochlorids H-Leu-Gln- Pro-NHC₂H₅ · HBr werden in 5 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0°C gekühlt und zuerst mit 0,70 ml (0,5 mMol) Triäthylamin und dann mit der Lösung von 2,57 ml (5 mMol) BOC-D-Phe-pentachlorphenylester in 10 ml Dimethylformamid versetzt. Der pH-Wert der Lösung wird mit Trimethylamin auf 7 bis 8 gestellt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt. Während dieser Zeit wird der pH-Wert mit Triäthylamin auf dem angegebenen Wert gehalten. Dann wird die Lösung im Vakuum eingedampft, der Rückstand wird in 100 ml Chloroform gelöst und die Lösung mit 10×10 ml 0,1m Ammoniak gewaschen. Dann wird die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet, abfiltriert und eingedampft. Der ölige Rückstand kann durch Behandeln mit Äther in ein Pulver überführt werden. Das getrocknete Rohprodukt wiegt 2,81 g (89%). Die Schutzgruppe wird ohne weitere Reinigung entfernt.2.33 g (5 mmol) of the tripeptide hydrochloride H-Leu-Gln- Pro-NHC₂H₅ · HBr are dissolved in 5 ml of dimethylformamide. The Solution is cooled to 0 ° C and first with 0.70 ml (0.5 mmol) Triethylamine and then with the solution of 2.57 ml (5 mmol) BOC-D-Phe-pentachlorophenyl ester in 10 ml of dimethylformamide transferred. The pH of the solution is adjusted with trimethylamine set to 7 to 8. The Mixture is stirred at room temperature for 48 hours. During this time, the pH with triethylamine kept at the specified value. Then the solution evaporated in vacuo, the residue is in 100 ml Chloroform dissolved and the solution with 10 × 10 ml 0.1m Washed ammonia. Then the organic phase dried over sodium sulfate, filtered off and evaporated. The oily residue can be treated with ether in one Powder are transferred. The dried raw product weighs 2.81 g (89%). The protective group is removed without further cleaning away.

l) H-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHC₂H₅ · TFA M = 645.65

1,26 g (2 mMol) des Tetrapeptids BOC-D-Phe-Leu-Gln- Pro-NHC₂H₅ werden in 10 ml Trifluoressigsäure (TFA) gelöst. Die Lösung wird bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gerührt. Die Trifluoressigsäure wird dann im Vakuum schnell entfernt. Der Rückstand wird an einer Silikagelsäule mit einem im Volumverhältnis 4 : 1 : 1 bereiteten Gemisch aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser chromatographiert. Die Produktfraktionen werden gesammelt und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in wenig Wasser gelöst und dann lyo philisiert.
Ausbeute: 880 mg (68%)
R_f² = 0,25; R_f⁶ = 0,35.
Schmp.: 142°C; [α] = -66° (c = 0,1, Dimethylformamid). 1.26 g (2 mmol) of the tetrapeptide BOC-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHC₂H₅ are dissolved in 10 ml of trifluoroacetic acid (TFA). The solution is stirred at room temperature for 20 minutes. The trifluoroacetic acid is then quickly removed in vacuo. The residue is chromatographed on a silica gel column using a 4: 1: 1 by volume mixture of n-butanol, acetic acid and water. The product fractions are collected and evaporated in vacuo. The residue is dissolved in a little water and then lyophilized.
Yield: 880 mg (68%)
R _f ² = 0.25; R _f ⁶ = 0.35.
Mp: 142 ° C; [ α ] = -66 ° ( c = 0.1, dimethylformamide).

m) <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHC₂H₅ M = 1199

286 g (0,4 mMol) des gemäß Schritt g) hergestellten Pentapeptidhydrazids <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-N₂H₃ werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf -10°C gekühlt und unter Rühren mit 0,27 ml 6n Salzsäure und dann mit der gesättigten wäßrigen Lösung von 30,2 mg NaNO₂ versetzt. Nach 5 Minuten gibt man die mit einem Gemisch aus 1 ml Dimethylformamid und 0,27 ml Triäthylamin bereitete und auf -10°C gekühlte Lösung von 258 mg (0,4 mMol) H-D-Phe-Leu-Gln- Pro-NHC₂H₅ · TFA zu dem Gemisch zu. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde lang bei -5°C, dann eine weitere Stunde lang bei 0°C gerührt, wobei der pH-Wert erforderlichenfalls durch Zusatz von Triäthylamin neutral gehalten wird. Schließlich läßt man die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen und dampft das Reaktionsgemisch im Vakuum ein.286 g (0.4 mmol) of that prepared according to step g) Pentapeptide hydrazides <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-N₂H₃ are dissolved in 10 ml of dimethylformamide. The solution is cooled to -10 ° C and with stirring with 0.27 ml 6n hydrochloric acid and then with the saturated aqueous Solution of 30.2 mg of NaNO₂ added. After 5 minutes there one with a mixture of 1 ml of dimethylformamide and 0.27 ml of triethylamine was prepared and at -10 ° C cooled solution of 258 mg (0.4 mmol) of H-D-Phe-Leu-Gln- Pro-NHC₂H₅ · TFA to the mixture. The reaction mixture is at -5 ° C for one hour, then another hour long at 0 ° C, taking the pH if necessary neutral by adding triethylamine is held. Finally the temperature is left on Rise to room temperature and the reaction mixture evaporates in a vacuum.

Das nach dem Verdampfen erhaltene Cl wird in 5 ml 0,2n Essigsäure gelöst und an einer Säule aus Sephadex® G25 (2×95 cm) mit 0,2n Essigsäure chromatographiert. Die entsprechenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert.
Ausbeute: 298 mg (62%)
R_f¹ = 0,74; R_f⁵ = 0,65; R_f⁶ = 0,37; R_f⁸ = 0,80.The Cl obtained after evaporation is dissolved in 5 ml of 0.2N acetic acid and chromatographed on a column of Sephadex® G25 (2 × 95 cm) with 0.2N acetic acid. The appropriate fractions are collected and lyophilized.
Yield: 298 mg (62%)
R _f 1 = 0.74; R _f ⁵ = 0.65; R _f ⁶ = 0.37; R _f ⁸ = 0.80.

Aminosäurenanalyse
Ser 0,89, Pro 0,97, Leu 1,00, Phe 0,99,
Glu 1,98, His 1,01, Tyr 1,03, Trp 0,91. Amino acid analysis
Ser 0.89, Pro 0.97, Leu 1.00, Phe 0.99,
Glu 1.98, His 1.01, Tyr 1.03, Trp 0.91.

Example 3

Bereiten von Injektionslösungen für intramuskuläre, subkutane oder intravenöse Verabreichung.Preparation of injection solutions for intramuscular, subcutaneous or intravenous administration.

a) The gonadoliberin derivative of the general formula I, for example that of Example 1, is dissolved in a concentration of 1 to 10 mg / ml in distilled water, physiological sodium chloride solution or buffered aqueous solution. The solution is sterile filtered and then filled into ampoules in volumes containing 50 to 500 μg of active ingredient and lyophilized, whereupon the ampoules are sealed.
The application can be done as follows.
Before use, the substance contained in the ampoule is dissolved in 1 to 10 ml of distilled water and an amount corresponding to the necessary dose is injected from the solution.
b) from the gonadoliberin derivative of the general formula I, for example that of Example 1 with a 0.9% by weight NaCl and 0.9% by weight benzyl alcohol containing aqueous solution with a solution a concentration of 20 to 500 µg / ml and this is filled into ampoules. The ampoules are closed. The manufactured in this way Preparations are for immediate administration suitable.

Example 4 Induced artificial multiplication of the sturgeon (Acipenser ruthenus)

Es wurden aus dem Fischbestand eines gegebenen Lebensraumes geschlechtsreife Fische ausgewählt und zur Vermehrungs station transportiert. Die Fische wurden nach Geschlechtern sortiert und dann wurde der Reifegrad der Eizellen der weiblichen Fische bestimmt. Ein Fisch ist zum Einleiten der Ovulation reif, wenn sich der Zellkern der Eizellen an der Peripherie der Eizelle befindet. Der Reifegrad des Spermas der Milchner wurde nicht gesondert untersucht, weil im Fischbestand eines vorgegebenen Lebensraumes die Geschlechtsprodukte der männlichen und der weiblichen Individuen praktisch in identischem Reifezu stand vorliegen. Als die Fische zur Ovulation reif waren, wurden sie zusammen mit den männlichen Fischen mit dem DecapeptidIt was from the fish population of a given habitat sexually mature fish selected and reproductive station transported. The fish were sorted by sex sorted and then the maturity level of the Egg cells of female fish determined. A fish is for Initiation of ovulation ripe when the nucleus of the Egg cells are located on the periphery of the egg cell. The degree of maturity the milk sperm was not examined separately, because in the fish stock of a given habitat the sex products of the male and the female individuals practically in identical maturity stood there. When the fish were ready to ovulate, they were together with the male fish with the Decapeptide

<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly-NH₂<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly-NH₂

in einer 1maligen Dosis von 70 µg/Fisch behandelt.treated in a single dose of 70 µg / fish.

Wenn die Fische zum Einleiten der Ovulation noch nicht reif waren, wurden sie auf natürlicher Laichtemperatur gehalten und mindestens 2mal, höchstens jedoch 10mal mit je 10 µg der genannten Verbindung so lange behandelt, bis der Zellkern aus dem Zentrum an die Peripherie gewandert war. Die Anzahl der Behandlungen hing davon ab, wie weit der Reifezustand der Eizellen noch vom ovulationsreifen Zustand entfernt war. Dieser Reifevorgang nahm im Temperaturbereich von 12 bis 18°C mindestens 100, höchstens jedoch 650 Tagesgrade (die Tagesgrade errechnen sich durch Multiplizieren der Anzahl der Tage mit der Durchschnittstemperatur des Wassers) in Anspruch.If the fish have not yet started ovulation when ripe, they were kept at natural spawning temperature and at least twice, but no more than 10 times each treated 10 µg of the compound mentioned until the cell nucleus migrated from the center to the periphery was. The number of treatments depended on how far the maturity of the ovum is still from the ovulation stage Condition was removed. This ripening took place in the temperature range from 12 to 18 ° C at least 100, at most however 650 daily degrees (the daily degrees are calculated by multiplying the number of days with the average temperature of water).

24 bis 32 Stunden nach der Verabreichung der letzten Dosis erfolgte die Ovulation. In den folgenden 40 bis 60 Minuten wurden die Geschlechtsprodukte isoliert.24 to 32 hours after the last administration Dose ovulation occurred. In the next 40 to 60 minutes the sex products were isolated.

Example 5 Induced artificial reproduction of perch (Perca fluviatilis)

Es wurden aus dem Fischbestand geschlechtsreife Fische ausgewählt und zur Vermehrungsstation transportiert. Auf die im Beispiel 4 beschriebene Weise wurde der Reifezustand der Geschlechtsprodukte bestimmt, die Geschlechter wurden jedoch nicht voneinander getrennt. Die zur Ovulation reifen Fische wurden zusammen mit den männlichen Fischen mit dem DecapeptidThe fish population became sexually mature fish selected and transported to the propagation station. On the manner described in Example 4 became ripe of sex products determines the sexes however, were not separated. The one for ovulation mature fish were along with the male fish with the decapeptide

in einer 1maligen Dosis von 20 µg/Fisch behandelt.in a Single dose of 20 µg / fish treated.

Die zum Einleiten der Ovulation noch nicht reifen Fische wurden auf natürlicher Laichtemperatur gehalten und mindestens 2mal, höchstens jedoch 10mal mit je 2 µg der genannten Verbindung behandelt. Die Behandlung wurde so lange fortgesetzt, bis in den Eiern der Zellkern vom Zentrum an die Peripherie gewandert war. Die Anzahl der Behandlungen hing davon ab, wie weit der Reifezustand der Eizellen noch von der Ovulationsreife entfernt war. Der Reifevorgang erforderte im Temperaturbereich von 12 bis 16°C mindestens 100, höchstens 400 Tagesgrade.Not yet ripen to induce ovulation Fish were kept at natural spawning temperature and at least twice, but at most 10 times with 2 µg each treated connection. The treatment was like this long continued until in the eggs the nucleus from the center had migrated to the periphery. The number of treatments depended on how far the maturity of the Oocytes were still not ready for ovulation. The Ripening required in the temperature range from 12 to 16 ° C at least 100, at most 400 daily degrees.

24 bis 36 Stunden nach der Verabreichung der letzten Dosis erfolgte das Laichen. Barsche laichen unter den Bedingungen im Becken gut, so daß ein Abmelken der Geschlechtsprodukte nicht erforderlich war.24 to 36 hours after the last administration The spawning took place in dose. Perch spawn under the conditions well in the pelvis, so that a milking of the sex products was not required.

Example 6 Induced artificial reproduction of mackerel (Trachurus trachurus)

Es wurden von im Monat November von Adriafischern lebend gefangenen Fettmakrelen die mindestens 24 cm langen Exemplare ausgesucht und zur Vermehrungsstation transportiert (Fische dieser Größe sind schon geschlechtsreif). In jedem Fisch wurde eine 1malige Dosis von 10 µg des DecapeptidesIt was made in November by Adriatic fishermen Live mackerel caught at least 24 cm long Specimens selected and transported to the propagation station (Fish of this size are already sexually mature). In each Fish became a single 10 µg dose of the decapeptide

injiziert. Im Temperaturbereich von 18 bis 24°C erfolgte die Ovulation innerhalb 24 Stunden. Die Geschlechtsprodukte wurden innerhalb 2 Stunden isoliert. injected. Ovulation occurred in the temperature range from 18 to 24 ° C within 24 hours. The sex products were within 2 hours isolated.

Bei der Vermehrung von Makrelen kann auf die Feststellung der Geschlechter und der unterschiedlichen Reifezustände verzichtet werden, weil geschlechtsreife Fische in praktisch unbegrenzter Menge zur Verfügung stehen.When propagating mackerel can on the finding the sexes and the different states of maturity to be dispensed with because sexually mature fish are available in practically unlimited quantities.

Example 7 Induced artificial reproduction of pike (Esox Lucius)

Es wurden aus dem Fischbestand geschlechtsreife Fische ausgesucht und zur Vermehrungsstation transportiert. Die Fische wurden nach Geschlechtern getrennt und der Reifezustand der Geschlechtsprodukte wurde auf die im Beispiel 4 beschriebene Weise untersucht. Die zur Ovulation reifen Fische wurden zusammen mit den männlichen Fischen mit dem DecapeptidThe fish population became sexually mature fish selected and transported to the propagation station. The Fish were separated by sex and the ripeness the sex products were based on those in Example 4 described way examined. The one for ovulation mature fish were along with the male fish with the decapeptide

in einer 1maligen Dosis von 100 µg/Fisch behandelt.in a Single dose of 100 µg / fish treated.

Das zum Einleiten der Ovulation noch nicht reifen Fische wurden auf natürlicher Laichtemperatur gehalten und mindestens 2mal, höchstens jedoch 10mal mit je 5 µg der genannten Verbindung behandelt. Die Behandlung dauerte so lange, bis der Zellkern der Eizelle vom Zentrum zur Peripherie gewandert war. Die Anzahl der Behandlungen hing davon ab, wie weit der Reifezustand der Geschlechtszellen noch von der Ovulationsreife entfernt war. Der Reifevorgang nahm im Temperaturintervall von 8 bis 14°C mindestens 70, höchstens 350 Tagesgrade in Anspruch.Fish that are not yet mature enough to induce ovulation were kept at natural spawning temperature and at least 2 times, but at most 10 times with 5 µg each treated connection. The treatment lasted like this long until the nucleus of the egg cell from the center to the periphery had hiked. The number of treatments depended depends on how far the maturity of the sex cells was still far from ovulation maturity. The ripening process took at least in the temperature interval of 8 to 14 ° C 70, maximum 350 daily degrees.

36 bis 42 Stunden nach der Verabreichung der letzten Dosis erfolgte die Ovulation. In den nächsten 5 Stunden wurden die Geschlechtsprodukte isoliert. 36 to 42 hours after the last administration Dose ovulation occurred. In the next 5 hours the sex products were isolated.

Example 8 Induced artificial multiplication of the sturgeon (Acipenser ruthenus)

Es wurden aus dem Fischbestand eines gegebenen Lebensraumes geschlechtsreife Fische ausgewählt und zur Vermehrungsstation transportiert. Die Fische wurden nach Geschlechtern sortiert und dann wurde der Reifegrad der Eizellen der weiblichen Fische bestimmt. Ein Fisch ist zum Einleiten der Ovulation reif, wenn sich der Zellkern der Eizellen an der Peripherie der Eizelle befindet. Der Reifegrad des Spermas der Milchner wurde nicht gesondert untersucht, weil im Fischbestand eines vorgegebenen Lebensraumes die Geschlechtsprodukte der männlichen und der weiblichen Individuen praktisch in identischem Reifezustand vorliegen. Als die Fische zur Ovulation reif waren, wurden sie zusammen mit den männlichen Fischen mit dem NonapeptidIt was from the fish population of a given habitat sexually mature fish selected and to the reproductive station transported. The fish were sorted by sex sorted and then the maturity level of the Egg cells of female fish determined. A fish is for Initiation of ovulation ripe when the nucleus of the Egg cells are located on the periphery of the egg cell. The degree of maturity the milk sperm was not examined separately, because in the fish stock of a given habitat the sex products of the male and the female individuals practically in the same state of maturity are available. When the fish were ready to ovulate, they were together with the male fish with the Nonapeptide

<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHC₂H₅<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHC₂H₅

in einer 1maligen Dosis von 50 µg/Fisch behandelt.treated in a single dose of 50 µg / fish.

Wenn die Fische zum Einleiten der Ovulation noch nicht reif waren, wurden sie auf natürlicher Laichtemperatur gehalten und mindestens 2mal, höchstens jedoch 10mal mit je 5 µg der genannten Verbindung solange behandelt, bis der Zellkern aus dem Zentrum an die Peripherie gewandert war. Die Anzahl der Behandlungen hing davon ab, wie weit der Reifezustand der Eizellen noch vom ovulationsreifen Zustand entfernt war. Dieser Reifevorgang nahm im Temperaturbereich von 12 bis 18°C mindestens 100, höchstens jedoch 650 Tagesgrade (die Tagesgrade errechnen sich durch Multiplizieren der Anzahl der Tage mit der Durchschnittstemperatur des Wassers) in Anspruch. If the fish have not yet started ovulation when ripe, they were kept at natural spawning temperature and at least twice, but no more than 10 times each treated 5 µg of the compound mentioned until the cell nucleus migrated from the center to the periphery was. The number of treatments depended on how far the maturity of the ovum is still from the ovulation stage Condition was removed. This ripening took place in the temperature range from 12 to 18 ° C at least 100, at most however 650 daily degrees (the daily degrees are calculated by multiplying the number of days with the average temperature of water).

Binnen 24 Stunden nach der Verabreichung der letzten Dosis erfolgte die Ovulation. In den folgenden 40 bis 60 Minuten wurden die Geschlechtsprodukte isoliert.Within 24 hours after the last administration Dose ovulation occurred. In the next 40 to 60 minutes the sex products were isolated.

Example 9 Induced artificial reproduction of pike (Esox Lucius)

Es wurden aus dem Fischbestand geschlechtsreife Fische ausgesucht und zur Vermehrungsstation transportiert. Die Fische wurden nach Geschlechtern getrennt und der Reifezustand der Geschlechtsprodukte wurde auf die im Beispiel 8 beschriebene Weise untersucht. Die zur Ovulation reifen Fische wurden zusammen mit den männlichen Fischen mit dem DecapeptidThe fish population became sexually mature fish selected and transported to the propagation station. The Fish were separated by sex and the ripeness the sex products were based on those in Example 8 described way examined. The one for ovulation mature fish were along with the male fish with the decapeptide

<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tyr-Leu-Gln-Pro-Gly-NH₂<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tyr-Leu-Gln-Pro-Gly-NH₂

in einer 1maligen Dosis von 120 µg/Fisch behandelt.in a Single dose of 120 µg / fish treated.

Die zum Einleiten der Ovulation noch nicht reifen Fische wurden auf natürlicher Laichtemperatur gehalten und mindestens 2mal, höchstens jedoch 15mal mit je 10 µg der genannten Verbindung behandelt. Die Behandlung dauerte so lange, bis der Zellkern der Eizelle vom Zentrum zur Peripherie gewandert war. Die Anzahl der Behandlungen hing davon ab, wie weit der Reifezustand der Geschlechtszellen noch von der Ovulationsreife entfernt war. Der Reifevorgang nahm im Temperaturintervall von 8 bis 14°C mindestens 70, höchstens 300 Tagesgrade in Anspruch.Fish that are not yet mature enough to induce ovulation were kept at natural spawning temperature and at least 2 times, but at most 15 times with 10 µg each treated connection. The treatment lasted like this long until the nucleus of the egg cell from the center to the periphery had hiked. The number of treatments depended depends on how far the maturity of the sex cells was still far from ovulation maturity. The ripening process took at least in the temperature interval of 8 to 14 ° C 70, at most 300 daily degrees.

30 bis 36 Stunden nach der Verabreichung der letzten Dosis erfolgte die Ovulation. In den nächsten 5 Stunden wurden die Geschlechtsprodukte isoliert. 30 to 36 hours after the last administration Dose ovulation occurred. In the next 5 hours the sex products were isolated.

Example 10

Beispiel 4 wurde mit dem Unterschied wiederholt, daß als DecapeptidExample 4 was repeated with the difference that as a decapeptide

<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Asn-Pro-Gly- NH₂<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Asn-Pro-Gly- NH₂

statt des Decapeptidesinstead of the decapeptide

<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu- Gln-Pro-Gly-NH₂<Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu- Gln-Pro-Gly-NH₂

verwendet wurde.has been used.

Claims

1. Gonadoliberin derivatives of the general formula wherein
<Glu L-pyroglutamic acid,
His L-histidine,
Trp L-tryptophan,
Ser L-serine,
Tyr L-tyrosine,
X₁ D-phenylalanine or D-tyrosine,
X₂ L-leucine or L-tryptophan,
X₃ L-glutamine, L-leucine or L-asparagine,
Per L-proline and
X₄ is glycinamide or an ethylamide residue,
with the proviso that in the case
X₂ L-tryptophan means
X₃ is different from L-Leu cin ver,
as well as their acid addition salts and complexes.

2. <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly-NH₂ as well as its acid addition salts and complexes.

3. <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHC₂H₅ as well as its acid addition salts and complexes.

4. A process for the preparation of the compounds according to claims 1 to 3, characterized in that in each case in a manner known per se

a) using the peptide synthesis on the solid phase, the protected amino acids are fixed stepwise in the desired order by coupling with carbodiimide or via an active ester to a solid support, the peptide is removed from the support by acidic or basic cleavage and the protective group (s) are present , split off from the carrier during or after the split off or
b) expanding the peptide from protected amino acids by combinations of stepwise condensation and fragment condensation, or
- b₁) the pentapeptide azide of the formula <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-N₃ (II) with a tetra- or pentapeptide of the general formula X₁-X₂-X₃-Pro-X₄ (III), wherein X₁, X₂, X₃ and X₄ have the meanings given in claim 1, or
- b₂) a hexapeptide azide of the general formula <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-X₁-N₃ (IV), wherein X₁ has the meanings given in claim 1, with a tri- or tetrapeptide of the general formula X₂-X₃-Pro-X₄ (V), wherein X₂, X₃ and X₄ have the meanings given in claim 1, or
- b₃) a heptapeptide azide of the general formula <Glu-His-Trp-Ser-Tyr-X₁-X₂-N₃ (VI), wherein X₁ and X₂ have the meanings given in claim 1, with a di- or tripeptide of the general formula X₃-Pro -X₄ (VII), in which X₃ and X₄ have the meanings given in Claim 1, condenses,

whereupon the gonadoliberine derivatives obtained, if appropriate of the general formula I in acid addition salts or transferred complexes or from the obtained acid addition salts the free gonadoliberin derivatives releases.

5. Medicinal products characterized by a content of one or more compound (s) according to Claims 1 to 3, optionally together with one or more conventional ones pharmaceutical packaging agent (s).