DE3428988A1

DE3428988A1 - Method for the production of homocaryons from di- or heterocaryotic strains of Basidiomycetes

Info

Publication number: DE3428988A1
Application number: DE19843428988
Authority: DE
Inventors: Rainer 3550 Marburg Dickhardt; Gerlind Prof. Dr.rer.nat. 3556 Weimar Eger-Hummel
Original assignee: GESELLSCHAFT fur PILZFORSCHUNG EGER-HUMMEL MBH; Gesellschaft Fuer Pilzforschung Eger Hummel Mbh 3556 Weimar; PILZFORSCHUNG EGER HUMMEL MBH
Current assignee: Dickhardt Rainer Dr 6237 Liederbach De
Priority date: 1984-08-07
Filing date: 1984-08-07
Publication date: 1984-12-13

Abstract

The invention relates to the breeding and patenting of novel varieties of edible fungi (Basidiomycetes) with the aid of homocaryons which have not been obtained by single-spore selection and pairing of single-spore mycelia. Rather, the heterocaryons are tested for outstanding growing qualities, and the best strains are homocaryotised by means of glycine-N-glucoside, salts thereof, or N-acetylglucosamine. The resulting homocaryons are combined with compatible partners to give novel strains. Since the characteristics of the homocaryons which are used as components are known, they can be used in addition to those of the heterocaryon to describe the variety or identify the strain (see P 2813521).

Description

Verfahren zur Herstellung von Homokaryen aus di- bzw. Process for the production of homokaryen from di- or

heterokaryotischen Stämmen von Basidiomyceten In der deutschen Patentschrift 28 13 521 (Erfinder: Eger, Gerlind, Prof. Dr;Leal-Lara, Hermilo; Anmeldetag 29.3.1978) wurde ein Verfahren zur Herstellung von Monokaryen durch Dedikaryotisierung dikaryotischer Stämme von Basidiomyceten beschrieben. Mit diesem Verfahren lassen sich schnallenbildende Dikaryen mit 2 Kernen je Hyphenabschnitt, von jedem Elter einen, in 2 Typen von Homokaryen zerlegen, die jeweils nur einen Kern pro Hyphenabschnitt enthalten und dem jeweiligen Eltermonokaryon entsprechen Die erfolgreiche Spaltung des Dikaryons in Monokaryen ist unter dem Mikroskop schon bei 100-facher Vergrößerung daran zu erkennen, daß monokaryotische Hyphen schnallenlos sind. Das genannte Verfahren beschränkt sich auf Pilzstämme, die Schnallen tragen, in einer autoklavierten Lösung von Glucose und Glycin oder einem neutralen Fleischpepton ( mit hohem Gehalt an Glycin und geringem Gehalt an Phosphat- und Magnesiumionen ) wachsen und die Zerkleinerung mit einem Universalmixgerät (z.B. Waring Blender) bei hoher Umdrehungszahl (20 500 U/min) vertragen. Unter den kommerziell genutzten Speisepilzen gibt es aber auch solche, die dikaryotisch sind ohne Schnallen zu haben, wie der Stadtchampignon (Agaricus bitorquis) , und heterokaryotische Arten, wie der Kulturchampignon (Agaricus bisporus, jetzt auch A. brunnescens), die nicht nur keine Schnallen besitzen, sondern pro Hyphenabschnitt auch mehrere Kerne in wechselnder Zahl enthalten, wobei der Anteil der jeweiligen Eltertypen unbekannt ist. Beim Kulturchampignon tritt erst kurz vor der Bildung der Ständer (Basidien) eine Paarung der Elterkerne ein. Die beiden Kerne verschmelzen in der jungen Basidie und ihr Genmaterial wird während der Meiosis auf 4 Tochterkerne verteilt. Es wandert aber nicht wie bei anderen Pilzen jeder Kern in eine Spore ein, sondern vorwiegend Kernpaare, die sich in ihren Geschlechts- (Incompatibilitäts-) Faktoren unterscheiden. Aus solchen Sporen wachsen dann wieder Heterokaryen aus. Mycelien mit nur einem Kerntyp je Hyphenabschnitt - (beim Kulturchampignon kommen Monokaryen mit nur einem Kern je Zelle nicht vor ) sogenannten Homokaryen, konnte man bisher mit Sicherheit nur erhalten, wenn man von Basidien, an denen ausnahmsweise 4 Sporen entstehen, die Sporen mit dem Mikromanipulator einzeln abnimmt und zu kultivieren versucht (Fritsche, G., S. 243 in :The Biology and Cultivation of Edible Mushrooms, eds. heterokaryotic strains of Basidiomycetes In the German patent specification 28 13 521 (inventors: Eger, Gerlind, Prof. Dr; Leal-Lara, Hermilo; filing date March 29, 1978) became a method of making monokaryotes by dedikaryotizing dikaryotic ones Basidiomycete strains described. This process can be used to create buckles Dikarya with 2 nuclei per hyphal segment, one from each parent, in 2 types of Decompose homokaryons, each containing only one nucleus per hyphae segment and correspond to the respective parent monokaryon Successful cleavage of the dikaryon in monokarya it is already closed under the microscope at 100x magnification recognize that monokaryotic hyphae are buckleless. The aforementioned procedure is limited on mushroom stems that wear buckles in an autoclaved solution of glucose and glycine or a neutral meat peptone (high in glycine and low in Content of phosphate and magnesium ions) grow and the comminution with one Universal mixer (e.g. Waring Blender) at high speed (20 500 rpm) tolerate. However, among the commercially used mushrooms there are also those the dikaryotic ones are available without buckles, like the city mushroom (Agaricus bitorquis), and heterokaryotic species such as the cultivated mushroom (Agaricus bisporus, now also A. brunnescens), which not only have no buckles, but pro Hyphen section also contain several nuclei in varying numbers, with the proportion of the respective parent types is unknown. In the case of cultivated mushrooms, it only occurs shortly the formation of the stands (basidia) a pairing of the parental nuclei. The two cores merge in the young basidia and their genetic material becomes during the meiosis distributed over 4 daughter cores. However, unlike other mushrooms, it does not migrate all Nucleus into a spore, but predominantly nucleus pairs that differ in their sex Differentiate (incompatibility) factors. Such spores then grow again Heterokaryons from. Mycelia with only one core type per hyphae segment - (in the case of cultivated mushrooms monokarya with only one nucleus per cell do not occur) so-called Homocarya, could only be obtained with certainty if one of basidia, on which, as an exception, 4 spores develop, the spores individually with the micromanipulator decreases and tries to cultivate (Fritsche, G., p. 243 in: The Biology and Cultivation of Edible Mushrooms, eds.

Chang/Hayes, Academic Press, New York, 1978). Dieses Verfahren ist sehr mühsam und hat unsichere Erfolgschancen, weil die Keimungsrate der Sporen bei manchen Stämmen niedrig ist ( siehe T.J. Elliott, S. 12 in Mushroom Science VIII, London, 1972). Die Wahrscheinlichkeit, unter Meiosisprodukten ein Homokaryon mit hervorragenden Eigenschaften für die Züchtung zu finden, ist überdies gering. Für die Erzeugung neuer Sorten ist jedoch die planmäßige Paarung ausgewählter Homokaryen zu Hochleistungs-Heterokaryen eine wesentliche Voraussetzung. Bisher besteht die Züchtung von Sorten des Kulturchampignons in der Auslese heterokaryotischer Einzelspormycelien. Es wäre jedoch wünschenswert, Kerne aus bereits vorhandenen., guten Heterokaryen (Sorten) zu neuen Heterokaryen zu vereinen.Au-ßerdem wäre es wünschenswert, die Elterhomokaryen aus Handelssorten nach Belieben isolieren zu können, um Stämme zu identifizieren und so unlizenzierte Vermehrung nachzuweisen (vergl. deutsche Patentschrift 28 13 521). Das in der Patentschrift 28 13 521 beschriebene Verfahren hat außerdem den Nachteil, daß die Konzentration der beim Autoklavieren von glycin-und-glucosehaltigen Lösungen entstehenden monokaryotisierend wirkenden Substanzen unbekannt ist. Es kann darum die für den einzelnen Stamm optimale Konzentration nicht ermittelt bzw. eingestellt werden.Chang / Hayes, Academic Press, New York, 1978). This procedure is very troublesome and has an uncertain chance of success because the germination rate of the spores is at some strains is low (see T.J. Elliott, p. 12 in Mushroom Science VIII, London, 1972). The likelihood of having a homokaryon among meiosis products Finding excellent properties for breeding is also little. For however, the creation of new cultivars is the systematic pairing of selected homokaryons an essential prerequisite for high-performance heterokaryons. So far the Breeding of cultivars of cultivated mushrooms in the selection of heterokaryotic single spormycelia. However, it would be desirable to use nuclei from already existing, good heterokaryons (Varieties) to unite to form new heterokaryons. In addition, it would be desirable to have the Parent homokaryons from commercial varieties to be able to isolate at will in order to strains identify and thus prove unlicensed propagation (see German patent specification 28 13 521). The method described in patent specification 28 13 521 also has the disadvantage that the concentration of glycine-and-glucose-containing Solutions with monokaryotic action is unknown. It therefore the optimal concentration for the individual strain cannot be determined or can be set.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das Verfahren, das aus der Patentschrift 28 13 521 bekannt ist, so weiterzubilden, daß es nicht nur für holzzersetzende, dikaryotische Pilze mit Schnallen, sondern auch für anspruchsvolle oder empfindliche Stämme ohne Schnallen und mehr als 2 Kernen je Hyphenabschnitt, wie den Kulturchampignon, anwendbar ist.The invention is based on the object of the method that is derived from Patent 28 13 521 is known to develop so that it is not only for wood-decomposing, dikaryotic mushrooms with buckles, but also for demanding or sensitive Trunks without buckles and more than 2 cores per hyphae section, such as the cultivated mushrooms, is applicable.

(Da das Monokaryon mit einem und das Dikaryon mit 2 Kernen als Sonderfälle des Homokaryons mit gleichartigen Kernen bzw.(Since the monokaryon with one and the dikaryon with 2 nuclei are special cases of the homokaryon with nuclei of the same type or

des Heterokaryons mit zwei Typen von Kernen betrachtet werden kann, sprechen wir fortan verallgemeinernd von Homo- und Heterokaryen) Die Aufgabe wurde erfindungsgemäß durch die im kennzeichnenden Hauptanspruch beschriebenen Verfahrensschritte gelöst.of the heterokaryon can be considered with two types of nuclei, henceforth we will generally speak of homo- and heterokaryons) the According to the invention, the object was described by what is described in the characterizing main claim Process steps solved.

Die Lösung der erfinderischen Aufgabe beruht auf einer sehr schonenden Zerkleinerung der Pilzhyphen in wenigzellige Fragmente sowie der Verwendung von Glycin-N-Glucosid, seinen Salzen oder N-Acetylglucosamin in den jeweiligen Stämmen zusagenden Konzentrationen und pH -Werten in phosphat- und magnesiumarmen Nährlösungen, die alle für das Wachstum der jeweiligen Stämme notwendigen Verbindungen enthalten. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Gewinnung von Homokaryen aus Pilzstämmen, die keine oder wenige einkernige Sporen bilden, und durch Paarung solcher Homokaryen die planmäßige Züchtung neuer Sorten. Es gestattet ferner die Identifizierung von Sorten, die aus bekannten Homokaryen synthetisiert wurden und damit den Nachweis einer unrechtmäßigen Vermehrung. Es gestattet schließlich den Nachweis einer unrechtmäßigen Kernentnahme aus einem Heterokaryon und seine Paarung mit einem anderen Homokaryon.The solution to the inventive problem is based on a very gentle one Comminution of the fungal hyphae into fragments with few cells as well as the use of Glycine-N-glucoside, its salts or N-acetylglucosamine in the respective strains Appropriate concentrations and pH values in nutrient solutions low in phosphate and magnesium, which contain all the compounds necessary for the growth of the respective strains. The method according to the invention allows homokaryons to be obtained from fungal strains, which form few or no mononuclear spores, and by pairing such homokaryons the scheduled breeding of new varieties. It also allows the identification of Varieties that were synthesized from known homokaryons and thus the evidence an unlawful increase. It finally allows the proof of an illegitimate Nucleation from a heterokaryon and its mating with another homokaryon.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat gegenüber den bisherigen Methoden folgende Vorteile: 1. Das Verfahren ist einfacher als alle bisherigen Verfahren 2. Das Verfahren kann den Bedürfnissen des jeweiligen Pilzstammes angepaßt werden 3. Das Verfahren ist nicht nur auf holzzersetzende dikaryotische, sondern auch auf anspruchsvollere bzw. heterokaryotische Basidiomycetenarten anwendbar.The inventive method has compared to the previous methods the following advantages: 1. The procedure is simpler than any previous procedure 2. The method can be adapted to the needs of the respective fungal strain 3. The procedure is based not only on wood-decomposing dikaryotic but also on more demanding or heterokaryotic Basidiomycetes can be used.

Nachstehend werden folgende Schritte erläutert: A) Homokaryotisierung des Ausgangsmaterials und Klassifizierung der erhaltenen Kolonien B) Feststellung der Identität der erhaltenen Mycelklassen C) Paarung der Homokaryen zu neuen Stämmen A) Homokaryotisierung des Ausgangsmaterials und Klassifizierung der erhaltenen Kolonien Als Ausgangsmaterial dient Mycel eines Basidiomyceten, z.B.The following steps are explained below: A) Homokaryotization of the starting material and classification of the colonies obtained. B) Determination the identity of the mycelia classes obtained. C) Mating the homocaryons to form new strains A) Homokaryotization of the starting material and classification of the colonies obtained The starting material used is mycelium of a Basidiomycete, e.g.

des Austernseitlings (Pleurotus ostreatus) oder des Kulturchampignons (Agaricus bisporus = A. brunnescens). Der Pilzstamm wird unter geeigneten, möglichst optimalen Wachstumsbedingungen keimfrei angezüchtet. Ein kleines Stückchen des mit Pilzmycel durchwachsenen Nährbodens wird auf einem sterilisierten Objektträger mit einer sterilisierten Rasierklinge zerhackt, am besten in einen Tropfen Flüssigkeit, z.B. Homokaryotisierungslösung. Durch Anheben einer Seite des Objektträgers wird der Tropfen mit kleinen Mycelfragmenten von den gröberen Stückchen auf eine andere Stelle des Objektträgers abdekantiert. Von dort werden Portionen mit wenigen Mycelfragmenten in den unteren Teil der Homokaryotisierungslösung geimpft. Die eingeimpfte Zahl der Fragmente soll so gering sein, daß die Fragmente zu isolierten Mycelchen auswachsen können. Die Lösung mit den Fragmenten wird am besten bei der für den jeweiligen Stamm optimalen Temperatur bebrütet.oyster mushrooms (Pleurotus ostreatus) or cultivated mushrooms (Agaricus bisporus = A. brunnescens). The mushroom stem is under suitable, if possible cultivated germ-free in optimal growth conditions. A little bit of the with Fungal mycelium streaked nutrient medium is placed on a sterilized microscope slide using chopped up with a sterilized razor blade, ideally in a drop of liquid, e.g. homokaryotic solution. Lifting one side of the slide becomes the drop with small fragments of mycelium from the coarser pieces to another Place of the slide decanted. From there, portions are made with a few fragments of mycelium inoculated into the lower part of the homokaryotic solution. The inoculated number the fragments should be so small that the fragments grow into isolated mycelia can. The solution with the fragments is best suited to the individual Stem incubated at optimal temperature.

Als Homokaryotisierungslösung dient eine Minimallösung, die alle für des Wachstum eines gegebenen Pilzstammes notwendigen Nährstoffe enthält, sowie N-Acetylglucosamin , Glycin-N-Glucosid oder ein Salz davon in Konzentrationen von 5 bis 100 mmol pro Liter,aber möglichst wenige'Phosphat- und;cMagnesiumionen.: Nachdem die Mycelfragmente in der Lösung zu sichtbaren Mycelchen herangewachsen sind, werden ein oder mehrere Mycelchen auf einem sterilisierten Objektträger mit einer sterilisierten Rasierklinge wie oben beschrieben zerkleinert , die Fragmente dekantiert und auf einen für den jeweiligen Pilzstamm geeigneten Nähragar in solcher Verdünnung ausgestrichen, daß sie zu räumlich isolierten Kolonien heranwachsen können. Da bei Pilzstämmen, die keine Schnallen bilden, die Homokaryen von den Heterokaryen nicht ohne weiteres unterschieden werden können, werden die erhaltenen Einzel kolonien im Abstand von mehreren Tagen ein bis dreimal nacheinander auf frischen Nährboden übertragen und bei der für den jeweiligen Stamm optimalen Temperatur bebrütet. Dann werden die Kolonien mit gleichaltrigen Mycelien des Ausgangsheterokaryons(auf demselben Nährboden angezogen) verglichen. Manchmal sind einige bis mehrere vom Typ des Ausgangsheterokaryons vorhanden. In den meisten Fällen unterscheiden sie sich in morphologischen oder biochemischen Merkmalen vom Ausgangsheterokaryon und lassen sich in 2 unter schiedliche Klassen sortieren. Wird nur eine, vom Ausgangheterokaryon abweichende Mycelklasse gefunden, so wird der Versuch wiederholt. Es werden höhere Konzentrationen an z.B. Na-Glycinat-N-Glucosid angewendet und die aus den Fragmenten entstandenen Mycelchen einige Tage länger in der Homokaryotisierungs- lösung belassen. Es sind dann höchstwahrscheinlich tw7-f Ausgangsheterokaryon verschiedene Mycelklassen entstanden. Notfalls muß die Behandlung noch ein weiteres Mal wiederholt werden, mit höherer Na-Glycinat-N-Glucosid-Konzentration und über einen abermals längeren Zeitraum.A minimal solution is used as the homokaryotic solution, which is all for contains nutrients necessary for the growth of a given strain of fungus, as well as N-acetylglucosamine , Glycine-N-glucoside or a salt thereof in concentrations of 5 to 100 mmol per Liters, but as few as possible of phosphate and magnesium ions. After the mycelium fragments have grown into visible mycelia in the solution, one or more Mycelia on a sterilized slide with a sterilized razor blade crushed as described above, the fragments decanted and placed on one for the appropriate nutrient agar in such a dilution that they can grow into spatially isolated colonies. Since with mushroom stems that do not form buckles, the homokaryons not easily from the heterokaryons can be distinguished, the individual colonies obtained are spaced apart by Transfer to fresh nutrient medium one to three times in succession for several days and incubated at the optimum temperature for the respective strain. Then the Colonies with mycelia of the same age of the parent heterokaryon (on the same culture medium dressed) compared. Sometimes a few to several are of the parent heterokaryon type available. In most cases they differ in morphological or biochemical characteristics of the starting heterokaryon and can be divided into 2 under different Sort classes. Becomes only one class of mycelium that differs from the parent heterokaryon found, the experiment is repeated. Higher concentrations of e.g. Na-glycinate-N-glucoside applied and the mycelia resulting from the fragments a few days longer in the homokaryotic leave solution. It is then most likely that tw7-f parent heterokaryon of different mycelium classes developed. If necessary, the treatment must be repeated one more time, with a higher Na-glycinate-N-glucoside concentration and again for a longer period Period.

B) Feststellung der Identität der erhaltenen Mycelklassen Von jeder der vom Heterokaryon abweichenden Mycelklassen werden kleine Stückchen eines Vertreters mit Stückchen anderer Vertreter derselben sowie der anderen Klasse auf frischen Nährboden zusammengeimpft = gepaart. Homokaryen geben mit paarungsfähigen Partnern von beiden Partnern abweichende Mycelsektoren, die-nach Abimpfung von diesen-zu Mycelien vom Typ des Ausgangsheterokaryons werden. Die Paarung ist in solchem Falle geglückt. B) Establishing the Identity of the Mycelia Classes Obtained From Each of the mycelia classes deviating from the heterokaryon become small pieces of a representative with bits of other representatives of the same class as well as the other class on fresh Culture medium inoculated together = paired. Homokaryen give birth to mating partners Mycelium sectors differing from both partners, which - after vaccination of these - to Mycelia become of the parent heterokaryon type. The mating is in such a case successful.

Paaren Vertreter einer Klasse nur mit Vertretern der anderen Klasse zu Mycelien vom Ausgangstyp, ist die Homokaryotisierung geglückt. Mutanten oder Varianten mit abweichender Morphologie sowohl in Bezug auf das Ausgansheterokaryon als auch seine Komponentenhomokaryen können gelegentlich auftreten, sind aber nur als Einzel kolonien und nicht wiederholt vorhanden. Auch sind sie bei einer Wiederholung der Homokaryotisierung mit anderen Mycelstückchen nicht mehr aufzufinden.Only pair representatives of one class with representatives of the other class to mycelia of the original type, homokaryoticization has succeeded. Mutants or Variants with different morphology both in relation to the starting heterokaryon as well as its component homokaryons can occur occasionally, but are only as single colonies and not present repeatedly. They are also in a repetition the homokaryotization with other pieces of mycelium can no longer be found.

C) Paarung der Homokaryen zu neuen Stämmen Ein Homokaryon aus jeder Klasse'von Homokaryen eines Versuches wird mit den Homokaryen aus anderen Versuchen zusammengeimpft ( gepaart). Gelingt die Paarung, d.h. entsteht ein von den Partnern verschiedener Sektor, wird dieser abgeimpft und in Anbauversuchen auf seine Eignung als Produktionsstamm geprüft. C) Mating the homocaryons to form new strains One homokaryon from each The class of homokaryons from one experiment is compared with the homocaryons from other experiments inoculated together (paired). If the pairing succeeds, i.e. one is created by the partners different sector, this is vaccinated and in cultivation trials for its suitability checked as a production master.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.The following examples explain the process according to the invention.

A) Homokaryotisierung des Ausgangsmaterials und Klassifizierung der erhaltenen Kolonien Beispiel 1 Pleurotus ostreatus, Stamm F, ATCC 38538, wird auf einem festen Nährboden mit 1,2% Malzextrakt und 1,5% Agar bei 27°C angezogen. Ein von Mycel durchwachsenes Nährbodenwürfelchen von 2 mm Kantenlänge wird in einem Tropfen Homokaryotisierungs- lösung auf einem sterilisierten Objektträger mit sterilisierter Rasierklinge zerhackt und unter dem Mikroskop auf das Vorhandensein genügend kleiner Fragmente überprüft. Der Objektträger wird an einer Seite angehoben, so daß der Tropfen samt kleiner Fragmente von den größeren Stückchen abgetrennt wird. Von der Flüssigkeit mit Fragmenten werden 10/ul in 25 ml Homokaryotisierungslösung in eine Erlenmeyerkölbchen gegeben, so daß Fragmente auf den Boden des Gefäßes gelangen. Die Homokaryotisierungslösung enthält pro Liter destillierten Wassers 10 mmol Glycin, 30 mmol Glycin -N-glucosid, 70 mmol Glucose. Nach 30 Tagen Bebrütung bei 20 0C werden einige, mit freiem Auge sichtbare Mycelchen auf einen sterilisierten Objektträger übertragen und wie oben beschrieben zerkleinert. Die Fragmente werden abdekantiert und in Portionen von 5, 10 und 20 ul auf Agarplatten mit 1,2 % Malz ausgestrichen. Nachdem die Fragmente bei 270 zu Kolonien herangewachsen sind, wird einzeln liegenden Kolonien je ein gleichgroßes Stückchen entnommen und auf neuen Nährboden übertragen. Parallel wird ein gleichgroßes Stückchen des Ausgangsdikaryons angezüchtet. Nach 4 Tagen bei 270 list deutlich zu erkennen, daß die aus Fragmenten gewonnenen Kolonien vom Ausgangsdikaryon verschieden sind. Von 15 isolierten Kolonien haben 8 kleinen Durchmesser, 7 sind fast doppelt so groß. A) Homokaryotization of the starting material and classification of the Colonies obtained Example 1 Pleurotus ostreatus, strain F, ATCC 38538, is on grown on a solid culture medium with 1.2% malt extract and 1.5% agar at 27 ° C. A A nutrient medium cube with an edge length of 2 mm, which is streaked with mycelium, becomes in a Drops of homokaryotic solution on a sterilized slide Chopped up with sterilized razor blade and examined for presence under a microscope sufficiently small fragments checked. The slide is raised on one side, so that the drop and its small fragments are separated from the larger pieces will. 10 μl of the liquid with fragments are added to 25 ml of homokaryotic solution placed in an Erlenmeyer flask so that fragments get to the bottom of the vessel. The homokaryotic solution contains 10 mmol glycine per liter of distilled water, 30 mmol glycine-N-glucoside, 70 mmol glucose. After 30 days of incubation at 20 ° C some mycelia visible to the naked eye on a sterilized slide transferred and crushed as described above. The fragments are decanted and streaked in 5, 10 and 20 µl portions on agar plates containing 1.2% malt. After the fragments have grown into colonies at 270, they become solitary A piece of the same size was removed from each colonies and transferred to a new culture medium. At the same time, an equal-sized piece of the original dikaryon is grown. To 4 days at 270 list can clearly be seen that the colonies obtained from fragments are different from the starting dikaryon. Out of 15 isolated colonies, 8 have small ones Diameter, 7 are almost twice as large.

Beispiel 2 Agaricus brunnescens, Stamm A 6 der Fa. Hauser, Gossau , wird auf Agarplatten mit 2 % Malzextrakt bei 24 0C angeimpft. Nach 5 Tagen wird ein Würfelchen mit Mycel wie in Beispiel 1 zerkleinert und in Homokaryotisierungslösung wie in Beispiel 1 übertragen. Nach 54 Tagen Bebrütung bei 230 werden entsprechend Beispiel 1 Mycelchen der Homokaryotisierungslösung entnommen, fragmentiert und auf Nährboden ausgestrichen. Die erscheinenden, einzeln liegenden Kolonien werden zweimal nacheinander subkultiviert. Von 30 Kolonien haben 4 Wachstumsgeschwindigkeit und Aussehen des zur Kontrolle angeimpften Ausgangsstammes, 26 sind sehr viel kleiner. Diese lassen sich makroskopisch nach Größe und Aussehen in 2 Klassen sortieren, wobei die mit den etwas größeren Durchmessern Klasse 1 genannt werden. Klasse 2 zeigt eine leichte Bräunung des Nährbodens.Example 2 Agaricus brunnescens, strain A 6 from Hauser, Gossau , is inoculated on agar plates with 2% malt extract at 24 0C. After 5 days it will a cube with mycelium crushed as in Example 1 and in homokaryotic solution transferred as in example 1. After 54 days of incubation at 230, accordingly Example 1 Mycelia removed from the homokaryotic solution, fragmented and expanded Spread the culture medium. The appearing, solitary colonies are twice successively subcultured. Out of 30 colonies, 4 have growth rates and Appearance of the initial strain inoculated as a control, 26 are much smaller. These can be macroscopically sorted into 2 classes according to size and appearance, whereas those with the slightly larger diameters are called class 1. 2nd grade shows a slight browning of the nutrient medium.

In Klasse I fallen 16, in Klasse II zehn Mycelien.Class I includes 16 mycelia and Class II includes ten mycelia.

Beispiel 3 Pleurotus F und Homokaryotisierungslösung wie im Beispiel 1.Example 3 Pleurotus F and homokaryotic solution as in the example 1.

Letztere wird zum besseren Wachstum mit o,3 g pro Liter "Pepton P!l der Fa. Oxoid, Charge 1845 versetzt. Bereits nach 14 Tagen könnerr darin gewachsene Mycelchen fragmentiert werden. Von 15 wie im Beispiel 1 isolierten Kolonien sind 6 von Klasse I (größerer Myceldurchmesser), 9 von Klasse II.The latter is used for better growth with 0.3 g per liter of "Peptone P! L from Oxoid, batch 1845. Already after 14 days you can grow in it Mycelia become fragmented. From 15 colonies isolated as in Example 1 are 6 from class I (larger mycelium diameter), 9 from class II.

Beispiel 4 Pleurotus F und Homokaryotisierungslösung wie im Beispiel 1.Example 4 Pleurotus F and homokaryotic solution as in the example 1.

Da verschiedene Peptonchargen unterschiedlich wirken, wird zum besseren Wachstum mit d§8 a eines Aminosäuregemisches supplementiert, das folgende Zusammensetzung hat(g/l): Arginen HC1 0,68; Cystin o,o3; Glutaminsäure 1,43; Glycin 1,54; Histidin HC1 o,l4; Isoleuzin o,24; Leucin o,l9; Lysin HC1 o,o3; Methionin o,l9; Phenylalanin o,27; Prolin o,73; Threonin o,l9; Tryptophan o,o3; Tyrosin o,l9. Nach 25 Tagen bei 200 können die in der Homokaryotisierungslösung gewachsenen Mycelchenfragmentiert werden.. Von 15 isolierten Kolonien sind 8 in Klasse I, in Klasse II sieben.Since different batches of peptones work differently, it becomes for the better Growth supplemented with d§8 a of an amino acid mixture, the following composition has (g / l): arginen HC1 0.68; Cystine o, o3; Glutamic acid 1.43; Glycine 1.54; Histidine HC1 o, 14; Isoleucine 0.24; Leucine 0.19; Lysine HC1 o, o3; Methionine 0.19; Phenylalanine o, 27; Proline o.73; Threonine 0.19; Tryptophan o, o3; Tyrosine o, l9. After 25 days at 200 can fragment the mycelia grown in the homokaryotization solution of 15 isolated colonies, 8 are in class I, and seven in class II.

Beispiel 5 Pleurotus F entsprechend Beispiel 1. Zur Homokaryotisierung dient eine Lösung mit 100 mmol/l Glucose, 4 mmol/l Glycin und 50 mmol/l N-Acetylglucosamin, pH 6,3. Es werden nach 30 Tagen 30 Kolonien isoliert. Davon sehen 14 wie Stamm F aus, fünf entsprechen Klasse I und 11 der Klasse II.Example 5 Pleurotus F corresponding to Example 1. For homokaryotization a solution with 100 mmol / l glucose, 4 mmol / l glycine and 50 mmol / l N-acetylglucosamine is used, pH 6.3. 30 colonies are isolated after 30 days. 14 of them look like tribe F off, five correspond to class I and 11 to class II.

Beispiel 6 Agaricus brunnescens wie Beispiel 2. Zur Homokaryotisierung dient eine Lösung mit 100 mmol/l Glucose, 20 mmol/l Na-Gycinat-N-glucosid und o,8% des Aminosäuregemisches aus Beispiel 4.Example 6 Agaricus brunnescens as in Example 2. For homokaryotization serves a solution with 100 mmol / l glucose, 20 mmol / l Na-glycinate-N-glucoside and 0.8% of the amino acid mixture from Example 4.

Der pH ist 4,5. Nach 23 Tagen in der Homokaryotisierungslösung werden 30 Kolonien isoliert. Davon entsprechen 7 dem Ausgangsstamm, 11 sind Klasse I, 9 sind Klassen.The pH is 4.5. Be in the homokaryotic solution after 23 days 30 colonies isolated. Of these, 7 correspond to the original strain, 11 are class I, 9 are classes.

Beispiel 7 A. brunnescens, Stamm 71 a, ATCC 36929. Zur Homokaryotisierung dient eine Lösung mit 80 mmol/l Glucose, 10 mmol/l Glycin-N-glucosid, 89/1 Pepton P von Oxoid und o,ol% Malzextrakt in Form von 20 min bei 121 autoklavierter Lösung. Nach 31 Tagen werden 24 Kolonien isoliert. Dem Ausgangsstamm entsprechen 13, zur Klasse I gehören 7, zur Klass II gehören 5.Example 7 A. brunnescens, strain 71a, ATCC 36929. For homokaryotization a solution with 80 mmol / l glucose, 10 mmol / l glycine-N-glucoside, 89/1 peptone is used P of Oxoid and o, ol% malt extract in the form of 20 min with 121 autoclaved solution. After 31 days will be 24 colonies isolated. Correspond to the original stem 13, 7 belong to class I, 5 belong to class II.

Beispiel 8 A. brunnescens Stamm 310a, ATCC 36930. Zur Homokaryotisierung dient eine Lösung mit 70 mmol Glucose, 10 mmol Glycin, 30 mmol Glycin-N-glucosid pro Liter,supplementiert mit O,ol % Malzextrakt wie in Beispiel 7. Der pH ist 5,7. Nach 50 Tagen werden 30 Kolonien isoliert, 18 sind vom Ausgangstyp, 10 sind Klasse 1 und zwei Klasse II. Die Klasse II zeigt extrem langsames Wachstum.Example 8 A. brunnescens strain 310a, ATCC 36930. For homokaryoticization a solution with 70 mmol glucose, 10 mmol glycine, 30 mmol glycine-N-glucoside is used per liter, supplemented with 0.01% malt extract as in Example 7. The pH is 5.7. After 50 days, 30 colonies are isolated, 18 are initial type, 10 are class 1 and two class II. Class II shows extremely slow growth.

B) Feststellung der Identität der erhaltenen Mycelklassen Beispiel 9 Eine Kolonie der Klasse I aus Beispiel 8 wird mit den 9 übrigen dieser Klasse gepaart und mit den 2 der Klasse II. Nach 30 Tagen ist bei keiner der Paarungen innerhalb der Klasse I ein andersartiger Mycelsektor zu sehen. Dagegen ist bei den Paarungen mit Kolonien. der Klasse II nach 15 bzw. 17 Tagen ein Sektor von dichterem Mycel zu sehen. Zweimal subkultiviert, ist Mycel aus diesen Sektoren vom Ausgangsstamm 310 a nicht zu unterscheiden. B) Establishing the identity of the mycelium classes obtained Example 9 A class I colony from Example 8 is matched with the 9 remaining in this class paired and with the 2 of class II. After 30 days there is no pairing to see a different mycelium sector within class I. On the other hand is with the Matings with colonies. class II after 15 or 17 days a sector of denser See mycelium. Subcultured twice, mycelium from these sectors is from the parent strain 310 a indistinguishable.

C) Paarung von Homokaryen zu neuen Stämmen Beispiel 10 Ein Mycel der Klasse I des Stammes 71 a wird mit Mycel der Klasse II von Stamm A6 zusammengeimpft. Es entsteht ein schnellerwüchsiges Mycel als das der jeweiligen Partner. Zweimal subkultiviert ist es von Stamm 71 a und Stamm A 6 verschieden. C) Mating of homocaryons to form new strains. Example 10 A mycelium Class I of strain 71a is inoculated with class II mycelium from strain A6. The result is a mycelium that grows faster than that of the respective partners. Twice subcultured it is different from strain 71a and strain A 6.

Im Halbschalentest (Eger 1962, Die Deutsche Gartenbauwirtschaft 10,Heft 1) produziert es Fruchtkörper,Mycel der Klasse I von 71a und der Klasse II von A6 dagegen nicht.In the half-shell test (Eger 1962, Die Deutsche Gartenbauwirtschaft 10, issue 1) it produces fruiting bodies, mycelium of class I of 71a and class II of A6 on the other hand not.

Claims

Patent claims: . \ Process for the production of homokaryen from di- and heterokaryotic fungal strains characterized by circumventing meiosis, that you have a few small, living mycelium fragments in one for the respective mushroom strain suitable minimal nutrient solution with only small amounts of phosphate and magnesium ions and a pH of 3 to 9, the glycine-N-glucoside, salts thereof or N-acetylglucosamine in concentrations of 5 to 100 mmol per liter that one contains the mycelium fragments Allowed to grow submerged by comminuting the mycelia obtained from the mycelium fragments and applies it to a nutrient agar suitable for the respective fungal strain in such a way that that the fragments can grow into spatially isolated colonies, that the Colonies inoculated one to four times in succession on fresh nutrient medium so that Growth and appearance stabilize, so that the colonies can then be based on morphological and / or biochemical characteristics and classified by pairing one or more Representatives from each class confirmed identity as a homokaryon.

2. Use of the homokaryen obtained according to claim 1 for the production, Cultivation and identification of commercial fungal strains.