DE3341367A1 - MELANOMIC DIAGNOSIS CONTAINING MONOCLON-SPECIFIC ANTIBODY - Google Patents
MELANOMIC DIAGNOSIS CONTAINING MONOCLON-SPECIFIC ANTIBODYInfo
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Description
- 4 Beschreibung - 4 description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reagenz zur Verwendung für die Melanomdiagnose, wobei das Reagenz einen monoklonen Antimelanomantikörper enthält, der ein Säugetieren eigenes Melanomantigen erkennt. Die Erfindung betrifft ebenfalls Diagnoseverfahren zur Auffindung von Melanomen (Melanomkarzinomen, -Sarkomen},* wobei das genannte Reagenz verwendet wird.The present invention relates to a reagent for use in melanoma diagnosis, the reagent being a Contains monoclonal anti-melanomic antibody derived from a mammal recognizes its own melanoma antigen. The invention also relates to diagnostic methods for the detection of melanoma (Melanoma carcinoma, sarcoma}, * where the said reagent is used.
Erfindungsgemäß wurde auf einem T-Zellenspiegel (T cell level) die Existenz eines melanomspezifischen Antigens, das verschiedenen Tierarten eigen ist, gefunden, das auf der Oberfläche von Melanomzellen ausgebildet ist (Nature,294, 748-750, 1981).According to the invention, on a T cell level the existence of a melanoma-specific antigen, the different Animal species, found that is formed on the surface of melanoma cells (Nature, 294, 748-750, 1981).
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Diagnosereagenz zur Verfügung zu stellen, das einön monoklonen Antimelanomantikörper enthält.The present invention is based on the object to provide a diagnostic reagent that is monotonous Contains monoclonal anti-melanomic antibodies.
Aufgabe der Erfindung ist ebenfalls, einen monoklonen Antimelanomantikörper zur Verfügung zu stellen, der nicht artenspezifisch ist.The object of the invention is also to provide a monoclonal To provide anti-melanomantibodies that are not species-specific.
Eine weitere Aufgabe besteht darin, eine Diagnoseausstattung (Diagnosekit) zur Verfügung zu stellen, die als ein Reagenz einen monoklonen Antimelanomantikörper enthält.Another object is to provide diagnostic equipment (diagnostic kit) that acts as a reagent contains a monoclonal anti-melanoma antibody.
Eine weitere Aufgabe besteht darin, Diagnoseverfahren zum Auffinden von Melanomen bei Säugetieren, insbesondere Menschen, zur Verfügung zu stellen, bei denen ein nicht artenabhängiger monokloner Antimelanomantikörper verwendet wird.Another object is to provide diagnostic methods for finding melanomas in mammals, in particular People who use a non-species-dependent monoclonal anti-melanoma antibody will.
Andere vorzugsweise Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.Other preferred embodiments of the present invention emerge from the following description.
Erfindungsgemäß wird (1) ein Reagenz zur Verwendung bei der Diagnose von Melanomen bei Menschen zur Verfügung gestellt, das einen monoklonen Antikörper enthält, der geeignet ist, ein Säugetieren eigenes Melanomantigen zu erken-According to the present invention, (1) a reagent for use in the diagnosis of melanoma in humans that contains a monoclonal antibody that contains is capable of recognizing a mammal's own melanoma antigen.
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nen;des weiteren wird (2) eine Diagnoseausstattung, die das besagte Reagenz enthält, und (3) Immunoassays zur Erkennung von menschlichen Melanomantigenen zur Verfügung gestellt. Das, Reagenz kann den monoklonen Antikörper und als einen weiteren damit assoziierten Teil beispielsweise ein radioaktives Element oder ein Enzym oder einen anderen Trägeranteil enthalten.nen; furthermore, (2) diagnostic equipment that contains said reagent, and (3) immunoassays for the detection of human melanoma antigens are available posed. The reagent can be the monoclonal antibody and as a further part associated therewith, for example contain a radioactive element or an enzyme or other carrier component.
Bevorzugt ist der erfindungsgemäße Melanomantikörper ein M2590 Antikörper.The melanoma antibody according to the invention is preferably an M2590 antibody.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Figuren näher erläutert.The invention is explained in more detail with reference to the following figures explained.
Fig. 1 gibt schematisch ein erfindungsgemäßes VerfahrenFig. 1 shows schematically a method according to the invention
zur Diagnose von Melanomen wieder; 15to diagnose melanoma again; 15th
Fig. 2 ist eine graphische Auftragung der Auffindung vonFigure 2 is a plot of the discovery of
Melanomantigenen unter Verwendung eines Radioimmunoassays gemäß Erfindung;Melanoma antigens using a radioimmunoassay according to the invention;
Fig. 3 gibt graphisch die Spezifizität der vorliegenden Erfindung bei der Auffindung von menschlichen Melanomantigenen durch Radioimmunoassay wieder.Figure 3 graphically depicts the specificity of the present invention in locating human Melanoma antigens again by radioimmunoassay.
Die zuvor gefundenen melanomspezif ischen Antigeneigenschäften, die verschiedenen Tierarten eigen ist, wird ebenfalls durch einen Antikörper erkannt, der durch Isoimmunisierung erhalten wird; demnach wurde gezeigt, daß das Antigen ein melanomspezifisches Antigen ist. Im einzelnen werden Melanomzellen von C57BL/6 Mäusen mit Mitomycin behandelt und intraperitonäal C57BL/6 Mäusen einige Male zur Immunisierung verabreicht. Die MiIzzellen der Tiere werden mit P3U1 Myelomzellen unter Verwendung von PoIyäthylenglycol zur Herstellung eines monoklonen Antikörpers verschmolzen (fusioniert.) . Dieser Antikörper ist ein MäüsantikÖrper der IgM Klasse; aber trotzt seiner Her-The previously found melanoma-specific antigenic properties, which is peculiar to different animal species is also recognized by an antibody that is produced by isoimmunization is obtained; accordingly it was shown that the antigen is a melanoma-specific antigen. In detail Melanoma cells from C57BL / 6 mice are treated with mitomycin and C57BL / 6 mice intraperitoneally several times administered for immunization. The blood cells of the animals with P3U1 myeloma cells using polyethylene glycol fused (fused.) to produce a monoclonal antibody. This antibody is a IgM class antibodies against mice; but defies his heart
Stellung durch Immunisierung mit Mausmelanom reagiert er nicht nur mit Mausmelanom sondern ebenso mit Melanomen von anderen Lebewesen wie menschlichen und Hamstermelanomen. Es wurde jedoch gefunden, daß der monoklone Antikörper eine solche Spezifizität aufweist, daß er in keinem Fall mit Neuroblastom, Myelom, Fibrosarcom, schuppenförmigen ZeIlcarcinoni/ Akanthom, Zervi kale arc inom und Lymphom oder mit normalen Geweben (von der Haut, Augen, Cerebrum, usw.) von Menschen und Mäusen reagiert.He reacts by immunization with mouse melanoma not only with mouse melanoma but also with melanoma from other living things such as human and hamster melanoma. However, it has been found that the monoclonal antibody is a has such a specificity that it is in no case associated with neuroblastoma, myeloma, fibrosarcoma, scaly cell carcinoni / Acanthoma, cervical arc inoma and lymphoma or reacts with normal tissues (from the skin, eyes, cerebrum, etc.) of humans and mice.
Die biochemische Analyse hat gezeigt, daß das menschliche oder Mäusemelanomantigen ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 31.000 ist. Insbesondere haben Experimente mit der Behandlung, mit Exoglycosidase und Behandlung mit Tunicamycin zu der Entdeckung geführt, daß die Antigenwirkung, die durch den monoklonen Antimelanomantikörper gemäß Vergleichsbeispiel (als "M2590 Antikörper" bezeichnet) erkannt wird, asparagingebundene Zuckerketten mit endständigen Speichelsäuren (sialic acid) ist. ■ Im allgemeinen erkennt ein monokloner Antikörper nur eine Antigendeterminante von Antigenmolekülen. Ist eine spezifizierte Antigendeterminante ein Protein, ist nur eine solche Determinante an einem Molekül vorhanden. Demnach kann nur ein Molekül des monoklonen Antikörpers mit einem Antigenmolekül kombiniert werden. Jedoch erkennt der erfindungsgemäße monoklone Antikörper ein Tumorantigen, das aus Zuckerketten zusammengesetzt ist. Das heißt, daß viele Zuckerketten an einem Antigenmolekül vorhanden sind, und daß deshalb viele Antikörpermoleküle mit einem Antigenmolekül kombinieren können. Entsprechend sollte der monoklone Antikörper gemäß Erfindung mit seiner hochspezifischen Reaktivität hohe Sensitivität aufweisen, wenn er als diagnostisches oder therapeutisches Mittel verwendet wird. Da, wie zuvor erwähnt, der erfindungsgemäße monoklone Antikörper, wie der M2590 Antikörper, gleichwertig mit nicht-menschlichen tierischen Melanomzellen und mensch-Biochemical analysis has shown that the human or mouse melanoma antigen is a glycoprotein with a Molecular weight is 31,000. In particular, experiments with treatment, with exoglycosidase and treatment with tunicamycin led to the discovery that the antigenic action exerted by the monoclonal antimelanomantibody according to comparative example (as "M2590 antibody" is recognized, is asparagine-bound sugar chains with terminal salivary acids (sialic acid). ■ In general, a monoclonal antibody recognizes only an antigen determinant of antigen molecules. Is a If a specified antigen determinant is a protein, only one such determinant is present on a molecule. Therefore only one molecule of the monoclonal antibody can be combined with one antigen molecule. However, recognizes the invention monoclonal antibody a tumor antigen that is composed of sugar chains. That means that many Sugar chains are present on an antigen molecule, and that therefore many antibody molecules can combine with one antigen molecule. Accordingly, the monoclonal Antibodies according to the invention with its highly specific reactivity have high sensitivity when used as diagnostic or therapeutic agent is used. Since, as mentioned above, the monoclonal of the invention Antibodies, such as the M2590 antibody, are equivalent to non-human animal melanoma cells and human
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lichen Melanomzeilen reagieren kann, sind die Ergebnisse . der Tierversuche direkt auf Menschen übertragbar. Unter Berücksichtigung dieser Zusammenhänge ist der genannte Antikörper ein ideales Mittel zur Diagnose von Melanom. Insbesondere kann man erwarten, daß eine Immunprobe, bei der der monoklone Antikörper in Kombination mit einer Markierung wie einem Isotop oder Enzym ein ausgezeichnetes Diagnosemittel ist.Melanoma lines can react, are the results . of animal experiments can be directly transferred to humans. Taking these relationships into account, the above is Antibodies an ideal means of diagnosing melanoma. In particular, one can expect an immunoassay at that of the monoclonal antibody in combination with a label such as an isotope or enzyme is an excellent one Diagnostic agent is.
Die Herstellung von M2590 Antikörper als erfindungsgemäß bevorzugter Melanomantikörper wird im folgenden Vergleichsbeispiel beschrieben.The production of M2590 antibody as a melanoma antibody preferred according to the invention is shown in the following comparative example described.
Vergleichsbeispiel Comparative example
(1) Sensibilisierung der Maus mit Antigen.(1) sensitizing the mouse with antigen.
In einem Kulturfluid RPMI-1640 (enthaltend 4% Rinderfetusserum, hergestellt von Gibco Co.) wurden 1 χ 10 /ml von Maus-B-16-Melanomzellen (J. Natl. Cancer Inst., 32, 535-545, 1964) mit 100 μg/ml Mitomycin C bei 370C für 45 Minuten umgesetzt. Die B16-Melanomzellen (1 χ 10 ), behandelt mit Mitomycin C, wurden intraperitonäal C57BL/6 Mäusen einmal wöchentlich verabreicht; diese Immunisierung wurde 10 Wochen lang wiederholt. Darüber hinaus, drei Tage vor ZeIl-In a culture fluid RPMI-1640 (containing 4% bovine fetal serum, manufactured by Gibco Co.), 1 × 10 / ml of mouse B-16 melanoma cells (J. Natl. Cancer Inst., 32, 535-545, 1964) were added 100 μg / ml mitomycin C reacted at 37 ° C. for 45 minutes. The B16 melanoma cells (1 × 10) treated with mitomycin C were administered intraperitoneally to C57BL / 6 mice once a week; this immunization was repeated for 10 weeks. In addition, three days before the
fusion, wurden 1 χ 10 Bi6-Melanomzellen, behandelt mit Mitomycin C, intravenös in die Tiere injiziert. Drei oder vier Tage später wurden die Milzen aus den Mäusen entnommen und zum Erhalt einer RPMI-1640 Zellsuspension zu Stücken zerbrochen=fusion, 1 × 10 Bi6 melanoma cells were treated with Mitomycin C, injected intravenously into the animals. Three or four days later, the spleens were removed from the mice and broken into pieces to obtain an RPMI-1640 cell suspension =
(2) Hybridisierung(2) hybridization
10 ml einer RPMI-1640 Suspension mit Gehalt an 1 χ 10 Myelomzellen P3U1 (Curr. Top. Microbiol. Immunoil., 81, 1-7,10 ml of an RPMI-1640 suspension with a content of 1 χ 10 Myeloma cells P3U1 (Curr. Top. Microbiol. Immunoil., 81, 1-7,
1978), und 10 ml einer Suspension mit Gehalt an 1 χ 10 Milzzellen, hergestellt nach (1), (bei Bedarf können beide1978), and 10 ml of a suspension containing 1 × 10 spleen cells, prepared according to (1), (if necessary, both
in einer Anzahl von 1x10 verwendet werden; in anderen Worten: das Mischungsverhältnis der Myelomzellen zu MiIzzellen kann 1:10 bis 1:1 betragen) wurden in ein 50 mlbe used in numbers of 1x10; in other Words: the mixing ratio of myeloma cells to miIz cells can be 1:10 to 1: 1) were in a 50 ml
Zentrifugenrohr eingegeben und 10 Minuten bei Zimmertemperatur und 400 χ g zentrifugiert. Der überstand wurde vollständig entfernt und der Rückstand in ein konstantes Temperaturbad bei 370C eingebracht. Während die Zellen langsam mit der Spitze einer Pipette vermischt wurden, wurde 1 ml einer erhitzten 50 %igen Polyäthylenglycol(PEG)Lösung langsam über einen Zeitraum von 1 Minute zugegeben. Für eine weitere Minute wurde die Suspension mit der gleichen Pipette gerührt. Dann wurden langsam 2 ml erhitzter RPMI-1640 unter Rühren über einen Zeitraum von 2 Minuten zugesetzt. Zusätzlich wurden über 2 bis 3 Minuten 7 ml RPMI-1640 zugegeben. Die Mischung wurde bei Zimmertemperatur 10 Minuten bei 400 χ g zentrifugiert. Der überstand wurde entfernt und 10 ml RPMI-1640 mit Gehalt an 10 % Kalbfetusserum versetzt.Entered centrifuge tube and centrifuged for 10 minutes at room temperature and 400 χ g. The supernatant was completely removed and the residue in a constant temperature bath at 37 0 C is introduced. While slowly mixing the cells with the tip of a pipette, 1 ml of a heated 50% polyethylene glycol (PEG) solution was slowly added over a period of 1 minute. The suspension was stirred with the same pipette for a further minute. Then 2 ml of heated RPMI-1640 was slowly added with stirring over a period of 2 minutes. In addition, 7 ml of RPMI-1640 were added over 2 to 3 minutes. The mixture was centrifuged at 400 χ g for 10 minutes at room temperature. The supernatant was removed and 10 ml of RPMI-1640 containing 10% calf serum was added.
Die Mischung wurde leicht gerührt. Die Zellsuspension wurde schrittweise in einer Menge von 0,1 ml je Ausnehmung auf eine flachbödige Mikrotestplatte mit 96 Ausnehmungen aufgegeben und in einem Kohlendioxidinkubator kultiviert. (3) UntersuchungenThe mixture was gently stirred. The cell suspension was gradually increased in an amount of 0.1 ml per well A flat-bottomed micro test plate with 96 wells was applied and cultivated in a carbon dioxide incubator. (3) Investigations
Am nächsten Tag nach Beginn der Kultivierung wurde 0,1 ml HAT (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin)-Kulturfluid zugesetzt; nach Ablauf von 2, 3, 5, 8 und 11 Tagen wurde eine Hälfte des Überstands in jeder Ausnehmung abgezogen und 0,1 ml frischen HAT-Kulturfluids zugesetzt. Dann wurde das Kulturmedium mit HT(Hypoxanthin, Thymidin)-Kulturfluid alle 3 oder 4 Tage ausgetauscht.The next day after the start of the cultivation, 0.1 ml HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) culture fluid added; after 2, 3, 5, 8 and 11 days, half of the supernatant in each well was peeled off and 0.1 ml of fresh HAT culture fluid added. Then it became Culture medium with HT (hypoxanthine, thymidine) culture fluid exchanged every 3 or 4 days.
Als Zielzellen (target cells) wurden (1) B16 Mausmelanomzellen, (2) menschliche Melanomzellen und (3) EL-4 Lymphomazeilen von C57BL/6 Mäusen verwendet. 5 χ 10 der Zielzellen wurden mit 0 50 μΐ der überstehenden Kulturflüssigkeit des Hybridoma (einschließlich des Antikörpers) bei 00C für 50 Minuten umgesetzt. Die Reaktion wurde auf einer Mikrotiterpolystyrolplatte mit 96 Ausnehmungen (hergestellt von Dynatech Lab. Co.) durchgeführt. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugieren gewaschen und mit 50 μΐ Antimaus-Ig AntikörperThe target cells used were (1) B16 mouse melanoma cells, (2) human melanoma cells and (3) EL-4 lymphoma cells from C57BL / 6 mice. 5 χ 10 target cells were treated with 0 50 μΐ the culture supernatant of the hybridoma (including the antibody) at 0 0 C for 50 minutes implemented. The reaction was carried out on a 96-well polystyrene microtiter plate (manufactured by Dynatech Lab. Co.). The cells were then washed by centrifugation and treated with 50 μl anti-mouse Ig antibodies
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(50.000 cpm/Ausnehmung), mit J bei 00C für 1 Stunde umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gut gewaschen und getrocknet; dann wurde seine Radioaktivität mit einem Gammazähler (hergestellt von Dynaboard Co.) gemessen. Der Antikörper, der mit (1) aber nicht mit den Zielzellen (2) und (3) reagierte, wurde vorläufig als ein Mausmelanom-spezifischer Antikörper (M562 Antikörper) betrachtet, worauf dann der nächste Schritt durchgeführt wurde. Der Antikörper, der mit (1) und (2), jedoch nicht mit (3) reagierte, wurde als ein Antikörper (M2590 Antikörper) bezeichnet, der ein Melanomantigen, das verschiedenen Arten zueigen ist, erkennt. Jene Antikörper, die mit allen Zielzellen (1), (2) und (3) reagierten oder mit keiner der Zielzellen reagierten, wurden als nicht spezifische Antikörper ausgeschlossen.(50,000 cpm / well), reacted with J at 0 0 C for 1 hour. The reaction product was washed well and dried; then, its radioactivity was measured with a gamma counter (manufactured by Dynaboard Co.). The antibody which reacted with (1) but not with the target cells (2) and (3) was tentatively regarded as a mouse melanoma-specific antibody (M562 antibody), and then the next step was carried out. The antibody that reacted with (1) and (2) but not with (3) was called an antibody (M2590 antibody) that recognizes a melanoma antigen peculiar to various species. Those antibodies which reacted with all of the target cells (1), (2) and (3) or did not react with any of the target cells were excluded as non-specific antibodies.
(4) Heranziehen von Zellen, die den gewünschten Antikörper herstellen können(4) Obtaining cells capable of producing the desired antibody
Es wurde nach der Grenzverdünnung gearbeitet. Wenn bei Untersuchungen einer Ausnehmung gefunden wurde, in der Hydridomzellen existierten, die einen spezifischen Antikörper produzierten, wurde das Heranziehen (Cloning) dieser Ausnehmung durch die Grenzverdünnungsmethode durchgeführt. Beim Heranziehen der Zellen wurden die Zellen so eingestellt, daß ihre Konzentration 30 Zellen/20 ml betrug. Die Zellsuspension wurde in Mengen von 0,2 ml-Portionen in Vertiefungen einer flachbödigen Mxkrotiterplatte mit 96 Ausnehmungen aufgeteilt. 5 Tage nach dem Heranziehen wurde 0,1 ml eines HA (Hypoxanthin, Aminoptenin)-Kulturfluids zu jeder Ausnehmung zugesetzt; 12 Tage später wurde eine Hälfte des Kulturmediums mitThe limit dilution was used. When with examinations a recess was found in which there were hydridoma cells that had a specific antibody produced, cloning of this recess was carried out by the limiting dilution method. When pulling up of the cells, the cells were adjusted so that their concentration was 30 cells / 20 ml. The cell suspension was divided into 0.2 ml portions in wells of a flat-bottomed microtiter plate with 96 wells. 5 days after the growing, 0.1 ml of an HA (hypoxanthine, aminoptenin) culture fluid was added to each well; 12 days later, half of the culture medium was used
3Ό frischem HA-Kulturfluid ausgetauscht. Dann wurde das Kulturmedium alle 3 oder 4 Tage· mit' frischem HA-Kulturfluid ausgetauscht.3Ό fresh HA culture fluid exchanged. Then the culture medium every 3 or 4 days exchanged with fresh HA culture fluid.
Zellen, die M562 Antikörper produzierten, wurden mit D~ und Zellen, die M2590 Antikörper produzierten, mit D10 Cells M562 produced antibodies were produced with D ~ and cells M2590 antibody, with D 10
bezeichnet.designated.
(5) Reinigung des Antikörpers(5) Purification of the antibody
1x10 Hybridomazellen wurden intraperitonäal jeder von (BALB/C χ C57BL/6) F1 Mäusen verabreicht; nach 10 Tagen wurde der Ascites, der den Antikörper enthielt, gesammelt. 10 ml Ascites wurden zentrifugiert, in ein Dialyserohr eingegeben und gegen 0,001M Phosphatpuffer (pH 6,5) für 48 Stunden dialysiert. Auf diese Weise konnten alle monoklonen Antikörper abgetrennt werden. Der abgetrennte monoklone Antikörper wurde in einer geringen Menge von 3 %iger NaCl-Lösung gelöst und gegen 0,1 M Phosphat/Natriumchloridpuffer (pH 7,2) dialysiert. Als Ergebnis konnten die meisten der anderen Proteine zusammen mit dem überstand entfernt werden. Durch zwei- bis dreimaliges Wiederholen dieses Vorgangs wies der monoklone Antikörper eine Reinheit von mehr als 95 % auf. Die Immunoglobulinklassen der M2590 und M562 Antikörper war IgM; darüber hinaus waren es Euglobuline. 1x10 hybridoma cells were intraperitoneally administered to each of (BALB / C χ C57BL / 6) F 1 mice; after 10 days the ascites containing the antibody was collected. 10 ml ascites were centrifuged, placed in a dialysis tube and dialyzed against 0.001M phosphate buffer (pH 6.5) for 48 hours. In this way all monoclonal antibodies could be separated. The separated monoclonal antibody was dissolved in a small amount of 3% NaCl solution and dialyzed against 0.1 M phosphate / sodium chloride buffer (pH 7.2). As a result, most of the other proteins could be removed along with the supernatant. By repeating this process two to three times, the monoclonal antibody had a purity of more than 95%. The immunoglobulin class of the M2590 and M562 antibodies was IgM; in addition, they were euglobulins.
Die Melanomantikörper, die wie zuvor beschrieben erhalten wurden, können als ein Melanomdiagnosemittel, beispielsweise in Form einer Lösung verwendet werden.The melanoma antibodies obtained as previously described can be used as a melanoma diagnostic agent, for example, in the form of a solution.
Das folgende Beispiel beschreibt eine Methode zum Diagnostizieren von Melanom unter Verwendung des erfindungsgemäßen Melanomdiagnosemittels.The following example describes a method for diagnosing melanoma using the invention Melanoma diagnostic agent.
(1) Immunoassay in der Festphase(1) Solid phase immunoassay
Es wurde eine Lösung von gereinigtem M2590 Antikörper (gereinigt durch isoelektrische Abscheidung) in einer Konzentration von 2 mg/ml hergestellt, wobei 0,1M Phosphat/ Natriumsalzpuffer (pH 7,2) verwendet wurde. 60 μΐ der Antikörperlösung wurden je Ausnehmung auf eine 96 Ausnehmungen enthaltende Polystyrolplatte (hergestellt durch Dynatech Lab. Co.) in -Form zugegeben und bei Zimmertemperatur über einen Zeitraum von einer Stunde umgesetzt. Dann wurde 0,5% Rinderserum Albumin (BSA) zugesetzt und die Platte drei-A solution of purified M2590 antibody (purified by isoelectric deposition) at a concentration of 2 mg / ml using 0.1M phosphate / sodium salt buffer (pH 7.2). 60 μΐ of the antibody solution were per recess on a polystyrene plate containing 96 recesses (manufactured by Dynatech Lab. Co.) was added in form and reacted at room temperature over a period of one hour. Then became 0.5% bovine serum albumin (BSA) was added and the plate three-
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mal mit Phosphat/Natriumchloridpuffer (BSA-PBS) zur Entfernung des nicht an die Platte gebundenen Antikörpers gewaschen. Darüber hinaus wurden 100 μΐ BSA-PBS zugesetzt und die Reaktion bei Zimmertemperatur über eine Stunde durchgefährt, um die Protein^-Reaktionsgruppen abzuschließen (Stufe 1). Nach sorgfältigem Waschen wurden 40 μΐ eines TttKiorantigenextrakts oder eines Überstands einer Kultur von Krebszellen, die wie unten beschrieben hergestellt wurden, j© Ausnehmung zugesetzt und vier Stunden bei 4°C umgesetzt (Stufe 2)ο Vier Stunden später wurde die Platte dreimal mit STW-Puffer (pH 7,6) (mit Gehalt an 20 mM Tris, 0,15M Natriumchlorid, 0,2% Natriumnitrid, 5 mM EDTA, 2mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 1% NP-40 oberflächenaktives Mittel) gewaschen und dann mit 50 μΐ (10.000 cpm) M2590times with phosphate / sodium chloride buffer (BSA-PBS) for removal of the antibody not bound to the plate was washed. In addition, 100 μΐ BSA-PBS were added and run the reaction at room temperature for one hour to complete the protein ^ reaction groups (Step 1). After careful washing, 40 μΐ were one TttKiorantigenextrakt or a supernatant from a culture of Cancer cells, which were prepared as described below, were added to the recess and reacted for four hours at 4 ° C (Step 2) ο Four hours later the plate was washed three times with STW buffer (pH 7.6) (containing 20 mM Tris, 0.15M Sodium Chloride, 0.2% Sodium Nitride, 5mM EDTA, 2mM Phenylmethylsulfonyl Fluoride and 1% NP-40 surfactant) and then washed with 50 μΐ (10,000 cpm) M2590
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Antikörper, markiert mit J gemäß der in Biochemical Journal, 108, 611-618, (1968) beschriebenen ifethode (Stufe 3) umgesetzt. Nach Durchführung dieser Reaktion für eine Stunde bei 400C wurde das Reaktionsprodukt gut gewaschen.und seine Radioaktivität durch Gammazähler (Stufe 4) gemessen. Diese Operation ttfird in Fig. 1 wiedergegeben.Antibodies labeled with J were reacted according to the method (step 3) described in Biochemical Journal, 108, 611-618, (1968). After performing this reaction for one hour at 40 0 C the reaction product was its radioactivity measured by well gewaschen.und gamma counter (Step 4). This operation ttf is shown in FIG.
Der zuvor erwähnte Tumorantigenextrakt und der Überstand der Krebszellenkultur wurden wie folgt hergestellt:The aforementioned tumor antigen extract and the cancer cell culture supernatant were made as follows:
Tumorzellen (entsprechend 2x10), extrahiert von Geweben oder Gewebefragmenten, die chirurgisch reseziert wurden und 100 mg Gewicht entsprachen,wurden mit 1 ml STN-Puffer (Iph-isoelektrisch ph 7,6) 1 Stunde bei 40C umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei 10.000 üpm 5 Minuten zentrifugiert, um den überstand zu erhalten. Es wurde ein Krebsantigen extrahiert und war im überstand enthalten.'Tumor cells (corresponding to 2x10), extracted from tissues or tissue fragments that have been surgically resected and corresponded to 100 mg weight, were reacted with 1 ml STN buffer (Iph-isoelectric pH 7.6) for 1 hour at 4 0 C. The reaction mixture was centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes to obtain the supernatant. A cancer antigen was extracted and contained in the supernatant. '
Krebszellen (2 χ 106) wurden in RPMI-1640 , enthaltend 4 %iges Kalbserum,kultiviert' und der überstand der Kulturbrühe wurde erhalten.Cancer cells (2 × 10 6 ) were cultured in RPMI-1640 containing 4% calf serum, and the supernatant of the culture broth was obtained.
(2) Herstellung der Eichkurve und die Genauigkeit des Immunoassays in fester Phase :(2) Preparation of the calibration curve and the accuracy of the immunoassay in solid phase:
Es wurden Tumorantigene von wechselnden Zahlen von C57BL/6There were tumor antigens of varying numbers from C57BL / 6
Melanom-(B16)-Zellen oder menschlichen Melanomzellen (P-39) gemäß dem Verfahren, wie es in den letzten beiden Paragraphen des Abschnitts (1) zuvor beschrieben wurde/ hergestellt. Die gebildeten Tumorzellenextrakte unterschiedlicher Antigenkonzentratxonen wurden zu dem in (1) beschriebenen Immun oassaysy stem zugegeben und geprüft. Das Ergebnis, wie es in Fig. 2 abgebildet ist, ist derart, daß,wenn ein Extrakt entsprechend 10 /ml Tumorzellen schrittweise auf ein Verhältnis von 1:10 verdünnt wurde, die Auffindung bei einer Konzentration von 10 /ml und mehr nahezu linear abfiel, wobei das Minimum zur Auffindung 10 -102/ml betrug.Melanoma (B16) cells or human melanoma cells (P-39) according to the method as described / prepared in the last two paragraphs of section (1) above. The tumor cell extracts formed from different antigen concentrates were added to the immunoassaysy system described in (1) and tested. The result, as shown in FIG. 2, is such that when an extract corresponding to 10 / ml of tumor cells was gradually diluted to a ratio of 1:10, the detection fell almost linearly at a concentration of 10 / ml and more , the minimum for detection being 10 -10 2 / ml.
Diese experimentellen Ergebnisse zeigen, daß der Immunoassay in Festphase unter Verwendung dieses Antikörpers (M2590) sehr genau ist und die Auffindung sehr geringer Mengen an Melanomantigen ermöglicht.These experimental results show that the solid phase immunoassay using this antibody (M2590) is very accurate and enables the detection of very low levels of melanoma antigen.
(3) Spezifizität des Immunoassays in der Festphase Um die Spezifizität der Festphasenimmunoassay-Methode zu prüfen, wurden Tumorantigenextrakte gemäß (1) aus drei Arten von menschlichen Melanomzellen (P-36, P-39, P-22), Hamstermelanomzellen, zwei Arten von Mausmelanomzellen (B-16, S-91) menschlichen Cervicalcarcinom(Heia), chirurgisch resezierten Fragmenten von einem Melanompatienten(menschlich, zwei Fälle), menschlicher Hautkrebs (schuppenförmiges Zellcarcinom) und resezierte Proben von Basalioma hergestellt. Diese Tumorantigenextrakte wurden dem Immunoassay in Festphase gemäß Abschnitt (1) unterworfen. Das Ergebnis gemäß Fig. 3 bestand darin, daß Extrakte von Melanomzellen, die von Menschen, Hamstern und Mäusen erhalten wurden, unabhängig davon, ob sie kultivierte Zellstränge oder chirurgisch resezierte Proben waren, durch Immunoassay aufgezeigt wurden; der Antikörper jedoch reagierte überhaupt nicht mit anderen Krebszellen als Melanomzellen, wie menschlichen Cervicalcarcinom, schuppenförmigen Zellkarzinom und Acanthoma. Die Ergebnisse werden in Fig. 3 wiedergegeben.(3) Specificity of the solid phase immunoassay In order to increase the specificity of the solid phase immunoassay method test, tumor antigen extracts according to (1) from three types of human melanoma cells (P-36, P-39, P-22), hamster melanoma cells, two types of mouse melanoma cells (B-16, S-91) human cervical carcinoma (Heia), surgically resected Fragments from a melanoma patient (human, two cases), human skin cancer (flaky cell carcinoma) and prepared resected specimens of basalioma. These tumor antigen extracts were solid phase immunoassay subject to section (1). The result according to FIG. 3 was that extracts of melanoma cells which from humans, hamsters and mice, whether they were cultured cell strands or surgically resected specimens were identified by immunoassay; however, the antibody did not react at all cancer cells other than melanoma cells, such as human cervical carcinoma, flaky cell carcinoma, and acanthoma. The results are shown in FIG.
Taniguchi : : "": ~: '--* ' P 1769-DETaniguchi:: "": ~: '- *' P 1769-DE
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Folgende Schlüsse können aus den offenbarten Ergebnissen abgeleitet werden:The following conclusions can be drawn from the disclosed results:
(1) Menschliches Melanom kann bei Verwendung eines Zeil- oder Gewebeextrakts spezifisch diagnostiziert werden. (2) Immunoassays unter Verwendung des monoklonen Antimelanomantikörpers, wie M2590 Antikörper, besitzen hohe Sensitivität und können ein Melanomantigen in einem menschlichen Melanomzellenextrakt, in denen 1000 bis 500 Melanomzellen existieren, auffinden.(1) Human melanoma can be specifically diagnosed using a cell or tissue extract. (2) immunoassays using the monoclonal anti-melanoma antibody, like M2590 antibodies, have high sensitivity and can be a melanoma antigen in a human Melanoma cell extract in which 1000 to 500 melanoma cells exist, find.
Erfindungsgemäß können beispielsweise verschiedene Immunoassayverfahren angewendet werden, beispielsweise,bei denen der monoklone Antikörper (markiert oder nicht markiert) mit anderen konventionellen Festkörperträgern wie Glasperlen verbunden sind/oder bei denen andere Markierungen wie ein Enzym, eine fluoreszierende Verbindung, usw. verwendet werden; ebenfalls geeignet ist eine indirekte Methode unter Verwendung von sekundären Antikörpern. Demnach kann der erfindungsgemäßen monoklonen Antikörper auf verschiedene konventionelle Träger oder Materialien wie ein Testrohr, Trägerperlen, Polymerpartikel und ähnliche aufgebracht sein.According to the invention, for example, various immunoassay methods can be used, for example at those of the monoclonal antibodies (labeled or unlabelled) with other conventional solid supports such as glass beads / or where other markings such as an enzyme, a fluorescent compound, etc. are used will; an indirect method using secondary antibodies is also suitable. Accordingly, the monoclonal antibodies according to the invention on various conventional carriers or materials such as a test tube, Carrier beads, polymer particles and the like can be applied.
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Chiba / JapanMasaru Taniguchi
Chiba / Japan
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