DE3322847A1 - Process for the stabilisation of biological cells, and biological cell compositions stabilised by this process - Google Patents

Process for the stabilisation of biological cells, and biological cell compositions stabilised by this process

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Abstract

Compositions of biological cells are stabilised in order to avoid, by the formation of acetal, in particular cyclic acetal, an aldehyde functionality, mainly for preventing the linkage of cells. The stabilised biological cells are suitable in particular as analogues for human haematocytes in reference or control reagents as they are used in electronic haematological test apparatus. In a process for the preparation of acetal-stabilised biological cells, biological cells which have been treated with polyaldehyde are reacted with alcohol, in particular 1,2-diol, under acidic conditions; the reaction solution formed is then rendered basic for stabilising the acetal formation on the biological cells.

Description

Verfahren zur Stabilisierung von biologischen Process for stabilizing biological

Zellen sowie danach stabilisierte biologische Zellzusammensetzungen Die Erfindung bezieht sich auf die Stabilisierung von biologischen Zellen, wie Blutteilchen zur Verwendung in Bezugs-bzw. Vergleichareagenzien, wie dies in Blutteilchenzähl-und -größenbestimmungs- bzw. -klassiereinrichtungen der Fall ist. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Stabilisierung von biologischen Zellen, welche zur Fixierung mit einem Polyaldehyd einer entsprechenden Behandlung untenorfen worden sind. Cells and then stabilized biological cell compositions The invention relates to the stabilization of biological cells such as blood particles for use in reference or. Comparative reagents, such as those in Blood Particle Counting and -sizing or -classing devices is the case. The invention relates in particular on the stabilization of biological cells, which are used for fixation have been subjected to an appropriate treatment with a polyaldehyde.

Bei der Shtwicklung verbesserter elektronischer Blutteilchenzähl- und-bestimmungs- bzw. -klassiereinrichtungen, wie der unter dem Warenzeichen "Coulter" vertriebenen Geräte, hat die fortschreitende Differenzierung zwischen Teilchenarten, wie sie durch die Größenverteilungen ermittelt amrden, eine stetige Verbesserung der Vergleichslösungen mit bekannten bzw. üblichen Teilchenkonzentrationen und -verteilungen im Hinblick auf ihre Vertzendung als Kontrollsubstanzen erf orderlich gemacht, um sicherzustellen, daß die Geräte zuverlässig arbeiten. Frisches menschliches Blut kann zwar dahin1ehend modifiziert werden, daß man aus ihm hämatologische Vollblut-Vergleichs- bzw.-Bezugssubstanzen herstellt, jedoch haben solche Suspensionen eine begrenzte Lagerzeit und verlieren ihre Stabilität selbst bei Kühllagerung nach etwa 30 Tagen.In the development of improved electronic blood particle counting and determination or classification devices, such as the one under the trademark "Coulter" distributed devices, the progressive differentiation between particle types, as determined by the size distributions, a constant improvement of the comparison solutions with known or customary particle concentrations and distributions with a view to their use as control substances made necessary in order to ensure that the equipment is working reliably. Fresh human blood can be modified in such a way that hematological whole blood comparative or reference substances, but have such suspensions have a limited storage time and lose their stability even when stored cold about 30 days.

Eine solche Instabilität führt zu einer Veränderung des mittleren Zellvolumens (MCV),wodurch sich die Teilchen weniger zuverlässig unterscheiden lassen.Such instability leads to a change in the mean Cell volume (MCV), which means that the particles can be distinguished less reliably.

Beim Versuch, einen flüssigen Blutkontrollstandard durch Gefrieren mit Diol- oder Triolzusätzen zu stabilisieren, lehrt die US-Patentschrift Nr. 4 199 471 eine Behandlung, bei der rote Blutkörperchen zunächst mit einem Aldehyd behandelt werden, um ihnen dann langsam Diol oder Triol zuzusetzen und das entstandene Produkt anschließend in einer Pufferlösung zu belassen.When attempting a liquid blood control standard by freezing US Pat. No. 4 teaches stabilizing with diol or triol additives 199 471 a treatment in which red blood cells are first treated with an aldehyde treated in order to then slowly add diol or triol to them and the resulting Then leave the product in a buffer solution.

Die Betonung bei dieser Patentschrift auf die Zugabe von Diol oder Triol - anstelle einer Umsetzung - wird durch die Verwendung von Formaldehyd als bevorzugtem Aldehyd in den Beispielen der offenbarten Behandlungsmethode veranschaulicht.The emphasis in this patent on the addition of diol or Triol - instead of a reaction - is made through the use of formaldehyde as a preferred aldehyde illustrated in the examples of the disclosed treatment method.

Nach einem anderen Verfahren, welches in der US-Patentschrift Nr. 4 160 644 offenbart ist, wird ein Blutplättchenkontrollreagenz durch die Zugabe einer geringen Menge von festem Polyäthylenglycol entweder zu der Plättchensuspension oder aber dem Verdünnungsmittel für die Plättchensuspension stabilisiert, wodurch eine Stabilisierung sowohl in bezug auf Zeit als auch auf Bewegung erreicht wird; flüssiges Polyäthylenglycol mit einem niedrigeren Molekulargewicht hat sich als unwirksam erwiesen.Another method disclosed in U.S. Patent No. 4 160 644 is disclosed, a platelet control reagent becomes through the addition a small amount of solid polyethylene glycol to either the platelet suspension or the diluent for the platelet suspension is stabilized, whereby stabilization is achieved in terms of both time and motion; liquid polyethylene glycol with a lower molecular weight has been found to be proven ineffective.

Die Verwendung von å jeweils getrennten Bezugskontrollreagenzien für die verschiedenen Teilchenarten hat sich als schwierieter erwiesen als die Vefliendung von Vollblutkontrollreagen len. Beispiels1zeise ist es in j jedem Blutplättchenzählsystem, in dem anhand der chara'teristischen Größenordnungen und Volumenverteilungen der Plättchen in der Blutprobe zwischen PLttchen des menschlichen Organismus und anderen Zellen unterschieden wird, erforderlich, daß die Vergleichssubstanz auch die Plättchengrößenordnungen weitgehendst simuliert.The use of å separate reference control reagents for The various types of particles have proven to be more difficult than using them of whole blood control reagents. For example, in every platelet counting system it is in which based on the characteristic orders of magnitude and volume distributions of the Platelets in the blood sample between platelets in the human body and others Cells differentiated, required that the reference substance even the platelet sizes largely simulated.

Vergleichsreagenzien mit Plättchen oder simulierten Plättchen, die nur einen eng begrenzten Größenverteilungsbereich aufweisen, würden sich nicht zur Vermittlung eignen, ob die Größenverteilungsgrenzen richtig eingestellt sind. Aus diesem Grunde muß'das Vergleichsreagenz einen mittleren Größenwert aufweisen, der zwischen der oberen und unteren Grenze liegt, sowie ein Volumenverteilungshistogramm, welches sich der normalen Logarithmusverteilung frischer menschlicher Blutplättchen stark annähert.Comparative reagents with platelets or simulated platelets that only have a narrow range of size distribution would not result in Mediation are suitable as to whether the size distribution limits are set correctly. the end For this reason, the comparison reagent must have an average size value that lies between the upper and lower limit, as well as a volume distribution histogram, which is the normal logarithmic distribution of fresh human platelets strongly approximates.

Um das Problem der Herstellung eines Produkts mit der geeigneten Größe und Form, dem geeigneten Volumen und der geeigneten Elektroresistenz sowie mit der entsprechenden Temperatur- und Zeitstabilität, einer einheitlichen Teilchenverteilung und der mikrobiologischen Hemmung zu lösen, sind bislang viele Technologien erprobt worden. Bisher sind im wesentlichen synthetische Teilchen, wie Polystyrollatex, nicht-tierische Hefe und Pollenzellen, chemisch fixierte Blutplättchen vom Menschen oder anderen Säugetieren sowie sonstige chemisch fixierte tierische Zellen untersucht worden. Dabei können die synthetischen Teilchen sehr stark den mittleren Volumen- und Größenverteilungsspezifikationen angenähert werden, jedoch lassen sich gleichmäßige, stabile und einheitliche Suspensionen nur sehr schwer herstellen.To solve the problem of making a product with the appropriate size and shape, the appropriate volume and the appropriate electrical resistance as well as with the corresponding temperature and time stability, a uniform particle distribution and to release the microbiological inhibition, many technologies have so far been tried and tested been. So far, mainly synthetic particles, such as polystyrene latex, non-animal yeast and pollen cells, chemically fixed human platelets or other mammals as well as other chemically fixed animal cells are examined been. The synthetic particles can very strongly correspond to the mean volume and size distribution specifications can be approximated, but uniform, It is very difficult to produce stable and uniform suspensions.

Darüber hinaus stellt die sphärische Form dieser Teilchen eine unterschiedliche elektronische "Form" für einen sogenannten "Coulter-Zahler" dar, so daß diese Volumen hinsichtlich der Differenz in der Form mittels eines willkürlich gewählten Form-Faktors "korrigiert" werden müssen.In addition, the spherical shape of these particles represents a different one electronic "form" for a so-called "Coulter counter", so that this volume in terms of the difference in shape by means of an arbitrarily chosen shape factor need to be "corrected".

Die Einführung eines undefinierten ma«hematischen Faktors in das Vergleichsverfahren ist unerl m scht. Pollen und Hefen weisen dieselben Nachteile auf, und darüber hinaus sind sie von Einsatzmaterial zu Einsatzmaterial unterschiedlich und auch nicht immer verfügbar. Menschliche und sonstige tierische Blutplättchen lasse, sich nur schwer und unter hohem Kostenaufwand sammeln und herstellen. Die heute üblichen Konservierungsverfahren führen zu einer erheblichen Schrumpfung der Plättchen, was die Volumenverteilung der Normalpopulation aus dem Gleichgewicht bringt; durch diese verschlechterte Volumenverteilung werden die Plättchen auch beim Altern negativ beeinflußt, wodurch die Verwendbarkeit des Blutplättchenkontrollreagenz stark beeinträchtigt wird.The introduction of an undefined mathematical factor in the comparison process is essential. Pollen and yeast have the same disadvantages and more are they different and not always from input material to input material available. Human and other animal platelets are difficult to get rid of and collect and manufacture at high cost. The preservation methods used today lead to a significant Shrinkage of platelets what the Unbalances the volume distribution of the normal population; through this worsened volume distribution, the platelets also become negative with aging influenced, whereby the usability of the platelet control reagent is severely impaired will.

In einem in der US-Patentschrift Nr. 3 553 310 offenbarten Verfahren werden biologische Zellen, beispielsweise Erythrozyten von Ziegen und mikrobiologische Zellen, zur Bildung von konservierten und gegen Lyase stabilisierten Teilchen durch chemische Fixierung in Form einer Umsetzung mit Aldehyden, insbesondere Glutaraldehyden, stabilisiert. Wenn auch die Fixierung mit einem Aldehyd im Hinblick auf die Ueilchenstabilität erstrebenswert ist, so kann eine solche Fixierung auch zu einer Vernetzung zwischen den Teilchen mit unerwünschter Agglut/inierung führen.In a process disclosed in U.S. Patent No. 3,553,310 become biological cells such as goat erythrocytes and microbiological Cells to form preserved and lyase-stabilized particles chemical fixation in the form of a reaction with aldehydes, especially glutaraldehydes, stabilized. Albeit the fixation with an aldehyde with a view to the stability of the violet is desirable, such a fixation can also lead to a networking between lead the particles with undesired agglutination.

Typischerweise reagiert nur eine der Aldehydgruppen von Glutaraldehyd (1,5-Pentandialdehyd, OHCCH2CH2CXO) mit einer biologischen Zelle, beispielsweise einem Ersthrozyt-Membran-Proteinmolekül (RBC) und läßt die andere Aldehydgruppe für die Vernetzung mit anderen benachbarten funktionellen Gruppen an derselben Zelle oder an anderen Zellen frei. Typically only one of the aldehyde groups of glutaraldehyde (1,5-pentanedialdehyde, OHCCH2CH2CXO) reacts with a biological cell, for example a first blood cell membrane protein molecule (RBC), and leaves the other aldehyde group for cross-linking with other neighboring functional groups on the same cell or on other cells free.

Andere vermutete Mechanismen für diese Reaktion schließen die Bildung eines Glutaraldehyddimeren ein, welches eine C=C-Gruppe mit einem aktiven beta-Wasserstoffatom enthält.Other putative mechanisms for this response include formation a glutaraldehyde dimer which has a C = C group with an active beta hydrogen atom contains.

Die Kondensierung an dieser Stelle läßt beide Aldehydgruppen frei. The condensation at this point releases both aldehyde groups.

Glutara ldehyddimer In-beiden Fällen erfolgt eine Pseudo-Hämagglutinierung (d.h. eine Vernetzung zwischen einander benachbarten Zellen), was zur Bildung von Zellklümpchen führt, die sich sehr schnell absetzen und dasu neigen, auf dem Boden des Reaktionsbehälters einen Belag zu bilden. Obwohl dieser Prozeß langsam abläuft, beeinträchtigt er nachhaltig die Stabilität und Anwendbarkeit jeder auf diese Art und Weise durchgeführten Analogkontrolle.Glutaraldehyde dimer In both cases, pseudo-hemagglutination occurs (ie cross-linking between adjacent cells), which leads to the formation of cell clumps which settle very quickly and which tend to form a coating on the bottom of the reaction container. Although this process is slow, it severely affects the stability and applicability of any analog control performed in this way.

Erfindungsgemäß können biologische Zellen, die mit Polyaldehod behandelt worden sind, zur Verhinderung einer Zellezu-Zelle-Vernetzung dieser Zellen stabilisiert werden, und zwar durch Bildung eines Acetals, das die nicht reagierte Aldehydfunktionalität schützt.According to the invention, biological cells which have been treated with polyaldehod can be used have been stabilized to prevent cell-to-cell crosslinking of these cells by forming an acetal that will remove the unreacted aldehyde functionality protects.

Das Verfahren zur Herstellung von mit Acetalresten stabilisierten biologischen Zellen umfaßt die Umsetzung von mit Polyaldehyd behandelten biologischen Zellen mit einem Alkohol unter- sauren Beding; danach kann zur Stabilisierung der Acetalbildung der pH-Wert auf einen basischen Wert angehoben werden.The process for the preparation of stabilized with acetal residues biological cells involves the conversion of polyaldehyde treated biological cells Cells with an alcohol under acidic condition; after that, to stabilize the Acetal formation raises the pH to a basic value.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stabiligiert das entstandene cyclische Acetal die mit dem Aldehyd behandelten biologischen Zellen dadurch, daß zur Umsetzung mit dem freien Aldehyd ein 1,3-Dialkohol oder ein 1,2-Dialkohol, insbesondere Xthylenglycol, verwendet wird.In a preferred embodiment of the invention, this stabilizes resulting cyclic acetal with the aldehyde treated biological Cells in that a 1,3-dialcohol or to react with the free aldehyde a 1,2-dialcohol, in particular ethylene glycol, is used.

Die erfindungsgemäß stabilisierten biologischen Zellen eignen sich insbesondere als menschliche Blutteilchen, die analog zu Vergleichsreagenzien sind, wie sie in den hämatologischen Testeinrichtungen vom Typ "Coulter" Verwendung finden ("Coulter" und 'tCoulter Counter" sind eingetragene Warenzeichen der Firma Coulter Electronics, Ins.).The biological cells stabilized according to the invention are suitable especially as human blood particles, which are analogous to comparison reagents, as used in the "Coulter" type hematological test facilities ("Coulter" and 'tCoulter Counter "are registered trademarks of Coulter Electronics, Ins.).

Im allgemeinen sind biologische Zellen, beispielsweise Erythrozyten von Säugetieren und Vögeln, die als menschliche Blutteilchenanaloga verwendet worden sind, unter Verwendung eines Aldehyds, insbesondere Glutaraldehyd, wie im einxlnen von Pearse in "Histochemistry: Theoretical and Applied??, 3. Ausgabe, Bnd 1 (1968) in Kapitel 5 beschrieben, fixiert worden. Wenngleich Glutaraldehyd der für die Fixierung der erfindungsgemäß stabilisierten biologischen Zellen bevorzugte Aldehyd ist, können geeigneterweise auch andere Polyaldehyde, wie zum Beispiel die Dialdehyde, die sich von Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure und Adipinsäure ableiten, fiir die Fixierung biologischer Zellen Verwendung finden.In general, they are biological cells such as erythrocytes from mammals and birds, which have been used as human blood particle analogs are, using an aldehyde, especially glutaraldehyde, as in the natural von Pearse in "Histochemistry: Theoretical and Applied ??, 3rd Edition, Volume 1 (1968) described in Chapter 5. Although glutaraldehyde is used for fixation of the biological cells stabilized according to the invention is the preferred aldehyde suitably also other polyaldehydes, such as, for example, the dialdehydes, which derived from oxalic acid, malonic acid, succinic acid and adipic acid, for fixation biological cells find use.

Ganz allgemein können erfindungsgemäß die nicht umgesetzten oder freien Aldehydgruppen an den mit Polyaldehyd behandelten biologischen Zellen zur Bildung von Acetalen mit Alkohol umgesetzt werden, welche eine nachfolgende Vernetzung von Zelle zu Zelle verhindern und die biologischen Zellen im Hinblick auf die Verwendung in Suspensionen mit einer größeren Lagerstabilität ohne die Gefahr einer Agglutsiniermg stabilisieren. Als geeignete Alkohole zur Umsetzung mit Aldehyden zur Bildung von Acetalen können beispielsweise Alkohole mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bei vorliegender Erfindung verwendet werden.Very generally, according to the invention, the unreacted or free Aldehyde groups on the biological cells treated with polyaldehyde to form of acetals are reacted with alcohol, which leads to a subsequent crosslinking of Cell to cell and prevent the biological cells from using in suspensions with a greater storage stability without the risk of agglutination stabilize. As suitable alcohols for reaction with aldehydes to form Acetals, for example, alcohols with 1 to 6 carbon atoms when present Invention can be used.

Die nach der Erfindung vorzugsweise verwendeten Alkohole reagieren mit dem Aldehyd unter Bildung eines cyclischen Acetals. Solche Alkohole sind beispielsweise die Glycole, die benachbart zu den Hydroxylgruppen nicht sterisch gehindert sind, beispielsweise Trimethylenglycol (1,3-Propandiol), das zur Bildung eines 6-gliedrigen cyclischen Acetals mit Aldehyd reagiert. Am meisten für die erfindungsgemäße Veflrendung bevorzugt werden die 1,2-Dialkohole die mit dem Aldehyd unter Bildung eines 5-gliedrigen Acetals reagieren, wodurch besonders stabilisierte biologische Zellen erhalten werden und die Beständigkeit gegenüber einer Agglutz-inierung der Zellen bei einer Suspension gefördert wird. So sind Propylenglycol, und insbesondere Äthylenglycol, Beispiele für die am meisten bevorzugten 1,2-Dialkohole. Weniger bevorzugt ist Glycerin, ein Beispiel eines Triols, das in der Lage ist, cyclisches Acetal zu bilden, jedoch eine freie Hydroxylgruppe aufweist, die dann unter Vernetzung zwischen biologischen Zellen unter verminderter Beständigkeit gegen ein Aggluttinieren reagieren kann. Andere Alkohole, die sich für die erfindungsgemäße Verwendung eignen, sind zum Beispiel 1,2-Cyclopentandiol und 1,2-Cyclohexandiol.The alcohols preferably used according to the invention react with the aldehyde to form a cyclic acetal. Such alcohols are for example the glycols that are not sterically hindered adjacent to the hydroxyl groups, for example trimethylene glycol (1,3-propanediol), which forms a 6-membered cyclic acetal reacts with aldehyde. Mostly for the use according to the invention preferred are the 1,2-dialcohols those with the aldehyde to form a 5-membered Acetals react, as a result of which particularly stabilized biological cells are obtained and the resistance to agglutination of cells in suspension is promoted. Propylene glycol, and particularly ethylene glycol, are examples for the most preferred 1,2-dialcohols. Less preferred is glycerin, a Example of a triol capable of forming cyclic acetal, however has a free hydroxyl group, which then under crosslinking between biological Cells can react with reduced resistance to agglutination. Other alcohols suitable for use in the present invention are, for example 1,2-cyclopentanediol and 1,2-cyclohexanediol.

Zur Herstellung der stabilisierten biologischen Zellen nach der erfindung werden die mit Polyaldehyd behandelten Zellen zur Förderung der Acetalbildung mit Alkohol unter sauren Bedingungen behandelt; insofern wird die Bildung von Acetal durch die Umsetzung in Gegenwart von Überschußalkohol zur Gewährleistung einer lIydroxyl-Äquivalent-Funktionalität begünstigt, die größer ist als das reagierende freie Aldehyd-Squivalent. Wenn beispielsweise eine Natriumchloridlösung mit 0,25 °ó Glutaraldehyd zur Umsetzung in einer Suspension von annähernd 75 000 bis 100 000 Zellen/mm3 verwendet wird, liefert die Umsetzung mit Jthylenglycol, das bis zu einer Lonzentration von etwa 3 Volumenprozent, bezogen auf das Volumen der Gesamt suspension, zugegeben wird, einen geeigneten EDerschuß an alkoholischen Hydroxylgruppen.For the production of the stabilized biological cells according to the invention the cells treated with polyaldehyde are used to promote acetal formation Alcohol treated in acidic conditions; to that extent the formation of acetal by the reaction in the presence of excess alcohol to ensure a hydroxyl-equivalent functionality favored, which is greater than the reacting free aldehyde squivalent. For example, if a sodium chloride solution with 0.25 ° ó glutaraldehyde for conversion in a suspension from approximately 75,000 to 100,000 cells / mm3 used provides the implementation with ethylene glycol, which is up to a concentration of about 3 percent by volume to the volume of the total suspension, a suitable e-shot is added on alcoholic hydroxyl groups.

Es ist gefunden worden, daß die rleaktionslösung als einem pH-Wert von vorzugsweise im Bereich von aImShernd 2, S>- bis 2,9 gehalten werden kann, um die Acetalbildung bei mit Aldehyd behandelten biologischen Zellen, wie tierischen Erythrozyten, in einer überschüssige Hydroxylgruppen enthaltenden Lösung zu fördern. Im Anschluß daran kann die entstandene Reaktionslösung basisch, vorzugsweise leicht über neutral, eingestellt werden.It has been found that the reaction solution as a pH of preferably in the range from aImShernd 2, S> - to 2.9 held can be used to prevent acetal formation in biological cells treated with aldehyde, such as animal erythrocytes, in an excess containing hydroxyl groups Promote solution. The resulting reaction solution can then be basic, preferably slightly above neutral.

Ferner ist gefunden worden, daß die Binstellung der entstandenen Reaktionslösung auf einen pH-Wert von vorzugsweise im Bereich von annähernd 7,2 bis 7,6 besonders wirksam ist für die Stabilisierung der mit Acetal stabilisierten biologischen Zellen. Eine geeignete basische Einstellung wird durch die Zugabe einer üblichen Phosphat-Pufferlösung erreicht; gegebenenfalls können auch geringe Anteile einer starken Base, beispielsweise 6-n Natriumhydroxidlösung zugesetzt werden.It has also been found that the position of the resulting reaction solution to a pH of preferably in the range of approximately 7.2 to 7.6 especially is effective for the stabilization of the biological cells stabilized with acetal. A suitable basic setting is made by adding a customary phosphate buffer solution achieved; if appropriate, small proportions of a strong base, for example 6-N sodium hydroxide solution can be added.

Bin Beispiel für die Stabilisierungsreaktion nach der Erf indung ist folgende Umsetzung, in der eine mit Glutaraldehyd behandelte Erythrozyte (RBC) unter Bildung einer cyclischen Äthylenglycolacetalstabilisierung der Zelle reagiert, die besonders stabil bei der basischen Einstellung der Reaktionslösung ist: Dic erfinålngsgemaß hergestellten biologischen Zellen sind für die Verwendung als menschliche Blutteilchenanaloga in BezuSs- bzw. Vergleichslösungen entwickelt worden, wie sie in hämatologischen Zähl- und Größenbestimmungs- bzw. Klassiereinrichtungen verwendet werden. Bei solchen Anwendungen können die saabilisierten Zellen in einem Verdünnungsmedium suspendiert werden, das zur Verhinderung einer unerwünschten Transacetalisierung vorzugsweise einen geeigneten Alkohol sowie darüber hinaus ein übliches Bakterizid und übliche Entschäumungsmittel mit einer Pufferlösung zur Aufrechterhaltung eines pH-Wertes von etwa 7,4 enthält. Die besten Ergebnisse bei der Herstellung von menschlichen Blutteilchenanaloga sind durch die Rerstellung von tierischen Erythrozyten, wie von roten Blutkörperchen vom menschen oder Ziegen, erzielt worden, die erfindungsgemäß stabilisiert worden sind. Beispielsweise sind erfindungsgemäß Erythrozyten von Ziegen beim Vermischen eines menschlichen Blutteilchenanalogs mit einer Teilchengröße im Bereich von 2 bis 20 µm³ und einer mittleren logarithmisch-normal Volumenpopulatation stabilisiert worden. In ähnlicher Weise sind erfindungsgemäß menschliche Erythrozyten für die Verwendung als Analogon eines Beukozyts des menschlichen Organismus oder einer weissen Blutzelle (I{BC) verwendet worden. Die stabilisierten Zellen können entweder als alleinstehende Analoga oder als Vollblutsimulierungen für Vergleichsreagenzien Verwendung finden.An example of the stabilization reaction according to the invention is the following reaction, in which an erythrocyte (RBC) treated with glutaraldehyde reacts to form a cyclic ethylene glycol acetal stabilization of the cell, which is particularly stable when the reaction solution is made basic: The biological cells produced in accordance with the invention have been developed for use as human blood particle analogs in reference or comparison solutions, such as are used in hematological counting and sizing or classifying devices. In such applications, the saabilized cells can be suspended in a dilution medium which, to prevent undesired transacetalization, preferably contains a suitable alcohol and also a common bactericide and common defoaming agent with a buffer solution to maintain a pH of about 7.4. The best results in the preparation of human blood particle analogs have been obtained by preparing animal erythrocytes, such as human or goat red blood cells, which have been stabilized in accordance with the invention. For example, according to the present invention, goat erythrocytes have been stabilized by mixing a human blood particle analog having a particle size in the range of 2 to 20 µm 3 and a mean log-normal volume population. Similarly, according to the invention, human erythrocytes have been used as an analog of a beukocyte of the human organism or a white blood cell (I {BC). The stabilized cells can be used either as stand-alone analogs or as whole blood simulations for comparative reagents.

Folgendes sei ein Beispiel für die erfindungsgemäße Behandlung von Säugetiererythrozyten: Beispiel Frisches Ziegenblut wird unter aseptischen Bedingungen in ein Anticoagulans gesammelt. Das Blut wird langsam zentrifugiert und das Plasma und das Anticoagulans entfernt. Die Erythrozyten werden dreimal mit mit Phosphat gepuffertem Natriumchlorid gewaschen, wobei der pH-Wet bei annähernd 410 Milliosmol/kg (mOsm/kg) eingestellt wird. Etwa 100 bis 150 ml der frisch gewaschenen Erythrozyten werden in 2-1 Natriumchloridlösung, 410 m0sm/kg, suspendiert und mit einem magnetischen Rührer gerührt. Dann werden 500 ml Natriumcloridl;sung (410 mOsm/kg), die 0,31 Gew.-%, bezogen auf das Volumen, Glutaraldehyd enthält, mit einer Geschwind:it:-keit von 10 bis 15 ml/min zugetropft. Das Rühren wird 15 Minuten fortgesetzt, und anschließend fügt man 500 ml einer Natriunchloridlösung (410 mOsm/kg), die 0,44 Gew.-% Glutaraldehyd, bezogen auf das Volumen, enthält, hinzu.The following is an example of the inventive treatment of Mammalian erythrocytes: Example Fresh goat blood is processed under aseptic conditions collected in an anticoagulant. The blood is slowly centrifuged and the plasma and removed the anticoagulant. The erythrocytes are used three times with phosphate washed with buffered sodium chloride, the pH-Wet at approximately 410 milliosmol / kg (mOsm / kg) is set. About 100 to 150 ml of the freshly washed red blood cells are suspended in 2-1 sodium chloride solution, 410 m0sm / kg, and with a magnetic Stirrer stirred. Then 500 ml of sodium chloride solution (410 mOsm / kg), the 0.31 wt .-%, based on the volume that contains glutaraldehyde, at a speed: it: -ness from 10 to 15 ml / min were added dropwise. Stirring is continued for 15 minutes and then add 500 ml of a sodium chloride solution (410 mOsm / kg) containing 0.44% by weight of glutaraldehyde, based on the volume it contains.

Nach weiterem 15-minütigem Rühren werden 120 ml Xthylenglycol und 75 ml 1-m Glycin-0;5-m HCl-Pufferlösung vom pH 2,4 zugesetzt und das entstandene Produkt dann 30 Minuten lang gerührt. Der Ehd-pH-Wert beträgt 2,8 + 0,1. Der erhaltenen Lösung werden dann etwa 100 ml 2-m Phosphatpufferlösung vom pH 7,4 zugesetzt, um den pH-Wert auf 7,4 + 0,2 zu bringen. Die Erythrozyten werden über Nacht stehengelassen. Nachdem der Uberstand dekantiert worden ist, werden die Erythrozyten dreimal mit Wasser gewaschen. Dann werden die Erythrozyten nochmals in einem Suspensionsmedium auf eine Zahl von 1 Million + 500 000/ml suspendiert, zur Auflösung der Klümpchen 1 bis 2 Stunden in ein Ultraschallbad gegeben und anschließend, vor der Endlagerung, durch einen 20 µm-Mikroaggregatfilter gefiltert. Das Präparat ist bei Raumtemperatur stabil.After stirring for a further 15 minutes, 120 ml of ethylene glycol and 75 ml of 1-M glycine-0; 5-M HCl buffer solution of pH 2.4 were added and the resulting Product then stirred for 30 minutes. The Ehd pH value is 2.8 + 0.1. The received Then about 100 ml of 2-M phosphate buffer solution of pH 7.4 are added to the solution bring the pH to 7.4 + 0.2. The erythrocytes are left to stand overnight. After the supernatant has been decanted, the erythrocytes are used three times Water washed. Then the erythrocytes are again in a suspension medium suspended to a number of 1 million + 500,000 / ml to dissolve the lumps Put in an ultrasonic bath for 1 to 2 hours and then, before final storage, filtered through a 20 µm micro-aggregate filter. The preparation is at room temperature stable.

Rezeptur für ein Suspensionsmedium Ili Wasser 800 ml auf ein belie-NaH2PO4 H20 0,2 g biges Volumen Na2HP04 7H20 0,2 g mit destilliertem Athylenglocol 150 ml Wasser auffüllen Natriumsalz des und durch ein 0,2 4-Chlor-3,5-Xylenols 0,5 g µm-Filter fil-Na2-Äthylendiamintetraessigsäure 0,25g trieren. Recipe for a suspension medium Ili water 800 ml on a belie-NaH2PO4 H20 0.2 g volume of Na2HP04 7H20 0.2 g with distilled ethylene glycol 150 ml Make up water, the sodium salt of and through a 0.2 4-chloro-3,5-xylenol 0.5 g µm filter fil-Na2-ethylenediaminetetraacetic acid 0.25g.

Isopropanol 100 ml Bei Anwiendlmgen wie der Simulierung sowohl lymphoider als auch mylolder menschlicher Leukozyten können stabilisierte reellen verschiedener Arten zum Erhalt der gewünschten Zwei-Volutnen-Zell-Fopulation miteinander vermischt werden, wobei trnischerweise für ein genaues menschliches teukozytanalogon in einem Vollblutreagens mittlere Zellvolumenbereiche von sowohl 70 bis 90 T m3 als auch über 100 µm³ erforderlich sinde Der Fachmann wird ohne weiteres die große Breite der Verwendungsmöglichkeiten der erfindungsgemäß stabilisierten biologischen Zellen erkennen. Die vorstehend aufgeführten Beispiele sollen dabei nicht einen normalen Ersatz äquivalenter Komponenten im Rahmen dessen, was man vom Fachmann erwarten darf, ausschließen.Isopropanol 100 ml For applications such as simulating both lymphoid as well as mylolder of human leukocytes can be stabilized real of different Species mixed together to obtain the desired two-volume cell population being, intrinsically for an exact human teukocyte analog in a whole blood reagent mean cell volume ranges of both 70 to 90 T m3 and even more than 100 µm³ are required. The person skilled in the art will readily appreciate the great breadth the possible uses of the biological cells stabilized according to the invention recognize. The examples given above are not intended to be normal Replacement of equivalent components within what would be expected from a person skilled in the art may exclude.

Claims (19)

Verfahren zur Stabilisierung von biologischen Zellen sowie danach stabilisierte biologische Zellzusammensetzungen. Process for stabilizing biological cells and thereafter stabilized biological cell compositions. Patentansprüche X Stabilisierte biologische Zellzusammensetzung, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß die Zellzusammensetzung so behandelt wird, daß sie mindestens einen Äcetalrest aufweist, in der R1 R2, R3 und R4 Reste mit 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen sind.Claims X Stabilized biological cell composition, characterized in that the cell composition is treated in such a way that it contains at least one acetal residue in which R1, R2, R3 and R4 are radicals with 1 to about 6 carbon atoms. 2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Acetalrest eine cyclische Struktur aufweist. 3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die cyclische Struktur umfaßt, wobei R2. Composition according to claim 1, characterized in that the acetal radical has a cyclic structure having. 3. Composition according to claim 2, characterized in that the cyclic structure comprises, where R 3 CH2 und R4 CH2CH2 ist.3 is CH2 and R4 is CH2CH2. 4. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die cyclische Struktur umfaßt, wobei R3 CH2 und R4 CH2 ist.4. Composition according to claim 2, characterized in that the cyclic structure wherein R3 is CH2 and R4 is CH2. 5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Zelle ein tierisches Erythrozyt umfaßt.5. Composition according to claim 1, 2, 3 or 4, characterized in that that the biological cell comprises an animal erythrocyte. 6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das tierische Frythrozyt mindestens ein Glied von menschlichen Erythrozyten oder von Erythrozyten von Ziegen umfaßt.6. Composition according to claim 5, characterized in that the animal red blood cell at least one member of human red blood cells or of Includes goat erythrocytes. 7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Suspensionsverdünnungsmittel diese stabilisierten Zellen enthält.7. Composition according to claim 6, characterized in that a Suspension diluent containing these stabilized cells. 8. Verfahren zur Stabilisierung der Fixierung von mit einem l~oloaldehyd behandelten biologischen Zellen, um eine Vernetzung von Zelle zu Zelle zu verhindern, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte: (a) Umsetzen der mit Aldehyd behandelten biologischen Zellen mit mindestens einem Alkohol in einer Lösung,die zur Bidung von Acetal sauer gehalten ist, und anschließendes (b) basisches Einstellen der in Schritt (a) erhaltenen Produktlösung.8. Method for stabilizing the fixation of with an oloaldehyde treated biological cells to prevent cross-linking from cell to cell, characterized by the following process steps: (a) Reacting the with aldehyde treated biological cells with at least one alcohol in a solution containing for the formation of acetal is kept acidic, and then (b) basic adjustment of the product solution obtained in step (a). 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die saure Reaktionslösung in Schritt (a) auf einem pH im Bereich von annähernd 2,3 bis 2,9 gehalten wird.9. The method according to claim 8, characterized in that the acid Reaction solution in step (a) to a pH in the range of approximately 2.3 to 2.9 is held. 10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die saure Reaktionslösung in Schritt (a) durch Zugabe einer Lösung von Glycin und Salzsäure beibehalten wird.10. The method according to claim 8, characterized in that the acid Reaction solution in step (a) by adding a solution of glycine and hydrochloric acid is retained. -11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der -Alkohol mindestens ein 1,2-Diol ist.-11. Process according to Claim 8, characterized in that the alcohol is at least one 1,2-diol. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das 1,2-Diol Xthylenglycol ist.12. The method according to claim 11, characterized in that the 1,2-diol Is ethylene glycol. 13. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der basische Zustand in Schritt (b) durch Zugabe einer Phosphat-Pufferlösung in einer Menge bewirkt wird, die ausreicht, um einen pH im Bereich von annähern 7,2 bis 7,6 sicherzustellen.13. The method according to claim 8, characterized in that the basic State brought about in step (b) by adding a phosphate buffer solution in an amount sufficient to ensure a pH in the range of approximately 7.2 to 7.6. 14. Verfahren nach den Ansprüchen 8, 9, 10, 11, 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Polyaldehyd Glutaraldehyd ist.14. The method according to claims 8, 9, 10, 11, 12 or 13, thereby characterized in that the polyaldehyde is glutaraldehyde. 15. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die biologischen Zellen tierische Erythrozyten sind.15. The method according to claim 8, characterized in that the biological Cells are animal erythrocytes. 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die tierischen Erythrozyten Erythrozyten von Ziegen zur Verçendung als Menschenblutplättchenanaloga in Bezugs- bzw. Vergleichslösungen sind, welch letztere zur Verwendung bei elektronisch arbeitenden hämatologischen Labor-Testeinrichtungen geeignet sind.16. The method according to claim 15, characterized in that the animal Erythrocytes Goat erythrocytes for use as human platelet analogs in reference or comparison solutions, the latter for use in electronic working hematological laboratory test facilities are suitable. 17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die tierischen Erythrozyten menschliche Erythrozyten zur Verwendung als menschliche weiße Blutkörperchenanaloga in Bezugs- bzw. Vergleichslösungen sind, welch letztere zur Verwendung in elektronisch arbeitenden hämatologischen Labor-Te3teinrichfungen geeignet sind.17. The method according to claim 15, characterized in that the animal Erythrocytes human erythrocytes for use as human white blood cell analogs in reference or comparison solutions, the latter for use in electronic working hematological laboratory facilities are suitable. 18. Stabilisierte biologische Zellzusammensetzung, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 8.18. Stabilized biological cell composition, prepared according to the method according to claim 8. 19. Suspension von stabilisierten biologischen Zellen, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 8.19. Suspension of stabilized biological cells, prepared according to the method according to claim 8.
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DE3938907A1 (en) * 1989-11-24 1991-05-29 Behringwerke Ag MEANS FOR STORING AND SUSPENDING CELLS, ESPECIALLY ERYTHROCYTES
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