DE3230527A1 - Screening method - Google Patents
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Abstract
Description
..
Die Erfindung betrifft ein in vitro-Verfahren zur Auffindung von pharmakologisch relevanten Wirkstoffen gemäß dem im Anspruch beschriebenen Verfahren.The invention relates to an in vitro method of discovery of pharmacologically relevant active ingredients according to the method described in the claim.
Durch Bearbeitung von biologischem Material, hauptsächlich von Pflanzen, welche in der Medizin und Volksmedizin verwendet wurden und werden, sind in der Vergangenheit zahlreiche aktive Stoffe isoliert und charakterisiert worden. Als Beispiele seien genannt: Rauwolfiaalkaloide, Catharanthusalkaloide, Atropin, Opiate, Digitalisglycoside, Mutterkornalkaloide, Curanalkaloide, Reserpin usw. Die Auffindung von aktiven Wirkstoffen aus biologischen Materialien ist jedoch sehr aufwendig, da große Mengen anBy processing biological material, mainly of plants which have been and are used in medicine and folk medicine are numerous in the past active substances have been isolated and characterized. Examples are: Rauwolfia alkaloids, Catharanthus alkaloids, Atropine, opiates, digitalis glycosides, ergot alkaloids, Curan alkaloids, reserpine, etc. The discovery of active ingredients from biological However, materials are very expensive, since large amounts of
biologischem Material, welches oft nicht zur Verfügung 30biological material, which is often not available 30
steht, wie z.B. bei Pilzen, Algen, Korallen, pflanzlichen Zellkulturen udgl., benötigt werden. Dieses Material muß durch aufwendige Chromatographieverfahren fraktioniert und die einzelnen Fraktionen müssen in umfangreichen phar-is required, e.g. for mushrooms, algae, corals, plant cell cultures, etc. This material must fractionated by complex chromatography processes and the individual fractions must be in extensive pharmaceutical
makologischen und toxikologischen Tierversuchen auf ihre 35macological and toxicological animal experiments on their 35
mögliche pharmakologische Aktivität untersucht werden.possible pharmacological activity to be investigated.
Oft ist der Wirkstoffgehalt in den einzelnen Fraktionen so niedrig, daß das Auffinden einer definierten Wirksub-Often the active ingredient content is in the individual fractions so low that finding a defined active substance
stanz nicht möglich ist. Aus diesem Grund sind nur wenige biologische Materialien auf therapeutisch relevante Inhaltsstoffe untersucht worden. So ist z.B. bei den Pflanzenarten nur ein geringer Anteil (kleiner als 10 %) auf therapeutisch relevante Inhaltsstoffe hin untersucht worden (M.H.Malone in New Natural Products and Plant Drugs with Pharmacological, Biological or Therapeutical Activity, Springer 1977).punching is not possible. For this reason, only a few biological materials have been examined for therapeutically relevant ingredients. For example, only a small proportion (less than 10 %) of the plant species has been examined for therapeutically relevant ingredients (MHMalone in New Natural Products and Plant Drugs with Pharmacological, Biological or Therapeutical Activity, Springer 1977).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein biologisches Prüfsystem zu finden, das zur Erkennung wirksamer Substanzen führt, deren Isolierung und Charakterisierung sich anschließt. Das biologische Prüfsystem sollte folgende Bedingungen erfüllen:The object of the present invention is to find a biological test system that can be used to identify active substances leads, the isolation and characterization of which follows. The biological testing system should be as follows Satisfy conditions:
- Hinreichende Empfindlichkeit und Spezifität des biolo-- Sufficient sensitivity and specificity of the biological
""
gischen Prüfsystems, um auch wirksame Nebenkomponenten zu erfassen, also z.B. Substanzen, deren Anteil am Substanzgemisch unter 0,1% liegt.gical test system in order to also record effective secondary components, e.g. substances whose proportion of the substance mixture is below 0.1 % .
- Damit verbunden ein geringer Substanzbedarf, so daß für das Primärscreening nur relativ wenig Biomasse produziert werden muß.- Associated with this is a low substance requirement, so that only relatively little biomass is produced for the primary screening must become.
- Das Testsystem sollte neben hoher Empfindlichkeit und Spezifität sowie hohem Probendurchsatz, möglichst viele biologische Wirkungen erfassen können.- The test system should be in addition to high sensitivity and Specificity and high sample throughput, able to record as many biological effects as possible.
- Es sollte weiterhin die Möglichkeit eröffnen, in Kombi-- It should still open up the possibility of combining
or -or -
nation mit modernen, effizienten Trennmethoden und Analysenautomaten möglichst frühzeitig eine biologische Wirkung einer definierten Substanz oder Substanzgruppe zuzuordnen.nation with modern, efficient separation methods and automatic analyzers A biological effect of a defined substance or group of substances as early as possible assign.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die Konzentrierung und Lokalisierung von Wirksubstanzen in Extrakten aus biologischen Materialien dadurch erreicht werden kann, indem die Extrakte durch Hochdruckflüssigchromatographie fraktioniert und in einer anschließenden Rezeptoruntersuchung mit rezeptorspezifischen radioaktiv-markierten Liganden die aktiven Fraktionen bestimmt werden.It has now surprisingly been found that the concentration and localization of active substances in extracts from biological materials can be achieved by by fractionating the extracts by high pressure liquid chromatography and in a subsequent receptor study the active fractions can be determined with receptor-specific radioactively labeled ligands.
Die neue Methode eignet sich besonders zur Untersuchung von PflanzenzelIkulturen. Die Verwendung von Pflanzenzel1-kulturen bietet die Möglichkeit, seltene und bisher schwer zugängliche Pflanzenarten zu untersuchen und ggfs. in grösseren Mengen zu kultivieren, ohne deren natürlichen Bestand durch Raubbau zu gefährden.The new method is particularly suitable for examining plant cell cultures. The use of plant cell cultures offers the opportunity to examine rare and previously difficult to access plant species and, if necessary, in larger ones To cultivate quantities without endangering their natural population through overexploitation.
Zur Durchführung des neuen Verfahrens wird biologisches Material mit organischen Lösungsmitteln, wie z.B. Alkoholen, Ether, Kohlenwasserstoffe udgl., insbesondere jedoch Alkohole, wie Methanol oder Ethanol, extrahiert und ggfs. durch geeignete Methoden wie z.B. hydrophobe Adsorbtion an Ionenaustauschern wie z.B. XAD-2 oder RP8 von Primärmetaboliten wie Zuckern, Peptiden, Cellulose udgl. befreit. Die erhaltenen Extrakte werden durch Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie fraktioniert, wodurch eine Konzentrierung und Lokalisierung der Wirksubstanzen ermöglicht wird. Die einzelnen Fraktionen werden zur Bestimmung auf mögliche, pharmakologisch wirksame Inhaltsstoffe einer Rezeptorbindungsuntersuchung unterzogen.To carry out the new process, biological material is mixed with organic solvents such as alcohols, Ethers, hydrocarbons and the like, but in particular Alcohols such as methanol or ethanol are extracted and, if necessary, by suitable methods such as hydrophobic adsorption on ion exchangers such as XAD-2 or RP8 of primary metabolites such as sugars, peptides, cellulose and the like. freed. The extracts obtained are subjected to high pressure liquid chromatography fractionated, which enables the active substances to be concentrated and localized. the individual fractions are used for the determination of possible, pharmacologically active ingredients of a receptor binding test subjected.
Als Beispiele für solche Rezeptoren seien Hormon- und Neurotransmitterrezeptoren erwähnt.Examples of such receptors are hormone and neurotransmitter receptors mentioned.
Rezeptor/Bindungsstelle pharmakologische WirkungReceptor / binding site pharmacological effect
Acetylcholin, muscarinisch spasmolytisch Gamma-Aminobuttersäure neuroleptisch, sedativ (GABA)Acetylcholine, muscarinic, spasmolytic Gamma-aminobutyric acid neuroleptic, sedative (GABA)
Benzodiazepin sedativ, anxiolytisch,Benzodiazepine sedative, anxiolytic,
antikonvulsiv,anticonvulsant,
Dopamin antipsychotisch, neuroDopamine antipsychotic, neuro
leptischleptic
Opiat analgetischOpiate analgesic
Serotonin antidepressiv, psychomi-Serotonin antidepressant, psychomi-
metischmetic
alpha-adrenerg vasokonstriktorischalpha-adrenergic vasoconstrictor
beta-adrenerg vasodilatatorischbeta-adrenergic vasodilator
Imipramin anti depressivImipramine anti depressive
Die Rezeptorenbindungsuntersuchung kann nach bekannten Methoden erfolgen, wie z.B. E.I. Yamamura et al., in Neurotransmitter Receptor Bindung (Raven Press, 1978) oder L.T. Williams et al., Receptor Binding Studies in Adrener-The receptor binding study can be carried out by known methods, such as E.I. Yamamura et al., In Neurotransmitter Receptor binding (Raven Press, 1978) or L.T. Williams et al., Receptor Binding Studies in Adrenal
gic Pharmacology (Raven Press, 1978). 5gic Pharmacology (Raven Press, 1978). 5
Diese neue Methode ermöglicht auf Grund ihrer hohen Sensitivität und Spezifität und des damit verbundenen geringen Bedarfs an biologischem Material in einfacher und schneller Weise pharmakologisch relevante Wirkstoffe aufzufinden, ohne den Einsatz von kostspieligen und aufwendigen Tierversuchen.This new method allows due to its high sensitivity and specificity and the associated low Find the need for biological material in a simple and quick way to find pharmacologically relevant active ingredients, without the use of costly and laborious animal experiments.
Die Durchführung des neuen Verfahrens wird in den folgen-Beispielen erläutert.The implementation of the new procedure is shown in the following examples explained.
Eine Kalluskultur (Berberis spec.) (10 g F.G.) wurde in 50 ml Methanol 15 Stunden bei 50pC extrahiert. Der methanolische Extrakt wurde auf ein Volumen von 10 ml beiA callus culture (Berberis spec.) (10 g FG) was extracted in 50 ml of methanol at 50 ° C. for 15 hours. The methanolic extract was made to a volume of 10 ml
40°C eingeengt und mit 90 ml Wasser und 10 g Adsorbens (XAD-2) versetzt, um die Primärmetaboliten abzutrennen. Das Adsorbens mit den gebundenen Sekundärmetaboliten wurde von der 10 % methanolischen Lösung durch Filtration abgetrennt. Die Elution der Sekundärmetaboliten (119,8 mg) erfolgte mit Methanol.Concentrated to 40 ° C and treated with 90 ml of water and 10 g of adsorbent (XAD-2) to separate the primary metabolites. The adsorbent with the bound secondary metabolites was separated from the 10 % methanolic solution by filtration. The secondary metabolites (119.8 mg) were eluted with methanol.
4 mg der Sekundärmetabolitfraktion wurden mittels Hochdruck· Flüssigkeits-Chromatographie aufgetrennt (Elutionsmittel:4 mg of the secondary metabolite fraction were removed by means of high pressure Liquid chromatography separated (eluent:
0,01 m Ammoniumacetatpuffer, pH8 mit Triethylamin, sowie0.01 M ammonium acetate buffer, pH8 with triethylamine, as well
Acetonitril als organischer Phase). Das Eluat wurde in 4 ml-Gläschen aufgefangen, wobei die Gläschen alle 60 Sekunden gewechselt wurden. Die Proben wurden 1 : 10 verdünnt und auf Bindung am Opiat-Rezeptor getestet.Acetonitrile as the organic phase). The eluate was in 4 ml vial collected, with the vial every 60 seconds were changed. The samples were diluted 1:10 and tested for binding to the opiate receptor.
Die Durchführung der Bindungsexperimente am Opiat-Rezeptor erfolgte mit dem Tritium-markierten Opiatantagonisten Naloxon in einer Konzentration von 0,8 μ Mol/l. Als Blindwert diente unmarkiertes Naloxon (Im Mol/l). Die Carrying out the binding experiments on the opiate receptor was carried out with the tritiated opiate antagonist naloxone in a concentration of 0.8 μ mol / l. Unlabeled naloxone (Im Mol / l) served as the blank value. the
Bestimmungen erfolgten in Rohhomogenaten von Rattenhirnmembranen mit einer Inkubationszeit von 15 Minuten bei 370C und 5 Minuten bei O0C - 40C. Die Inkubationen wurden durch Filtration der Proben beendet. Der erforderliche hohe Probendurchsatz konnte durch eine Filtriermaschine mit 48 Probenplätzen sichergestellt werden. Die membrangebundene Aktivität auf den Filtern wurde durch Flüssigkeitsszintillationsmessung bestimmt.Determinations were made in Rohhomogenaten from rat brain membranes with an incubation time of 15 minutes at 37 0 C and 5 minutes at 0 ° C - 4 0 C. The incubations were terminated by filtration of the samples. The required high sample throughput could be ensured by a filter machine with 48 sample positions. The membrane-bound activity on the filters was determined by liquid scintillation measurement.
Die prozentuale Inhibition spezifischer H Naloxonbindung (Opiatrezeptor) durch halbpräparativ mit HPLC gewonnenen Fraktionen aus der Sekundärmetabolitenfraktion von Berberis spec, ist in Abb. 1 dargestellt.The percentage inhibition of specific H naloxone binding (opiate receptor) obtained by semi-preparative HPLC Fractions from the secondary metabolite fraction of Berberis spec is shown in Fig. 1.
29,2 g getrocknetes Material des Basidiomyceten Cortinarius spec, wurden in 3 1 Methanol am Soxhlet extrahiert. Der methanolische Extrakt (7,12 g) wurde zur Trockne eingeengt. 29.2 g of dried material from the Basidiomycete Cortinarius spec, were extracted in 3 l of methanol on a Soxhlet. The methanolic extract (7.12 g) was concentrated to dryness.
4 mg des methanolischen Extraktes wurden ,wie in Beispiel 1 beschrieben, am HPLC aufgetrennt. Die einzelnen Fraktionen wurden auf Bindung am Benzodiazepinrezeptor getestet. Die Durchführung der ßindungsexperimente am Benzodiazepinrezeptor erfolgte mit Tritium markierten Flunitrazepam in einer Konzentration von 1 μ Mol/l. Als Blindwert diente unmarkiertes Diazepam (10 μ Mol/l). Die Untersuchungen erfolgten ebenfalls in Rohhomogenanten von Rattenhirnmembranen. Die Inkubation wird 30 min bei 0 - 40C durchgeführt und durch Filtration beendet. Die membrangebundene Aktivität auf den Filtern wurde durch Flüssigkeitsszintillations-4 mg of the methanolic extract were, as described in Example 1, separated on HPLC. The individual fractions were tested for binding to the benzodiazepine receptor. The binding experiments on the benzodiazepine receptor were carried out with tritiated flunitrazepam in a concentration of 1 μ mol / l. Unlabeled diazepam (10 μ mol / l) served as the blank value. The investigations were also carried out in raw homogenants of rat brain membranes. The incubation is carried out for 30 min at 0-4 ° C. and terminated by filtration. The membrane-bound activity on the filters was determined by liquid scintillation
3Omessung bestimmt.3O measurement determined.
Die prozentuale Inhibition spezifischer H Flunitrazepambin dung (Benzodiazepinrezeptor) durch halbpräparativ mit HPLC gewonnenen Fraktionen aus der Sekundärmetabolitenfraktion von Cortinarius spec, ist in Abb. 2 dargestellt.The percentage inhibition of specific H flunitrazepam binding (benzodiazepine receptor) by semi-preparative with HPLC The fractions obtained from the secondary metabolite fraction of Cortinarius spec is shown in Fig. 2.
Eine Kalluskultur von Catharanthus spec. (10 g F.G.) wurde wie im Beispiel 1 extrahiert. Die Gewinnung der Sekundärmetabol itfraktion erfolgte ebenfalls wie im Beispiel 1 angegeben. A callus culture of Catharanthus spec. (10 g F.G.) was extracted as in Example 1. The secondary metabolite fraction was also obtained as indicated in Example 1.
Die Ausbeute an Sekundärmetaboliten betrug 86,5 mg. 4 mg dieser Sekundärmetabolitfraktion wurden wie im Beispiel 1 aufgetrennt und die Proben auf Bindung am Benzodiazepinrezeptor getestet.The yield of secondary metabolites was 86.5 mg. 4 mg of this secondary metabolite fraction were as in the example 1 separated and the samples tested for binding to the benzodiazepine receptor.
Die Durchführung des Benzodiazepin Receptor Assays erfolgte wie im Beispiel 1 angegeben.The benzodiazepine receptor assay was carried out as indicated in example 1.
Die prozentuale Inhibition spezifischer H Flunitrazepam bindung (Benzodiazepinrezeptor) durch halbpräparativ mit HPLC gewonnenen Fraktionen aus der Sekundärmetabolitenfraktion von Catharanthus spec, ist in Abb. 3 dargestellt.The percentage inhibition of specific H flunitrazepam binding (Benzodiazepine receptor) by means of fractions obtained semi-preparatively with HPLC from the secondary metabolite fraction of Catharanthus spec, is shown in Fig. 3.
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Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19823230527 DE3230527A1 (en) | 1982-08-17 | 1982-08-17 | Screening method |
Applications Claiming Priority (1)
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| DE19823230527 DE3230527A1 (en) | 1982-08-17 | 1982-08-17 | Screening method |
Publications (1)
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|---|---|
| DE3230527A1 true DE3230527A1 (en) | 1984-02-23 |
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ID=6171027
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DE19823230527 Withdrawn DE3230527A1 (en) | 1982-08-17 | 1982-08-17 | Screening method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE3230527A1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0199254A1 (en) * | 1985-04-22 | 1986-10-29 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Total digoxin determination and reagent kit suitable therefor |
| US6664106B1 (en) * | 1998-05-30 | 2003-12-16 | Mueller Werner E. G. | Production of primmorphs from disassociated cells of sponges and corals |
-
1982
- 1982-08-17 DE DE19823230527 patent/DE3230527A1/en not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0199254A1 (en) * | 1985-04-22 | 1986-10-29 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Total digoxin determination and reagent kit suitable therefor |
| US4698315A (en) * | 1985-04-22 | 1987-10-06 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method and kit for determining total digoxin levels involving agent to dissociate digoxin-protein complex |
| US6664106B1 (en) * | 1998-05-30 | 2003-12-16 | Mueller Werner E. G. | Production of primmorphs from disassociated cells of sponges and corals |
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