DE3226202A1

DE3226202A1 - Process for the size fractionation of linear polymers by liquid-liquid chromatography

Info

Publication number: DE3226202A1
Application number: DE19823226202
Authority: DE
Inventors: Werner Prof. Dipl.-Chem.Dr. 4800 Bielefeld Müller
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1982-07-13
Filing date: 1982-07-13
Publication date: 1984-01-26

Abstract

The invention relates to a process for the size fractionation of macromolecular substances by liquid-liquid chromatography using the two-phase system formed from polyethylene glycol and dextran, with the lower dextran-rich phase as the stationary phase, and gradient elution of the polymer fractions, and is characterised in that a phase ratio (ratio between the mobile phase and the stationary phase) of from 1.10 to 1.70 and a temperature of from 30 to 40 DEG C are used. The support used for the stationary phase is, for example, cellulose.

Description

Verfahren zur Größenfraktionierung von linearen Polyme-Process for size fractionation of linear polymers

ren durch Flüssigkeit-Flüssigkeit-Chromatographie Beschreibung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Größenfraktionierung von makromolekularen Substanzen durch Flüssigkeits-Flüssigkeits-Chromatographie. by liquid-liquid chromatography description The invention relates to a method for size fractionation of macromolecular Substances by liquid-liquid chromatography.

Die Größenfraktionierung von Makromolekülen, wie zum Beispiel von Nucleinsäuren, wird üblicherweise mittels präparativer Gel-Elektrophorese oder Chromatographie an RPC-5 Harzen durchgeführt. Nachteile dieser Verfahren sind im Falle der Gel-Elektrophorese die begrenzte Kapazität, insbesondere bei größeren Molekülen, und die schwierige Isolierung der Fraktionen, insbesondere bei Nucleinsäuren, aus dem Gel in reiner Form, im Falle der Chromatographie das schlechte Auflösungsvermögen im größeren Molekülbereich.The size fractionation of macromolecules such as Nucleic acids, is usually determined using preparative gel electrophoresis or chromatography performed on RPC-5 resins. Disadvantages of these methods are in the case of gel electrophoresis the limited capacity, especially with larger molecules, and the difficult one Isolation of the fractions, especially in the case of nucleic acids, from the gel in pure form Form, in the case of chromatography the poor resolution in the larger Molecular domain.

W. Müller et al, Nucleic Acids Research 7 (1979), 2483 beschreiben ein Verfahren zur Größenfraktionierung von DNA-Fragmenten durch Flüssigkeit-Flüssigkeit-Chromatographie unter Verwendung eines Zweiphasensystems einer wäßrigen Lösung aus Polyäthylenglykol (PEG) und Dextran, mit Zellulose oder Kieselgur (Celit ) als Träger für die untere Dextranreiche stationäre Phase.W. Müller et al, Nucleic Acids Research 7: 2483 (1979) a method for size fractionation of DNA fragments by liquid-liquid chromatography using a two-phase system of an aqueous solution of polyethylene glycol (PEG) and dextran, with cellulose or kieselguhr (celite) as a carrier for the lower Dextran-rich stationary phase.

Aber auch dieses Verfahren stellt noch keine befriedigende Methode, insbesondere hinsichtlich des Auflösungsvermögens kleiner oder großer Fragmente, dar, weil Fragmente <160 Basenpaare mit der Front wandern und Fragmente >3000 Basenpaare kaum aufgelöst werden; gute Ergebnisse werden nur im Bereich zwischen 300 und 1200 Basenpaaren erhalten.But even this procedure is not yet a satisfactory method, especially with regard to the resolution of small or large fragments, because fragments <160 base pairs migrate with the front and fragments> 3000 Base pairs are hardly resolved; good results will only be in the range between 300 and 1200 base pairs obtained.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, ein allgemein anwendbares Verfahren zur Größenfraktionierung bereitzustellen, mit dem auch sehr kleine und sehr große Makromoleküle mit ausreichender Kapazität in einem Arbeitsgang fraktioniert werden können. Diese Aufgabe wird mit der vorliegenden Erfindung gelöst.The object of the present invention was therefore to provide a generally applicable To provide a method for size fractionation, with which also very small and very large macromolecules with sufficient capacity fractionated in one operation can be. This object is achieved with the present invention.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Größenfraktionierung von makromolekularen Substanzen durch Flüssigkeit-Flüssigkeit-Chromatographie unter Verwendung des aus einer wäßrigen Lösung aus Polyäthylenglykol und Dextran gebildeten Zweiphasensystems mit der unteren, eine feste Trägersubstanz enthaltenden Dextran-reichen Phase als stationärer Phase und Gradientenelution der Polymerfraktionen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man mit einem Phasenverhältnis (Verhältnis von mobiler zu stationärer Phase) von 1,10 bis 1,70, und bei einer Temperatur von 30 bis 40 OC arbeitet.The invention relates to a process for size fractionation of macromolecular substances by liquid-liquid chromatography taking Use of the formed from an aqueous solution of polyethylene glycol and dextran Two-phase system with the lower dextran containing a solid carrier substance Phase as stationary phase and gradient elution of the polymer fractions, which thereby is characterized by a phase ratio (ratio of mobile to stationary phase) from 1.10 to 1.70, and at a temperature of 30 to 40 OC is working.

Als Träger für die Dextran-reiche untere Phase des Zweiphasensystems Polyäthylenglykol/Dextran können für die Flüssigkeit-Flüssigkeit-Chromatographie geeignete bekannte Trägersubstanzen dienen, die eine ausreichende Affinität für die Dextran-reiche Phase besitzen, wie z.As a carrier for the dextran-rich lower phase of the two-phase system Polyethylene glycol / dextran can be used for liquid-liquid chromatography suitable known carrier substances are used that have sufficient affinity for possess the dextran-rich phase, e.g.

B. Polyacrylamidgele, Agarosegele, vernetzte Dextrane, carboxylierte Zellulosematerialien, wie zum Beispiel die Sephade u -Typen CM-G25 und CM-G50 der Firma Pharmacia, Schweden, usw. Ihre Auswahl ist insbesondere von den zu trennenden Makromolekülen abhängig. Zur Fraktionierung von Nukleinsäuren sind besonders geeignet Kieselgur (zum Beispiel Celit545, Reagent Grade der Firma John Manville Corp.) und Zellulose, insbesondere in vorgequollener und/oder mikrogranularer Form, wie zum Beispiel eine Zellulose, die zu 90 % eine Teilchengröße von 25 bis 36 ßm besitzt.B. polyacrylamide gels, agarose gels, crosslinked dextrans, carboxylated Cellulosic materials such as the Sephade u types CM-G25 and CM-G50 of the Pharmacia company, Sweden, etc. Your choice is particular from those to be separated Macromolecules dependent. They are particularly suitable for fractionating nucleic acids Kieselguhr (for example Celit545, Reagent Grade from John Manville Corp.) and Cellulose, especially in pre-swollen and / or microgranular form, such as for For example, a cellulose, 90% of which has a particle size of 25 to 36 µm.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren beträgt das Phasenverhältnis (Verhältnis mobiler zu stationärer Phase) ca.In the method according to the invention, the phase ratio is (ratio mobile to stationary phase) approx.

1,10 bis ca. 1,70, und vorzugsweise ca. 1,25 bis ca.1.10 to about 1.70, and preferably about 1.25 to about

1,40, die Temperatur (Äquilibrierungstemperatur Teq) 30 bis 40 °C, und insbesondere 37 + 1 °C.1.40, the temperature (equilibration temperature Teq) 30 to 40 ° C, and especially 37 + 1 ° C.

Die gesamte Ionenstärke (Salzkonzentration) des Polyäthylenglykol/Dextran-Systems liegt vorzugsweise zwischen 0,10 und 0,30 jedoch kann auch bei höheren.The total ionic strength (salt concentration) of the polyethylene glycol / dextran system is preferably between 0.10 and 0.30 but can also be higher.

oder etwas niedrigeren Werten gearbeitet werden. Insbesondere zur Trennung sehr kleiner und sehr großer Moleküle in einem Arbeitsgang ist es zweckmäßig, bei einer Ionenstärke von 0,20 bis 0,25 zu arbeiten. Wie ein Vergleich von Fig. 5 und Fig. 4 zeigt, wird z. B. unter sonst gleichen Bedingungen bei höherer Ionenstärke (nach Fig. 5 0,25, d. i. ca. - 2 x größer als nach Fig. 4) eine bessere Auflösung erreicht.or slightly lower values can be worked. In particular for Separation of very small and very large molecules in one operation, it is useful to to work at an ionic strength of 0.20 to 0.25. As a comparison of Fig. 5 and 4 shows, e.g. B. under otherwise identical conditions with a higher ionic strength (according to FIG. 5 0.25, i.e. approx. - 2 x larger than according to FIG. 4) a better resolution achieved.

Die übrigen Bedingungen (Elutionsgradient, Elutionsgeschwindigkeit, Molekulargewichte der phasenbildenden Polymeren, Aufbringen der stationären Phase auf den Träger usw.) entsprechen im wesentlichen den für Flüssigkeit-Flüssigkeit-Chromatographie üblichen, und insbesondere den aus W. Müller et al, Nucleic Acids Research 7 (1979), 2483 bekannten Bedingungen. Die Gradientenelution kann mit einem linearen oder einem exponentiellen, insbesondere quadratischen Gradienten durchgeführt werden. Zur Annäherung an ein lineares Verhältnis zwischen Größe der Makromoleküle und Elutionsmenge (Zahl der Fraktionen) kann es zweckmäßig sein, einen exponentiellen Gradienten zu verwenden. Die Fig. 3 zeigt z. B., daß ein quadratischer Gradient geeignet ist, den Elutionsbereich für die größeren Makromoleküle ohne wesentliche Beeinträchtigung der Auflösung der kleineren Makromoleküle zu erweitern. Im allgemeinen werden mehrere, insbesondere zwei, aufeinanderfolgende Salzgradienten, wie z. B. I-Kaliumacetat oder Lithiumacetat/Natriumacetat, und II-Lithiumacetat, Lithiumacetat/Natriumacetat oder Lithiumsulfat verwendet. Die von der Säulengröße abhängige Elutionsgeschwindigkeit beträgt für eine Säulengröße von 30 bis 60 x 1,6 cm in der Regel 4 bis 12 ml/Std., wobei die Geschwindigkeit während des Durchlaufens variieren kann. Die Elutionsgeschwindigkeit steigt im allgemeinen linear zum Querschnitt der Säule an. Das Gradientenvolumen soll linear proportional zum Querschnitt der Säule sein.The other conditions (elution gradient, elution rate, Molecular weights of the phase-forming polymers, application of the stationary phase on the support, etc.) correspond essentially to those for liquid-liquid chromatography customary, and in particular those from W. Müller et al, Nucleic Acids Research 7 (1979), 2483 known conditions. The gradient elution can be performed with a linear or a exponential, in particular quadratic gradients can be carried out. To get closer a linear relationship between the size of the macromolecules and the amount of elution (number of the fractions) it may be appropriate to use an exponential gradient. Fig. 3 shows, for. B. that a quadratic gradient is suitable, the elution area for the larger macromolecules without significantly impairing the resolution the expand smaller macromolecules. In general there will be several, in particular two successive salt gradients, e.g. B. I-potassium acetate or lithium acetate / sodium acetate, and II-lithium acetate, lithium acetate / sodium acetate or lithium sulfate are used. The elution rate, which depends on the column size, is for a column size from 30 to 60 x 1.6 cm usually 4 to 12 ml / hour, whereby the speed may vary during the run. The rate of elution generally increases linear to the cross section of the column. The gradient volume should be linearly proportional to be the cross section of the column.

Eine Erhöhung des Molekulargewichtes der phasenbildenden Polymeren (Polyäthylenglykol und Dextran) führt im allgemeinen zu einer Verringerung der Auftrennung.An increase in the molecular weight of the phase-forming polymers (Polyethylene glycol and dextran) generally leads to a reduction in the separation.

Die Isolierung der getrennten Makromoleküle aus den Eluaten kann nach einer der dafür üblichen Methoden erfolgen. DNA kann zum Beispiel, wie bei W. Müller et al., Nucleic Acids Research 7 (1979), 2483 beschrieben, aus den Fraktionen isoliert werden.The isolation of the separated macromolecules from the eluates can after one of the usual methods for this. DNA can, for example, as with W. Müller et al., Nucleic Acids Research 7 (1979), 2483, isolated from the fractions will.

Unter den makromolekularen Substanzen eignen sich besonders Makromoleküle mit geladenen Gruppen für die Erfindung. Bevorzugte Beispiele für letztere sind Nukleinsäuren und Proteine.Macromolecules are particularly suitable among the macromolecular substances with groups invited for the invention. Preferred examples of the latter are Nucleic acids and proteins.

Andere Makromoleküle, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren fraktioniert werden können, sind neutrale oder geladene Polymerisate sowie sonstige Biopolymere.Other macromolecules that are fractionated using the method according to the invention are neutral or charged polymers and other biopolymers.

Die Erfindung verbessert ganz allgemein die Größenfraktionierung makromolekularer Substanzen. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es aber überraschenderweise erstmals sogar möglich, lineare Makromoleküle mit einem Molekulargewicht von ca. 12 x 103 bis ca. 2 x 107 d, wie zum Beispiel DNA mit 20 bis 30 000 bp, also auch sehr kleine und sehr große Makromoleküle durch eine Flüssigkeit-Flüssigkeit-Verteilungschromatographie in einem Verfahrensgang erfolgreich zu fraktionieren.The invention generally improves the size fractionation of macromoleculars Substances. Surprisingly, however, it is with the method according to the invention For the first time it is even possible to produce linear macromolecules with a molecular weight of approx. 12 x 103 to approx. 2 x 107 d, such as DNA with 20 to 30,000 bp, so too very small and very large macromolecules by liquid-liquid partition chromatography to fractionate successfully in one process.

Fig. 4 zeigt zum Beispiel die erfindungsgemäße Auftrennung einer EcoRI-Digestion von ,-DNA im Bereich 3,38 bis 21,8 kbp (Kilobasenpaaren). Wie der Fig. 4 zu entnehmen ist, ist die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielte Auftrennung der Fraktionen wesentlich besser als die Auftrennung eines gleichen Gemisches nach der bekannten Methode von W. Müller et al, Nucleic Acids Research 7 (1979), 2483 (vgl. Fig 7a bis c).4 shows, for example, the separation according to the invention of an EcoRI digestion of, DNA in the range 3.38 to 21.8 kbp (kilobase pairs). As can be seen from FIG. 4 is the separation of the fractions achieved with the method according to the invention much better than the separation of the same mixture according to the known one Method by W. Müller et al, Nucleic Acids Research 7 (1979), 2483 (cf. Fig. 7a to c).

Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Erfindung näher, ohne sie darauf zu beschränken.The following examples describe the invention in more detail, without to limit them to that.

Beispiele Verwendete Materialien: Die meisten anorganischen Salze wurden von der Firma E. Merck, Darmstadt, bezogen. Kaliumacetat wurde von Riedel de Haen, Seelze b. Hannover, bezogen, Natriumkakodylat von der Firma Fluka, Schweiz, und Kakodylsäure von Sigma. Examples Materials used: Most inorganic salts were obtained from E. Merck, Darmstadt. Potassium acetate was made by Riedel de Haen, Seelze b. Hanover, sourced, sodium cacodylate from Fluka, Switzerland, and cacodylic acid from Sigma.

Lithiumacetat wurde von zwei Quellen verwendet. Eines der zwei Produkte enthielt 1 bis 2 % Calcium, Kalium und Chlorid-Ionen, was durch klassische analytische Techniken und Roentgen-Fluoreszenzspektroskopie festgestellt wurde. Diese Verunreinigungen beeinflussen stark die Verteilung von DNA im Polyäthylenglykol/ Dextran-System. Das zweite verwendete Material war frei von irgendwelchen feststellbaren Verunreinigungen und wurde, wenn nicht anders angegeben, verwendet. Um mit diesem Produkt den Effekt der Verunreinigungen des ersten Produktes nachzuahmen, wurden 15 % davon durch Natriumacetat ersetzt.Lithium acetate was used from two sources. One of the two products contained 1 to 2% calcium, potassium and chloride ions, what by classical analytical Techniques and fluorescence x-ray spectroscopy was noted. These impurities strongly influence the distribution of DNA in the polyethylene glycol / dextran system. The second material used was free of any detectable impurities and was used unless otherwise stated. To get the effect with this product To mimic the impurities of the first product, 15% of that was due to sodium acetate replaced.

Dextrane von verschiedenem Molekulargewicht wurden von Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden, bezogen.Dextrans of various molecular weights were available from Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden.

Polyäthylenglykole (PEG) verschiedener Molekulargewichte wurden von Serva, Heidelberg, bezogen. Das PEG 6000 wurde von-Sigma erhalten; sein Molekulargewicht liegt im Bereich von 8000 bis 9000; wenn nicht anders angegeben, wurde dieses Material verwendet.Polyethylene glycols (PEG) of various molecular weights were made by Serva, Heidelberg. The PEG 6000 was obtained from Sigma; its molecular weight ranges from 8,000 to 9,000; unless otherwise noted, this material was used used.

Mikrogranulare Zellulose vom Typ CC 31 wurde von Whatman, England, bezogen.Type CC 31 microgranular cellulose was manufactured by Whatman, England, based.

Kakodylatpuffer: 10 mM Natriumkakodylat wurden auf pH = 6,0 durch Zugabe von 1 mM Na2-EDTA und Kakodylsäure eingestellt.Cacodylate buffer: 10 mM sodium cacodylate were carried out to pH = 6.0 Addition of 1 mM Na2-EDTA and cacodylic acid stopped.

TE-Puffer: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH = 8.TE buffer: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH = 8.

Kalb-Thymus-DNA wurde aus frischen Drüsen gemäß Blin & Stafford (Nucleic Acids Research 3 (1976), 2303-2308) hergestellt.Calf thymus DNA was obtained from fresh glands according to Blin & Stafford (Nucleic Acids Research 3, 2303-2308 (1976)).

,-DNA (aus Phagen: Adam E. coli C 1857 Sam 7 Lysogen) wurde von BRL, Rockville MD, USA bezogen., -DNA (from phages: Adam E. coli C 1857 Sam 7 Lysogen) was obtained from BRL, Rockville MD, USA.

DNA aus Plasmid pBR 322 wurde aus geklärten Lysaten (H. Friederich, Dissertation Universität Tübingen, 1980) von E. coli-Zellen (Stamm SK1590, mit pBR 322 DNA transformiert) nach Phenolisierung, Alkoholausfällung und Gelfiltration über eine Sephacryl S 100Säule (2,6 x 100 cm, in einem Puffer von 50 mM Tris, 20 mM EDTA vom pH = 8,4 in 0,5 M Natriumchlorid) erhalten.DNA from plasmid pBR 322 was obtained from clarified lysates (H. Friederich, Dissertation University of Tübingen, 1980) from E. coli cells (strain SK1590, with pBR 322 DNA transformed) after phenolization, alcohol precipitation and gel filtration over a Sephacryl S 100 column (2.6 x 100 cm, in a buffer of 50 mM Tris, 20 mM EDTA of pH = 8.4 in 0.5 M sodium chloride).

Restriktionsenzyme: Hae III und Hind III wurden von BRL bezogen. Sie wurden gemäß den Hinweisen der Lieferfirma verwendet. EcoRI wurde von Dr. A. Mayer, GBF Stöckheim/ Braunschweig erhalten.Restriction Enzymes: Hae III and Hind III were purchased from BRL. she were used in accordance with the supplier's instructions. EcoRI was developed by Dr. A. Mayer, GBF Stöckheim / Braunschweig received.

Chromatographische Ausrüstung: Es wurden Säulen der Firmen Pharmacia Fine Chemicals oder Altex, die mit einem Thermostatmantel und mit wenigstens einem Adaptor (plunger) versehen waren, verwendet. Die Länge variierte zwischen 40 und 100 cm, der Durchmesser von 9 bis 50 mm. Sie wurden in Kombination mit Gilsonpumpen (vom Typ Minipuls 2) und Monitoren von Altex (Typ 153) oder LKB (Typ Unicord S) betrieben.Chromatographic equipment: Pharmacia columns were used Fine Chemicals or Altex, those with a thermostatic jacket and at least one Adapter (plunger) were provided. The length varied between 40 and 100 cm, the diameter from 9 to 50 mm. They were used in combination with Gilson pumps (of type Minipuls 2) and monitors from Altex (type 153) or LKB (type Unicord S) operated.

Verfahren: 1. Herstellung der imprägnierten Zellulose: Zum Imprägnieren der Zellulose mit der Dextran-reichen unteren Phase des Polyäthylenglykol/Dextran-Systems wurden ungefähr 500 g eines Systems aus 1,25 % PEG 6000 und 12,9 % Dextran T 500 und 85,85 % Kakodylatpuffer (alle Angaben in Gew.-%) bei der für die Chromatographie verwendeten Temperatur (T ) hergestellt. Die Zusammeneq setzung dieses Systems wurde der Verbindungslinie des Systems D von Albertsson (vgl. P. A. Albertsson, Verteilung von Zellpartikeln und Makromolekülen, 2. Auflage, 1971, Almquist und Wicksell, Stockholm, Seite 264) entnommen und ergibt ungefähr 90 Vol.-% untere und 10 Vol.-% obere Phase. Parallel dazu wurde ein größeres Volumen der oberen Phase des gleichen Systems, das zum Spülen der imprägnierten Zellulose und zur Durchführung der Chromatographie notwendig ist, durch Lösen von 7 Gew.-% PEG 6000 und 0,5 Gew.-% Dextran T 500 in 92,5 % Kakodylatpuffer bei T hergestellt. Die vollständige eq Trennung der Phasen erfordert mehrere Tage, außer man zentrifugiert bei niedriger Geschwindigkeit (1000 x g) bei einer Temperatur nahe Tee).Process: 1. Manufacture of the impregnated cellulose: For impregnation the cellulose with the dextran-rich lower phase of the polyethylene glycol / dextran system became approximately 500 g of a system of 1.25% PEG 6000 and 12.9% Dextran T 500 and 85.85% cacodylate buffer (all data in% by weight) in the case of that for the chromatography used Temperature (T) established. The composition of this system became the connecting line of System D by Albertsson (cf. P. A. Albertsson, Distribution of Cell Particles and macromolecules, 2nd edition, 1971, Almquist and Wicksell, Stockholm, page 264) and yields approximately 90% by volume of the lower and 10% by volume of the upper phase. Parallel to do this, a larger volume of the upper phase of the same system that was used for rinsing the impregnated cellulose and is necessary for performing the chromatography, by dissolving 7% by weight of PEG 6000 and 0.5% by weight of Dextran T 500 in 92.5% cacodylate buffer made at T. The complete eq separation of the phases takes several days, unless centrifuging at low speed (1000 x g) at one temperature near tea).

Für ein 10 %iges Imprägnieren des Trägers wurde 1 Gew.-Teil Zellulose CC31 in 7 Gew.-Teilen der oberen Phase, zu der die untere Phase in einer Menge von 10 % des trockenen Gewichtes der Zellulose gegeben wurde, suspendiert. Die Aufschlämmung wird in einem geschlossenen Gefäß unter schwachem Rühren 1 Stunde lang bei 80 OC erhitzt, auf 2 ° unterhalb Teq abgekühlt und 15 Minuten auf T reequilibriert. Alle Verfahrensschriteq te werden unter Rühren durchgeführt, das gerade stark genug ist, um ein Absetzen der Zelluloseteilchen zu verhindern. Nach Entfernung der Luftblasen durch kurze Evakuierung wird das Material in eine auf T thermostaeq tierte Säule gegossen. Als Richtlinie für die für ein bestimmtes Säulenvolumen erforderliche Zellulosemenge kann die Angabe dienen, daß 1 g trockene Zellulose CC31 ungefähr 1,9 ml Füllmaterial ergeben.1 part by weight of cellulose was used to impregnate the carrier by 10% CC31 in 7 parts by weight of the upper phase, to which the lower phase in an amount of 10% of the dry weight of the cellulose was added, suspended. The slurry is kept in a closed vessel with gentle stirring for 1 hour at 80.degree heated, cooled to 2 ° below Teq and reequilibrated on T for 15 minutes. All Process steps are carried out with stirring that is just strong enough to to prevent the cellulose particles from settling. After removing the air bubbles by brief evacuation, the material is placed in a column thermostatically controlled on T poured. As a guide to what is required for a given column volume Amount of cellulose can be used to indicate that 1 g of dry cellulose CC31 approximately Make 1.9 ml of filler material.

Für das Imprägnieren des Zelluloseträgers bis zur Sättigung wird ein bestimmtes Gewicht an Zellulose in 4 Gew.-Teilen der unteren Phasen suspendiert und 1 Stunde, wie oben beschrieben, auf 80 OC erhitzt. Die gekühlte und reequilibrierte Aufschlämmung wird entweder durch Absaugen oder Druck unter Verwendung einer thermostatierten Fritte filtriert und mit der oberen Phase gewaschen, was ca. 4 Teile Phase pro Gew.-Teil trockene Zellulose erfordert. Ein Zutritt von Luft in oder durch die abgesetzte Zellulose sollte vermieden werden. Die Zellulose wird in ca. 7 Gew.-Teilen der oberen Phase pro Gew.-Teil trockene Zellulose suspendiert, durch kurze Evakuierung entgast und in die thermostatierte Säule gegossen. Das Absetzen kann durch Anwendung eines geringen Druckes (o,1 bis 0,4 at) beschleunigt werden.For the impregnation of the cellulose backing up to saturation a certain weight of cellulose suspended in 4 parts by weight of the lower phases and heated to 80 ° C. for 1 hour as described above. The cooled and reequilibrated Slurry is controlled either by suction or pressure using a thermostatic Filtered frit and washed with the upper phase, which is about 4 parts of phase per part by weight requires dry cellulose. An ingress of air into or through the remote Cellulose should be avoided. The cellulose is in about 7 parts by weight of the top Phase suspended per part by weight of dry cellulose, degassed by brief evacuation and poured into the thermostated column. Weaning can be achieved by applying a low pressure (0.1 to 0.4 at) can be accelerated.

2. Vorbehandlung der Säulen und Herstellung der Proben: Das Säulenbett wird mit oberer Phase, 0,2 M an Kaliumacetat (zwei Bettvolumina) gespült und nachfolgend mit dem zwei Bettvolumina der Startphase des Elutionsgradienten, bis der UV-Monitor bei einer Sensitivität von 0,2 bis 0,4 A254-Einheiten pro voller Skala bei einer Schichtdicke von 1 mm ein gleichmäßiges Signal erhalten wird (vgl. W. Müller et al, Nucleic Acids Research 7, 1979, 2483). Die zu fraktionierende DNA-Probe kann bis zu 0,5 mg DNA pro cm2 Säulenquerschnitt enthalten, wenn Fragmente von 3 bis 30 kbp getrennt werden, und bis zu 2,5 mg DNA pro cm2, wenn Fragmente von 20 bis ca. 4000 bp getrennt werden sollen. Das Volumen der Probe sollte 1,6 ml pro cm2 Säulenquerschnitt nicht überschreiten.2. Pretreatment of the columns and preparation of the samples: The column bed is rinsed with upper phase, 0.2 M potassium acetate (two bed volumes) and subsequently with the two bed volumes of the start phase of the elution gradient until the UV monitor with a sensitivity of 0.2 to 0.4 A254 units per full scale on a Slice thickness of 1 mm a uniform signal is obtained (cf. W. Müller et al, Nucleic Acids Research 7, 1979, 2483). The DNA sample to be fractionated can Contains up to 0.5 mg DNA per cm2 column cross-section, if fragments from 3 to 30 kbp can be separated, and up to 2.5 mg DNA per cm2 if fragments from 20 to about 4000 bp should be separated. The volume of the sample should be 1.6 ml per cm2 Do not exceed the column cross-section.

Die Probe wird durch Lösen von soviel Polyäthylenglykol in der DNA-Lösung (in Kakodylat- oder TE-Puffer) hergestellt, daß die endgültige Probe 7 Gew.-% enthält. Nach Zugabe von 2 Vol.-% einer 1 %igen Dextran T 500-Lösung und den Salzen, um die gleichen Konzentrationen in der Probe wie in der Startphase des Gradienten zu ergeben, wird das endgültige Probenvolumen mit Kakodylatpuffer eingestellt. Wenn die DNA-Fragmente in der Probe die Größe von 5 kbp überschreiten, wird die Zugabe von Dextran unterlassen.The sample is made by dissolving as much polyethylene glycol in the DNA solution (in cacodylate or TE buffer) prepared so that the final sample contains 7% by weight. To Addition of 2% by volume of a 1% Dextran T 500 solution and the salts to the same concentrations in the sample as in the starting phase of the To give gradients, the final sample volume is adjusted with cacodylate buffer. If the DNA fragments in the sample are larger than 5 kbp, the Refrain from adding dextran.

3. Durchführung der Chromatographie: Die Probe wird direkt auf das Säulenbett aufgetragen (wobei der obere Adaptor entfernt ist) und durch leichten Druck in das Säulenbett gebracht. Die Fließgeschwindigkeit in dieser Stufe sollte ca. die Hälfte der Fließgeschwindigkeit der Chromatographie betragen. Nach Spülen des Säulenkopfes mit der Hälfte des Probenvolumens an Phase I des Gradienten wird die Säule 1 Stunde lang verschlossen gehalten. Das Säulenbett wird dann mit der Startphase des Gradienten überschichtet und der Adaptor sorgfältig wieder auf dem Säulenbett angebracht. Nach dem Spülen mit 1 bis 2 Probevolumina an Startphase bei ca. der halben endgültigen Durchflußgeschwindigkeit wird der Gradient an die Säule angelegt. Wenn kleine DNA-Fragmente zu trennen sind (20 bis 4000 bp), sollte die anfängliche Durchflußgeschwindigkeit für die ersten 25 % des Gradienten die Hälfte der endgültigen Geschwindigkeit betragen und dann auf den endgültigen Wert gesteigert werden.3. Performing the chromatography: The sample is applied directly to the Pillar bed applied (with the top adapter removed) and through light Pressure brought into the column bed. The flow rate at this stage should be be about half the flow rate of the chromatography. After rinsing of the column head with half the sample volume in phase I of the gradient the column was kept closed for 1 hour. The pillar bed is then connected to the Start phase of the gradient layered and the adapter carefully back on the Pillar bed attached. After rinsing with 1 to 2 sample volumes at the start phase about half the final flow rate is the gradient on the column created. If small fragments of DNA need to be separated (20 to 4000 bp), the initial flow rate for the first 25% of the gradient half the final speed and then increased to the final value will.

4. Isolierung der DNA aus der mobilen Phase: Die DNA wird aus den gesammelten Fraktionen durch Zugabe von 2 Volumina Äthanol oder 1 Volumen Isopropanol ausgefällt. Nach einstündigem Aufbewahren bei 0 OC (im Falle großer Fragmente) oder -20 OC (im Falle kleiner Fragmente) wird die mit Dextran zusammen ausgefällte DNA bei 10 000 bis 20 000 x g 20 Minuten lang bei 0 OC sedimentiert. Das Sediment (eine hoch viskose Flüssigkeit, wenn Isopropanol zur Fällung verwendet wurde) wird mit ca. 5 bis 10 ml 70 %igem Äthanol, das 0,2 M Natriumacetat, gewaschen und nach dem Dränieren zur sorgfältigen Entfernung aller organischen Lösungsmittel getrocknet. Der Niederschlag wird in ca. 10 ml TE-Puffer gelöst und die Lösung auf einen Gehalt an 0,4 M Natriumchlorid eingestellt. Durch Anwendung geringen Druckes wird die DNA an einer Schicht von RPC5 (oder RPC-5 Analogen der Fa. BRL) von 10 mm Dicke adsorbiert.4. Isolation of the DNA from the mobile phase: The DNA is isolated from the collected fractions by adding 2 volumes of ethanol or 1 volume of isopropanol failed. After storage for one hour at 0 OC (in the case of large fragments) or -20 OC (in case of smaller Fragments) is made up of dextran precipitated DNA sedimented at 10,000 to 20,000 x g for 20 minutes at 0 ° C. The sediment (a highly viscous liquid if isopropanol is used for precipitation was) is washed with about 5 to 10 ml of 70% ethanol, the 0.2 M sodium acetate and after draining to carefully remove all organic solvents dried. The precipitate is dissolved in approx. 10 ml of TE buffer and the solution is dissolved adjusted to a content of 0.4 M sodium chloride. By applying low pressure the DNA is attached to a layer of RPC5 (or RPC-5 analogs from BRL) from 10 mm thickness adsorbed.

Der Durchmesser der Schicht hängt von der Menge an zu bindender DNA ab; ein Durchmesser von 25 mm ist für die meisten Fälle geeignet. Das Dextran und die anderen Verunreinigungen werden durch Waschen mit 0,4 M Natriumchlorid in TE-Puffer entfernt. Die Entfernung des Dextrans kann mit Hilfe eines W-Monitors, der im allgemeinen das Dextran durch seinen Einfluß auf den Brechungsindex des Eluats anzeigt, verfolgt werden. Die DNA wird von dem RPC-5 durch 0,7 M Natriumchlorid in TE-Puffer eluiert. Ihre Wiedergewinnung ist praktisch quantitativ (595 %), das Elutionsvolumen ist im allgemeinen klein genug, um die Fällung der DNA mit 2 Volumina Äthanol in 50 ml Zentrifugengefäßen durchzuführen.The diameter of the layer depends on the amount of DNA to be bound away; a diameter of 25 mm is suitable for most cases. The dextran and the other contaminants are removed by washing with 0.4 M sodium chloride in TE buffer removed. The removal of the dextran can be done with the help of a W-monitor, which in general which indicates dextran by its influence on the refractive index of the eluate, followed will. The DNA is eluted from the RPC-5 by 0.7 M sodium chloride in TE buffer. Their recovery is practically quantitative (595%) that is the elution volume generally small enough to allow precipitation of DNA with 2 volumes of ethanol in 50 ml centrifuge tubes.

5. Fradientengrößen und Durchflußgeschwindigkeiten in Abhängigkeit der Säulendimensionen: Wenn man nach den in den vorstehenden Abschnitten 2 und 3 angegebenen Maßnahmen arbeitet, kann man das Verfahren unter Verwendung von Säulen bis zu einem Durchmesser von 50 mm (20 cm2 Querschnitt) und ca. 1 m Länge durchführen. Die Durchflußgeschwindigkeiten können linearproportional mit dem Querschnitt vergrößert werden; eine mit dem Querschnitt linear ansteigende Vergrößerung des Gradientenvolumens ist wesentlich.5. Depending on the gradient sizes and flow rates the column dimensions: If you follow the steps in Sections 2 and 3 If the specified measures works, one can carry out the procedure using columns Carry out up to a diameter of 50 mm (20 cm2 cross section) and approx. 1 m in length. The flow rates can be linearly proportional to the Cross-section can be enlarged; an enlargement that increases linearly with the cross-section of the gradient volume is essential.

Eine Vergrößerung der Säulenlänge ist nur bedeutungsvoll, wenn ein flacherer Gradient für eine bessere Auflösung verwendet werden soll. Für diesen Zweck wird eine lineare Vergrößerung des Gradientenvolumens mit der Säulenlänge empfohlen. Eine Säule mit einer Dimension von 32 x 1,6 cm erfordert im allgemeinen für kleine Fragmente einen Gradienten von 400 ml, der von 240 mM Kaliumacetat nach 240 mM Lithiumacetat führt oder, für große Fragmente, einen Gradienten von 800 ml, der von 240 mM Lithiumacetat nach 80 mM Lithiumsulfat führt. Die Durchflußgeschwindigkeit war 9 bis 10 ml/Std.An increase in the length of the column is only meaningful if a shallower gradient should be used for better resolution. For this The purpose is a linear increase in the gradient volume with the column length recommended. A column with a dimension of 32 x 1.6 cm generally requires for small fragments a gradient of 400 ml followed by that of 240 mM potassium acetate 240 mM lithium acetate leads or, for large fragments, a gradient of 800 ml, which leads from 240 mM lithium acetate to 80 mM lithium sulfate. The flow rate was 9 to 10 ml / hr.

6. Definition des Volumens an stationärer und mobiler Phase in der Säule: Bestimmung der Höhe der theoretischen Böden: Die Menge an stationärer Phase, die an den Träger gebunden ist, kann grob aus der Differenz zwischen der Menge der insgesamt zugegebenen und der Menge der zurückgehaltenen unteren Phase, wie unter 1. beschrieben, bestimmt werden. Eine präzisere Messung, die gleichzeitig auch das Volumen der mobilen Phase in der Säule ergibt, ist durch die Verwendung von zwei Testverbindungen, die in ihrem Verteilungskoeffizienten K (= Ctop/Cbot.) ausreichend differieren, möglich.6. Definition of the volume of stationary and mobile phase in the Column: Determination of the height of the theoretical trays: the amount of stationary phase, which is bound to the carrier can roughly be determined from the difference between the amount of total added and the amount of lower phase retained, as below 1. described, determined. A more precise measurement that is also the Volume of mobile phase in the column is obtained by using two Test compounds that are sufficient in their distribution coefficient K (= Ctop / Cbot.) differ, possible.

Durch Messung ihrer Elutionsvolumina Vel kann das Volumen der stationären Phase (V5) und das der mobilen Phase (Vm) der Säule mittels der Gleichung Vel = Vm + Vs 1 K bestimmt werden. Die Verteilungskoeffizienten der Testverbindungen werden durch Verteilungsexperimente in dem Phasenpaar unter den in der Säule herrschenden Bedingungen getrennt bestimmt.By measuring their elution volumes Vel, the volume of the stationary Phase (V5) and that of the mobile phase (Vm) of the column by means of the equation Vel = Vm + Vs 1 K to be determined. The distribution coefficients of the test compounds are determined by distribution experiments in the phase pair among those prevailing in the column Conditions determined separately.

Die Anwendung der Methode erfordert, daß die verwendeten Testverbindungen keine nennenswerte Adsorptionsaffinität für den Träger der stationären Phase besitzen und in ihren Stoke'schen Radien ähnlich sind, wenn Träger von hoher Porosität, wie sie für Gelfiltrationen verwendet werden, geprüft werden. Für Zellulosesäulen hat sich der Polyäthylenglykol-Ester des carboxylierten Malachitgrüns (PEG-Ester II in W. Müller et al, Nucleic Acids Research 9, 1981, 95 bis 119) bei Ionenstärken oberhalb von 0,15 in Kombination mit Kealiumhexacyanoferrat(III) als geeignet erwiesen. Die Verteilungskoeffizienten dieser beiden Testverbindungen im Polyäthylenglykol/Dextran-System, das 140 mM Kaliumacetat enthielt, wurden bei 37 OC mit 4,04 für den Polyäthylenglykol-Ester und mit 1,20 für das Hexacyanoferrat gefunden.Application of the method requires that the test compounds used have no significant adsorption affinity for the support of the stationary phase and are similar in their Stoke's radii when carriers of high porosity, such as they are used for gel filtrations should be checked. Has for cellulose columns the polyethylene glycol ester of carboxylated malachite green (PEG ester II in W. Müller et al, Nucleic Acids Research 9, 1981, 95 to 119) for ionic strengths above 0.15 in combination with potassium hexacyanoferrate (III) proved to be suitable. The distribution coefficients of these two test compounds in the polyethylene glycol / dextran system, which contained 140 mM potassium acetate, were at 37 ° C with 4.04 for the polyethylene glycol ester and found with 1.20 for the hexacyanoferrate.

Für alle Kombinationen von verwendeten Testsubstanzen wurde durch Vergleichsläufe an nicht imprägnierten Säulen in Dextran-freiem Medium sichergestellt, daß die an imprägnierten Säulen erhaltenen Ergebnisse nicht durch Adsorptions- oder Molekularsieb-Effekte verfälscht sind.For all combinations of test substances used, Comparison runs on non-impregnated columns in dextran-free medium ensured, that the results obtained on impregnated columns are not by adsorption or Molecular sieve effects are falsified.

Die Zahl der theoretischen Böden in den Säulen wurden aus der Form der Elutionsprofile, die mit Phenol oder 5-Bromdeoxyuridin erhalten wurden, bestimmt. Nach E.The number of theoretical trays in the columns were out of shape of the elution profiles obtained with phenol or 5-bromodeoxyuridine. According to E.

Glueckauf, Trans. Faraday Soc. 51, 1955, 34 steht die Zahl N der theoretischen Böden einer Säule zur Bandbreite des Peaks einer Testsubstanz in folgender Beziehung: in der Ve das Elutionsvolumen beim Peak-Maximum bedeutet und B die Bandbreite des Peaks in der Höhe 1/e x Höhe des Peak-Maximums. Für beide verwendeten Testververbindungen wurden für Säulen von 32 x 1,6 cm und Durchflußgeschwindigkeiten von 9 ml/Std. für N Werte um 1850 erhalten. Die Höhe eines theoretischen Bodens ist damit ca. 0,17 mm. Unter Verwendung des Farbstoff-Polyäthylenglykol-Esters wurden für N Werte von 750 bis 880 erhalten, was auf eine Heterogenität in der Größe des Polyäthylenglykols, an welches der Farbstoff gebunden ist, hinweist.Glueckauf, Trans. Faraday Soc. 51, 1955, 34 the number N of the theoretical bottoms of a column is related to the bandwidth of the peak of a test substance as follows: in which Ve means the elution volume at the peak maximum and B the bandwidth of the peak at the height 1 / ex the height of the peak maximum. For both test compounds used were for columns of 32 x 1.6 cm and flow rates of 9 ml / hour. obtained around 1850 for N values. The height of a theoretical floor is therefore approx. 0.17 mm. Using the dye-polyethylene glycol ester, values of 750 to 880 were obtained for N, which indicates a heterogeneity in the size of the polyethylene glycol to which the dye is bound.

Die Figuren 1 bis 6 zeigen die Größenfraktionierung verschiedener DNA-Proben nach dem erfindungsgemäßen Verfahren: Fig. 1: Fraktionierung einer Hae III-Digestion von 5 mg Kalb-Thymus-DNA an einer Polyäthylenglykol/Dextran-Säule von 32 x 1,6 cm. System: 7 Gew.-% PEG 6000, 0,5 Gew.-% Dextran T 500 in Kakodylatpuffer; Träger: Zellulose CC31; Imprägnierung: gesättigter Träger; Gradient: 400 ml, linear von 140 mM Kaliumacetat bis 140 mM Lithiumacetat; Temperatur: 37 OC; Durchflußgeschwindigkeit; 4,5 ml/Std. von Fraktion 1 bis 50; 9 ml/Std. von Fraktion 50 bis 180. Das eingefügte Gel-Muster wurde an einem 5 %igen Polyacrylamidgel von 30 x 0,3 cm erhalten, auf dem 5 Ag derselben Digestion in Tris-Borat-EDTA-Puffer (7,5 V/cm, 4,5 Std., Fraktionsgröße: 2,3 ml) lief.Figures 1 to 6 show the size fractionation of various DNA samples according to the method according to the invention: Fig. 1: Fractionation of a Hae III digestion of 5 mg calf thymus DNA on a polyethylene glycol / dextran column of 32 x 1.6 cm. System: 7% by weight PEG 6000, 0.5% by weight Dextran T 500 in cacodylate buffer; Carrier: cellulose CC31; Impregnation: saturated carrier; Gradient: 400 ml, linear from 140 mM potassium acetate to 140 mM lithium acetate; Temperature: 37 OC; Flow rate; 4.5 ml / hour from fraction 1 to 50; 9 ml / hour from fraction 50 to 180. The inserted Gel samples were obtained on a 5% polyacrylamide gel measuring 30 x 0.3 cm the 5 Ag of the same digestion in Tris-borate-EDTA buffer (7.5 V / cm, 4.5 hours, fraction size: 2.3 ml) ran.

Fig.2: Fraktionierung einer Hae III-Digestion von 5 mg Kalb-Thymus-DNA an einer Polyäthylenglykol/Dextran-Säule (63 x 1,6 cm). System, Träger und Imprägnierung wie in Fig. 1; Gradient: quadratisch von 200 mM Kaliumacetat (375 ml) bis 170 mM Lithiumacetat + 30 mM Natriumacetat (750 ml); Temperatur: 37 OC; Durchflußgeschwindigkeit: 4,5 ml/Std. für Fraktionen 1 bis 24, 9,4 ml für Fraktionen 25 bis 250. Bei der Fraktion 230 (durch einen Pfeil angezeigt) wurde die verbleibende DNA aus der Säule durch 200 mM Lithiumacetat eluiert, was zu dem Peak bei Fraktion 250 führte. Der Peak bei Fraktion 19 enthält Phenol. Fraktionsgröße: 5 ml.Fig. 2: Fractionation of a Hae III digestion of 5 mg of calf thymus DNA on a polyethylene glycol / dextran column (63 x 1.6 cm). System, carrier and impregnation as in Fig. 1; Gradient: square of 200 mM potassium acetate (375 ml) to 170 mM lithium acetate + 30 mM sodium acetate (750 ml); Temperature: 37 OC; Flow rate: 4.5 ml / hour. for fractions 1 to 24, 9.4 ml for fractions 25 to 250. For fraction 230 (indicated by an arrow) the remaining DNA eluted from the column by 200 mM lithium acetate, resulting in the peak at fraction 250 led. The peak at fraction 19 contains phenol. Fraction size: 5 ml.

Fig. 3: Fraktionierung einer EcoRI-Digestion von 0,5 mg DNA an einer Polyäthylenglykol/Dextran-Säule (32 x 1,6 cm).Fig. 3: Fractionation of an EcoRI digestion of 0.5 mg DNA on a Polyethylene glycol / dextran column (32 x 1.6 cm).

System, Träger, Imprägnierung und Temperatur wie für Fig. 2 beschrieben; Gradient: linear von 90 mM Lithiumacetat + 50 mM Natriumacetat bis 100 mM Lithiumacetat + 13 mM Lithiumsulfat (800 ml); Fließgeschwindigkeit: 9 ml/Std.; Fraktionsgröße: 3 ml.System, carrier, impregnation and temperature as described for FIG. 2; Gradient: linear from 90 mM lithium acetate + 50 mM sodium acetate to 100 mM lithium acetate + 13 mM lithium sulfate (800 ml); Flow rate: 9 ml / hour; Fraction size: 3 ml.

Die Tatsache, daß nur 5 Peaks festzustellen sind, beruht auf der Assoziation der größten und der kleinsten Fragmente über ihre komplementären einzelsträngigen Enden. Das größte Fragment besitzt eine Größe von 25,2 kpb (16,7 x 106 d).The fact that there are only 5 peaks is due to association the largest and smallest fragments via their complementary single-stranded End up. The largest fragment has a size of 25.2 kbp (16.7 x 106 d).

Fig. 4: Fraktionierung einer EcoRI-Digestion von 0,5 mg;t-DNA an einer Polyäthylenglykol/Dextran-Säule. Säulengröße, System, Träger, Imprägnierung und Temperatur wie für Fig. 3 beschrieben; Gradient: linear (800 ml) von 240 mM Lithiumacetat bis 80 mM Lithiumsulfat; Durchflußgeschwindigkeit: 9 ml/Std.; Fraktionsgröße: 3 ml.4: Fractionation of an EcoRI digest of 0.5 mg; t-DNA on a Polyethylene glycol / dextran column. Column size, system, support, impregnation and Temperature as described for FIG. 3; Gradient: linear (800 ml) of 240 mM lithium acetate up to 80 mM lithium sulfate; Flow rate: 9 ml / hour; Fraction size: 3 ml.

Die Homogenität der eluierten Peaks wird durch das ebenfalls eingetragene Gelmuster, das an Agarose-Gel (0,7 %), an welchem aliquote Teile der durch die Pfeile angezeigten Fraktionen in 40 mM Tris, 20 mM Natriumacetat, 2 mM EDTA (pH = 7,8 bei 2,5 V/cm) pherographiert wurden, gezeigt.The homogeneity of the eluted peaks is also registered by the Gel pattern attached to agarose gel (0.7%) at which aliquots the fractions indicated by the arrows in 40 mM Tris, 20 mM sodium acetate, 2 mM EDTA (pH = 7.8 at 2.5 V / cm) were shown.

Fig. 5: Fraktionierung einer Hae III-Digestion von 1,25 mg DNA aus dem Plasmid pBR 322 an einer Polyäthylenglykol/Dextran-Säule. Säulengröße, System, Träger, Imprägnierung und Temperatur wie für Fig. 4 beschrieben; Gradient: linear (600 ml) von 240 mM Kaliumacetat bis 240 mM Lithiumacetat; Fließgeschwindigkeit: 4,5 ml/Std. für Fraktionen 1 bis 25, 9 ml/Std. für Fraktionen 26 bis 190; Fraktionsgröße: 3 ml; Reproduktion der Recorder-Aufzeichnung, 0,2 A254-Einheiten pro voller Skala.Fig. 5: Fractionation of a Hae III digest of 1.25 mg of DNA the plasmid pBR 322 on a polyethylene glycol / dextran column. Column size, system, Carrier, impregnation and temperature as described for FIG. 4; Gradient: linear (600 ml) from 240 mM potassium acetate to 240 mM lithium acetate; Flow velocity: 4.5 ml / hour for fractions 1 to 25, 9 ml / hour. for fractions 26 to 190; Fraction size: 3 ml; Reproduction of the recorder recording, 0.2 A254 units per full scale.

Fig. 6: Teil eines Elutionsprofils, erhalten mit einer Mischung aus 1,25 mg einer Hae III-Digestion von pBR 322 Plasmid-DNA und 0,5 mg einer Hind III-Digestion von ,-DNA an einer Polyäthylenglykol/Dextran-Säule (60 x 1,6 cm). System, Träger, Imprägnierung und Temperatur wie für Fig. 5 beschrieben. Gradient I: linear (600 ml) von 240 mM Kaliumacetat bis 138 mM Lithiumacetat + 62 mM Natriumacetat; Gradient II: 138 mM Lithiumacetat + 62 mM Natriumacetat bis 80 mM Lithiumsulfat (linear, 800 ml); Fließgeschwindigkeit: 4,5 ml von Fraktion 1 bis 40; 9 ml/Std. für den Rest des Durchlaufs.6: Part of an elution profile obtained with a mixture from 1.25 mg of a Hae III digest of pBR 322 plasmid DNA and 0.5 mg of a Hind III digest of, -DNA on a polyethylene glycol / dextran column (60 x 1.6 cm). System, carrier, Impregnation and temperature as described for FIG. Gradient I: linear (600 ml) from 240 mM potassium acetate to 138 mM lithium acetate + 62 mM sodium acetate; gradient II: 138 mM lithium acetate + 62 mM sodium acetate to 80 mM lithium sulfate (linear, 800 ml); Flow rate: 4.5 ml from fractions 1 to 40; 9 ml / hour for the rest of the run.

Der dargestellte Teil des Elutionsprofils wurde mit dem zweiten Gradienten eluiert. Die Peaks von Fraktion 290 bis 310 enthalten die Plasmid-Fragmente mit 434, 458, 504, 540 und 587 bp, die Peaks von Fraktion 340 bis 395 die Hind III-Fragmente von DNA von 2,06, 2,21, 4,22, 6,47, 9,46 und 23,0 kp.The part of the elution profile shown was with the second gradient eluted. The peaks from fraction 290 to 310 contain the plasmid fragments with 434, 458, 504, 540 and 587 bp, the peaks from fraction 340 to 395 the Hind III fragments of DNA of 2.06, 2.21, 4.22, 6.47, 9.46 and 23.0 kp.

L e e r s e i t eL e r s e i t e

Claims

Claims 1. 1. "§ Method for size fractionation of macromolecular Substances by liquid-liquid chromatography using the from an aqueous solution of polyethylene glycol and dextran formed two-phase system with the lower dextran-rich phase containing a solid carrier substance as stationary phase and gradient elution of the polymer fractions, d u r c h g e it is not possible to state that one is dealing with a phase ratio (ratio of mobile to stationary phase) from 1.10 to 1.70 and at a temperature of 30 to 40 OC is working.

2. The method according to claim 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t that one works at a temperature of 37 + 1 "C.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that one works at an ionic strength of 0.10 to 0.30.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that that one works at an ionic strength of 0.20 to 0.25.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that that you can cellulose or natural or artificial polymers with acidic or basic Groups or polyacrylamide gels used as carriers for the stationary phase.

6. The method according to claim 5, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t that microgranular cellulose, 90% of which has a particle size of 25 up to 36 ßm, used as a carrier.

7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that that nucleic acids or proteins are fractionated.

8. The method according to claim 7, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t that one can nucleic acids and fragments in the range of 20 to 30,000 base pairs (bp) fractionated.

9. The method according to claim 7, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t that a phase ratio of 1.25 to 1.40 is used.