DE3107904A1

DE3107904A1 - METHOD FOR STABILIZING DETECTABLE REACTION PRODUCTS FORMED IN ENZYME TESTS

Info

Publication number: DE3107904A1
Application number: DE19813107904
Authority: DE
Inventors: Roger 60060 Mundelein Ill. Chung-Yuan Hu
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1980-03-03
Filing date: 1981-03-02
Publication date: 1982-01-21
Also published as: JPS56137155A; BE887771A; JPS629862B2; FR2477176B1; FR2477176A1; GB2070767A; GB2070767B

Description

Die Erfindung betrifft Reagentien und Verfahren zur Durchführung von Enzymimmuntests. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Stabilisieren des Reaktionsprodukts einer Peroxidase mit deren Substrat. Die Stabilisierung dieses Produkts erlaubt eine genaue Bestimmung von Immunoreaktanten, wie Antigenen, Antikörpern, bindenden Proteinen und Haptenen.The invention relates to reagents and methods for performing enzyme immunoassays. In particular, the invention relates to a Process for stabilizing the reaction product of a peroxidase with its substrate. The stabilization of this product allows an accurate determination of immunoreactants such as antigens, antibodies, binding proteins and haptens.

Bei typischen Enzymimrnuntests wird ein Enzym, wie Peroxidase, dem Reaktionsmedium in Form eines an einen Immunoreaktanten gebundenen Enzyms (Enzymkonjugat) einverleibt. Der enzymmarkierte Immunoreaktant nimmt an der Testreaktion teil, als ob er unmarkiert wäre. Seine Anwesenheit kann durch Zusatz eines Substrats, das mit dem Enzym reagiert, und durch Feststellen des gebildeten Reaktionsprodukts nachgewiesen werden. Um das Reaktionsprodukt genau zu messen, war es erforderlich, die Enzym-Substrat-Reaktion an der optimalen Stelle durch Zusatz eines Denaturierungsmittels oder eines irreversiblen Inhibitors für das Enzym, wie HCl, HpSO^, NaN,, oder NaF, zu beenden. Die Wirkung dieser Denaturierungsmittel beruht auf einer Zerstörung des Enzyms. Sie erweisen sich allein schon aufgrund ihrer Gefährlichkeit bei der praktischen Anwendung als unzufriedenstellend. Typical enzyme immunoassays involve an enzyme such as peroxidase, incorporated into the reaction medium in the form of an enzyme bound to an immunoreactant (enzyme conjugate). The enzyme-labeled Immunoreactant participates in the test reaction as if it were unlabelled. His presence can be confirmed by the addition of a Substrate that reacts with the enzyme, and detected by detecting the reaction product formed. To that To measure the reaction product accurately, it was necessary to add the enzyme-substrate reaction at the optimal point a denaturant or an irreversible inhibitor for the enzyme such as HCl, HpSO ^, NaN ,, or NaF. the The effect of these denaturants is based on the destruction of the enzyme. They turn out to be just because of their dangerousness unsatisfactory in practical use.

Erfindungsgemäss lässt sich diese Gefährdung dadurch beseitigen, dass man das Reaktionsprodukt des Substrats mit Peroxidase stabilisiert, indem man in das Reaktionsgemisch eine stabilisierende Menge eines löslichen Salzes eines Reduktionsmittels aus der Gruppe SpO^ und SpO-. einführt.According to the invention, this risk can be eliminated by that the reaction product of the substrate is stabilized with peroxidase by adding a stabilizing agent to the reaction mixture Amount of a soluble salt of a reducing agent from the group SpO ^ and SpO-. introduces.

Fig. 1 zeigt die Stabilisierung des Reaktionsprodukts von Meerrettich-Peroxidase (HPO) und o-Phenylendiamin (OPD) durch Natriummetabisulfit und Natriumthiosulfat, wie sich aus der über längere Zeit hinweg gleichmässigen optischen Dichte ergibt.Fig. 1 shows the stabilization of the reaction product of horseradish peroxidase (HPO) and o-phenylenediamine (OPD) by sodium metabisulfite and sodium thiosulfate, as can be seen from the above gives uniform optical density over a longer period of time.

Fig. 2 zeigt, dass Natriumarsenit, ein schwaches Reduktionsmittel, zur Stabilisierung des Reaktionsprodukts aus Meer-Fig. 2 shows that sodium arsenite, a weak reducing agent, to stabilize the reaction product from sea

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rettich-Peroxidase (HPO) und o-Phenylendiamin (OPD), ungeeignet ist, was sich daraus ergibt, dass die optische Dichte im Verlauf der Zeit zunimmt.radish peroxidase (HPO) and o-phenylenediamine (OPD), unsuitable is what follows from the fact that the optical density increases with the passage of time.

Peroxidase, insbesondere Meerrettich-Peroxidase, wird in grossem Umfang bei Enzymimmuntests zur Unterstützung des Nachweises geringer Mengen an Immunoreaktanten verwendet. Dieses Enzym lässt sich gemäss folgendem Reaktionsschema im Reaktionsgemisch nachweisen und quantitativ bestimmen:Peroxidase, especially horseradish peroxidase, is used extensively in enzyme immunoassays to aid in detection low levels of immunoreactants are used. This enzyme can be found in the reaction mixture according to the following reaction scheme prove and quantitatively determine:

Enzyme-substrate reaction

(1.) Peroxidase + HpO^ Enzymkomplex (2.) Enzymkomplex + o-Phenylendiamin(1.) Peroxidase + HpO ^ enzyme complex (2.) Enzyme complex + o-phenylenediamine

(AH₀) «r IkI- nachweisbares Produkt + Enzym + HpO(AH ₀ ) «r IkI- detectable product + enzyme + HpO

Stabilisierung
(3.) Enzymkomplex + BHp (Reduktionsmittel) stabilization
(3.) Enzyme complex + BHp (reducing agent)

B + Enzym + HpB + enzyme + Hp

(4.) H₂O + BH₂ —> 2H₂O + B(4.) H ₂ O + BH ₂ → 2H ₂ O + B

Bei A, dem nachweisbaren Produkt, handelt es sich um eine gelbliche Verbindung, die spektrophotometrisch gemessen werden kann. Die Menge der an in Stufe (2) gebildeten Verbindung A steht in direkter Beziehung zur vorhandenen Peroxidasemenge. Wenn Peroxidase mit einem Immunoreaktanten konjugiert ist, kann die Menge dieser Komponente in jeder Testphase durch Bestimmung der Intensität der Enzym-Substrat-Rcaktion ermittelt werden.A, the detectable product, is a yellowish compound that is measured spectrophotometrically can. The amount of compound A formed in step (2) is directly related to the amount of peroxidase present. When peroxidase is conjugated with an immunoreactant, the amount of this component can be determined at each test phase the intensity of the enzyme-substrate reaction can be determined.

Um die Menge des bei dieser Reaktionsfolge gebildeten nachweisbaren Reaktionsprodukts exakt zu bestimmen, wird erfindungsgemäss ein Reduktionsmittel, wie Methabisulfit (S^O₁- ) oderIn order to determine exactly the amount of the detectable reaction product formed in this reaction sequence, a reducing agent such as methabisulfite (S ^ O ₁ - ) or

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Thiosulfat (S₂O-, ) dem Reaktionsmedium im Anschluss an die Stufen (1) und (2) zugesetzt, um das Substrat als Elektronendonator zu verdrängen. Das Reduktionspotential des Reduktionsmittels soll so beschaffen sein, dass es zur Aufrechterhaltung einer konstanten Konzentration des Reaktionsprodukts während des Bestimmungszeitraunis ausreicht. Dieses Reaktionsschema ist in den Stufen (1) und (2) erläutert und in den Figuren 1 und dargestellt.Thiosulfate (S ₂ O-,) added to the reaction medium following steps (1) and (2) in order to displace the substrate as an electron donor. The reduction potential of the reducing agent should be such that it is sufficient to maintain a constant concentration of the reaction product during the determination period. This reaction scheme is explained in steps (1) and (2) and shown in FIGS.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Es ist festzuhalten, dass das erfindungsgemässe Verfahren nicht auf spezielle Enzyme und Substrate beschränkt ist. Beispielsweise eignen sich auch andere Peroxidasen, wie Lactoperoxidase, Verdoperoxidase und Cytochromperoxidase,ebenso wie Meerrettich-Peroxidase. Ferner können anstelle von o-Phenylendiamin auch andere Substrate, wie Mesidin, Pyrogallol, Benzidin, p-Phenylendiamin, 2,7-Diaminofluoren, p-Toluidin und Dimethylanilin, verwendet werden.The examples illustrate the invention. It should be noted that the method according to the invention does not rely on special enzymes and Substrates is restricted. For example, other peroxidases such as lactoperoxidase, verdoperoxidase and cytochrome peroxidase are also suitable like horseradish peroxidase. Furthermore, instead of o-phenylenediamine, other substrates, such as mesidine, Pyrogallol, benzidine, p-phenylenediamine, 2,7-diaminofluorene, p-toluidine and dimethylaniline can be used.

example 1

Etwa 10 ng Meerrettich-Peroxidase (HPO) werden zu 0,3 ml 0,1 m Citrat-Phosphat-Puffer vom pH-Wert 5,5 mit einem Gehalt an 0,02 Prozent HpOp und 3 mg/ml o-Phenylendiamin (OPD) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 30 Minuten ungestört bei Raumtemperatur stehengelassen. Sodann wird 1 ml dieses Gemisches mit 9 ml 0,1 m Na₂S₂Oj- versetzt. Das Absorptionsmaximum dieses Reaktionsgemisches bei 450 nm wird ermittelt.About 10 ng of horseradish peroxidase (HPO) become 0.3 ml of 0.1 M citrate phosphate buffer with a pH of 5.5 with a content of 0.02 percent HpOp and 3 mg / ml o-phenylenediamine (OPD ) given. The reaction mixture is left to stand undisturbed at room temperature for 30 minutes. _{9 ml of 0.1 M Na 2} S ₂ Oj- are then added to 1 ml of this mixture. The absorption maximum of this reaction mixture at 450 nm is determined.

Example 2

30 ng Meerrettich-Peroxidase werden zu 6 ml einer gemäss Beispiel 1 hergestellten Lösung von H₂O₃ und-OPD in Citrat-Phosphat-Puffer gegeben. Das Reaktionsgemisch wird wiederum 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschliessend30 ng of horseradish peroxidase are added to 6 ml of a solution of H ₂ O ₃ and OPD in citrate-phosphate buffer prepared according to Example 1. The reaction mixture is again left to stand for 30 minutes at room temperature. Afterward

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werden jeweils 1 ml des Reaktionsgemisches zu 9 ml 0,1 m Na₂S₃O₅, 9 ml 0,5 m Na₃S₂O₅ bzw. 9 ml 0,1 m Citrat-Phosphat-Puffer gegeben. Die Absorption wird 5 Stunden bei 450 nm gemessen. Es ergibt sieh, dass die Metabisulfitlösungen zu einer mindestens 5-stündigen Stabilisierung des nachweisbaren Reaktionsprodukts führen. Die Absorption des aktivierten Komplexes, nimmt in Citratpuffer innerhalb von 1 Stunde auf das 2-fache zu.1 ml of the reaction mixture is added to 9 ml of 0.1 M Na ₂ S ₃ O ₅ , 9 ml of 0.5 M Na ₃ S ₂ O ₅ or 9 ml of 0.1 M citrate-phosphate buffer. The absorption is measured for 5 hours at 450 nm. It can be seen that the metabisulfite solutions lead to a stabilization of the detectable reaction product for at least 5 hours. The absorption of the activated complex increases twice in citrate buffer within 1 hour.

Example 3

100 ng HPO werden auf 3 Reagenzgläser, die jeweils 1 ml der gemäss Beispiel 1 hergestellten Lösung von H₃O₂ und OPD in Citrat-Phosphat-Puffer enthalten, gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Zur Beendigung der Umsetzung werden die Reagenzgläser jeweils mit 5 ml 0,01 m, 0,05 m bzw. 0,1 m NapSgOg-Lösung versetzt. Die Absorption der» fieäktiönsgöfliisehe wird 2H Stunden bsi 45U mi ermittelt. Die Ergebnisse zeigen, dass durch die 0,05 m und die 0,1 m Na₂S₂Ot--Lösungen die Farbe des Produkts für diesen Zeitraum stabilisiert wird, während sich die 0,01 m-Lösung nicht als ausreichend starkes Reduktionsmittel erweist.100 ng of HPO are added to 3 test tubes each containing 1 ml of the solution of H ₃ O ₂ and OPD in citrate-phosphate buffer prepared according to Example 1. The reaction mixture is left to stand at room temperature for 30 minutes. To end the reaction, 5 ml of 0.01 m, 0.05 m or 0.1 m NapSgOg solution are added to the test tubes. The absorption of the "fieäktiönsgöfliisehe is determined 2H hours bsi 45U mi. The results show that the 0.05 m and 0.1 m Na ₂ S ₂ Ot solutions stabilize the color of the product for this period, while the 0.01 m solution does not prove to be a sufficiently strong reducing agent .

Example 4

4 ng HPO werden zu der -Lösung von H₃O₃ und OPD in Citrat-Phosphat-Puffer gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Zum Beenden der Reaktion werden jeweils 0,3 ml des Reaktionsgemisches in 4 Reagenzgläser,die 1 ml 0,1 m Na₃AsO₃, 0,1 m Na₃S₃O₅, 0,1 m KJ bzw. 0,1 m Na₃S₃O₃ enthalten, gegeben. Die Absorptionsspektren der Gemische werden 22 Stunden bei 450 nm ermittelt.4 ng of HPO are added to the solution of H ₃ O ₃ and OPD in citrate-phosphate buffer. The reaction mixture is left to stand for 5 minutes at room temperature. To terminate the reaction, 0.3 ml of the reaction mixture is poured _{into 4 test tubes, the 1 ml of 0.1 M Na 3} _{AsO 3} , 0.1 M Na ₃ S ₃ O ₅ , 0.1 M KI or 0.1 M Na ₃ S ₃ O ₃ contained, given. The absorption spectra of the mixtures are determined at 450 nm for 22 hours.

Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl Na₃S₃O., als auch Na₃S₃O₅ eine Stabilisierung des aktivierten Komplexes bewirken. Kaliurajodid ist ungeeignet, da das gebildete J₃ die Bestimmung beiThe results show that both Na ₃ S ₃ O. and Na ₃ S ₃ O ₅ stabilize the activated complex. Kaliurajodid is unsuitable, since the formed I ₃ the determination with

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450 nm stört. Na^AsOo ist offensichtlich kein ausreichend starkes Reduktionsmittel, da bei dessen Verwendung die Farbintensität mit der Zeit zunimmt.450 nm interferes. Na ^ AsOo is obviously not a strong enough one Reducing agent, since when used the color intensity increases over time.

Example 5

Mit HB Ag (Hepatitis B-Kernantigen) vorbeschichtete Polystyrolkügelchen werden in einem Reaktionstablett mit 0,2 ml Reihenverdünnungen von anti-HB -positiven Proben versetzt. Man lässt die Immunoreaktanten 2 Stunden bei 45 C reagieren. Sodann werden die Kügelchen aus den Vertiefungen entfernt und 2 mal mit je 5 ml Wasser gewaschen. Die gewaschenen Kügelchen werden mit 0,2 ml anti-HB :HRP-Konjugat versetzt. Sodann lässt man die Kügelchen und das markierte Konjugat 1 Stunde bei 45 C stehen. Die Kügelchen werden sodann wieder aus den Vertiefungen entfernt, 4 mal mit je 5 ml Wasser gewaschen und in Reagenzgläser gegeben, die 0,3 ml der Lösung von Peroxid und OPD in Citrat-Phosphat-Puffer enthalten. Nach 30-mirtlitigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wird zur Beendigung der Reaktion 1 ml 0,1 m Na₂SpO₁- zugesetzt. Das Absorptionsspektrum wird bei 450 nm mit einem bichromatischen Analysengerät bestimmt. Die erhaltene Titrationskurve zeigt, dass sich Na-SpO^ zur Verwendung in der Immuntestumgebung eignet.Polystyrene beads precoated with HB Ag (hepatitis B core antigen) are mixed with 0.2 ml serial dilutions of anti-HB -positive samples in a reaction tray. The immunoreactants are allowed to react at 45 ° C. for 2 hours. The beads are then removed from the wells and washed twice with 5 ml of water each time. 0.2 ml of anti-HB: HRP conjugate are added to the washed beads. The beads and the labeled conjugate are then left to stand at 45 ° C. for 1 hour. The beads are then removed again from the wells, washed 4 times with 5 ml of water each time and placed in test tubes containing 0.3 ml of the solution of peroxide and OPD in citrate-phosphate buffer. After standing for 30 minutes at room temperature, 1 ml of 0.1 M Na ₂ SpO ₁ - is added to terminate the reaction. The absorption spectrum is determined at 450 nm with a bichromatic analyzer. The titration curve obtained shows that Na-SpO ^ is suitable for use in the immunoassay environment.

Ende der BeschreibungEnd of description

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Claims

DR.-ING. WALTER ABITZ DR. DIETER F. MORF DIPL.-PHYS. M. GRITSCHNEDER patent attorneys

Munich,

March 2, 1981

Pontannchrlft / 3'OkIhI AddrexH Postfach 8ΘΟ1Ο9. 80OO München 8ΘPontannchrlft / 3'OkIhI AddrexH P.O. Box 8ΘΟ1Ο9. 80OO Munich 8Θ

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Tolox: (O)B23Ö9aTolox: (O) B23Ö9a

3753

ABBOTT LABORATORIES North Chicago, Illinois 60064

Method for stabilizing detectable reaction products formed in enzyme immunoassays

Claims

.J A method for stabilizing the reaction product of a substrate with peroxidase, characterized in that a stabilizing amount of a soluble salt of a reducing agent from the group $ 2 ^ 5 ^{and S} 2 ° 3 is incorporated into the reaction mixture.

2. The method according to claim 1, characterized in that the enzyme used is horseradish peroxidase.

3. The method according to claim 1, characterized in that

_{Na 0} S ₀ Oc- is used as the reducing salt.

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4. The method according to claim 1, characterized in that the reducing salt used is Na ₂ S ₀ O-.

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5. The method according to claim 1, characterized in that the substrate used is o-phenylenediamine.

6. A method for stabilizing the reaction product of o-phenylenediamine with horseradish peroxidase, characterized in that a stabilizing amount of a soluble salt of a reducing agent from the group SpO ₅ and SpO- is incorporated into the reaction mixture.

7- The method according to claim 6, characterized in that NapSpOc is used as the reducing salt.

8. The method according to claim 6, characterized in that NapSpCL · is used as the reducing salt.

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