DE2951412A1

DE2951412A1 - Immunity sample prodn. - by removing lipoid from egg yolk, and mixing with a polymer and precipitant to impart non-dispersibility to antibody

Info

Publication number: DE2951412A1
Application number: DE19792951412
Authority: DE
Inventors: Alfred Dr. Camps Bay Kapstadt Polson
Original assignee: South African Inventions Development Corp
Current assignee: South African Inventions Development Corp
Priority date: 1979-12-20
Filing date: 1979-12-20
Publication date: 1981-07-16

Abstract

Improved process for producing immunity sample is claimed in which a lipoid component is removed from an egg yolk and the resulting egg yolk is diluted and adjusted to a pH of 6 - 8 with a buffer agent and the diluted egg yolk solution is mixed with an aq. soluble mixt. consisting of a linear fibrous non-electrifying polymer and a precipitant and thereby, a non-dispersibility is imparted to an antibody of the egg yolk and then, the antibody having non-dispersibility is sepd. and collected from a produced supernatant solution. Above egg yolk is collected from an egg which is produced from an immunised hen having the antibody. Above linear fibrous non-electrifying polymer is chosen from nonyl-phenyl-ethoxylate, polyvinyl alcohol or polyvinyl-pyrrolidone and the precipitant is chosen from polyethylene glycol, polypropylene glycol, a copolymer of ethylene glycol - propylene glycol or dextran. Immunity sample is used for the transmission of passive immunity from maternal hen to chicken.

Description

Titel: Verfahren zur Herstellung immunologischTitle: Method of preparation immunologically

reaktiver Präparate Verfahren zur Herstellung immunologisch reaktiver Präparate Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herbtellung immunologisch reaktiver Präparate, wobei Antikörper, insbesondere Gammaglobuline durch selektive Fällung aus ihrer wässrigen Lösung angereichert bzw. gereinigt werden, und wobei als Fällungemittel fur die Antikörper lineare langkettige was8erlösliche ungeladene Polymerverbindungen, insbesondere Polyalkylenglykole oder Dextran verwendet werden. Die Erfindung betrifft ferner mittels des Verfahrens hergestellte Präparate sowie neue immunologisch reaktive Präparate, die mittels des Verfahrens herstellbar sind. reactive preparations Method of manufacture immunologically Reactive Preparations The invention relates to a method of preparation immunologically reactive preparations, whereby antibodies, in particular gammaglobulins by selective Precipitation are enriched or purified from their aqueous solution, and wherein linear, long-chain, water-soluble, uncharged substances as precipitating agents for the antibodies Polymer compounds, in particular polyalkylene glycols or dextran, can be used. The invention also relates to preparations produced by means of the method as well new immunologically reactive preparations that can be produced using the process.

Ublicherweise werden Präparate dieser Art aus antikörperhaltigen BlutSraktionen hergestellt, wobei Je nach der Art der Präparate sowohl Menschenblut als auch tierisches Blut verwendet wird. Antisera, die in grösseren Mengen benötigt werden, gewinnt man tiblicherweise aus dem Blut von fur diesen Zweck gehaltenen und immunisierten Pferden.Preparations of this type are usually made from antibody-containing blood fractions manufactured, depending on the type of preparations, both human and animal blood Blood is used. Antisera that come in larger quantities needed are usually obtained from the blood of those held for this purpose and immunized horses.

FUr die Herstellung von Spezialpräparaten, bzw. wenn verhältnismässig kleine Mengen benötigt werden, bedient man sich verschiedener Labortiere, insbesondere Kaninchen und Meerschweinchen. Diese werden bei der Blutgewinnung entweder völlig ausgeblutet und können somit nur ein einziges Mal verwendet werden, oder es werden in regelmässigen Zeitabständen geringere Blutmengen abgezapft, z.X. 25 ml, z.B. einmal wöchentlich , jeweils zwei Monate lang mit zwischenzeitlichen Nachimpfungen und Ruheperioden von ein bis zwei Monaten.For the production of special preparations, or if proportionate If small amounts are required, various laboratory animals are used, in particular Rabbits and guinea pigs. These are either completely during the blood collection bled out and can therefore only be used once, or it will be Smaller amounts of blood drawn off at regular intervals, e.g. 25 ml, e.g. once a week, for two months at a time, with additional vaccinations in between and rest periods of one to two months.

Diese Methodik erfordert normalerweise einen hohen Stand der technischen Ausbildung und Erfahrung des Laborpersonals, insbesondere wenn die Blutabzapfung durch Herzpunktur erfolgt. Die Gefahr des Verlustes wertvoller immunisierter Labortiere ist erheblich.This methodology usually requires a high level of technicality Training and experience of laboratory staff, especially when drawing blood done by cardiac puncture. The risk of losing valuable immunized laboratory animals is substantial.

Die Nachimpfung und regelmässige Blutung der Tiere, und dies gilt auch ftir Pferde, kann aus zwei Gründen nicht ueber zu lange Zeit forgesetzt werden: Nach mehreren Nacgimpfungen verlieren die Immunsera ihre Spezifizitat, da allmählich auch kleinere Mengen fremder Antigene auftreten.The re-vaccination and regular bleeding of the animals, and this applies also for horses, cannot be continued for too long for two reasons: After several vaccinations, the immune sera lose their specificity, since gradually small amounts of foreign antigens also occur.

Dies fÜhrt bei der Verwendung der Sera fur diagnostische Zwecke zu Fehlbefunden. Ferner führt die Methode im Laufe der Zeit zu Leberschäden und schliesslich tödlichem Leberversagen.This leads to the use of the sera for diagnostic purposes Missing findings. Furthermore, the method leads to liver damage over time and eventually fatal liver failure.

Die Gewinnung von Antisera bzw. Antikörperpräraten aus Blut oder BlutSraktionen ist aufwendig, insbesondere was die Herstellung von SpezialprEparaten in kleineren Mengen betrifft und hat den weiteren Nachteil, dass die Präparate schEdliche, insbesondere allergenische Begleitstoffe enthalten. Zur Verbesserung des Heretellungs verfahrens wurde bereits vorgeschlagen, die Antikörper durch selektive Fällung aus ihrer wässrigen Lösung anzureicheren, bzw. zu reinigen, wobei als Fällungsmittel fur die Antikörper lineare langkettige wasserlösliche ungeladene Polymerverbindungen, insbesondere Polyalkylenglykole oder Dextran verwendet werden (US-PS 3415804; 3,989,818).The extraction of antisera or antibody preparations from blood or blood fractions is complex, especially when it comes to the production of special preparations in smaller ones Quantities concerns and has the further disadvantage that the preparations are harmful, in particular Contain allergenic substances. To improve the manufacturing process it has already been suggested that the antibodies can be obtained by selective precipitation from their aqueous Enrich the solution or purify it, using as a precipitant for the antibodies linear long chain water soluble uncharged polymer compounds, in particular Polyalkylene glycols or dextran can be used (U.S. Patent 3,415,804; 3,989,818).

Dadurch wird zwar der grösste Teil der allergenischen Stoffe boseitigt. Eine hundertprozentige Beseitigung kann jedoch kaum gewährleistet werden.This removes most of the allergenic substances. However, a hundred percent elimination can hardly be guaranteed.

Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung hinsichtlich ihrer Wirksamkeit bzw. Reinheit vorteilhafter, immunologischer Präparate, insbesondere zur Verwendung als Diagnostika zur passiven Immunisierung von Tieren und Menschen, zur Behandlung pathologischer Zustände und als Gegengifte, beispielsweise gegen Schlangenbiss. Dabei sollen gegebenenfalls auch (zum Teil erhebliche und uberraschende) wirtschaftliche Vorteile erzielt werden.The object of the invention is the production with regard to their effectiveness or purity of advantageous immunological preparations, especially for use as diagnostics for passive immunization of animals and humans, for treatment pathological conditions and as antidotes, for example against snakebite. This should also include (sometimes considerable and surprising) economic ones Benefits can be achieved.

Zu diesem Zweok schlagt die Erfindung ein Verfahren der eingängsgenannten Art vor, worin zunächst eine Henne gegen das den gewtnschten Antikörpern entsprechende Antigen immunisiert wird, die von der immunisierten Henne gelegten Eier gesammelt, die fettartigen Stoffe von den Dottern der Eier abgetrennt und die in den Eidottern enthaltenen Antikörper mit dem Fallingsmittel in wkssriger Suspension gemischt werden, wodurch die Dispergierbarkeit der Antikörper unterdrUckt wird, worauf die als Niederschlag vorliegenden Antikörper von der flAssigen Phase abgetrennt werden.For this purpose, the invention proposes a method of the type mentioned at the outset Kind before, in which first a hen against the antibodies corresponding to the desired Antigen is immunized, the eggs laid by the immunized hen are collected, the fatty substances separated from the yolks of the eggs and those in the egg yolks contained antibodies are mixed with the falling agent in an aqueous suspension, whereby the dispersibility of the antibodies is suppressed, whereupon they appear as a precipitate present antibodies are separated from the liquid phase.

Es war bereits bekannt, dass Vogel, z.B. Legehennen, ihre immunitat auf die Eidotter ihrer Eier und somit auf ihre Nachkommen Ubertragen (F.W. Rogers Brambell "The transmission of passive immunity of mother to young", (1970) North Holland Publishing Company, Amsterdam, London).It was already known that birds, e.g. laying hens, have their immunity to the yolks of their eggs and thus to their offspring (F.W. Rogers Brambell, "The transmission of passive immunity from mother to young," (1970) North Holland Publishing Company, Amsterdam, London).

Uberraschenderweise eignen sich die erfindungsgemass vorgeschlagenen Fällungsmittel besonders gut zur selektiven Anreicherung bzw. Reinigung dieser Antikörper, aus Vogelinsbesondere Hühnereiern, und zur Herstellung von Präparaten mit besonders vorteilhaften Eigenschaften.Surprisingly, those proposed according to the invention are suitable Precipitants are particularly good for the selective enrichment or purification of these antibodies, from birds, especially chicken eggs, and for the production of preparations with especially beneficial properties.

Das war insofern nicht vorherzusehen, als die Begleitstoffe der Antikörper in Eiern völlig anders als die Begleitstoffe in Blut und BlutSraktionen sind. Ausserdem können die Molekulargewichte der Antikörper in verschiedenen Ausgangsmedien sehr unterschiedlich sin, und hierUber lagen keine Kenntnisse vor, aus denen sich die Eignung von Eigelb als Ausgangsmaterial für die Herstellung immunologischer Präparate durch selektive Fällung mit PEG ableiten lieSt.This could not have been foreseen inasmuch as the substances accompanying the antibodies in eggs are completely different from the accompanying substances in blood and blood fractions. Besides that the molecular weights of the antibodies in different starting media can be very high are different, and there were none Knowledge before, from which consider the suitability of egg yolk as a starting material for the production of immunological Preparations can be derived by selective precipitation with PEG.

Das Molekulargewicht von aus Eidottern gewonnenem IgY beträgt 170 000, also wesentlich mehr als das Molekulargewicht von Säugetierimmunoglobulin (IgG, Molgewicht 150 000). Erstmalig wurde nun festgestellt, dass der isoelektrische Punkt fur IgY um etwa eine pH Einheit niedriger liegt als der des IgG. Dadurch eignet sich IgY besonders gut als Antikörper fUr bestimmte immunoelektrophoretische Verfahren im Hinblick auf die höhere elektrophoretische Mobilität in Agarosegel bei Wasserstoffionenkonzentrationen im pH Bereich 7,0 bis 9,0.The molecular weight of IgY obtained from egg yolks is 170 000, significantly more than the molecular weight of mammalian immunoglobulin (IgG, Molecular weight 150,000). For the first time it has now been established that the isoelectric point for IgY is about one pH unit lower than that of IgG. This is suitable IgY is particularly effective as an antibody for certain immunoelectrophoretic processes in view of the higher electrophoretic mobility in agarose gel at hydrogen ion concentrations in the pH range 7.0 to 9.0.

Dies ist z.Rbesonders vorteilhaft fur die ein-bzw.This is particularly advantageous for

zweidimensionale Laurell-Immunoelektrophorese. Bisher musste das IgG zur Erhöhung der Nettoladungsdichte carbamilisiert werden, da es sonst nicht zum positiven Pol hinwanderte und nicht mit den Antigenen geringer elektrophoretischer Mobilität reagicren konnte. Die brfolgreiche Carbamilisierung des IgG erfordert proteinchemische Spezialkenntnisse. Die Mobilität von IgY ist fast so hoch wie die des carbamilisierten IgG, und somit kann auf die umst1ndliche Carbamilisierung verzichtet werden. Dieser erfindungsgemäss erzielbare Vorteil war nicht zu erwarten.two-dimensional Laurell immunoelectrophoresis. So far, the IgG be carbamilized to increase the net charge density, otherwise it will not be positive pole migrated to and not less electrophoretic with the antigens Mobility could react. The successful carbamilization of the IgG requires special knowledge of protein chemistry. The mobility of IgY is almost as high as that of the carbamilized IgG, and thus the cumbersome carbamilization can be dispensed with will. This advantage that can be achieved according to the invention was not to be expected.

Zwar liegen die gewunschten Antikörper nicht nur im E1-dotter, sondern auch im Eiweiss vor. Es werden jedoch erhebliche Vorteile damit erzielt, die technische Gewinnung der Antikörper auf die Verarbeitung der Eidotter zu beschränken. Di s Die Antikörperkonzentration im Eiweiss ist geringer und ausserdem enthält das Eiweiss lästige Begleitstoffe, unter anderem das stark basische Bysozym, sich welches/selbst in geringen Spuren stbrend auf diagnostische Reaktionen auswirkt.It is true that the desired antibodies are not only in the E1 yolk, but also in protein. However, significant advantages are achieved with it, the technical Limit the production of antibodies to the processing of the egg yolks. Di s The antibody concentration in the protein is lower and it also contains the protein annoying accompanying substances, among other things the strongly basic bysozyme, which / itself in small traces has a detrimental effect on diagnostic reactions.

Bei der Wahl des Fällungsmittels spielt es u.A. eine wesentliche Rolle, dass die zur Unterdrlickung der Dispergierbarkeit der Antikörper benötigte Menge die Viskosität der wässrigen Eigelbdispersion bei der herrschenden Temperatur nicht so stark erhöht, dass dadurch die Durchftlhrbarkeit des Verfahrens in Frage gestellt wird. In an sich bekannter Weise eignen sich besonders als Fällungsmittel PolyEthylenglykol, Polypropylenglykol, 1,4-Dihydroxybutanglykol oder Misch-bzw. Blockpolymere von Athylenglykol mit einen oder mehreren seiner höheren Homologen, wobei das Molekulargewicht des Fallungsmittels im Bereich von 2 000 bis 30 000 liegt.When choosing the precipitant, it matters, among other things. an essential role that the amount needed to suppress the dispersibility of the antibodies the viscosity of the aqueous egg yolk dispersion at the prevailing temperature does not increased so much that it calls into question the feasibility of the procedure will. In a manner known per se, particularly suitable precipitants are polyethylene glycol, Polypropylene glycol, 1,4-dihydroxybutane glycol or mixed or. Block polymers of ethylene glycol with one or more of its higher homologues, the molecular weight of the Precipitant is in the range of 2,000 to 30,000.

Es können auch andere lineare langkettige wasserldsliche ungeladene Polymerverbindungen verwendet werden, z .3.There can also be other linear long-chain water-soluble uncharged Polymer compounds are used, e.g.

Nonylphenolathoxylat, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrroliden. Doch werden diese nicht bevorzugt. Polyäthylenglykol (PEG) ist besonders wirtschaftlich und fur grosstechnische Zwecke leicht beschaffbar und wird unter anderem deshalb bevorzugt, insbesondere PEG mit einem Molekulargewioht von 2 000 und 30 000, vorzugsweise zwischen 4 000 und 9 000 insbesondere etwa 6 000. In der folgenden Beschreibung wird PEG 6000 deshalb besonders betont.Nonyl phenolate oxylate, polyvinyl alcohol and polyvinyl pyrrolides. Indeed these are not preferred. Polyethylene glycol (PEG) is special Easily obtainable economically and for large-scale technical purposes and is available under Therefore preferred among other things, especially PEG with a molecular weight of 2,000 and 30,000, preferably between 4,000 and 9,000, in particular about 6,000. In the In the following description, PEG 6000 is therefore particularly emphasized.

Falls ein anderes Fallungsmittel als PEG mit Molekulargewicht 6 000 verwendet werden soll, so lässt sich dessen benötigte Menge, die einer bekannten fur die gleiche Fällung benötigten Menge von PEG 6 000 entspricht, in den meisten Fallen wenigstens annKhernd aus der folgenden Gleichung errechnen: worin der benötigten Konzentration umgekehrt proportional ist; 7 - partielles spezifisches Volumen des Polymeren; rr= Radius des Polymermoleküls; r8- Radius, bzw. Stokes Radius der zu trennenden Partikel.If a precipitant other than PEG with a molecular weight of 6,000 is to be used, its required amount, which corresponds to a known amount of PEG 6,000 required for the same precipitation, can in most cases at least approximately be calculated from the following equation: wherein the concentration required is inversely proportional; 7 - partial specific volume of the polymer; rr = radius of the polymer molecule; r8- radius or Stokes radius of the particles to be separated.

Die der obigen Formel zugrunde liegenden Grundsätze werden im einzelnen in Biochem et Biophys. Acta. 229 (1971) Seite 535 - 546 beschrieben.The principles underlying the above formula are detailed in Biochem et Biophys. Acta. 229 (1971) pages 535-546.

Aus der Gleichung ergibt sich auch, dass fur ein kleines rr die Neigung ß der Fällungskurve grösser wird, was mit sich bringt, dass die vollständige Fällung in einem engen Konzentrationsbereich stattfindet. Dies gilt fur synthetische organische Polymerverbindungen. Wenn rr dahingegen gross ist, wie im Falle von Dextran, so ist auch die Neigung ß der Fällungskurve entsprechend geringer und findet die vollständige Fällung in einem entsprechend grösseren Bereich der Dextrankonzentration statt. Da das verdrängte Volumen (als Funktion der Gesamtlänge des Polymermoleküls) fur ein dünneres Polymermolektil grösser ist als fur ein dickeres PolymermolekÜl, lässt sich ferner ableiten, dasB das dünnere Polymermölekül die Fällung eines bestimmten Stoffes bei einer geringeren Gewichtskonzentration zustande bringt, als die Polymerverbindung mit dem grösseren Moleküldurchmesser.The equation also shows that for a small rr the slope ß the precipitation curve becomes larger, which means that complete precipitation takes place in a narrow concentration range. This applies to synthetic organic Polymer compounds. If, on the other hand, rr is large, as in the case of dextran, then so the slope ß of the precipitation curve is correspondingly lower and finds the complete one Precipitation takes place in a correspondingly larger range of the dextran concentration. Since the displaced volume (as a function of the total length of the polymer molecule) is for a thinner polymer molecule is larger than for a thicker polymer molecule can also be deduced that the thinner polymer oil is the precipitation of a certain Brings substance at a lower weight concentration than the polymer compound with the larger molecule diameter.

Eflr die meisten Falle ist die Beziehung zwischen der benötigten Konzentration und dem Molekulargewicht des Fällungsmittels annähernd linear.Eflr most cases is the relationship between the concentration needed and the molecular weight of the precipitant approximately linear.

Die Begriffe Fällung und "Fällungsmittel" sind im übertragenen Sinne zu verstehen, da man es hier im allgemeinen nicht mit einer Phasenbildung in echten Losungen zu tun hat, sondern mit der Unterdruckung der Diepergierbarkeit suspendierter Makromoleküle.The terms precipitation and "precipitant" are in a figurative sense to understand, since one is generally not dealing with a phase formation in real Solutions has to do, but with the suppression of the dispersibility of suspended Macromolecules.

Zur Verbesserung der Trennung bzw. Reinigung kann die Fraktionierung auch mehrmals wiederholt worden, entweder Jedes Mal in der erfindungsgemässen Weise oder auch in Kombination mit anderen herkömmlichen Fraktioniermethoden.Fractionation can be used to improve separation or purification also been repeated several times, either each time in the manner according to the invention or in combination with other conventional fractionation methods.

Bei der Verwendung von Polyalkylenglykolen, insbesondere PEG als Fällungsmittel, verwendet man vorzugsweise das handelsübliche Produkt "Polyäthylenglykol 6000" , wobei die Ziffer "6 000" annäherungsweise das Molekulargewicht bezeichnet. So besitzt beispielsweise das von der Firma Shell erhältliche PolyEthylenglykol 6 000 laut Angaben der Herstellerin ein durchschnittliches Molekulargewicht zwischen 6 000 und 7 500 unter Zugrundelegung der von der Herstellerin verwendeten Bestimmungsmethode. Jedenfalls ist das Molekulargewicht des Fällungsmittels nicht sehr kritisch und lassen sich geringfugige Abweichungen in der optimalen PEG Konzentration, soweit sie auf diesen Faktor zuckzuft1hren sind, sehr leicht durch routinemässigen Vorversuch feststellen. Solche routinemässigen Vorversuche können beispielsweise in deL bereits in US-PS 3,415,804 besohriebenen Weise durchgeführt werden.When using polyalkylene glycols, especially PEG as a precipitant, the commercial product "polyethylene glycol 6000" is preferably used, the number "6,000" approximating the molecular weight. So owns for example the polyethylene glycol 6,000 available from Shell According to the manufacturer, an average molecular weight between 6,000 and 7,500 based on the determination method used by the manufacturer. In any case, the molecular weight of the precipitant is not very critical and There can be slight deviations in the optimal PEG concentration, so far they can be traced back to this factor, very easily by routine preliminary experiment determine. Such routine preliminary tests can already be carried out in deL, for example in U.S. Patent 3,415,804 described manner.

Bevorzugte Einzelheiten des erfindungsgemässen Verfahrens ergeben sich aus den UnteransprEchen.Preferred details of the process according to the invention result from the subclaims.

Gemäss Unteranepruch 3 bis 8 findet die Fällung vorzugsweise in mindestens zwei Stufen statt, wobei vorzugsweise die Konzentration des Fällungsmittels so erhöht wird, dass zunachst, unter weniger starken F§Ilungsbedlngen, d.h.According to Unteranepruch 3 to 8, the precipitation takes place preferably in at least two stages take place, preferably the concentration of the precipitant so increased will that initially, under less severe conditions, i.e.

bei einer geringeren Konzentration des dem Eigelb beigemischten Fallungsmittels die verhältnismässig leicht füllbaren Verunreinigungen selektiv und ohne Fällung der Antikörper abgetrennt werden und in einer weiteren Stufe, unter vergleichsweisen stärkeren Fällungsbedingungen aufgrund der Konzentration des dem Eigelb beigemischten Fällung mittels in der wässrigen Suspension die Antikörper selektiv gefällt werden. Vorzugsweise wird das Eigelb mit zwei Volumenteilen Wasser, gepuffert auf ein R von vorzugsweise 7,5 verdünnt.at a lower concentration of the precipitant added to the egg yolk the relatively easy to fill impurities selectively and without precipitation the antibodies are separated and in a further stage, under comparative stronger precipitation conditions due to the concentration of the added to the egg yolk Precipitation means that the antibodies are selectively precipitated in the aqueous suspension. Preferably the egg yolk is mixed with two volumes of water, buffered on an R diluted by preferably 7.5.

Die richtige Wahl der Fällungsmittelkonzentration in der ersten Fallungsstufe ist verhältnismässig kritisch. The right choice of precipitant concentration in the first precipitation stage is relatively critical.

Liegt diese Konzentration im Falle von PEG 6 000 unter 3% (bezoge'auf Gewicht PEG/Volumen der wässrigen Suspension) so werden unter Umständen die kaseinartigen Proteine ungenügend ausgefällt. Liegt dahingegen die PEG Konzentration nicht unterhalb 4%, so kann dadurch bereits die Ausbeute an Antikörpern beeinträchtigt werden. Die bevorzugte PEG Konzentration liegt zwischen 3,3 und insbesondere bei 3,5%. If this concentration is below 3% in the case of PEG 6,000 (based on Weight of PEG / volume of the aqueous suspension) so under certain circumstances the casein-like Insufficiently precipitated proteins. On the other hand, if the PEG concentration is not below 4%, this can already affect the antibody yield. the preferred PEG concentration is between 3.3 and especially 3.5%.

Die gemäss Anspruch 7 und 8 bevorzugte Fällungsmittelkonzentration fnr die selektive Fällung der Antikörper selbst ergibt sich hinsichtlich der unteren Grenze, 11% vorzugsweise 11,5%, aus Ausbeuteerwägungen. The preferred precipitant concentration according to claims 7 and 8 For the selective precipitation of the antibodies themselves results with respect to the lower ones Limit, 11% preferably 11.5%, for yield considerations.

Die obere Grenze von 14%,vorzugsweise 12,5% ergibt sich daraus, dass im Bereich dieser oberen Grenze bereits Eiweiss und andere proteinartige Begleitstoffe gefällt werden. Die bevorzugte Konzentration beträgt 12,'.The upper limit of 14%, preferably 12.5%, results from the fact that in the area of this upper limit already protein and other protein-like accompanying substances be felled. The preferred concentration is 12 '.

Die Abtrennung der fettartigen Stoffe kann durch Extraktion mittels eines organischen Lösungsmittels, beispielsweise Toluol durchgefuhrt werden. Besonders bevorzugt wird Jedoch das Verfahren gemäss Anspruch 9, wobei als absorbierendes Filterbett eine Watteschicht verwendet werden kann.The separation of the fatty substances can be done by extraction an organic solvent, for example toluene. Particularly However, preferred is the method according to claim 9, wherein the absorbent Filter bed a layer of cotton wool can be used.

Es hat sich nun herausgestellt, dass die Immunisierung der in den Versuchen gemäss des oben gewürdigten Standes der Technik verwendeten Hennen keineswegs optimiert war. Die in den Versuchen verwendeten Eier wurden nur kurz nach der Immunisierung gewonnen, und aus den dort veröffentlichten Daten ist abzubiten, dass der Antikörpergehalt der nacheinander gelegten Eier nach etwa 5 Tage ein Maximum erreicht und dann sehr schnell und stark zuruckgeht.It has now been found that the immunization of the No hens used in experiments according to the state of the art recognized above was optimized. The eggs used in the experiments were only released shortly after immunization obtained, and from the data published there it can be shown that the antibody content of the successively laid eggs reached a maximum after about 5 days and then very much goes back fast and strong.

Unter solchen Umständen käme eine wirtschaftliche Gewinnung der Antikörper praktisch nicht in Frage. Auch aus diesem Grund war die Brauchbarkeit des beanspruchten Verfahrens für die Technik nicht vorauszusehen, da die Literatur das Gegenteil vermuten liess.Under such circumstances, the antibodies would be obtained economically practically out of the question. For this reason, too, the usefulness of the claimed Process for the technology cannot be foreseen, as the literature suggests the opposite left.

Uberraschenderweise ist es insbesondere gemäss Anspruch 10 möglich, einen sehr viel höheren und viele Monate lang praktisch unverminderten Antikörpergehalt zu erzielen, beispielsweise mindestens vier Monate lang oder gar länger, nach vorliegenden Erfahrungen sogar für die gesamte oder praktisch gesamte Legedauer der Henne. Dieser Erfindungsgedanke wird auch alleine gesehen als an sich neu betrachtet.Surprisingly, it is possible in particular according to claim 10, a much higher antibody content that was practically unchanged for many months to achieve, for example, for at least four months or even longer, according to the present Experience even for the entire or practically entire laying period of the hen. This The idea of the invention is also seen alone as being new in itself.

Das in der zweiten Fällungsstufe arkaltene Antikörperkonzentrat wird vorzugsweise einer weiteren Reinigung unterworfen, z.B. zunächst in wEssrige Lösung gebracht und danach wieder gefällt, z.B. mit Alkohol oder einem anderen Fällungamittel fur Proteine, vorzugsweise Jedoch wieder mit einem der erfindungsgemäss vorgeschlagenen linearen langkettigen wasserlöslichen ungeladenen Polymerverbindungen, z.B. PEG.The antibody concentrate, which is cold in the second precipitation stage, becomes preferably subjected to further cleaning, e.g. initially in an aqueous solution brought and then felled again, e.g. with alcohol or another precipitant for proteins, but preferably again with one of the proposed according to the invention linear long chain water soluble uncharged polymer compounds, e.g., PEG.

Fur viele Zwecke sind PEG Spuren im Endprodukt nicht störend. Falls Jedoch gegen PEG als Verunreinigung Bedenken vorliegen, wird in der letzten Fällungsstufe ein anderes nicht störendes Fällungsmittel verwendet, z.B.For many purposes, traces of PEG in the end product are not disturbing. If However, there is concern about PEG as an impurity in the final stage of precipitation another non-interfering precipitant is used, e.g.

Ammoniumsulphat in halber Sättigungskonzentration.Ammonium sulphate in half the saturation concentration.

Die Temperatur fur die Durchftlhrung des Verfahrens ist nicht besonders kritisch und liegt vorzugsweise zwischen 0 und 3000, insbesondere zwischen 40C und 250C beispielsweise bei normaler Zimmertemperatur.The temperature at which the process is carried out is not particularly high critical and is preferably between 0 and 3000, in particular between 40C and 250C for example at normal room temperature.

Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich nicht nur zur Gewinnung der Antikörper in guter Ausbeute, sondern auch in sehr reiner Porm, weshalb in entsprechend gelagerten Fällen das Präparat auch zur Einspritzung in Tiere oder Menschen ohne Gefahr oder wesentliche Gefahr allergischer Reaktionen geeignet ist. Da ferner weichgekochte Eier zum normale Speisezettel der meisten Menschen gehören, ist es sehr wahrscheinlich, dabA die Mehrzahl gegen eventuell im Eigelb vorhandene allergenische Stoffe und von denen unter Umständen neeWh Spuren LW Produkt des vorliogcnden Verfahrens vorliegen mögen, bereits desensitisiert sind.The method according to the invention is not only suitable for extraction the antibody in good yield, but also in very pure form, which is why in accordingly In stored cases, the preparation can also be injected into animals or humans without Danger or substantial risk of allergic reactions. Since also soft-boiled Eggs are part of the normal diet of most people, it is very likely that The majority against allergenic substances that may be present in the egg yolk and of which there may be no traces of LW product of the present process are already desensitized.

Aus Eidotter gewonnene Antikörper in gereinigter einspritzbarer Borm, stellen ein neues pharmazeutisches Präparat dar.Antibodies obtained from egg yolk in purified injectable form, represent a new pharmaceutical preparation.

Es ist auch verhältnismassig leicht, Htlhner so heranzuziehen und zu halten, dass sie praktisch nur solchen Antigenen ausgesetzt werden, gegen die eine Immunität erwünscht wird. Dabei ist es besonders vorteilhaft, dass diese Immunität derart langfristig beispielweise Uber die gesamte Legezeit der Henne ohne spätere Wiederholungen der Antigenanwendung erhalten bleibt.It is also relatively easy to pull up hens in this way and to keep that they are practically only exposed to antigens against the an immunity is desired. It is particularly beneficial to have this immunity such long-term, for example, over the entire laying time of the hen without later Repetitions of the antigen application is preserved.

Die Erfindung eignet sich gegebenenfalls zur Herstellung von Gegengiften, gegen tierische Angriffgifte, z.B.The invention is optionally suitable for the production of antidotes, against animal attack poisons, e.g.

von Schlangen, Skorpionen und Spinnen. Dabei ist die verringerte Gefahr allergischer Reaktionen besonders vorteilhaft und ebenso die Eignung des Verfahrens fur die Herstellung von Gegengiften gegen seltene Schlangenarten oder gegen Schlangen, gegen die es bisher keine leicht erhältlichen Gegengifte gegeben hat. Das gilt z.B. für Baumschlangen, Vogelschlangen, Rebenschlangen und selbst Mambas.of snakes, scorpions and spiders. Here is the reduced risk allergic reactions are particularly advantageous, as is the suitability of the procedure for the production of antidotes against rare species of snakes or against snakes, against which there have been no easily available antidotes. This applies e.g. for tree snakes, bird snakes, vine snakes and even mambas.

Solche aus Vogeleier gewonnenen Gegengifte sind an sich neu.Such antidotes obtained from bird eggs are new in themselves.

Die Erfindung eignet sich auch besonders fur die Herstellung von Antikörperkonzentraten fur die Feststellung und Identifizierung der verschiedensten Antigene im Labor, z.B.The invention is also particularly suitable for the production of antibody concentrates for the finding and identification of various antigens in the laboratory, e.g.

für pathologische, forensische oder endocrinologischc Zwecke.for pathological, forensic or endocrinological purposes.

Die Erfindung eignet sich auch flir die Herstellung von Mehrzweckgegengiften.The invention is also useful in the manufacture of multi-purpose antidotes.

Ferner wird die Anwendung der Erfindung auf die Herstellung antifoetaler Proteine fur die diagnostische Feststellung gewisser bbsartiger pathologischer Zustände, z.B. Leberkrebs und anderer Krebsarten, für die Heratellung antilymphocytischer Seren zur Verwendung bei der Organübertragung, antifoetaler Proteine fur die eventuelle Behandlung von trebsartigen Erscheinungen und ganz generell fUr die Herstellung von Antiseren gegen beliebige Antigene vorgeschlagen.Furthermore, the application of the invention to the manufacture of antifoetal Proteins for the diagnostic determination of certain abnormal pathological conditions, e.g. liver cancer and other types of cancer, for the production of antilymphocytic Serums for use in organ transplantation, antifoetal proteins for eventual Treatment of treble-like phenomena and, in general, for production suggested by antisera against any antigens.

Im Prinzip lässt sich das erfindungsgemässe Verfahren auch in umgekehrter Reihenfolge durchfthren, wobei zunächst die kaseinartigen Proteine gemeinsam mit den Antikörpern bei der höheren Fällungsmittelkonzentration gefällt werden, wonach die PEG Konzentration, insbesondere durch Verdünnung mit wässriger Fltasigkeit verringert wird, und dadurch die Antikörper wieder dispergiert werden, während die kaseinartigen Proteine im Niederschlag verbleiben und anschliessend gegebenenfalls die Antikörper wieder aus der Dispersion zu fällen.In principle, the method according to the invention can also be reversed Carry out the sequence, first taking the casein-like proteins together with the antibodies are precipitated at the higher precipitant concentration, after which the PEG concentration is reduced, in particular by dilution with aqueous liquid is, and thereby the antibodies are redispersed, while the casein-like Proteins remain in the precipitate and then the antibodies, if applicable to precipitate out of the dispersion again.

Es hat sich gezeigt, dass Antigene mit einem verhtltnismässig geringen Molekulargewicht, z.B. weniger als 100 000 und insbesondere weniger als 30 000 eine verhEltnismäßig geringe Wirksamkeit hinsichtlich der Bildung der gewunschten Antikörper in der Henne im Vergleich zu Antigenen mit hohem Molekulargewicht, insbesondere Molekulargewichten von mehr als 150 000 besitzen. Aufgrund dieser bisher nicht bekannten Erkenntnis sieht die Erfindung vorzugsweise vor, dass die immunogenen Eigenschaften von Antigenen mit verhältnismässig geringen Molekulargewichten durch Aggregation solcher Antigene zur Bildung immunogenisch wirksamerer Molekulargewichte aufgebessert werden. Dies wird vorzugsweise durch Vernetzungsreaktion zustande gebracht, vorzugsweise mit Glutaraldehyd im Falle basischer Antigene oder mit Carbodiiminen zur Vernetzung von Carboxylgruppen der Moleküle. Andere Vernetzungsmittel können ebenfalls verwendet werde Besonders bevorzugt wird die Erhöhung des Molekulargewichts solcher Antigene durch Vernetzung mit einem verhältnismässig hochmolekularen Trägermolekul. Als Beispiel geeigneter Trägermoleküle seien hierzu lIaemocyaninmolekule genannt, die zum Beispiel aus Mollusken, z.B. Schnecken oder aus Krebstieren gewonnen werden können.It has been shown that antigens with a relatively low Molecular weight, e.g. less than 100,000 and especially less than 30,000 a relatively low effectiveness in terms of the formation of the desired antibody in the hen compared to high molecular weight antigens, in particular have molecular weights of more than 150,000. Because of this so far unknown knowledge, the invention preferably provides that the immunogenic Properties of antigens with relatively low molecular weights Aggregation of such antigens to form immunogenically more effective molecular weights to be improved. This is preferably brought about by a crosslinking reaction, preferably with glutaraldehyde in the case of basic antigens or with carbodiimines to cross-link the carboxyl groups of the molecules. Other crosslinking agents can also used. It is particularly preferred to increase the molecular weight such antigens by crosslinking with a relatively high molecular weight carrier molecule. Examples of suitable carrier molecules are hemocyanin molecules, which are obtained, for example, from mollusks, e.g. snails, or from crustaceans can.

In dieser Weise war es zum Beispiel möglich, die immunogenen Eigenschaften der Antigene von Schlangengiften erheblich zu erhöhen. Die gleiche Arbeitsweise wird erfindungsgemäss auch fur die Herstellung immunologisch diagnostischer Präparate fur den Nachweis von Krebserkrankungen unter Anwendung der entsprechenden niedermolekularen Antigene vorgeschlagen.In this way it was possible, for example, to improve the immunogenic properties significantly increase the antigens of snake venom. The same way of working is also used according to the invention for the production of immunological diagnostic preparations for the detection of cancers taking Application of the appropriate proposed low molecular weight antigens.

Bei der diagnostischen Anwendung der erfindungsgemäss hergestellten immunologischen Präparate, insbesondere wenn die zur Immunisierung von Hennen verwendeten Antigene mit einem nachzuweisenden pathologischen Zustand zusammenhängen, so werden die erfindungsgemass abgetrennten Jntikorper auf eine pathologische Probe aufgetragen, und wird eine Präzipitinreaktion zwischen den erzeugten Antikörpern und den entsprechenden Antigenen der Probe in einer Weise, die an sich bekannt sein kann, beobachtet.In the diagnostic use of the manufactured according to the invention immunological preparations, especially when those used to immunize hens Antigens are related to a pathological condition to be detected the antibodies separated according to the invention are applied to a pathological sample, and there will be a precipitin reaction between the antibodies generated and the corresponding ones Antigens of the sample are observed in a manner that may be known per se.

Eine bevorzugte Arbeitsweise ist die weitgehend bekannte Ouchterlony-Methode. Eine Beschreibung dieser Methode erbringt sich, da sie aus der Originalliteratur und den ueblichen Nachschlagewerken allgemein bekannt ist. Im allgemeinen wird es bevorzugt, diese Methode in Gegenwart einer erheblichen Natriumchloridkonzentration in dem fur den Test verwendeten Gel durchzufuhren. Vorzugsweise wird Agarose Gel verwendet. Geeignete Natriumchloridkonzentrationen liegen im allgemeinen zwischen 0,1 und 0,2 M, wobei im allgemeinen 0,15 M bevorzugt wird, da diese Konzentration auch von empfindlichen Stoffen wie Viren ohne weiteres toleriert wird. Höhere Konzentrationen werden nur dann empfohlen, wenn sonst keine oder keine deutliche Präzipitinreaktion beobachtet wird. In solchen Fällen liegt die obere Konzentrationsgrenze vorzugsweise bei 1,5 M. Hiermit lassen sich unter Umständen deutlichere Reaktionen mit Antigenen eines Molekulargewichtes unter 150 000 erzielen.A preferred method of working is the widely known Ouchterlony method. This method can be described as it is taken from the original literature and is generally known to the usual reference works. Generally it will prefers this method in the presence of a significant concentration of sodium chloride in the gel used for the test. Agarose gel is preferred used. Suitable sodium chloride concentrations are generally between 0.1 and 0.2 M, with 0.15 M being generally preferred as this is the concentration is also easily tolerated by sensitive substances such as viruses. Higher concentrations are only recommended if otherwise no or no significant precipitin reaction is observed. In such cases, the upper concentration limit is preferably at 1.5 M. Under certain circumstances, this allows clearer reactions with antigens achieve a molecular weight below 150,000.

Hinsichtlich der praktischen Durchftlhrung der Doppeldiffusionsmethode und insbesondere der Ouchterlony Methode wird auf "Methods in Immunology and Immunochemistry", O.H. Williams und Merrill W. Chase, Academic Press (1971), Band III, Seiten 146 - 161 hingewiesen.Regarding the practical implementation of the double diffusion method and in particular the Ouchterlony method is referred to "Methods in Immunology and Immunochemistry", OH. Williams and Merrill W. Chase, Academic Press (1971), Volume III, pages 146 - 161 pointed out.

Obwohl in dieser Literaturstelle die Verwendung von Agar als auch Agarose als Gelmedium fur den Test empfohlen wird, hat sich gezeigt, dass im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, Agarose weitaus geeigneter ist. Im Falle von Agar bilden sich nämlich weisse Höfe, um die IgY Zonen im Agar (möglicherweise verursacht durch ein Reaktionsprodukt von Agaropektin und Spurenverunreinigungen mit Lysozym).Although in this reference the use of agar as well Agarose is recommended as the gel medium for the test has been shown to be related with the present invention, agarose is far more suitable. In the case of agar namely, white zones are formed around the IgY zones in the agar (possibly caused by a reaction product of agaropectin and trace impurities with lysozyme).

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausfthrungsbeispielen naher erläutert. Aus Einheitlichkeitsgründen wurden sämtliche Beispiele mit dem gleichen Fällung mittel, PEG 6000 durchgefuhrt. Aufgrund des Obengesagten ist es dem Fachmann Jedoch ohne weiteres möglich, die Beispiele sinngemäss auch suf andere Fällungsmittel zu übertragen. Die Beispiele wurden so gewählt, dass sie dem Fachmann einen Uberblick ueber die verschiedensten praktischen Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung geben, um es dem Fachmann zu erleichtern, auch andere beziehungsweise Analoge erfindungsgemässe Methoden durchzufuhren.The invention is illustrated in more detail below with the aid of exemplary embodiments explained. For the sake of consistency, all examples have been given the same Medium precipitation, PEG 6000 carried out. Based on the above, it is to the person skilled in the art However, without further ado, the examples also apply analogously to other precipitants transferred to. The examples have been chosen to give an overview to those skilled in the art give about the most diverse practical application possibilities of the invention, in order to make it easier for the person skilled in the art, also other or analogues according to the invention Methods to carry out.

Beispiel 1 Hennen Weisse Leghorn sowie Kreuzungen zwischen Rhode Ländern und Weissen Leghorn , 20 Wochen alt, wurden fur die Immunoglobulin-und Eierproduktion unter isolierten Bedingungen gehalten. Während der gesamten Versuchsreihe zeigten sie keine Erankheits- oder Unbehagenserscheinungen.Example 1 Hennen Weisse Leghorn and crosses between Rhode countries and Weissen Leghorn, 20 weeks old, were responsible for immunoglobulin and egg production kept in isolated conditions. During the entire test series showed they have no symptoms of sickness or discomfort.

Chemikalien Fur die Fraktionierung der Eidotter wurde Polyathylenglykol MW 6 000 Daltons (PEG) verwendet. Als Präservierungsmittel fUr die gewaschenen Eidotter und für die endgültig gereinigten Eidotter-Immunoglobuline (IgY) wurde Natriumazid in einer Konzentration von 0,1 g/Liter verwendet.Chemicals Polyethylene glycol was used for the fractionation of the egg yolk MW 6,000 Daltons (PEG) used. As a preservative for the washed egg yolks and for the final purified egg yolk immunoglobulins (IgY), sodium azide was used used at a concentration of 0.1 g / liter.

Puffer Die Eidotter wurden mit 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,5, NaCl Gehalt 0,1 M gepuffert. Der gleiche Puffer wurde auch als Dispersionsmedium fur das gereinigte IgY Endprodukt verwendet.Buffer The egg yolks were washed with 0.01 M phosphate buffer, pH 7.5, NaCl Content 0.1 M buffered. The same buffer was also used as a dispersion medium for the purified IgY end product is used.

Immunisierung Die Junghennen erhielten zunächst eine intramuskulare Einspritzung mit dem Jeweiligen Antigen im Phosphatpuffer, pH 7,5 emulgiert mit einem gleichen Volumen von unvollständigem Freund Adjuvant. Dabei war die verwendete Antigenkonzentration nicht kritisch und variierte von einem Antigen zum anderen,betrug aber im allgemeinen zwischen 1 und 5 mg/ml. Nach der ersten Einspritzung erhielten die Junghennen drei weitere Einspritzungen in Abständen von Je einer Woche. Es wurde Jeweils ein Volumen von 1 ml, d.h.Immunization The pullets initially received an intramuscular Injection with the respective antigen in phosphate buffer, pH 7.5 emulsified with an equal volume of incomplete Freund's adjuvant. It was the one used Antigen concentration not critical and varied from antigen to the others, but was generally between 1 and 5 mg / ml. After the first injection The pullets received three further injections at one-week intervals. In each case a volume of 1 ml, i.e.

zwischen 1 und 5 mg eingespritzt. Auf diese Weise wurde eine Hyperimmunisierung erzielt. Die Eier wurden gesammelt beschriftet und bei 40 bis zur Weiterverarbeitung und Extraktion des IgY aufbewahrt. Die Sammlung der Eier wurde 9 Monate lang fortgesetzt.injected between 1 and 5 mg. In this way it became hyperimmunization achieved. The eggs were collected and labeled at 40 pending further processing and extraction of the IgY preserved. The collection of the eggs was continued for 9 months.

Extraktion und Reinigung des IgY E3 wurden verschiedene Methoden zur Abtrennung der fettigen Stoffe und kaseinartigen Proteine vom verdünnten Eigelb verglichen, unter anderem die Verwendung organischer Lösungsmittel wie Ether und Toluol und die Fällung mit Ammoniumsulphat. Verdrängung mit PEG ergab die besten Ergebnisse.Various methods were used to extract and purify the IgY E3 Separation of fatty substances and casein-like proteins from the diluted egg yolk compared, among other things, the use of organic solvents such as ethers and Toluene and precipitation with ammonium sulphate. Displacement with PEG gave the best Results.

Die Abtrennung des IgY verlief denkbar einfach. Zunächst wurden die Eidotter einer tozahl Eier gesammelt und gründlich mit einem schwachen Strahl destillierten Wassers zur Entfernung des Eiweisses gewaschen. Die Eidotter wurden dann in einen grossen Glastrichterdber einem Messzylinder fallen gelassen. Dabei platzten die Dottersäcke und floss der Dotterinhalt in den Messzylinder. Das Dottervolumen wurde bestimmt, wonach die Dotter mit der zweifachen Volumenmenge an Puffer gründlich vermischt wurden. ' Das PEG wurde in einem Waring Mixer fein verpulvert und dem verdÜnnten Eigelb zugemischt bis zu einer Endkonzentration von 3,5 g PEG /100 ml verdunntes Eigelb und unter Rühren vollntAndig gelöst. Das Gemisch wurde dann 10 Minuten lang bei 10 000 Umdrehungen /Minute (12 000 x g) in einer Sorvall Zentrifuge zentrifugiert. Hierbei bildeten sich in den Zentrifugengläsern drei Phasen, eine obere gelbe Fettschicht, darunter eine klare, das grösste Volumen einnehmende Schicht und hierunter eine halbfeste plastische Schicht, die aus der Hauptmasse des Eigelbs und der kaseinartigen ProteinpilDe bestand und /insgesamt 1/3 des Gesamtvolumens im Zentrifugenglas darstellte. Die klare Flüssigkeitsschicht und die Fettschicht wurden sorgfältig in einen Trichter mit einem Vlattebau3ch im Hals des Trichters dekantiert. Die Fettschicht wurde von diesem Wattebausch beim Filtrieren der Flüssigkeit zurUckgehalten. Das Volumen des klaren Filtrats wurde gemessen und unter leichtem Rühren weiteres PEG beigemischt, wodurch eine endgultige Polymerkonzentration von 12g PEG/100ml Eidotterextrakt eingestellt wurde. Bei dieser Konzentration fand eine vollständige Verdrängung (Fällung) des IgY statt.The separation of the IgY was very easy. First of all, the Egg yolks of a number of eggs are collected and thoroughly distilled with a weak stream Washed with water to remove the protein. The egg yolks were then put into a large glass funnel dropped over a measuring cylinder. They burst Yolk sacs and the contents of the yolk flowed into the measuring cylinder. The yolk volume was determined, after which the yolk with twice the volume of buffer thoroughly were mixed. 'The PEG was Finely powdered in a Waring mixer and mixed with the diluted egg yolk up to a final concentration of 3.5 g PEG / 100 ml diluted egg yolk and completely dissolved while stirring. The mixture was then for 10 minutes at 10,000 revolutions / minute (12,000 x g) in a Sorvall Centrifuge centrifuged. Three phases formed in the centrifuge tubes, an upper yellow layer of fat, underneath a clear one that takes up the greatest volume Layer and below this a semi-solid plastic layer that consists of the main mass of the egg yolk and the casein-like protein mushrooms and / a total of 1/3 of the total volume in the centrifuge tube. The clear liquid layer and the fat layer were carefully placed in a funnel with a flap in the neck of the funnel decanted. The layer of fat was removed from this cotton ball while filtering the liquid held back. The volume of the clear filtrate was measured and taken gently Stir further PEG added, creating a final polymer concentration of 12g PEG / 100ml egg yolk extract was adjusted. At this concentration found one complete displacement (precipitation) of the IgY takes place.

Gewisse Anteile der begleitenden Proteine, insbesondere α- und ß-Livitin wurden zusammen mit dem IgY gefällt. Der Niederschlag wurde bei 10 000 Umdrehungen/Min. in der Sorvall Zentrifuge abzentrifugiert. Die Niederschlagspillen wurden im ursprÜnglichen Phosphatpuffervolumen wieder gelöst und das IgY wurde wiederum mit 12% pulverförmigem PEG gefällt und abzentrifugiert. Unter der Zentrifugalkrafteinwirkung bei 10 000 Umdrehungen/Min. wurden die gcfAllten Pellets kompaktiert und die zunächst eingeschlossenen PEG Lösungsmengen herausgequetscht und anschliessend abgesaugt. Die Kompaktierung der Pellets wurde wiederholt und die PEG Testlösung wurde beseitigt. Damit wurde die Polymerverunreinigung des IgY soweit verringert, dass eine Störung der AntikOrper/Antigenreaktion nicht mehr zu befürchten war. Die endgtlltigen Pellets wurden in einem Volumen Phosphatpuffer gelöst, welches dem halben ursprÜnglichen Eidottervolumen entsprach. Die Proteinkonzentration des Endproduktes betrug grössenordnungsmässig 6 mg/ml. Das Produkt wurde mit 0,01% Natrumazid als Präservierungsmittel versetzt. Das Natriumazid kann auch bereits fruher, nämlich dem zur Verdünnung des Eigelbes (siehe oben) dienenden Puffer in 0,0%iger Konzentration beigegeben werden. Je nach Wunsch können auch konzentriertere Lösungen durch Lösung der Pellets in geringeren Volumen hergestellt werden.Certain proportions of the accompanying proteins, especially α- and ß-Livitin were precipitated together with the IgY. The precipitation was at 10,000 Revolutions / min. centrifuged in the Sorvall centrifuge. The rainfall pills were redissolved in the original phosphate buffer volume and the IgY became again precipitated with 12% powdered PEG and centrifuged off. Under the effect of centrifugal force at 10,000 revolutions / min. the fallen pellets were compacted and the first Trapped PEG solution amounts squeezed out and then sucked out. The compaction of the pellets was repeated and the PEG test solution was discarded. This reduced the polymer contamination of the IgY to such an extent that it was a disturbance the antibody / antigen reaction was no longer to be feared. The final pellets were dissolved in a volume of phosphate buffer which was half the original Egg yolk volume corresponded. The protein concentration of the end product was of the order of magnitude 6 mg / ml. The product was treated with 0.01% sodium azide as a preservative. The sodium azide can also be used earlier, namely to dilute the egg yolk (see above) serving buffer in 0.0% concentration are added. Depending on You can also request more concentrated solutions by dissolving the pellets in smaller ones Volume can be produced.

Gegebenenfalls werden die im IgY noch vorhandenen PEG Spuren durch Fällung des IgY mit halbgesättigtem Ammoniumsulphat und anschliessender Zentrifugierung beseitigt.If necessary, the PEG traces still present in the IgY are through Precipitation of the IgY with half-saturated ammonium sulphate and subsequent centrifugation eliminated.

Dabei bildet das PEG in der wässrigen Ammoniumsulphatphase eine flüssige Phase, während sich das IgY als dritte Phase am Boden des Zentrifugenglases sammelt.The PEG forms a liquid in the aqueous ammonium sulphate phase Phase, while the IgY collects as the third phase at the bottom of the centrifuge tube.

Geschwindigkeit der Ubertragung der Antikörper in dan Eigelb nach der Immunisierung.Speed of the transfer of the antibodies in the egg yolk of immunization.

Diese Geschwindigkeit wurde in drei Systemen gemessen, nämlich: 1. Nudaurelia Virus - Anti Nudaurelia Virus IgY, 2. Amandin-anti Amandin IgY, und 3. Tetanus Toxin-Anti Tetanus Toxin.This speed was measured in three systems, namely: 1. Nudaurelia Virus - Anti Nudaurelia Virus IgY, 2. Amandin-anti Amandin IgY, and 3. Tetanus Toxin-Anti Tetanus Toxin.

Gereinigtes IgY wurde aus einzelnen an Jedem zweiten Tag gesammelten Eiern isoliert und hinsichtlich Fällungsvermögen fur die Antigene titriert. Im Falle von Nudaurelia Virus und Amandin wurde die Ouchterlony Gel-Diffusionsmethode verwendet. Im Falle des Anti-Tetanus IgY, wurde die Gegengiftaktivität an Schweizer weissen Mäusen ermittelt. In sämtlichen Fällen traten die Antikörper in feststellbarer Menge 10 Tage nach der ersten Einspritzung auf. Nach den Wiederholungen der Antigen-Einspritzungen wurden die Zeiträume zwischen der Einspritzung und dem Anstieg des Antikörpertiters kurzer, bis schliesslich ein Antikbrperniveau erreicht wurde, welches sich danach nicht mehr ändert.Purified IgY was collected from individuals every other day Eggs isolated and titrated for precipitating capacity for the antigens. In the event of of Nudaurelia Virus and Amandin the Ouchterlony gel diffusion method was used. In the case of anti-tetanus IgY, the antidote activity on Swiss people was white Mice determined. In all cases the antibodies appeared in detectable amounts 10 days after the first injection. After the repetitions of the antigen injections became the time between injection and the rise in antibody titer shorter, until finally an antique level has been reached, which is then no longer changes.

Nach vier Monaten wurde die Versuchsreihe beendet. Der Präzipitintiter des IgY gegen Nudaurelia Virus in den Eidottern der Henne mit der stärksten immunologischen Reaktion lag zwischen 1/256 und 1/512 und im Falle der Henne mit der schwächsten Reaktion zwischen 1/128 und 1/256.The test series was ended after four months. The precipitin titer of the IgY against Nudaurelia virus in the egg yolks of the hen with the strongest immunological Response was between 1/256 and 1/512 and in the case of the hen with the weakest Response between 1/128 and 1/256.

Die Eidotter der mit Amandin immunisierten Henne zeigten maximale Fällungstiter von etwa 1/64. Dieser Titer lässt sich durch Verwendung des Antigens in vernetzter Form gemäss Beispiel 7 aufbessern. The egg yolks of the hen immunized with amandin showed maximal Precipitation titre of about 1/64. This titer can be determined by using the antigen Improve in crosslinked form according to Example 7.

Anti-Tetanus IgY neutralisierte 2 mld des Tetanustoxins in einer Verdünnung eines IgY zwischen 10- 4 und 10 5.Anti-Tetanus IgY neutralized 2 ml of the tetanus toxin in a dilution an IgY between 10-4 and 10 5.

Nach Beendigung der Einspritzungen der Henne blieb dieses Aktivitätsniveau in den Eidottern für die gesamte Versuchsdauer von vier Monaten konstant. Dabei wurde beobachtet, dass im allgemeinen der IgY Gehalt in den Eidottern höher ansteigt, als im Serum der Hennen, und das gleiche Molekulargewicht wie im Serum (170 000) besitzt.After the hen injections were finished, this level of activity remained constant in the egg yolks for the entire duration of the experiment of four months. Included it was observed that the IgY content in the egg yolks generally rises higher, than in the serum of the hens, and the same molecular weight as in the serum (170,000) owns.

Bcispiel 2 Eidotter Antikörper (IgY) gegen Pflanzenviren Beispiel 1 wurde mit Pflanzenviren als Antigen wiederholt.Example 2 Egg yolk antibodies (IgY) against plant viruses Example 1 was repeated with plant viruses as the antigen.

Die Ubertragung der Pflanzenvirusantikörper in die Eidotter entsprach den mit Nudaurelia Virus, Amandin und etanustoxoid gemachten BeobachtungWn. Der IgY Titer gegen Tabakmosaikvirus hatte die gleiche Grössenordnung wie der üblicherweise im Antiserum mit Kaninchen erzielbare Titer.The transfer of the plant virus antibodies into the egg yolk corresponded the observation made with Nudaurelia virus, Amandin and etanus toxoid Wn. Of the IgY titer against tobacco mosaic virus was of the same order of magnitude as the usual one titre achievable in the antiserum with rabbits.

Mit den IgY Antikörpern gegen Bromgrassmosaikvirus wurden auf den Ouchterlony Platten doppelte Präzipitatlinien erhalten. Die den Antigen Auftragstellen nächsten Linien wurden von vollständigen Virusteilchen gebildet, während diejenigen, die der zentralen Antikörperaufgabestelle am nächsten lagen, von proteinartigen Virusbruchstucken herrührten.With the IgY antibodies against bromine grass mosaic virus were on the Ouchterlony plates obtained duplicate lines of precipitate. The antigen application sites next lines were formed by complete virus particles, while those closest to the central antibody delivery site from proteinaceous Virus fragments resulted.

IgY Antikörper gegen gelben Rübenmosaikvirus ergaben nur die Präzipitinlinien fur die intakten Viruspartikel, und der IgY Antikörpertiter war ähnlich wie der Titer für Kaninchen Immunsera.IgY antibodies against yellow beet mosaic virus gave only the precipitin lines for the intact virus particles, and the IgY antibody titer was similar to that Titer for rabbit immune sera.

ähnliche Ergebnisse wurden mit drei weiteren Pflanzenvirusarten erzielt.similar results were obtained with three other plant virus species.

Die mit Natriumazid stabilisierten Antikörperlösungen sind bei 40C als Diagnostikum fur estmethoden wie die Doppeldiffusionsmethode nach Ouchterlony, vorzugsweise auf Agaroseplatten lange haltbar.The antibody solutions stabilized with sodium azide are at 40C as a diagnostic for est methods such as the double diffusion method according to Ouchterlony, Long shelf life, preferably on agarose plates.

Beispiel 3 Diagnose auf Bromgrasmosaikvirus (BMV) Bromgras-Mosaikvirus (BMV) wird in infizierten Weizen-und Gerstenextrakten Ueber die Ouchterlony Doppeldiffusionsmethode nachgewiesen. Die IgY Antikörper gegen BI+V werden gemäss Beispiel 2 hergestellt und in eine in die Agarosefläche einer Petrischale eingeschnittene Vertiefung eingeflihrt. Die Antigenprobe der infizierten Weizen-und Gerstenextrakte wird in entsprechende Vertiefungen gebracht, die sich auf einem Kreis, 5 mm um die zentrale Vertiefung befinden. Vier bis 6 solcher Vertiefungen fur die Proben worden Jeweils in der aus der Fachliteratur bekannten Weise um die zentrale Vertiefung herum angebracht.Example 3 Diagnosis for Bromine Grass Mosaic Virus (BMV) Bromine Grass Mosaic Virus (BMV) is found in infected wheat and barley extracts using the Ouchterlony double diffusion method proven. The IgY antibodies against BI + V are produced according to Example 2 and introduced into a recess cut into the agarose surface of a Petri dish. The antigen sample of the infected wheat and barley extracts is in appropriate Wells placed on a circle, 5mm around the central well are located. Four to 6 such wells for the samples been In each case in the manner known from the specialist literature around the central recess attached around.

Nach Auftragung der Reaktionsmittel in die Vertiefarlgen der Petrischalen, werden diese bei Zimmertemperatur 24 bis 48 Stunden lang stehen gelassen. In dieser Zeit diffundieren die Reagenzien (d.h. das diagnostische IgY Reagenz und die BMV Antigene der Jeweiligen Proben) aus ihren Jeweiligen Vertiefungen in das diese umgebende Agarosegel hinein, und bilden sichtbare Niederschlagslinien zwischen der mittleren Vertiefung und den diese umgebenden Vertiefungen. Diese typischen Nieder6chlagslinien ergeben den Nachweis des BMV Antigens in den Proben und dienen als positive Diagnose von BMV im Weizen oder der Gerste.After applying the reagents in the wells of the Petri dishes, they are left at room temperature for 24 to 48 hours. In this Time the reagents diffuse (i.e. the diagnostic IgY reagent and the BMV Antigens of the respective samples) from their respective wells into the surrounding one Agarose gel into it, and form visible lines of precipitation between the middle Depression and the depressions surrounding them. These typical lines of precipitation provide evidence of the BMV antigen in the samples and serve as a positive diagnosis of BMV in wheat or barley.

Besonders im Falle von Virusdiagnosen ist die Verwendung von Kochsalz nicht immer notwendig. Zwischen 0,15 und 1,5 M Natriumchlorid im Agarosegel erhöhen Jedoch die Testempfindlichkeit, insbesondere im Falle von Antigenen mit geringe Molekulargewicht. Die bevorzugte Konzentration ist normalerweise 0,15M und sollte im Falle von Virusdiagnosen nicht überschritten werden.The use of table salt is particularly important in the case of virus diagnoses not always necessary. Increase between 0.15 and 1.5 M sodium chloride in the agarose gel However, the test sensitivity, especially in the case of antigens with low Molecular weight. The preferred concentration is usually 0.15M and should in the case of virus diagnoses must not be exceeded.

Höhere Konzentrationen sollten nur dann zur Anwendung kommen, wenn bei 0,15M keine oder nur eine schwache Präzipitinreaktion feststellbar ist.Higher concentrations should only be used if at 0.15M no or only a weak precipitin reaction can be detected.

BeisPiel 4 IgT Antikörper gegen menschliches IgG Im elektrischen Feld haben Mensch- und Kaninchen- IgG eine ähnliche, wenn auch geringe Mobilität und bewegen sich unter Elektrophoresebedingungen in Agarose oder Agagel zum negativen Pol hin. Im Gegensatz hierzu hat IgY eine erhebliche Mobilität in Richtung auf den positiven Pol. Aus dieser unterschiedlichen Mobilität ergibt sich die Möglichkeit Schwierigkeiten bei der Analyse von verschiedenen Antigenen mit geringer MobilitEt wie menschliches IgG in der ein- bzw. zweidimensionalen Laurell-Elektrophorese zu Uberwinden. Wegen der erheblichen Endosmose mit IgG muss vor der Elektrophorese die Ladung der Antikörpermolekule chemisch geändert werden, was im Falle von IgY Antikörpern nicht notwendig ist.EXAMPLE 4 IgT antibodies against human IgG in the electric field, human and rabbit IgG have a similar, albeit low level Mobility and move under electrophoresis conditions in agarose or agagel towards the negative pole. In contrast, IgY has significant mobility in Direction towards the positive pole. This different mobility results the possibility of having difficulties in the analysis of different antigens low mobility like human IgG in one or two-dimensional Laurell electrophoresis to overcome. Because of the significant endosmosis with IgG, electrophoresis must be performed the charge of the antibody molecules can be chemically changed, which in the case of IgY Antibodies is not necessary.

Für die klinische Diagnose ist es wichtig, den Gehalt an Menschen-IgY im Blutkreislauf festzustellen. Dies lässt sich damit erreichen, dass man den maximalen Verdünnungsgrad des menschlichen Serums feststellt, bei welchem noch eine Niederschlagslinie gegen in der Herde erzeugte IgY Körper gegen IgG feststellbar ist, wobei die Methode gemäss Beispiel 1 und die gemäss Beispiel 1 aus Hühnereidottern hergestellten Antikörperpräparate verwendet werden.For clinical diagnosis it is important to know the level of human IgY detected in the bloodstream. This can be achieved by getting the maximum Determines the degree of dilution of the human serum at which there is still a precipitation line against IgY produced in the herd body against IgG can be determined, with the method according to Example 1 and the antibody preparations made from chicken egg yolks according to Example 1 be used.

BeisPiel 5 Klinische Bestimmung von IgM im Menschen FUr die. klinische Diagnose ist die Bestimmung des menschlichen IgM-Gehaltes wichtig. Es handelt sich hierbei um einen Antikörper, der fruh während der Immunisierung, insbesondere gegen Bakterien und Viren gebildet wird. Hennen werden gegen reines IgM in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise immunisiert. Die IgY Antikörper gegen dieseslgM werden aus den Eidottern gemäss Beispiel 1 gewonnen und Bienen als Reagenz ftir die klinische Diagnose mittels der Doppeldiffusionsmethode.EXAMPLE 5 Clinical determination of IgM in humans For the. Clinical diagnosis, the determination of the human IgM content is important. It is an antibody that is produced early during immunization, especially against bacteria and viruses. Hens become against pure IgM immunized in the manner described in Example 1. The IgY antibodies against this IgM are obtained from the egg yolks according to Example 1 and bees as a reagent for clinical diagnosis using the double diffusion method.

Beispiel 6 Tetanus Antitoxin wird nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1 hergestellt. Das Molekulargewicht des Neurotoxins im vom Tetanuserreger erzeugten Tetanustoxin beträgt etwa 145 000 und eignet sich somit zur Erzeugung guter Antikörperausbeuten in Huhnereiern. Titer bis zu 10 -5 mld/ml (minimum lethal dose) wurden mit 6 mg IgY/ml erhalten. Für InJektionszwecke entspricht dies den in herkömmlicher Preise mit Pivrden erzeugten Antiseren. Das aus Eigelb gemäss Beispiel 1 gewonnene IgY wird folgendermassen in einspritzbare Form gebracht PEG-Spuren im IgY-Konzentrat werden durch Fällung mit 40% Alkohol bei O bis 40C entfernt. Der IgY Niederschlag wird abzentrifugiert und durch Gefriertrocknen vom Alkohol befreit. Das erhaltene Pulver wird in der Mindestenge Kochsalzlösung gelöst; Das so erhaltene einspritzbare Anti- Toxin lost sich an Stelle von Pferdeantitoxin auf solche Patienten anwenden, die gegen Pferdeserum allergisch reagieren. Die Dosierung wird in der gleichten Weise wie fur Pferdeserumantitoxin bestimmt, je nach dem Zustand des Patienten.Example 6 Tetanus antitoxin is produced according to the method according to the example 1 manufactured. The molecular weight of the neurotoxin produced by the tetanus pathogen Tetanus toxin is about 145,000 and is therefore suitable for generating good antibody yields in chicken eggs. Titers up to 10 -5 mld / ml (minimum lethal dose) were 6 mg IgY / ml obtained. For injection purposes this corresponds to the conventional prices antisera generated with pivot. The IgY obtained from egg yolk according to Example 1 is brought into injectable form as follows: PEG traces in IgY concentrate are removed by precipitation with 40% alcohol at 0 to 40C. The IgY rainfall is centrifuged off and freed from alcohol by freeze-drying. The received Powder is dissolved in the minimum amount of saline; The injectable thus obtained anti- Toxin dissolves in place of equine antitoxin on such Use in patients who are allergic to horse serum. The dosage will in the same manner as intended for horse serum antitoxin, depending on the condition of the patient.

Beispiel 7 Schlangengegengift (Kobra, NaJa Nivea). Das Gift dieser Kobra besteht aus mindestens 20, Bestandteilen, deren Molekulargewichte durchweg erheblich unterhalb 30 000, insbesondere im Bereich von 3 000 bis unterhalb 30 000 liegen. Deshalb sind diese Moleküle als Antigen zur Hühner schlecht geeignet. Durch Vernetzung der Giitstoffe mit Glutaraldehyd bilden sich über Kovalente Bindungen grösserer Aggregate. Wenn diese in Hühner eingespritzt werden, ergibt sich eine entsprechend grössere Antigenität. Die Vernetzung der Giftstoffmolektlle findet wahllos statt, und die verschiedenen Komponenten uind als antigene Gruppen auf den Oberflächen der vernetzten Aggregate vertreten. Kobragift eignet sich besonders fur diese Vernetzung, da die Bestandteile durchweg stark basisch sind, und leicht und schnell mit Glutaraldehyd in folgender Weise reagieren: Zwischen 1 und 10 mg des getrockneten Giftes werden in 1 ml 0,1 M Natriumchloridlösung gelöst und mit Glutaraldehyd bis zu einer Endkonzentration von 0,6% versetzt.Example 7 Snake Antidote (Kobra, NaJa Nivea). The poison of this Cobra is made up of at least 20, constituents whose molecular weights consistently considerably below 30,000, in particular in the range from 3,000 to below 30,000 lie. Therefore, these molecules are poorly suited as antigens for chickens. By Crosslinking of the lubricants with glutaraldehyde is formed via covalent bonds larger aggregates. When these are injected into chickens, one results correspondingly greater antigenicity. The networking of the toxin molecules takes place instead of indiscriminately, and the various components are shown as antigenic groups on the Surfaces of the networked aggregates represented. Cobra poison is particularly suitable for this crosslinking, since the components are consistently strongly basic and light and react quickly with glutaraldehyde in the following ways: Between 1 and 10 mg of the dried poison are dissolved in 1 ml of 0.1 M sodium chloride solution and mixed with Glutaraldehyde was added up to a final concentration of 0.6%.

Uberschüssiges Glutaraldehyd wird mit herkömmlichen Zcllophandialyseschläuchen abdialysiert. Der Niederschlag wird fUr Immunisationszwecke aufbewahrt. Die Im:nuntaierung und Gewinnung der Antikörper geschieht gemäss Beispiel 1.Excess glutaraldehyde is used with conventional Cyclophane dialysis tubing dialysed. The precipitate is kept for immunization purposes. The Im: nuntaierung and the antibodies are obtained according to Example 1.

Dabei Isst sich folgendes feststellen: Durch die Vernetzung wird die Gesamtausbeute an Antikörpern verbessert.Thereby the following can be determined: Through the networking, the Overall antibody yield improved.

Jedoch ist die antitoxische Wirkung gegen einige der 20 oder mehr Giftstoffe noch nicht ausreichend. Das Präparat wird dann mit selektiven Gegengiften gegen diese besonderen Giftkomponentenangereichert. Es ist auch möglich, das Schlangengift zunächst in bekannter Weise, (z.B. durch PEG Fällung, Exklusionschromatografie) vorzufraktionieren und Gegengifte gegen die einzelnen Fraktionen getrennt herzustellen, wobei die Methoden fUr die einzelnen Fraktionen individuell optimiert werden. Danach werden die einzelnen Gegengifte in einem Verhältnis kombiniert, welches die gewünschte Wirksamkeit gegen die gesamte Palette der Giftkomponenten ergibt.However, the antitoxic effect is against some of the 20 or more Toxins still insufficient. The preparation is then used with selective antidotes enriched against these special poison components. It is also possible to use the snake venom initially in a known manner (e.g. by PEG precipitation, exclusion chromatography) pre-fractionate and prepare antidotes against the individual fractions separately, the methods for the individual fractions being optimized individually. Thereafter the individual antidotes are combined in a ratio that corresponds to the desired Effectiveness against the entire range of poison components results.

Beispiel 8 Schlangengegengift - Puffott,r Puffottergift hat eine weniger vielfältige Zusammensetzung als Kobragift (Beispiel 7). Die Komponenten haben ferner ein höheres Molekulargewicht. Nach der in Beispiel 7 beschriebenen Vernetzung werden die so vernetzten Antigene zur Herstellung des Gegengiftpräparates gemäss Beispiel 1 verwendet.Example 8 Snake Antidote - Puffott, r puffadder venom has one less diverse composition as cobra poison (Example 7). The components also have a higher molecular weight. After the crosslinking described in Example 7 are the antigens crosslinked in this way for the production of the antidote preparation according to the example 1 used.

Beispiel 9 Krebsdiagnose Embryonische Antikrebsantigene von menschlichen Verdauungskanaltumoren werden gemäss Beispiel 7 vernetst.Example 9 Cancer Diagnosis Human Embryonic Anticancer Antigens Digestive canal tumors are crosslinked according to Example 7.

Die vernetzten Aggregate werden als Antigen ftir die Gewinnung von IgY Antikörpern fur Diagnosezwecke gemäss Beispiel 1 verwendet. Dabei wird im vorliegenden Falle ein Karbodiimidvernetzungsmittel (Konzentration 0,1%) zur Vernetzung der Karboxylgruppen des Antigens verwendet.The cross-linked aggregates are used as an antigen for the production of IgY antibodies according to Example 1 used for diagnostic purposes. In the present Trap a carbodiimide crosslinking agent (concentration 0.1%) to crosslink the carboxyl groups of the antigen used.

Die gleiche Methode wird auf α1 foetales Protein aus Leberkrebs (Häpatoma) zur Gewinnung von IgY Antikörpern fur Diagnosezwecke gemäss Beispiel 1 angewandt. Auch diese Antigene haben ein zu geringes Molekular£"ewicht fur eine ausreichende immunologische Reaktion der Herine und müssen deshalb vernetzt werden.The same method is used on α1 fetal protein from liver cancer (Häpatoma) for the production of IgY antibodies for diagnostic purposes according to the example 1 applied. These antigens are also too low in molecular weight for one sufficient immunological reaction of the Herine and must therefore be networked.

Beispiel 10 Serameba Antigenantikörper Serameba Antigen ist ein Gemisch von mindestens 19 Antigenen und dient zur Diagnose von Amöbenruhr Das Molekulargewicht dieser Antigene ist sehr gering.Example 10 Serameba Antigen Antibodies Serameba Antigen is a mixture of at least 19 antigens and is used to diagnose amoebic dysentery The molecular weight this antigens is very low.

Deshalb wird die Vernetzungsmethode gemäss Beispiel 7 vor der Immunisierung der Hennen gemäss Beispiel 1 und der Gewinnung der Antikörper angewandt.Therefore, the crosslinking method according to Example 7 is used before the immunization of the hens according to Example 1 and the production of the antibodies.

Beispiel 11 Haemocyanin Haemocyanin-Antigene aus Burnupena Cincta haben ein Molekulargewicht von 8 x 106 und eignen sich somit unmittelbar fUr die Immunisierung der Hennen gemäß Beispiel 1.Example 11 Hemocyanin Hemocyanin antigens Burnupena Cincta have a molecular weight of 8 x 106 and are therefore immediately suitable for the immunization of the hens according to Example 1.

Das gleiche gilt fur Haemocyanin-Antigene aus Jasus Lalandii mit Molekulargewicht 5 x 105.The same applies to hemocyanin antigens from Jasus Lalandii with molecular weight 5 x 105.

Beispiel 12 Aus dem Immun IgY können auch einzelne Antikörper in herkömmlicher Weise durch Affinitätschromatografie bzw. Absorption und Elution aus Immunoniederschlägen nach den Verfahren von G. Hardy und M.H.V. van Regenmortel, t. Immunological Methods, Band 15, 1977, Seite 305-314) gewonnen werden. Spezifische IgY Antikörper gegen menschliches IgG wurden durch Affinitätschromatographie hergestellt. Die Ausbeute an spezifischem IgG war 8%.Example 12 Individual antibodies can also be obtained from the immune IgY in conventional Way by affinity chromatography or absorption and elution from immuno precipitates according to the procedures of G. Hardy and M.H.V. van Regenmortel, t. Immunological Methods, Volume 15, 1977, pages 305-314). Specific IgY antibodies against human IgG were prepared by affinity chromatography. The yield the specific IgG was 8%.

Beispiel 13 Immunospezifische IgY Antikörper wurden durch Dissoziation des Komplexes von IgY und Tabakmosaikvirus(TMV) bei pH 2,9 in 0,005 M Glycin HC1 und anschliessende Zentrifugierung zur Entfernung des TMV hergestellt. Die Ausbeute an isoliertem spezifischen IgY betrug 18% der gesamten IgY Proteinmenge.Example 13 Immunospecific IgY antibodies were produced by dissociation of the complex of IgY and tobacco mosaic virus (TMV) at pH 2.9 in 0.005 M glycine HC1 followed by centrifugation to remove the TMV. The yield of isolated specific IgY was 18% of the total IgY protein amount.

Beispiel 14 Escherischia colli-Erkrankungen (Durchfall) sind für 90% dor Sterblichkeit neugeborener Kälber in manchen Molkereien vcrantwortlich.Example 14 Escherischia colli diseases (diarrhea) are 90% Responsible for the mortality of newborn calves in some dairies.

Die Immunisierung von Hennen gegen die einzelnen Typen dieses Erregers (E.colli) eribt den ausgezeichneten Agglutinationstiter von 1/4000 im Antikörperpräparat.The immunization of hens against the individual types of this pathogen (E. colli) yields the excellent agglutination titer of 1/4000 in the antibody preparation.

Für einen vollständigen Schutz ist es notwendig, gelten sämtliche Erregervarianten zu immunisieren. Hierzu werden entweder die einzelnen Hennen je gegen einen der Erregertypen immunisiert, wonach die erhaltenen monovalenten Immunpräparate im gewunschten Verhälnis zu einem polyvalenten Immunpräparat zusammengestellt werden.For full protection it is necessary that all of them apply To immunize pathogen variants. Either the individual hens are used for this purpose immunized against one of the pathogen types, after which the monovalent immune preparations obtained be put together in the desired ratio to form a polyvalent immune preparation.

Es ist aber auch mUglich, sämtliche Hennen mit einem Gemisch der einzelnen Erreger zu immunisieren.But it is also possible to give all hens a mixture of each Immunize pathogens.

Während der ersten vier Stunden nach der Geburt des Kalber ist das Immunpräparat als Schluckimpfstoff verwedbar. Nach zwölf Stunden wird der Verdauungstrakt fUr die Antikörper undurchlässig. Die Impfung findet dann intravenös statt.During the first four hours after the calf is born, that is Immune preparation can be used as an oral vaccine. After twelve hours the digestive tract becomes impermeable to the antibodies. The vaccination then takes place intravenously.

scissiel 15 Verwendung von Träger-Molekülen Als Trager-Molekül wird ilaemocyanin von Krebsen (Jasus lalandii) verwendet. In 1 ml 0.1 M-Phosphat Puffer (ph 6,8) werden 5 mg Haemocyanin und 12 mg Cobra-Gift gelöst. Zu dieser Lösung werden mit leichtem Rühren 0,05 ml einer einprozentigen wässrigen Lösung von Glutaraldehyd tropfenweise zugegeben. Das Reaktionsgemïsch wird 2 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen und dann zweimal gegen 5 Liter gepufferte physiologische Kochsalzlösung (pH ca. 7,0) bei 40C eine Nacht lang dialysiert. Es bildet sich auch ein geringer NiederschlacJ, der nicht abgetrennt wird. Es wird viclmehr die ganze Lösung und Suspension für die Immunisierung von Hennen verwendet.scissiel 15 Use of carrier molecules As a carrier molecule, ilaemocyanin used by crayfish (Jasus lalandii). In 1 ml 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8) 5 mg of hemocyanin and 12 mg of cobra poison are dissolved. Become this solution with gentle stirring 0.05 ml of a one percent aqueous solution of glutaraldehyde added dropwise. The reaction mixture is 2 hours at room temperature left to stand and then twice against 5 liters of buffered physiological saline solution (pH about 7.0) dialyzed at 40C for one night. A minor one also forms Lower layer that is not separated. It becomes rather the whole solution and Suspension used for immunization of hens.

Die Hennen werden wie in Beispiel 1 immunisiert. Diesmal werden jedoch nicht ganze 1 ml des Impfstoffes gleichzeitig eingespritzt, sondern zunächst nur 0,3 ml an drei aufeinander folgenden Tagen, und diese Prozedur wird 6 Wochen lang in wöchentlichen Zwischenräumen wiederholt. Vor jeder Einspritzung der Vakzine wird die Henne jeweils mit 0,1 ml einer Standard Adrenalin 15 Lösung vorgespritzt.The hens are immunized as in Example 1. This time, however, will not a whole 1 ml of the vaccine injected at the same time, but initially only 0.3 ml for three consecutive days, and this procedure lasts for 6 weeks repeated at weekly intervals. Before each injection of the vaccine the hen is pre-injected with 0.1 ml of a standard adrenaline 15 solution.

Ansonsten findet die Sammlung der Eier und Abtrennung und Reinigung der Antikörper wie in Beispiel 1 statt.Otherwise, the collection of eggs and separation and cleaning takes place the antibody as in Example 1 instead.

In genau gleicher Weise werden Antikörper Präparate gegen Puffotter-Cift und gegen andere Antigene mit geringen Molekulargewichten bereitet.Antibodies against puff adder cift are made in exactly the same way and prepared against other low molecular weight antigens.

Zum Abschluss seien noch einige Vorteile des Eldotterantikörpersystems gegenüber herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Antiseren aus Säugetieren genannt: 1. Die Bildung der Antikörper in der Henne und die Ubertragung auf die Eidotter erreicht ein hohe und auf Dauer konstantes Niveau.Finally, there are some advantages of the Eldotter antibody system versus conventional methods of preparing antisera from mammals called: 1. The formation of antibodies in the hen and the transfer to the Egg yolks reach a high level that is constant over time.

Die wirtschaftlich6 Legedauer einer henne beträgt etwa zwei Jahre. Bereits in einem Jahr entspricht die erreichbare Ausbeute an Immunoglobulin(Ir;y) fast dem zehnfachen Wert der im Laufe eines Jahres aus dem Serum eines Kaninchen (IgG) gewonnen werden kann. The economic6 laying time for a hen is around two years. In just one year, the achievable yield of immunoglobulin (Ir; y) almost ten times that of a rabbit serum over the course of a year (IgG) can be obtained.

2. Die Blutung und regelmässige Nachimpfung, die mit herkömmlichen Laborsäugetieren erforderlich ist, entfällt. Die anschliessende Sammlung der Eier für die Äntikörpergewinnung ist unaufwendig und das immunisierte Tier wird nicht gefährdet.2. The bleeding and regular vaccination associated with conventional Laboratory mammals is not required. The subsequent collection of the eggs for the antibody production is inexpensive and the immunized animal will not endangered.

3. Die Antikörper sind vom 7 S Typ und enthalten kein IgM. Infolge der Isolationsmethode mit Polyäthylen glykol liegen die Antikörper als molekulare Einzelkomponente vor. Dies wurde durch analytische Ultrazentrifugierung nachgewiesen. Hühnerantikörper eignen sich somit unter Umständen besonders fur die quantitative Bestimmung mittels der Radikal-Immuno-Diffusionsmethode. Es ist bekannt, dass Gemisch von IgM und IgG in diesem Verfahren fehlerhafte Werte ergeben. Es hat sich gezeigt, dass die fttr diagnostische Zwecke sehr störende Makroglobuline (Molekulbargewicht 900 000) zwar im Serum der henne vorliegen, jedoch nicht auf das Ei ubertrarren werden.3. The antibodies are of the 7 S type and do not contain IgM. As a result The isolation method with polyethylene glycol means that the antibodies are molecular Single component before. This was demonstrated by analytical ultracentrifugation. Chicken antibodies are therefore particularly suitable for quantitative Determination using the radical immuno-diffusion method. It is known that mixture of IgM and IgG give erroneous values in this procedure. It has shown, that the fttr Macroglobulins are very troublesome for diagnostic purposes (Molecular weight 900,000) are present in the hen serum, but not on the egg will drown out.

4. Da die IgY Antikörper in der endgültigen Reinigungsstufe als halbfestes Pellet anfallen, kann man sie in einem praktisch beliebig kleinen Volumen lösen und somit entsprechend beliebige Aktivitäten erzeugen.4. As the IgY antibodies are in the final purification stage as semi-solid Accumulate pellet, they can be dissolved in practically any small volume and thus generate any activities.

5. Die elektrophoretische Homogenität des IgY im Vergleich zur äusserst starken Heterogeneität von SEugetier-IgG fuhrt zur Vereinfachung immunochemischer Untersuchungen mit gereinigten Antikörpern.5. The electrophoretic homogeneity of IgY compared to the extremely strong heterogeneity of SEalian IgG leads to simplification of immunochemical Investigations with purified antibodies.

6. Huhner sind weniger krankheitsanfällig als die herkömmlichen Labortiere und sind wirtschaftlicher in der Haltung.6. Chickens are less prone to disease than conventional laboratory animals and are more economical in keeping.

7. Für die Gewinnung der Eidotterimmunoglobuline (IgY) können Eier von Huhnern verwendet werden, die auf normalen eierproduzierenden Hühnergrossfarmen gehalten werden, wo ohnehin hinsichtlich Hygiene, Fütterung und Produktivität optimale Bedingungen herrschen.7. Eggs can be used for the production of egg yolk immunoglobulins (IgY) used by chickens grown on normal large egg-producing chicken farms are kept where they are already optimal in terms of hygiene, feeding and productivity Conditions prevail.

Die Immunisierung wirkt sich in kcinstcr Weise nachteilig auf die Genicssbarkeit der Eier aus. Eier, die nicjht für die Herstellung von Immunprepäraten benötigt werden oder vorUbergehend den Bedarf überschreiten, können gefahrlos als Nahrungsmittel verkauft werden. Auch dat; im Verfahren abgetrennte Eiweiss eignet sich nach wie vor für die menschliche oder tierische Ernährung. The immunization is extremely detrimental to the population Edibility of the eggs. Eggs that are not used for the production of immune preparations are needed or temporarily exceed the need can be safely used as Food to be sold. Also dat; Protein separated in the process is suitable as before for human or animal nutrition.

8. Besondere Vorteile ergeben sich aus, der Immunisierung der Huhner gegen Schlangengift. Hier ergibt sich der bereits genannte Vorteil fUr gegen Eferdeserum allergische Patienten und aus der Tatsache, dass vergleichsweise weniger Antigen fur die Immunisierung von Hennen als fur Pferde benötigt wird.8. Special benefits arise from immunizing the chickens against snake venom. Here there is the already mentioned advantage for against horse serum allergic patients and from the fact that comparatively less antigen for the immunization of hens than is needed for horses.

Verhältnismässig selten benötigte Gegengifte lassen sich somit in ausreichender Menge mittels verhaltnismässig geringer Schlangengiftmengen herstellen. Relatively rarely required antidotes can thus be found in Produce sufficient quantities using relatively small amounts of snake venom.

9. Die Eier der immunisierten Huhner kdnnen bei 400 mindestens 6 Monate lang aufbewahrt werden und brauchen erst dann verarbeitet zu werden, wenn die Antikörper benötigt werden. Die Eidotter selbst lassen sich in homogenisierter Form und stabilisiert mit Natriumazid bei -20°C sogar praktisch unbegrenzt halten.9. The eggs of the immunized chickens can be kept for at least 6 months at 400 are stored for a long time and do not need to be processed until the antibodies are needed. The egg yolks themselves can be homogenized and stabilized with sodium azide hold practically indefinitely at -20 ° C.

10. IgY Antigene gegen verschiedenste GeflUgelkrankheiten können natürlich ebenfalls aus den Eidottern immunisierter Hennen gewonnen und prophylaktisch auf jung geschlüpfte oder ältere Küken gegen Krankheiten angewandt werden, gegen die die Mutterhennen noch nicht immun waren. Dadurch werden die Küken passiv immunisiert, bis sie aktiv immunisiert werden können.10. IgY antigens against various poultry diseases can of course also obtained from the egg yolks of immunized hens and used prophylactically young hatched or older chicks are used against diseases, against the the mother hens were not yet immune. This will passively immunize the chicks, until they can be actively immunized.

Besonders erwähnenswert ist in diesem Zusammenhang die Immunisierung gegen Newcastle Krankheit und gegen Geflügelpest. Immunization is particularly worth mentioning in this context against Newcastle disease and against avian influenza.

IgY Antigene lassen sich erfindungsgernäss auch fur die passive Immunisierung von Menschen und Säugetieren herstellen, beispielsweise für die Immunisierung von neugeborenen Kälbern gegen E.colli. According to the invention, IgY antigens can also be used for passive immunization of humans and mammals, for example for the immunization of newborn calves against E. colli.

Claims

Claims 1. A method for producing immunologically reactive Preparations in which antibodies, in particular gammaglobulins, are produced by selective precipitation enriched or purified from their aqueous solution and being used as a precipitant linear long-chain water-soluble uncharged polymer compounds for the antibodies, in particular polyalkylene glycols or dextran are used, characterized in that that first a hen against the antigen corresponding to the desired antibodies is inaunized, the eggs laid by the immunized hen collected, the fatty ones Substances separated from the yolks of the eggs and those contained in the egg yolks Antibodies are mixed with the precipitating agent in aqueous suspension, whereby the dispersibility of the antibodies is suppressed, whereupon they appear as a precipitate present antibodies are separated from the liquid phase.

2. The method according to claim 1, characterized in that in an known way as falling agent Poly ': ethylene glycol, polypropylene glycol, 1,4-Dihydroxybutane glycol or mixed or block polymer of ethylene glycol with one or more of its higher homologues is used, the molecular weight the precipitant is in the range of 2,000 to 30,000.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the separation of the antibodies from the egg yolks takes place in two stages, whereby due to comparatively less severe precipitation conditions during one of the stages adjusted to the concentration of the precipitant added to the egg yolk and thereby relatively easily precipitable impurities selectively and without filling the antibodies are separated, and in a further stage comparatively stronger precipitation conditions due to the concentration of the precipitant added to the egg yolk in the aqueous Suspension for selective precipitation of the antibodies has been set.

4. The method according to claim 3, characterized in that for precipitation of the easily foldable impurities a concentration of more than 3% and less than 4% based on the weight of PEG 6 000 and volume of the aqueous egg yolk suspension correspond.

5. The method according to claim 4, characterized in that die'Eidotter be diluted with between 1 and 10 parts by volume of water.

6. The method according to claim 5 or 6, characterized in that the water is buffered to a PII between 6 and 8.

7. The method according to any one of claims 3 to 6, characterized in that that the comparatively stronger precipitation conditions of a PEG 6000 concentration of more than 11% and less than 14% weight per volume of the aqueous egg yolk suspension correspond.

8. The method according to any one of claims 3 to 7, characterized in that that the egg yolks are buffered with between 1½ and 5 parts by volume of water pH between 6.5 and 7.8, and the thus diluted suspension first is mixed with precipitant in such a concentration that the precipitation conditions a concentration of between 3.3 and 3.7% PEG 6000, weight per volume of the aqueous suspension, after which the Fallungsmittcl in the second precipitation stage Is brought to a concentration that in terms of the precipitation conditions a PEG 6,000 concentration of between 11.5 and 12.5 based on weight per volume corresponds to the aqueous egg yolk suspension.

9. The method ACCORDING to one of claims 1 to 8, characterized in that that for the separation of the fatty substances the diluted in aqueous suspension Egg yolk material is first mixed with that amount of precipitant, which is needed to corrugate the casein-like proteins it contains, whereupon the separated liquid phase, on the surface of which the greasy layer floats, is filtered through an absorbent filter bed, with the fatty layer retained will.

10. The method ACCORDING to one of claims 1 to 9, characterized in that that the hen is immunized in stages over a longer period of time is carried out until the antibody level in the hen’s serum reaches a plateau has, and that the collection of eggs for antibody production takes several Months.

11. The method ACCORDING to one of claims 1 to 10, characterized in that that the immunization with the antigen is carried out in an aggregated form.

12. The method according to claim 11, characterized in that the Antigen is brought into the aggregated form by crosslinking reaction.

13. The method according to claim 12, characterized in that (fc "enn '/ irb?) <'. T that the crosslinking is brought about by reaction with glutaramdehyde.

14. The method according to any one of claims 1 to 13, characterized in that that the antigen is applied to a high molecular weight carrier molecule prior to immunization will.

15. The method according to claim 14, characterized in that as Carrier molecule a hemocyanin molecule is used.

16. The method according to any one of claims 11 to 1 ', characterized in that that an animal attack poison is used as the antigen.

17. The method according to any one of claims 1 to 15, characterized in that that an antigen is used which accompanies a cancerous The clinical picture arises.

18. The method according to any one of claims 1 to 17, applied to the immunological diagnostics, characterized in that an antigen is used, which is related to the pathological condition to be diagnosed, and that the enriched resp.

Purified antibody is applied to a pathological sample and the precipitin reaction between the antibodies and the antigens of the sample is observed will.

19. The method according to claim 18, characterized in that the Reaction and observation is carried out according to the Ouchterlony procedure.

20. The method according to claim 19, characterized in that the Precipitin reaction is carried out at a significant NaCl concentration.

21. The method ACCORDING to one of claims 1 to?, Characterized in that that the eggs before the further processing and extraction of the antibodies but one Time collected up to about 6 to 12 months and now stored at 40C will.

22. The method according to any one of claims 1 to 2 '., Characterized in that that the egg yolks are separated and homobenized and after adding a preservative can be stored at around -20 ° C until further processing.

23. The method according to claim 22, characterized in that as Preservative sodium azide in a compatible concentration on the order of magnitude; 0.1 g / l is used.

24. Diagnostic preparation produced according to the method according to one of claims 1 to 23.

25.Preparation for use as an antidote against animal attack poisons, characterized by: eo effective as an antidote, obtained from bird eggs.

Contains antibodies.

26. A preparation according to claim 25, characterized in that the Antibodies through an immunogenic reaction against a high molecular weight aggregate of antigens of a snake venom are formed.

27. The preparation according to claim 25, characterized in that the Antibodies through an immunogenic reaction against a high molecular weight compound of antigens and a carrier molecule are formed.

28. Antibodies obtained from egg yolks in purified injectable form.

29. Egg yolk-derived vaccine, especially oral vaccine or intravenous vaccine against R. colli.