DE2858322C2

DE2858322C2 -

Info

Publication number: DE2858322C2
Application number: DE2858322A
Authority: DE
Inventors: Prithipal Sunnyvale Calif. Us Singh; Mae Wan-Leng Los Altos Hills Calif. Us Hu
Original assignee: Syva Co
Current assignee: Syva Co
Priority date: 1977-04-15
Filing date: 1978-02-13
Publication date: 1990-08-09
Anticipated expiration: 1998-02-14
Also published as: JPH0413360B2; JPS53130692A; IT1104619B; AU514358B2; DE2805961A1; JPH0240984B2; DE2805961C2; JPH01112156A; AU3442078A; IT7848508A0; US4156081A

Description

Theophyllin (1,3-Dimethylxanthin) ist ein Arzneimittel, das üblicherweise für die Behandlung von Asthma, Hypertension (Bluthochdruck) und des Nierenödems verwendet wird. Bei erhöhten Plasmagehalten führt Theophyllin manchmal zu Übelkeit (Erbrechen) und bei hohen Plasmakonzentrationen innerhalb des Bereiches von etwa 25 bis etwa 70 µg/ml können schwerwiegende toxische Wirkungen auftreten. Serum-Theophyllin zeigt beträchtliche individuelle Schwankungen bei Patienten aufgrund der großen Differenzen in bezug auf den Grad des Stoffwechsels und der Sekretion sowie Schwankungen während der Dosierungsintervalle in bezug auf die Geschwindigkeit bzw. Rate der Absorption und Verteilung. Bei Kindern sind die Probleme noch ausgeprägter wegen der niedrigen Körperflüssigkeitsmenge der Kinder.Theophylline (1,3-dimethylxanthine) is a medicine that usually for the treatment of asthma, hypertension (High blood pressure) and kidney edema. With increased Theophylline sometimes causes nausea in plasma (Vomiting) and at high plasma concentrations within the A range of about 25 to about 70 µg / ml can be serious toxic effects occur. Serum theophylline shows considerable individual fluctuations in patients due to big differences in the level of metabolism and secretion and fluctuations during dosing intervals with respect to the rate or rate of absorption and distribution. The problems are more pronounced in children because of the low amount of body fluids in children.

Im Hinblick auf die schwerwiegenden Nebenwirkungen, die eine Folge von erhöhten Serum-Theophyllin-Gehalten sind, ist es wichtig, daß empfindliche Verfahren zur Überwachung der Theophyllin-Gehalte geschaffen werden. Das Verfahren sollte schnell, genau und in der Lage sein, Theophyllin leicht von seinen normalen Metaboliten und weit verbreiteten Analogen, wie Xanthin und Caffein, zu unterscheiden.With regard to the serious side effects that result of elevated serum theophylline levels, it is important that sensitive methods for monitoring theophylline levels be created. The process should be quick, accurate, and be able to easily remove theophylline from its normal metabolites and widely used analogues such as xanthine and caffeine, to distinguish.

In den US-Patentschriften 36 90 834, 38 17 837, 38 50 752 und 37 66 162 und in den darin genannten Literaturstellen sind eine Reihe von verschiedenen immunbiologischen Nachweisverfahren (Immunoassays) beschrieben. In der US-Patentschrift 38 17 837 ist ein homogener Enzym-Immunoassay beschrieben. Die Synthese von Xanthinderivaten ist in "Advances in Heterocyclic Chemists", 1966, Band VI, Lister et al, "Rev. Pure & Applied Chem." (Australien), sowie auch in den US-Patentschriften 25 17 410 und 26 73 848 und vom Holmes und Leonard in "J. Org. Chem.", 41, 568 (1976), und Cavalieri et al in "J. Am. Chem. Soc.", 76, 1119 (1954), beschrieben. Rasmussen und Leonard beschreiben in "J. Am. Chem. Soc.", 89, 5439 (1967), die Verwendung der Pivaloyloxymethylgruppe als Schutzgruppe.In U.S. Patents 36 90 834, 38 17 837, 38 50 752 and 37 66 162 and in the references cited therein are one Range of different immunobiological detection methods (Immunoassays). In US Patent 38 17 837 is a homogeneous enzyme immunoassay. The synthesis of Xanthine derivatives is in "Advances in Heterocyclic Chemists", 1966, Volume VI, Lister et al, "Rev. Pure & Applied Chem." (Australia), as well as in US Pat. Nos. 25 17 410 and 26 73 848 and by Holmes and Leonard in "J. Org. Chem.", 41, 568 (1976), and Cavalieri et al in "J. Am. Chem. Soc.", 76, 1119 (1954). Describe Rasmussen and Leonard in "J. Am. Chem. Soc.", 89, 5439 (1967), the use of the Pivaloyloxymethyl group as a protecting group.

Theophyllinderivate werden an Antigene und Enzyme konjugiert. Die Antigen-Theophyllin-Konjugate werden für die Herstellung von Antikörpern für den spezifischen Nachweis von Theophyllin verwendet. Die Enzymkonjugate werden in Konkurrenz-Protein-Bindungstests für die Bestimmung von Theophyllin, insbesondere im Serum, verwendet.Theophyllin derivatives are conjugated to antigens and enzymes. The antigen-theophylline conjugates are used for the manufacture of antibodies for the specific detection of theophylline used. The enzyme conjugates are used in competitive protein binding assays for the determination of theophylline, in particular in the serum.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind 1-methyl-3-substituierte Xanthine, gekennzeichnet durch die allgemeine FormelThe present invention relates to 1-methyl-3-substituted Xanthine, characterized by the general formula

worin R¹ eine C_1-6-Alkylengruppe und Z eine Carboxylgruppe oder eine Cyanogruppe bedeutet.wherein R¹ represents a C _1-6 alkylene group and Z represents a carboxyl group or a cyano group.

Die erfindungsgemäßen Xanthine können an eine Polyaminosäure, vorzugsweise an eine solche mit einem Molekulargewicht von mindestens 5000, gebunden werden, wie es in der DE-PS 28 05 961 (Stammpatent zu dem vorliegenden Patent) im einzelnen beschrieben ist. Bevorzugte Polyaminosäuren sind Antigene mit einem Molekulargewicht von 10 000 bis 600 000, Enzyme mit einem Molekulargewicht von 10 000 bis 300 000.The xanthines according to the invention can be attached to a polyamino acid, preferably one with a molecular weight of at least 5000, are bound, as described in DE-PS 28 05 961 (Master patent for the present patent) described in detail is. Preferred polyamino acids are antigens with a Molecular weight from 10,000 to 600,000, enzymes with a Molecular weight from 10,000 to 300,000.

Die an eine Polyaminosäure gebundene Theophylinderivate können zur Herstellung von Antikörpern, insbesondere zur Bestimmung von Theophyllin, vorzugsweise in Form eines Testsets, verwendet werden, wie es ebenfalls in der DE-PS 28 05 961 beschrieben ist.The theophore derivatives bound to a polyamino acid can for the production of antibodies, in particular for the determination of Theophylline, preferably in the form of a test set, is used be, as is also described in DE-PS 28 05 961.

Ein bevorzugtes 1-methyl-3-substituiertes Xanthin ist das 1- methyl-3-(3′-carboxypropyl)-Xanthin, das durch die FormelA preferred 1-methyl-3-substituted xanthine is 1- methyl-3- (3'-carboxypropyl) xanthine by the formula

gekennzeichnet ist.is marked.

Ferner betrifft die Erfindung ein neues und einfaches Verfahren zur Herstellung von 1-methyl-3-substituierten Xanthinen der vorstehend angegebenen allgemeinen Formel, die frei von anderen Isomeren sind. Hierbei hat R¹ die vorstehend angegebene Bedeutung, und Z bedeutet eine Carboxylgruppe. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise 1- Methylxanthin mit Halogenmethylpivalat kondensiert, das erhaltene 1-Methyl-7-pivaloyloxymethylxanthin unter milden basischen Bedingungen mit einem aliphatischen Halogencarbonsäureester, worin der Säureanteil 2 bis 7 Kohlenstoffatome, der Alkoholanteil 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist und das Halogen ein Chlor-, Brom- oder Jodatom ist, in Kontakt bringt und die Pivaloyloxymethylgruppe und die Carboalkoxygruppe des erhaltenen 1-Methyl-3-carboalkoxy-alkyl-7-pivaloyloxymethylxanthins unter basischen Bedingungen hydrolysiert.The invention further relates to a new and simple method for the production of 1-methyl-3-substituted xanthines general formula given above, free of others Are isomers. Here R¹ has the meaning given above, and Z represents a carboxyl group. The procedure is characterized in that 1- in a manner known per se Condensed methylxanthine with halomethyl pivalate, the obtained 1-methyl-7-pivaloyloxymethylxanthine under mild basic Conditions with an aliphatic halocarboxylic acid ester, wherein the acid portion has 2 to 7 carbon atoms, the alcohol portion Has 1 to 6 carbon atoms and the halogen Is chlorine, bromine or iodine atom, brings in contact and the Pivaloyloxymethyl group and the carboalkoxy group of the obtained 1-methyl-3-carboalkoxy-alkyl-7-pivaloyloxymethylxanthins under hydrolyzed basic conditions.

Das 1-Methylxanthin wird mit einer etwa stöchiometrischen Menge Halogenmethylpivalat kondensiert, wobei im allgemeinen ein polares, wasserfreies, nicht hydroxylhaltiges organisches Medium, wie DMF, THF, DMSO, HMP od. dgl. verwendet wird. Es werden Temperaturen von 0 bis 50°C angewendet, wobei zweckmäßig bei Umgebungstemperatur gearbeitet wird. Bei der Base kann es sich um das Stickstoffsalz, Natriumcarbonat, tert.-Amin u. dgl. handeln. Man läßt die Reaktion bis zur Vollständigkeit ablaufen und trennt das monosubstituierte Pivaloyloxymethylderivat von eventuell vorhandenen geringeren Mengen an disubstituiertem Material ab.The 1-methylxanthine comes with an approximately stoichiometric amount Halogenmethylpivalat condensed, generally a polar, anhydrous, non-hydroxyl organic Medium such as DMF, THF, DMSO, HMP or the like is used. It temperatures of 0 to 50 ° C are used, where appropriate working at ambient temperature. With the base it can the nitrogen salt, sodium carbonate, tert-amine u. the like act. The reaction is allowed to proceed to completion and separates the monosubstituted pivaloyloxymethyl derivative from possibly smaller amounts of disubstituted Material.

Das 7-substituierte Produkt wird isoliert und mit dem aliphatischen Halogencarbonsäureester (vorzugsweise dem Jodcarbonsäureester) in Kontakt gebracht. Als basisches Medium wird vorzugsweise ein wasserfreies, nicht-hydroxyhaltiges polares Medium, wie es vorstehend angegeben ist, verwendet, wobei analoge Reaktionsbedingungen angewendet werden. Nach der Isolierung des Produkts werden die Estergruppen unter konventionellen Bedingungen hydrolysiert. Bei einer Temperatur von etwa 75 bis etwa 100°C kann eine wäßrige Base verwendet werden. Nach dem Ansäuern der Lösung kann das gewünschte 1-Methyl-3-carboxyalkylxanthin isoliert werden.The 7-substituted product is isolated and with the aliphatic Halogen carboxylic acid ester (preferably the iodocarboxylic acid ester) brought into contact. As the basic medium is preferred an anhydrous, non-hydroxy polar medium, as indicated above, using analogous reaction conditions be applied. After isolating the The product will be the ester groups under conventional conditions hydrolyzed. At a temperature of about 75 to about 100 ° C an aqueous base can be used. After this The desired 1-methyl-3-carboxyalkylxanthine can be acidified be isolated.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, in denen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beschrieben sind, näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Alle darin angegebenen Prozentsätze beziehen sich, wenn nichts anderes angegeben ist, auf das Gewicht mit Ausnahme der Flüssigkeitsgemische, die sich auf das Volumen beziehen. Alle Temperaturen sind, wenn nichts anderes angegeben ist, in °C angegeben. Die verwendeten Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen: DMF = N,N-Dimethylformamid, TLC = Dünnschichtchromatographie, ECDI = 1-Äthyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid, THF = Tetrahydrofuran.The invention is illustrated by the following examples, in which preferred embodiments of the invention are described, explained in more detail without being limited thereto. All percentages given refer to if nothing other is stated on weight other than Liquid mixtures that refer to the volume. All Unless otherwise stated, temperatures are in ° C specified. The abbreviations used have the following Meanings: DMF = N, N-dimethylformamide, TLC = thin layer chromatography, ECDI = 1-ethyl-3- (dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, THF = tetrahydrofuran.

Example 1 Preparation of 1-methyl-7-pivaloyloxymethylxanthine

Zu einer Mischung aus 844 mg (5,08 mMol) 1-Methylxanthin und 538 mg (5,08 mMol) Natriumcarbonat in 20 ml trockenem DMF wurde unter Stickstoff über einen Zeitraum von 1 Stunde langsam eine Lösung von 828 µl (5,59 mMol) Chlormethylpivalat in 6 ml DMF bei Raumtemperatur zugegeben und die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt. Die Mischung wurde filtriert, das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft und der Rückstand wurde mit 50 ml 10vol.-%igem ÄtOH/CHCl₃ behandelt. Die dabei erhaltenen Feststoffe bestanden aus dem Ausgangsmaterial und die organische Phase wurde an Silicagel-Platten chromatographiert (10 Vol.-% ÄtOH/CHCl₃). Beim Eluieren mit 125 ml 10vol-%igem ÄtOH/CHCL₃ erhielt man zwei Produkte und bei dem Streifen R_f = 0,48 handelte es sich um das gewünschte Produkt, das in einer Menge von 365 mg erhalten wurde. Bei dem anderen Streifen handelte es sich um das 3,7-disubstituierte Material.To a mixture of 844 mg (5.08 mmol) of 1-methylxanthine and 538 mg (5.08 mmol) of sodium carbonate in 20 ml of dry DMF, a solution of 828 μl (5.59 mmol ) Chloromethyl pivalate in 6 ml of DMF was added at room temperature and the reaction mixture was stirred overnight. The mixture was filtered, the filtrate was evaporated to dryness and the residue was treated with 50 ml of 10 vol .-% EtOH / CHCl₃. The solids obtained consisted of the starting material and the organic phase was chromatographed on silica gel plates (10 vol .-% EtOH / CHCl₃). Elution with 125 ml of 10 vol% EtOH / CHCL₃ gave two products and the strip R _f = 0.48 was the desired product, which was obtained in an amount of 365 mg. The other strip was the 3,7-disubstituted material.

Example 2 Preparation of 1-methyl-3- (carboethoxypropyl) -7- (pivaloyloxymethyl) xanthine

Eine Mischung aus 350 mg (1,25 mMol) 1-Methyl-7-(pivaloyloxymethyl) xanthin, 265 mg (2,50 mMol) Natriumcarbonat und 384 µl (2,50 mMol) Äthyl-4-jodbutyrat in 5,8 ml trockenem DMF wurde 18 Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Es wurde Wasser zugegeben und die Reaktionsmischung wurde mit Chloroform extrahiert. Nach dem Trocknen wurden die Extrakte gestrippt, wobei ein gelbes Öl zurückblieb, das an vier dicken Silicagel-Platten mit 10% ÄtOH/CHCl₃ chromatographiert wurde. Der Laufstreifen wurde abgekratzt und mit 100 ml 25% ÄtOH/CHCl₃ eluiert, wobei man 609 mg des gewünschten Produkts in Form eines Öls erhielt.A mixture of 350 mg (1.25 mmol) of 1-methyl-7- (pivaloyloxymethyl) xanthine, 265 mg (2.50 mmol) sodium carbonate and 384 µl (2.50 mmol) of ethyl 4-iodobutyrate in 5.8 ml of dry DMF Stirred for 18 hours at room temperature under nitrogen. Water was added and the reaction mixture was mixed with Chloroform extracted. After drying, the extracts stripped, leaving a yellow oil that was thick on four Silica gel plates with 10% EtOH / CHCl₃ was chromatographed. The tread was scraped off and with 100 ml 25% ÄtOH / CHCl₃ eluted, whereby 609 mg of the desired product received in the form of an oil.

Example 3 Preparation of 1-methyl-3- (3'-carboxypropyl) xanthine

Eine ölige Suspension von 508 mg 1-Methyl-3-(carboäthoxypropyl)- 7-(pivaloyloxymethyl)xanthin in 36,2 ml 2n NaOH wurde 2 Stunden lang unter Stickstoff auf 95 bis 100°C erhitzt. Das Öl löste sich auf und die Reaktion war beendet, wie durch TLC gezeigt wurde. Nach dem Abkühlen der Reaktionsmischung wurde mit 15 ml 12%iger Chlorwasserstoffsäure auf pH 2 bis 3 angesäuert und die Lösung wurde mit 3 × 5 ml Chloroform extrahiert, um die Pivalinsäure zu entfernen. Nach dem Waschen der Chloroformextrakte mit 5 ml 0,5 n HCl wurden die wäßrigen Lösungen miteinander vereinigt und zur Trockne gestrippt und der Rückstand wurde bei Raumtemperatur im Vakuum getrocknet. Das Rohprodukt wurde in etwa 22 ml heißem Wasser gelöst, entfärbt und auf 15 ml eingeengt, wobei man nach dem Abkühlen 159 mg eines kristallinen Produktes, F. 220 bis 221°C, erhielt.An oily suspension of 508 mg of 1-methyl-3- (carboethoxypropyl) - 7- (pivaloyloxymethyl) xanthine in 36.2 ml of 2N NaOH Heated to 95-100 ° C under nitrogen for 2 hours. The Oil dissolved and the reaction was complete as by TLC was shown. After the reaction mixture was cooled acidified to pH 2 to 3 with 15 ml of 12% hydrochloric acid and the solution was extracted with 3 × 5 ml of chloroform, to remove the pivalic acid. After washing the Chloroform extracts with 5 ml of 0.5N HCl became the aqueous solutions united together and stripped to dryness and the residue was dried in vacuo at room temperature. The crude product was dissolved in about 22 ml of hot water, decolorized and concentrated to 15 ml, after cooling 159 mg of a crystalline product, mp 220 to 221 ° C, was obtained.

Das 1-Methyl-3-(3′-carboxypropyl)-Xanthin kann, wie es in Beispiel 4 der DE-PS 28 05 961 beschrieben ist, mit Rinder-γ- globulin konjugiert werden.The 1-methyl-3- (3'-carboxypropyl) xanthine, as described in Example 4 of DE-PS 28 05 961, can be conjugated with bovine γ -globulin.

Dieses Xanthin kann ferner gemäß Beispiel 6 der DE-PS 28 05 961 an Glucose-6-phosphat-dehydrogenase konjugiert werden. Das Konjugat eignet sich als Reagens für den Theophyllin-Nachweis. This xanthine can also according to Example 6 of DE-PS 28 05 961 be conjugated to glucose-6-phosphate dehydrogenase. The Conjugate is suitable as a reagent for theophylline detection.

Example 4 Preparation of 3- (2'-cyanoethyl) -1-methylxanthine

In einen Reaktionskolben wurden 100 mg 7-Pivaloyloxymethyl-1- methylxanthin, gelöst in 1,42 ml DMF, 44,17 mg Natriumcarbonat und 47 µl Acrylnitril eingeführt. Nach 16stündigem Erhitzen auf 100°C wurde die Mischung in Wasser gegossen und die wäßrige Mischung wurde mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte wurden getrocknet und eingedampft, der ölige Rückstand wurde zweimal an Silicagal-Platten chromatographiert und der Laufstreifen wurde mit 75 ml 25%igem Äthanol/- Chloroform (bezogen auf das Volumen) eluiert, wobei man 109 mg eines öligen Produktes erhielt, das beim Stehenlassen fest wurde, F. 118 bis 120°C.100 mg of 7-pivaloyloxymethyl-1- were placed in a reaction flask. methylxanthine, dissolved in 1.42 ml DMF, 44.17 mg sodium carbonate and 47 ul acrylonitrile introduced. After heating for 16 hours at 100 ° C the mixture was poured into water and the aqueous mixture was extracted with chloroform. The Chloroform extracts were dried and evaporated, the oily The residue was chromatographed twice on silica gel plates and the tread was washed with 75 ml 25% ethanol / - Chloroform (by volume) eluted, 109 mg of an oily product that solidified upon standing m.p. 118 to 120 ° C.

Das obige Nitril (109 mg) wurde in 0,35 ml 1n Natriumhydroxid suspendiert und es wurden 0,35 ml THF zugegeben. Die Mischung wurde 3,5 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, danach wurden 0,2 ml 0,1n Natriumhydroxid zugegeben und das Rühren wurde weitere 0,5 Stunden lang fortgesetzt. Die Mischung wurde dann in etwa 2 ml Wasser gegossen, die wäßrige Lösung wurde angesäuert und erschöpfend mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte wurden mit einer 8%igen Natriumbicarbonatlösung gewaschen, anschließend getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde an zwei Silicagel- Platten chromatographiert (10% ÄtOH/CHCl₃) und mit 125 ml 25%igem ÄtOH/HCCl₃ eluiert. Nach dem Eindampfen zur Trockne erhielt man 50 mg des gewünschten Produktes.The above nitrile (109 mg) was dissolved in 0.35 ml of 1N sodium hydroxide suspended and 0.35 ml of THF was added. The mixture was stirred at room temperature for 3.5 hours, then 0.2 ml of 0.1N sodium hydroxide was added and stirring was continued for an additional 0.5 hour. The mixture was then poured into about 2 ml of water, the aqueous solution was acidified and extracted exhaustively with chloroform. The chloroform extracts were with an 8% sodium bicarbonate solution washed, then dried and used Evaporated to dryness. The residue was collected on two silica gel Chromatographed plates (10% EtOH / CHCl₃) and with 125 ml 25% EtOH / HCCl₃ eluted. After evaporation to dryness 50 mg of the desired product were obtained.

Das Nitril kann leicht zu dem Imidoester modifiziert und für die Konjugation an die in Poly(aminosäuren) vorhandenen Aminogruppen zur Herstellung von Amidin-Brückenbindungen verwendet werden.The nitrile can be easily modified and used for the imido ester conjugation to the amino groups present in poly (amino acids) used for the production of amidine bridge bonds will.

Claims

1. 1-methyl-3-substituted xanthines, characterized by the general formula wherein R¹ represents a C _1-6 alkylene group and Z represents a carboxyl group or a cyano group.

2. 1-methyl-3- (3'-carboxypropyl) xanthine, characterized by the formula

3. Process for the preparation of 1-methyl-3-substituted Xanthines of the general formula given in claim 1, in which R¹ has the meaning given and Z is a carboxyl group means, characterized in that one in itself known manner 1-methylxanthine with halomethyl pivalate condensed, the 1-methyl-7-pivaloyloxymethylxanthine obtained under mild basic conditions with a aliphatic halocarboxylic acid esters, wherein the acid portion 2 to 7 carbon atoms, the alcohol content 1 to Has 6 carbon atoms and the halogen is a chlorine, Bromine or iodine atom is in contact and the Pivaloyloxymethylgruppe and the carboalkoxy group of obtained 1-methyl-3-carboalkoxy-alkyl-7-pivaloyloxymethylxanthins hydrolyzed under basic conditions.