DE2813548A1

DE2813548A1 - Stabilisierte leikocyten

Info

Publication number: DE2813548A1
Application number: DE19782813548
Authority: DE
Inventors: Hoda Antoun Guirgis
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1977-03-29
Filing date: 1978-03-29
Publication date: 1978-10-05
Also published as: AT364085B; ATA287878A; JPS53122283A; GB1581718A; FR2385400A1; DK136278A

Description

Patentanwälte 2 8 T 3 5 4 "8

Dr. \mi Keßerer

L-InO- Ito F- Mjsyer 3 ₂

&OÜO München 80

. 22. Td. 108914729«

RAH 4094/1

F. Hofimann-La Rochc & Co. Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz Stabilisierte Leukocyten

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhalten der Lebensfähigkext von Leukocyten oder von spezifischen Fraktionen von Leukocyten.

Leukocyten sind für. die Forschung sehr wichtig und finden verschiedene medizinische und diagnostische Anwendungen. Es bestehen Probleme wenn es notwendig oder erwünscht ist, Leukocyten von einem Ort zum andern zu transportieren. Im allgemeinen wurden bisher Leukocyten in der Kälte wie z.B. bei ungefähr 4 ctransportiert. Dies weil sie - ausser sie werden innerhalb 5 bis 6 Stunden nach ihrer Trennung vom Vollblut benützt - bei wärmeren Temperaturen, wie z.B. bei Raumtemperatur, unstabil sind.

Die bisherigen Methoden zum Sammeln von Blut von Spendern oder Patienten und zur Trennung von Leukocyten sind unbefriedigend,. da keine Suspensionen von Leukocyten oder von

Hen/2.2.1978 809840/1014

spezifischen Fraktionen davon, welche über längere Zeit bei Raumtemperatur stabil sind, hergestellt werden können. Die übliche Methode besteht darin, dass man das Blut in einer Spritze oder einem Behälter, enthaltend ausreichend Heparin, um eine Gerinnung zu vermeiden, aufnimmt oder sammelt, die Leukocyten trennt und sie in ein gepuffertes Medium suspendiert. In einem anderen Verfahren wird das Blut gesammelt, mit Glaskügelchen defibriniert und die Granulozyten durch magnetische Partikel abgetrennt, wobei die Lymphozyten in der überstehenden Lösung zurückbleiben. In einem weiteren Verfahren wird das gesammelte Blut in eine Hank's Lösung enthaltend ausreichend Heparin um 30 Einheiten/ml Blut zu gewährleisten, aufgenommen. Die letztere Methode ist, was das Erhalten der Lebensfähigkeit anbelangt, halb so wirksam wie die erfindungsgemässe Methode, in welcher das Blut direkt in die BSS-Heparinlösung (BSS = basische Salzlösung) oder in die MEM-Heparinlösung (MEM = minimales essentielles Medium) gegeben wird.

Die obigen Methoden und die anderen bekannten Methoden zur Trennung von Leukozyten vom Blut ergeben keine Leukozytensuspensionen, welche bei Temperaturen, die klar über 4 C liegen, z.B. bei Raumtemperatur, von einem Ort zum anderen transportiert werden können. Es besteht somit ein echtes Bedürfnis für eine stabile Leukozytensuspension, die bei Temperaturen zwischen ungefähr 4 C und ungefähr 30 C transportiert werden kann und während mehreren Tagen lebensfähig bleibt.

Der Stand der Technik wird durch die folgenden Literaturstellen illustriert:

Pattengale et al., The New England Journal of Medicine 291, No. 22, 1145-48, November 28, 1974 beschreiben die Trennung von Leukozyten von heparinisiertem Blut, gefolgt durch eine Lyse der roten Blutzellen und das Suspendieren der Leukozyten in ein geeignetes Medium enthaltend. 10%iges fötales

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Rinderserum.

Schumm et al., Europ. J. Cancer 10_f 107-113 (1974) beschreiben ebenfalls die Aufnahme von Blut in heparinisierten Behältern, die Isolierung der Leukozyten und deren Suspendieren in Hank's Medium.

Zucker-Franklin et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 71, No. 7, 2711-2714 beschreiben das Erhalten von gereinigten Leukozyten aus heparinisiertem Blut und das Suspendieren dieser Leukozyten in ein geeignetes Medium enthaltend 15%iges fötales Kälberserum.

Meckler et al., Oncology 3_0, 177-191 (1974) beschreiben eine Methode, in welcher Blut in einer Hank's Lösung, enthaltend ausreichend Heparin um 30 Einheiten/ml Blut zu gewährleisten, aufgenommen wird.

Chisari et al., The Journal of Experimental Medicine 142, 1092-1107 (1975) beschreiben das konventionelle Verfahren Leukozyten auf eine Ficoll-Hypaque-Schicht aufzutragen. Weiter beschreibt diese Literaturstelle das Suspendieren von Leukozyten in ein geeignetes Medium, dem Antibiotika, nämlich Penicillin und Streptomycin, zugesetzt wurden. 25

Boyum, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 (Suppl.) 97, 77 (1968) beschreibt eine Methode zur Isolierung von Leukozyten, worin Blut in einer heparinisierten Spritze gesammelt, mit Phosphatpuffer verdünnt und auf einer Ficoll-Hypaque-Schicht zentrifugiert wird.

Chang et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 6_4, No. 2, 539-545 (1975) beschreiben - wie Chisari - das Aufnehmen von Blut in heparinisierten Spritzen, die Reinigung der Leukozyten und das Suspendieren dieser Leukozyten in einem geeignetem Medium, enthaltend 20%iges hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum, Penicillin und Streptomycin.

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-X-

West et al.. Clinical Immunology and Immunopathology 5_, 60-66 (1976) beschreiben die Reinigung von Leukozyten nach der Methode von Boyum_r supra, und das Vermischen der Leukozyten mit hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum.

Muijsson et al., Biochemical Genetics L3, Nos. 7/8, 501- 509 (1975) beschreiben die Behandlung von Leukozyten nach einem Verfahren, welches den oben beschriebenen Methoden sehr nahe kommt, d.h. es wird Blut in heparinisierte Salzlösung gegeben, die Leukozyten auf Ficoll-Hypaque aufgetragen, zentrifugiert und die Leukozyten in einem geeigneten Medium resuspendiert.

Vanky et al., J. Nat. Cancer Inst. £7, No. 1, 95-103 (Juli 1971) beschreiben eine Methode zum Defibrinieren von Blut mit Glaskügelchen und die Trennung der Granulozyten mit magnetischen Partikeln.

Lionetti et al., US Patentschrift No. 4.004.975 beschreiben eine Methode zur Erhaltung von Granulozyten, worin die Leukozyten isoliert und gefroren werden.

Keine der obigen Literaturstellen beschreibt oder legt nahe wie man die Lebensfähigkeit von Leukozyten während mehreren Tagen bei einer Temperatur, die klar oberhalb 4 C liegt, aufrecht erhalten kann.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer wärmestabilen Leukozytensuspension und die mit diesem Verfahren erhaltene Suspension, die sich für einen Transport von einem Ort zum anderen bei Temperaturen oberhalb 4°C eignet.

Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Stabilisierung von Leukozyten, wobei

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a) das Blut eines Patienten oder eines Spenders direkt in eine Mischung eines Mittels zur Verhinderung der Koagulation und eines Mittels zum Erhalten der Lebensfähigkeit der Leukozyten überführt wird?

b) die Leukozyten durch Zentrifugierung in einer Lösung mit etwa dem spezifischen Gewicht der zu trennenden Leukozyten, enthaltend ein wasserlösliches, synthetisches Copolymeres von Sukrose und Epichlorhydrin mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 400.000 + lOO.OOO und Natriumditrizoat, abgetrennt werden; und

c) die Leukozyten gesammelt und in Behältern, enthaltend ein Mittel zum Erhalten der Lebensfähigkeit der Leukozyten, das aus einem Gemisch von Antibiotika und hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum oder einem Serumersatzstoff, der dem hitzeinaktivierten fötalen Kälberserum äquivalent ist, aufbewahrt werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren kann bei allen Leukozyten, Basophilen, Lymphozyten und dergleichen angewandt werden. Bevorzugt wird das erfindungsgemässe Verfahren bei Lymphozyten benützt.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird wie folgt durchgeführt:

a) Es wird Blut eines Spenders oder eines Patienten direkt in eine Spritze oder einen anderen Behälter, welche ein Mittel zur Verhinderung der Koagulation und ein Mittel zum Erhalten der Lebensfähigkeit von Leukozyten, d.h. eine basische Salzlösung (BSS), die zusätzlich Aminosäuren und Vitamine enthalten kann, oder ein minimales essentielles Medium (MEM) enthalten, aufgenommen und anschliessend gemischt. Damit das erfindungsgemässe Verfahren zum Erfolg führt ist es

wichtig, dass das Blut direkt in die BSS- oder die MEM-Heparin-" . Mischung gegeben wird. Alle anderen Arten, die Materialien zu

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kombinieren, ergeben unbefriedigende Resultate, weil die erhaltenen Leukozyten ihre Lebensfähigkeit verlieren. So ist z.B. die Lebensfähigkeit von Lymphozyten in einer nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Suspension nach ungefähr einer Woche bei Raumtemperatur etwa 90-100% während analoge Verfahren lediglich etwa eine 50%ige Lebensfähigkeit der Lymphozyten ergeben würden.

Geeignete Mittel zur Verhinderung der Koagulation sind EDTA; Natriumf luorid', Natriumeitrat, Heparin und dergleichen.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist Heparin besonders bevorzugt. Die Menge an Mittel zur Verhinderung der Koagulation kann in Abhängigkeit vom Volumen an Blut in der Probe variieren, muss jedoch ausreichend sein, um sicherzustellen, dass keine Koagulation erfolgt. Wenn Heparin verwendet wird, sind je nach Art des benützten spezifischen Heparins ungefähr 20 USP Einheiten Heparin pro ml Blut ausreichend. Die Menge an BSS oder MEM muss ausreichen, um sicherzustellen, dass die Leukozyten im Blut lebensfähig bleiben. In der Regel werden 30-50 Volumenprozente an BSS oder MEM (bezogen auf das Blutvolumen) verwendet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung eignen sich verschiedene BSS und MEM-Arten. Einige im Handel üblichen BSS's und MEM's werden nachstehend aufgeführt:

Earl's MEM, Hank's MEM, RPMI Medium, F-I3 Medium, Hanks' F-12 Medium, Hanks¹ F-10 Medium, MB75211, McCoy 5a Medium, Medium 499, Medium L-15, NCTC 109, Scherers Erhaltungslösung, Earl's basische Salzlösung, Hanks' basische Salzlösung, Gey's basische Salzlösung.

Typische MEM- und BSS-Lösungen haben die folgenden Zusammensetzungen. Eagle Minimum Essentielles Medium [Eagle, H. Science 130, 432 (1959)].

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-Pt-

■ l·

Minimum essentielles Medium (Eagle)

Komponenten	mg/Liter
Aminosäuren
L-Arginin.HCl	126,4
L-Cystin	24,0
L-Glutamin	292,0
L-Histidin.HCl.H₂O	41,9
L-Isoleucin	52,5
L-Leucin	52,4
L-Lysin.HCl	73,1
L-Methionin	14,9
L-Phenylalanin	33,0
L-Threonin	47,6
L-Tryptophan	10,2
L-Tyrosin	36,2
L-Valin	46,8
Vitamine
D-Ca-Pantothenat	1,0
Cholinchlorid	1,0
Polsäure	1,0
i-Inositol	2,0
Nicotinamid	1,0
Pyridoxal.HCl	1,0
Riboflavin	0,1
Thiamin.HCl	1,0
Anorganische Salze und andere Komponenten
Earle's BSS
CaCl₂.2H₂O	265,0
KCl	400,0
MgSO₄.7H₂O	200,0
NaCl	6800,0
NaHCO₃	2200,0
NaH₃PO₄-H₂O	14O,O
Dextrose	1000,0
Phenolrot	10,0

/ίο ·

Komponenten Hanks' BSS

CaCl₂.2H₂O	186,0
KCl	400,0
KH₂PO₄	60,0
MgSO₄.7H₂O	200,0
NaCl	8000,0
NaHCO₃	350,0
Na₂HPO₄.7H₂O	90,0
Dextrose	1000,0
Phenolrot	20,0
Suspensionsmedium BSS
KCl	400,0
NaCl	6800,0
NaHCO₃	2200,0
NaH₂PO₄-H₂O	1500,0
MgCl₂.6H₂O	200,0
Dextrose	1000,0
Phenolrot	10,0
Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA)
L-Alanin	8,90
L-Asparagine äur e	13,30
L-Asparagin	13,21
L-Aminoglutarsäure	14,70
Glycin	7,50
L-Prolin	11,50
L-Serin	10,50

Earle's MEM wird bei pH 7,0 bis 7,2 in Fläschchen gefüllt Hanks' MEM wird bei pH 7,2 bis 7,4 in Fläschchen gefüllt

i O e 3 4 O / 1 Q H

/H-

RPMI Media 1640 [Moore et al., JAMA In Vitro 6, No. 2 (197O)]

519-524 (1967);

RPMI Media 1640

Komponenten Aminosäuren

L-Alanin L-Arginin (freie Base) L-Asparagin L-Asparag ins äure L-Cystin L-Aminoglutarsäure L-Glutamin Glycin

L-Histidin (freie Base) Hydroxy-L-prolin L-Isoleucin L-Leucin L-Lysin.HCl L-Methionin L-Phenylalanin L-Prolin L-Serin L-Threonin L-Tryptophan L-Tyrosin L-Valin Vitamine p-Aminobenzoesäure Biotin

D-Ca-Pantothenat Cholinchlorid Folsäure i-Inositol Nicotinamid Pyridoxin.HCl

mg/Liter	0
200,	0
50,	0
20,	0
50,	0
20,	0
300,	0
10,	0
15,	0
20,	0
50,	0
50,	0
40,	0
15,	0
15,	0
20,	0
30,	0
20,	0
5,	0
20,	0
20,	00
1,	20
0,	25
0,	00
3,	00
1,	00
35,	00
1,	00
1,

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-V-

/ia.

Riboflavin Thiamin.HCl Vitamin B,,,

Andere Komponenten

Dextrose Glutathion (reduziert) Phenolrot

Anorganische Salze

Ca (NO₃)₂.4H₂O

KCl MgSO₄.7H₂O

NaCl NaHCO₃

Na₃HPO₄.7H₂O

0,20

1,00 0,005

2000,0 1,0 5,0

100,0 400,0 100,0

6000,0 2000,0 1512,0

In Fläschchen gefüllt bei pH 7,2 bis 7,4.

Earle's, Gey's und Hanks¹ äquilibrierte Salzlösung [EarIe, J. Nat. Cancer Inst. ·4, 165-212 (1943); Gey et al., Am. J. Cancer 2Ί_, 45-76 (1936); Hanks et al., Proc. Soc. Exp. Bio!. and Med. 71, 196-200 (1949)]

Aequilibrierte Salzlösungen

	Earle's	Gey's	Hanks'
Komponenten	(mg/Liter)	(mg/Liter)	(mg/Liter)
NaCl	6800	8000	8000
KCl	400	375	400
CaCl₂.2H₂O	265	225	186
MgSO₄.7H₂O	200	70	200
MgCl₂.6H₃O	—	210	—
NaH₃PO₄.H₂O	140	—	—
Na₃HPO₄.7H₂O	—	226	90
KH₂PO₄	—	30	60
Dextrose	1000	1000	1000
Phenolrot	10	—	20
NaHCO.	2200	227	350

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" Diese Lösungen stammen von Microbiological Associates, Bethesda, Maryland.

Es ist die bereits beschriebene Stufe a), welche es ermöglicht, die weiteren Stufen des erfindungsgemässen Verfahrens zur Herstellung eines stabilen Leukozytenpräparates durchzuführen. Nach Mischung der Bestandteile werden die folgenden Stufen durchgeführt:

b) Die Mischung Blut-Heparin-MEM oder -BSS wird in einem Glasbehälter, vorzugsweise einem Teströhrchen auf eine Ficoll-Hypaque-Lösung aufgetragen. Dies wird erreicht, indem man die Mischung sorgfältig auf die im Behälter vorhandene Lösung giesst. Das Volumenverhältnis der Ficoll-Hypaque-Lösung zum Blut liegt zwischen 1:1 und 1:2, vorzugsweise bei 1:1. Die relativen Mengen an Mischung und Lösung können variieren, in der Regel ist jedoch das Volumen der Mischung leicht grosser als dasjenige der Lösung. Die relativen Mengen an Ficoll und Hypaque können variieren, in der Regel sollten sie jedoch so seiii, dass das spezifische Gewicht der Ficoll-Hypaque-Lösung etwa das gleiche ist, wie dasjenige der einzelnen zu trennenden.Leukozyten. Wenn z.B. Lymphozyten getrennt werden, sollte das spezifische Gewicht etwa 1,07 bis 1,08 sein. Ficoll ist ein synthetisches Hochpolymeres, welches durch die Copolymerisation von Sucrose und Epichlorhydrin hergestellt wurde und ein durchschnittliches Molekulargewicht von 400,000 + 100,000 aufweist. Hypague ist Natriumditrizoat. Ficoll und Hypaque sind wasserlöslich. Zur Herstellung der für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendeten Ficoll-Hypaque-Lösung wird destilliertes und/oder entionisiertes Wasser verwendet. Ficoll ist erhältlich von Pharmacia Piscataway, New Jersey. Hypaque ist erhältlich von Winthrop Laboratories, New York City.

c) Die auf eine Ficoll-Hypaque-Lösung aufgetragene Mischung Blut-Heparin-BSS oder -MEM wird zur Abtrennung der Leukozyten von Plasma bei 4 C zentrifugiert. Die Zentrifugierung wird

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■ Ak.

in der Kälte durchgeführt damit die Lebensfähigkeit der Leukozyten nicht durch die wegen der Zentrifugalkräfte verursachten Hitze beeinträchtigt wird. Die Umdrehungen der Zentrifuge pro Minute sollten so sein, dass eine ungefähr 400-fache Schwerkraft während einer Zeit, die ausreicht, um die Leukozyten auf die Ficoll-Hypaque-Lösung aufzutragen, d.h. ungefähr 30 bis 40 Minuten, erreicht wird.

d) Das in Stufe b) erhaltene überstehende Plasma wird dekantiert und die Leukozyten enthaltende Schicht auf übliche Weise, z.B. mit Hilfe einer Spritze, entfernt. Diese Leukozyten enthaltende Phase wird anschliessend mit BSS oder MEM gemischt und bei einer etwa 400-fachen Schwerkraft während einer Zeit, die ausreicht, um die Leukozyten von BSS oder MEM abzutrennen, d.h. ungefähr 10 bis 30 Minuten, zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird abdekantiert und der Rückstand enthält die Leukozyten.

Dieser Leukozyten enthaltende Rückstand wird in BSS oder MEM suspendiert und eine aliquote Probemenge wird genommen, damit die Anzahl der Leukozyten gezählt werden kann. Die Zählung der Zellen kann auf konventionelle Art erfolgen. Ein Coulter Counter (Coulter Electronics Inc. Hialeah, Florida) hat sich jedoch als bevorzugt erwiesen. Weiter wird zur Untersuchung der Lebensfähigkeit der Bakterien eine zusätzliche aliquote Probemenge genommen. Die konventionelle Trypanblau-AusSchlussmethode wird verwendet. Die Zählung der Zellen und die Untersuchung ihrer Lebensfähigkeit sind nicht Teil der vorliegenden Erfindung, werden jedoch bei einer Kommerzialisierung zur Qualitätskontrolle benützt.

e) Nach Zählung der Zellen und Untersuchung ihrer Lebensfähigkeit wird die BSS- oder MEM-Suspension mit einer zusätzlichen BSS- oder MEM-Suspension, die Antibiotika und hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum oder einen äquivalenten Serumersatzstoff enthält, so verdünnt, dass schliesslich die Konzentration an lebensfähigen Leukozyten ungefähr 0,5x10

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lebensfähige Zellen pro ml beträgt.

Die Antibiotika werden zugesetzt, damit sichergestellt wird, dass das Leukozytenpräparat steril bleibt. Die eingesetzten Mengen an Antibiotika können - wie aus der Literatur bekannt - in Abhängigkeit der effektiven Konzentration dieser Antibiotika, variieren. Eine bevorzugte Kombination von Antibiotika ist beispielsweise Penicillin, Streptomycin und Gentamycin. Wenn diese bevorzugte Gruppe von Antibiotika verwendet wird, enthält die Verdünnungsflüssigkeit diese Antibiotika in Mengen, welche in dem gebrauchsfertigen Präparat Konzentrationen von 75 Einheiten, 50 μg und 50 μg per ml ergeben.

Das hitzeinaktivierte fötale Kälberserum oder der äquivalente Serumersatzstoff werden verwendet,- um die Leukozyten in einem für die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit geeigneten Milieu zu halten. Genauer gesagt wird auf diese Weise den Medien ein Protein zugegeben, welches einen Proteinverlust der Zellmembranen verhindert. Weiter bezweckt die Anwesenheit einer Proteinquelle im Milieu die Stärkung der Zellmembranen.

Die Verwendung von hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum als ein Zusatz zum Erhalten der Lebensfähigkeit verschiedener Zellarten ist aus der Literatur bekannt. Siehe z.B. McCaIl et al., Ann. Rheum. Dis, 2J5, Seiten 42-48 (1966)? Mc Leod et al., Blood, Vol. 44, No. 4, Seiten 517-534; Kowacs et al., J. of Inv. Dermatology, Vol. 63, Seiten 456-60 (1974); und Fabrikant et al., Radiology, Vol. 92, Seihen 1309-20 (1962-) , sowie die eingangs erwähnten Zucker-Franklin- und Chang-Artikel. Serumersatzstoffe, die bekanntlich dem hitzeinaktivierten fötalen Kälberserum äquivalent sind, gibt es grundsätzlich zwei Typen, nämlich Proteine und synthetische Medien. Als eiweissartige Ersatzstoffe eignen sich beispielsweise menschliches Serumalbumin und autologes Serum. Als synthetische Medien eignen sich z.B. serumfreie Kultursysteme, die als Schutzmittel

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synthetische Polymere wie z.B. Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, Dextran, Hydroxyäthylstärke und dergleichen enthalten. Diese Serumersatzstoffe werden von Taylor in J, of the National Cancer Institute, Vol. 53, No. 5, November 1974, Seiten 1449-1457 und in den in diesem Artikel erwähnten Literatursteilen im Detail beschrieben. In der Regel enthält das Verdünnungsmedium, d.h. BSS oder MEM ungefähr 1% bis ungefähr 10% (v/v) hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum oder einen äquivalenten Serumersatzstoff.

f) Die Suspension aus Stufe e) wird auf Raumtemperatur gehalten und anschliessend zum Transport in sterile Behälter beispielsweise aus Glas oder Kunststoff gegeben. Jeder Behälter sollte eine Menge an Leukozytenzellen, bei welcher praktisch alle Zellen lebensfähig bleiben, d.h. etwa 2 bis 10x10 Leukozytenzellen enthalten. Die Behälter werden in isolierte Behälter, bestehend vorzugsweise aus Styrofoam (Polystyrolschaum), verpackt und sind somit transportfähig.

Unter Verwendung der erfindungsgemässen Methode bleiben in der Suspension nach etwa 1 Woche ungefähr 90% und mehr der Leukozytenzellen stabil.

Das nachstehende Beispiel dient zur Illustration der Erfindung.

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Beispiel

1 ml Heparin und 11 ml F-13 Medium (MEM-Medium) werden in eine 30 ml Spritze eingesaugt. Die Nadeln der Spritze werden gewechselt und 18 ml Blut von einem Spender werden direkt in die Spritze aufgenommen. Das Blut, das Heparin und das F-13-Medium werden durch einfaches oder zweifaches Kippen der Spritze vermischt.

" ungefähr 8 ml der erhaltenen Mischung werden auf 6 ml einer Ficoll-Hypaque-Lösung in einem Teströhrchen (16x125 mm) aufgetragen. Anschliessend wird bei 1000 Upm (400-fache Schwerkraft) und 4°C während 37 Minuten zentrifugiert. Die erhaltene überstehende Plasmaschicht wird abdekantiert. Die lymphozytenreiche Phase wird entfernt und in 3.0 ml F-13 Medium übergeführt. Die erhaltene Mischung wird bei 1000 Upm (400-fache Schwerkraft) und 4°C während 10 Minuten zentrifugiert. Nach Entfernung der überstehenden Flüssigkeit verbleibt ein Lymphozyten enthaltender Rückstand. Diesem Rückstand werden 4,5 ml F-13 Medium zugegeben und es wird gut gemischt. Ein 0,1 ml Aliquot wird genommen und in 20 ml einer Zählflüssigkeit (isotonische Lösung) für eine Coulterzählung (Zellenzählung in einem Coulterzähler) gegeben. Ein weiteres Aliquot wird genommen und die Lebensfähigkeit der darin enthaltenen Lymphozyten wird unter Verwendung der Trypanblaufarbstoff-Ausschlussmethode untersucht.

Die Lymphozytensuspension in F-13 Medium wird mit F-13 Medium enthaltend 1000 Einheiten/ml Penicillin, 50 Streptomycin und 10 Volumenprozente hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum auf 0,5x10 lebensfähige Zellen pro ml verdünnt. Die erhaltenen Proben werden auf Raumtemperatur gehalten und in sterile Glasbehälter übergeführt. Die Glasbehälter, welche X alle 5x10 Lymphozytenzellen enthalten, werden in Styrofoam-Behälter verpackt und sind somit bereit für den Transport, z.B. per Luft. Die Lebensfähigkeit der Lymphozytenzellen in einer gemäss vorliegendem Beispiel hergestellten Suspension

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-¹*

nach Transport per Luft war wie folgt:

Tabelle

Probe Alter der Zellen % Lebensfähigkeit (Tage)

1 4 97

2 4 98

3 5 94 4 " 3 92

5 1 93

6.4 91

Die in der Tabelle wiedergegebenen Daten veranschaulichen die Wirksamkeit des erfindungsgemässen Verfahrens.

Die im vorliegenden Beispiel benützte Ficoll-Hypaque-Lösung wird wie folgt hergestellt:

A. Herstellung von Ficoll

1. 18 g Picoll werden gewogen.

2. Das Volumen wird durch Zusatz von destilliertem Wasser zum Ficoll auf 200 ml eingestellt.

3. Es wird gemischt bis eine vollständige Auflösung erfolgt ist.

4. Es wird 5 Minuten mit einem magnetischen Rührer gemischt.

B. Herstellung von Hypaque.

1. Es werden zwei 25 ml-Büretten verwendet - eine für

destilliertes Wasser, die andere für eine 50% wässrige Hypaque-Lösung.

2. 56,5 ml 50% Hypaque-Lösung werden mit 26,84 ml destilliertem Wasser verdünnt.

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Al

1 C. Herstellung von Ficoll-Hypaque.

1. Die gesamte erhaltene Hypaque-Lösung wird mit der

gesamten erhaltenen Ficoll-Lösung gemischt.

5 2. Ein Messzylinder wird mit 250 ml Ficoll-Hypaque-

Lösung gefüllt.

3. Das spezifische Gewicht der Lösung wird mit einem Hydrometer gemessen. Wenn das spezifische Gewicht unterhalb 1,07-1,08 liegt, wird mehr Hypaque-Lösung zuge-

10 geben, wenn es oberhalb 1,<^8 liegt, wird destilliertes

Wasser zugesetzt.

4. Die Lösung wird in einen Autoklaven gegeben.

Neben dem Erhalten der Lebensfähigkeit, beispielsweise 15 von Lymphozyten, ermöglicht die vorliegende Erfindung die

Rückgewinnung von mehr als 90% der totalen Menge an Zellen, d.h. der vorhandenen Lymphozyten. Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass das Medium ein Mittel zur Verhinderung der Koagulation enthält, was das Klumpen der Zellen verhindert. 20

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Stabilisierung von Leukozyten, wobei

a) das Blut eines Patienten oder eines Spenders direkt in eine Mischung eines Mittels zur Verhinderung der Koagulation und eines Mittels zum Erhalten der Lebensfähigkeit der Leukozyten überführt wird;

t>) die Leukozyten durch Zentrifugierung in einer Lösung mit etwa dem spezifischen Gewicht der zu trennenden Leukozyten, enthaltend ein wasserlösliches, synthetisches Copolymeres von Sukrose und Epichlorhydrin mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 400.000 + 100.000 und Natriumditrizoat, abgetrennt werden; und

2. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,

dass das Mittel zur Verhinderung der Koagulation Heparin ist.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zum Erhalten der Lebensfähigkeit der Leukozyten eine basische Salzlösung ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zum Erhalten der Lebensfähigkeit der Leukozyten ein minimales essentielles Medium ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Leukozyten Lymphozyten sind und das spezifische Gewicht in Stufe b) etwa 1,07 bis 1,08 ist.

ORIGINAL INSPECTED 809840/1014

6. Suspension von Leukozyten mit etwa 90% bis 100% lebensfähigen Leukozyten in einem. Mittel zum Erhalten der Lebensfähigkeit der Leukozyten enthaltend Antibiotika und hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum oder Proteinersatzstoffe, die dem hitzeinaktivierten fötalen Kälberserum äquivalent sind, oder Protein-Derivate, die dem hitzeinaktivierten fötalen Kälberserum äquivalent sind.

1. Suspension nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, ■{0 dass die Leukozyten Lymphozyten sind.

8. Suspension nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zum Erhalten der Lebensfähigkeit der Leukozyten eine basische Salzlösung ist.

9. Suspension nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zum. Erhalten der Lebensfähigkeit der Leukozyten ein minimales essentielles Medium ist.

10. Suspension nach einem der Ansprüche 6-9 enthaltend hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum.

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