DE2812988A1

DE2812988A1 - Verfahren und anordnung zur erfassung der beta-thalassaemie minor

Info

Publication number: DE2812988A1
Application number: DE19782812988
Authority: DE
Inventors: Ian B Shine
Original assignee: Coulter Electronics Inc
Current assignee: Coulter Electronics Inc
Priority date: 1978-03-06
Filing date: 1978-03-23
Publication date: 1978-10-05
Also published as: FR2386081A1; US4159895A; FR2386081B1; DE2812988C2; JPS6133142B2; CA1098430A; GB1603643A; JPS5412795A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Untersuchung und Erfassung von Blutkrankheiten, insbesondere auf die Erkennung der gemeinen iChalassämien und "speziell der Beta-Thalassämie minor.

In den Vereinigten Staaten wird derzeit vielen Menschen die Möglichkeit geboten, sich im Hinblick auf mögliche Hämoglobinvarianten aufklären, untersuchen und genetisch beraten zu lassen. Palis es nun für die Ärzte in USA in absehbarer Zeit zur Pflicht werden sollte, ihre Patienten über genetische Risiken aufzuklären, müßte mit den Nachweismethoden für Hämoglobinvarianten die Erkennung von Thalassämien, insbesondere der Beta-ÜÜBLassämie minor gewährleistet sein.

Die Thalassämien stellen eine Gruppe klinisch wesentlicher Störungen dar, die auf hereditären Defekten der Synthese des normalen Hämoglobins beruhen. Die Beta-Thalassämie minor ist die häufigste, bei Heterozygotie entstehende Verlaufsform einer Reihe von thalassämischen Gen-Mustern, wobei bei einem kein Hämoglobin A erzeugt wird, bei einem anderen eine Wechselwirkung mit Beta-Ketttenvarianten unter Erzeugung einer erheblichen Hämoglobinmenge A aber ohne Zunahme der roten Blutkörperchen stattfindet und ein weiteres keinerlei hämatologische oder klinische Erscheinungsformen zeigt.

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Bei Homozygotie verläuft die Thalassämie für jährlich. ca. 100.000 Kinder auf der Welt tödlich. Es müssen also exakte und da~bei verhältnismäßig einfache und wirtschaftliche Mittel und Wege zur Erfassung der Träger von Thalassämien gefunden werden. Wie "bei jeder rezessiven Autosomstörung ließe sich das Vorkommen bei Homozygotie fast bis auf Null reduzieren, wenn es gelingt, die heberozygoten Formen zu erfassen. Ein idealer Nachweistest für die heterozygote Erscheinungsform sollte keine falschen negativen und wenig falsche positive Ergebnisse ermitteln und dabei einfach und zuverlässig sein. Die verschiedenen, bisher angewandten Nachweismethoden, u.a. die Messung und Auswertung der osmotischen Resistenz des fetalen Hämoglobins, des freien Porphyrin der roten Blutkörperchen, der Blutausstriche und des Hämoglobins Ap, eignen sich nicht ohne weiteres für Reihenuntersuchungen. Mit der Entwicklung und Durchsetzung der elektronischen Rechner ging man dazu über, die Index-Werte der roten Blutkörperchen zu berechnen und kombiniert oder einzeln für sich zur Erkennung von Heterozygotie einzusetzen. Drei bekannte Nachweismethoden wurden, wie noch beschrieben wird, an 25-302 Proben getestet, aber mit keiner konnten vorliegende, bekannte heterozygote Typen erfaßt werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, zur Abhilfe . dieser Unempfindlichkeit bekannter Verfahren ein Verfahren und eine Anordnung zu entwickeln, mit welchen sich unter Verwendung oer ais der Hämoglobin-Elektrophorese erhaltenen Informationen aus den Index-Werten der roten Blutkörperchen ein Maximum an Informationen gewinnen läßt.

Zur Lösung dieser Aufgabe ist das Verfahren nach der Erfindung gekennzeichnet durch eine an sich bekannte Messung des mittleren TeilchenvJLumens und des mittleren Teilchenhämoglobingehalts der roten Blutkörperchen einer Blutprobe, durch Ableitung des Thalassämie-Index als mathema-

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tisches Produkt dieser beiden Parameter und durch Vergleich des Produkts mit einem vorbestimmten Schwellenwert des Thalassämie-Index, wobei der Betrag, um den der Thalassämie-Indexwert unter dem Schwellenwert liegt, proportional zu der Wahrscheinlichkeit ist, daß die Probe von einem thalassämischen Träger stammt.

Zur Durchführung dieses Verfahrens sieht die Erfindung eine Anordnung vor bestehend aus einer an sich bekannten Einrichtung zur Messung der Parameter mittleres Teilchenvolumen und mittlerer Teilchenhämoglobingehalt der roten Blutkörperchen einer Blutprobe, einer Einrichtung zur Ableitung des Thalassämie-Index als mathematisches Produkt der zwei gemessenen Parameter und einer Einrichtung zur Darstellung des abgeleiteten Thalassämie-Index zum Vergleich mit mindestens einem vorbestimmten Standard-Index, um zu ermitteln, mit welcher Wahrscheinlichkeit die Proben von einem Träger der Thalassämie stammt.

Weitere Merkmale und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines in den Zeichnungen veranschaulichten, bevorzugten Ausführungsbeispiels näher beschrieben.

In den Zeichnungen zeigt:

Fig. 1 im Diagramm die drei Verfahrensschritte nach der Erfindung und die erhaltenen Testergebnisse;

Fig. 2 zwei Verlaufsfirmen der Verteilungskurven für(MCV)² χ MCH, in welchen Beta-Thalassämie minor mit normalen und anämischen Fällen verglichen wird;

Fig. 3 die Wahrscheinlichkeitskurve, wobei die thalassämischen Index-Werte (MCV)² χ MCH auf der Abszisse und die Wahrscheinlich-

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keitswerte für Beta-Thalassämie minor auf der Ordinate aufgetragen sind;

Fig. 4 ein Blockschaltbild einer Anordnung zur Bildung der thalassämischen Indexwerte; und

Fig. 5 ein elektrisches Schaltbild eines Teils der Anordnung nach Fig. 4.

Das derzeit "bevorzugte Nachweisverfahren wird in drei Verfahr ensschritten durchgeführt, nämlich 1) Hämoglobin-Elektrophorese, 2) Ermittlung des Produkts aus der zweiten Potenz des mittleren Teilchenvolumens der roten Blut-Körperchen (MCV) und dem· mittleren Teilchenhämoglobingehalt (MCH) in Bnheiten von 100 gemessen, und 3) A₀ -Be-Stimmung aller AA-Proben mit einem Wert (MCV) χ MCH <£ 1530 sowie aller Proben der mit Thalassämie zu vereinbarenden Varianten.

Verfahren und Anordnungen zur Durchführung der Verfahrensschritte 1) und 3) sind allgemein bekannt, aber der Verfahrensschritt 2), d.h. (MCV)² χ MCH ist sowohl als Bestandteil einer Nachweismethode für Thalassämie, insbesondere der Beta-Thalassäraie minor als auch in alleiniger Anwendung als Indikator bzw. Untersuchungsindex für Thalassämien, insbesondere der Beta-Thalassämie-minor, neu. Die Verwendung des Produktes (MCV) χ MCH statt (MCV)² x MCH hat sich zwar im Verfahrensschritt 2) und auch für sich allein als brauchbarer Index erwiesen, liefert aber nicht so exakte Ergebnisse wie (MCV)² χ MCH.

Es sind ebenfalls Verfahren und Anordnungen zur Messung der einzelnen Parameter MCV und MCH bekannt. Die Erfindung sieht eine Anodnung vor, mit der sich ein bekanntes Gerät, das sog. Coulter-Teilchenanalysiergerät, Model S, verbindung und auf selbsttätige Ermittlung des Werts

(MCV)² xMCH umstellen läßt.

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Nachstehend werden alle drei Verfahrensschritte dieses bevorzugten Nachweisverfahrens für Beta-Thalassämie minor ausgehend von dem Diagramm nach Fig. 1 beschrieben. Die im Verfahren nach der Erfindung gewonnenen Ergebnisse schnitten im Vergleich mit allen bekannten Verfahren ausgezeichnet ab, wie aus den Daten der Tabelle 1 ersichtlich. Diese Nachweismethode bietet ein seit langem gesuchtes Kriterium zur Erfassung der Thalassämie, nämlich den sog. Thalassämie-Index, der sich durch Bestimmung der Parameter MGV (mittleres Zeil- oder Teilchenvolumen) und MCH (mittleres Teilchenhämoglobin.) der roten Blutkörperchen und Bildung deren mathematischen Produkts ergibt, vorzugsweise unter Verwendung von MCV in zweiter-Potenz, als& (MCV) χ MCH.

F~g. 3 zeigt die Wahrscheinlichkeitskurve für Thalassämie-Träger, wobei die Wahrscheinlichkeit zunimmt, je weiter der Thalassämie-Index unter einem vorbest immten Schwellenwert liegt, wie noch beschrieben wird.

Wie aus Fig. 1 ersichtlich^ wurden in aufeinanderfolgender Reihe 25-302 gesunde Erwachsene ambulant auf hereditäre Anämien untersucht. 7·ο,3% waren Schwarze, 29,7% waren Weisse,die von gemischt nordeuropäischen Vorfahren mit geringem mediterranen Einschlag abstammten. 5 ml Venenblut Jeder Testperson wurden in ein 7^6 EDTA enthaltendes Vakuumröhrchen eingesaugt. Der Hämoglobin-Typus wurde in bekannter Weise durch Zellulose-Acetat-Elektrophorese mit "Tris-"EDTA Boratpuffer, pH = 8.4- und dann mit Zitratagar-Elektrophorese in Zitratpuffer, pH = 6.2, im Verfahren nach Schneider bestimmt. Bei jeder Bandwanderung F wurde eine quantitative Bestimmung nach dem bekannten Betke-Verf ahren vorgenommen. Da die Proben oft ein oder zwei Tage alt waren, wurden rote Blutkörperchen nicht auf|fetales Hämoglobin gefärbt. Hämoglobin Ap wurde bei allen möglicherweise thalassämischen Proben zweifach gemessen, d.h. bei allen Proben mit einem mittleren Teilchenvolumen von unter 80 at und bei allen des Genotypus AF, FA oder SA. Außerdem wurde Ap so vieler im Normalbereich liegender Proben gemessen wie täglich arbeitsmäßig zu be-

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wältigen war. -Hämoglobin A- wurde vom Gesamtblut in einer DEAE Zellulose Minisäule in Glyzinpuffer abgesondert und mit einem Spektrofotometer T>el 415 21m gemessen. Die Messung T/Oll A "war mit Ausnahme von. Hämoglobin S enthaltenden Proben reproduzierbar. Der TJngenauigkeitsgrad wurde an einer Sammelprobe von 50 Personen mit Sichelzellen-OharakterIstxk gemessen.} der gesammelte Hämoglobin Ap-Ante±l wurde durch Dialyse konzentriert und in einer langen Säule In 85.7% A₂ und 14.3% S getrennt. Mit einem täglich gegen normale und anormale Einflüsse geeichten Goulter-Gerät Model S wurden die Index-Werte MCV, Hb, RBG und MGH der roten Blutkörperchen ermittelt und der Berechnung '.des Diskriminanten nach England Fräser (MCV - RBC - 5Hb -3.4 £ 1), der Erfassung des Schwellenwerts von MCV unter 79/U nach Pearson und der Berechnung des von Mentzer versuchsweise vorgeschlagenen Terhaltnisses (MCV/RBC -<13) zugrunde gelegt.

Das bevorzugte Verfahren nach der Erfindung wurde heuristisch entwickelt, um die Anzahl falscher positiver und falscher negativer Ergebnisse, die sich bei Anwendung der anderen Methoden zeigten, zu reduzieren. Das Produkt aus (MCV) χ MCH gemessen in Einheiten von 100 wurde für jede Probe errechnet. Da der Genotypus AS bekanntlich mit der ■diagnose von Beta-Thalassämie minor nicht vereinbar und die Genotypen nicht willkürlich auf die Indexwerte der roten Blutkörperchen verteilt sind, brauchte dieses Produkt lediglich für die Proben des Genotypus AA, wie die 23.075 Proben in Fig. 1 zeigen, berechnet zu werden. Da bei Männern die Werte um 6.2% höher liegen als bei Frauen, wurden alle von Männern hergeleiteten Werte um 6.2% reduziert, um eine einheitliche Trennlinie zu schaffen. Aus der Gesamtanzahl von 25-302 untersuchten Individuen wuncten 138 mit Hämoglobin A~> 4.5% identifiziert. Vier Methoden zur Erfassung dieser 138 Individuen wurden verglichen, wie Tabelle 1 zeigt.

Die Werte des Thalassämie-J-Index (MCV) χ MCH ergaben einen breiten Abstand zwischen thai as sämi sehen und nor-

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malen Fällen, wie die thalassämische Kurve 6 und die normale Kurve 7 in d-er unteren Hälfte in Fig, 2 zeigen. Der Mittelwert für die thalassämischen Fälle lag "bei 1.094- +_ 259 > und der Tlittelwert für die AA nicht-thalassämischen Fälle bei 2.218 +_ 386. Diese Differenz war sehr bezeichnend, t = 205, ρ ^0.0001. Die einzige nicht erfaßte Person hatte im Normalbereich liegende hämatologisehe "Werte und wäre jeglicher Erfassung mit auf den Index-Werten der roten Blutkörperchen beruhenden Methoden entgangen. Derartige Thalassämie-Träger mit normalen hämatologischen Werten dürften äußerst selten sein, da .die Messung von A bei 1,761 Personen mit Mikrozytose Iceinen und bei 1.973 Personen ohne Mikrözytose nur eien Träger ergab. Die Thalassämie-Indexwerte ergaben auch einen deutlichen Abstand zwischen den Mittelwerten der heterozygoten 1.094- +_ 259 und der anämischen Personen 1.814- +_ 601, wie die Kurven 8 bzw. 9 in der oberen Hälfte in Fig. 2 zeigen, wobei Anämie als eine Hämoglobinkonzentration definiert wird, die bei Männern unter 12g/dl und bei Frauen unter 11g/dl liegt, t = 7-7, P < 0.0001.

Versuche mit den Indexwerten MOV und MCH der roten Blutkörperchen haben gezeigt, daß deren Produkt zwar einen aufschlußreichen Thalassämie-Index liefert (Daten hierfür sind

hier nicht angegeben), daß aber bei Zugrundelegung von(MCV) sehr viel genauere, aussagereichere Ergebnisse gewährleistet sind, da Hterozygoten bei Hämoglobin S und C zu thalassämi-

sehen roten Blutkörperchen neigen und sich äfer Wert (MCV) χ MCH in Gegenwart von SA oder bei Erhöhung von F in Verbindung mit Thalassämie minor in den ITo rm albere ich verschob. Das bevorzugte Verfahren nach der Erfindung verfehlte nur einen einzigen heterozygoten Typ und ermittelte ,lediglich 4-.4% falsche positive Ergebnisse.

Die Daten umfangreicherer Populations-Untersuchungen könnten ergeben, daß der Exponentialwert für MCV bestenfalls mindestens etwas von zwei abweicht. Die Potenz "zwei" ist

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datier inst es ond ere hinsichtlich der Ansprüche nicht zu eng auszulegen. .

Me Messung von Hämoglobin Ap wird als verläßlichster Indikator für Beta-Thalassämie minor zugrundegelegt, obwohl zwischen einzelnen Laboratorien und Verfahren Abweichungen bestehen». 3.5% &2 6·*··*-^ ^{zwar a}l^s üblicher Schwellenwert zwischen Beta-Thalassämie minor und Normal, aber bei Beurteiling der Wirksamkeit des Verfahrens nach, der Erfindung wurde der Schwellenwert auf 4.5% gesetzt, da der Zwischenbereich einige Fälle umfaßte, für die die Diagnose weder klinisch noch genetisch belegbar war. Da es Zweck dieser Untersuchung war, die einzelnen Nachweismethoden für Heterozygoten vergleichend zu beurteilen, hat man sich entschlossen, diesen Zwischenbereich bis zum Abschluß genetischer Untersuchungen an jedermann unberücksichtigt zu lassen.

Der Wert des Thalassämie-Index (MCV) χ MGH liefert auch einen Anhaltspunkt für die Wahrscheinlichkeit, ob ein Individuum heterozygot ist, da sich die Häufigkeit der Heterozygotie im wesentlichen umgekehrt proportional zu diesem Wert verhält. Die Wahrscheinlichkeitskurve in Fig. 3 gibt als Schwellenwert I53O an, unterhalb welchem eine Bestimmung des Hämoglobin A~ angezeigt ist. Unter dem Wert von 1530 liegen 99% der thalassämischen häberozygoten Population, und dieser Bereich «£1530 läßt sich in Untergruppen je nach den unterschiedlichen Wahrscheinlichkeiten dieser Anomalie einteilen.

Fig. 4 zeigt ein Blockschaltbild eines Geräts 10, mit welchem sich der Thalassämie-Index ermitteln läßt. Die für MCV,MCH und A/D stehenden Blöcke 12,14 und 16 sind beim Coulter-Teilchenanalysiergerät vorhanden, aber nicht auf dieses Gerät beschränkt. Lediglich die zwischen den gestrichelten Linien und 20 liegenden Blöcke sind zusätzlich erforderlich, um das Model S auf Ermittlung des Thalassämie-Index umzustellen. Die analogen Ausgänge von MCV und MCH werden dem Funktionsblock zugeführt, der.den analogen Wert von (MCV) χ MCH liefert. Um diesen analogen Wert des Thalassämie-Index in einen digitalen Wert mittels eines bereits vorhandenen Analog-Digital Umsetzers

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umwandeln zu können, ist ein Verstärker 24 vorgesehen, der einen Maßstabfaktor liefert.

Fig. 5 zeigt schematisch die einzelnen Schalt- und Bauelemente der Blöcke 22 und 24. Wichtigstes Element des Funktionsblockes 22 ist der Funktionsumsetzer 26 (handelsübliche Ausführung von Burr-Brown Research Corp., Tucson, Arizona, Artikel Bfoi4302).

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Die gesuchte Funktion (MCV) χ MCH ist natürlich auch mit

einer entsprechend ausgelegten anderen Schaltungsanordnung ; erhältlich. Der V Eingang ist ein Maßstabänderungs-Eingang und wird als +5V gewählt, um die Berechnung der analogen Funktion in den Operationsbereich des Model-S zu bringen. Der Widerstand 5OK ist mit dem Ausgang E verbunden und liefert einen Eichfaktor für den Analog-Digital-Umsetzer 24. Ein mit den in Fig. 4 und 5 gezeigten Schaltverbindungen ausgestattetes Coulter Model S ermöglicht die Darstellung und das Ausdrucken des digitalen Werts des Thalassämie-Index.

Weitere Erläuterungen zum Aufbau und zur Funktionsweise des Teilchenanalysiergeräts Model S gibt die US-PS 3,4-59,994 sowie die analogen ausländischen Patentschriften. Wie in dieser Patentschrift beschrieben und außerdem allgemein bekannt ist, läßt sich MCV als Quotient des Hämatokrit-Werts und der Anzahl roter Blutkörperchen, d.h. MCV = HCT/RBC und MCH als Quotient von Hämoglobin und Anzahl roter Blutkörperchen, d.h. MCH = Hb/RBC ableiten. All diese Parameter sind mit einem Model S erhältlich. Natürlich brauchen weder die analogen noch die numerischen Werte von MCV und MCH ermittelt zu werden, lediglich deren Äquivalente, HCT/RBC und Hb/RBC sind erforderlich und lassen sich entweder in analoger oder digitaler Form darstellen, je nachdem, für welche der bekannten Verfahen und Anordnungen man sich entscheidet.

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	SAMPLES	DETECTED	(99.3%)	WITH	A₂>4.5%	TOTAL	I Hl	(4*4%)	Wit	UE NßÖ	4*5%	¹TOTAL
	137	(92.0%)		MtSSED	138	SAMPLES	(6.3%)	Tk	*Q48		25,164
METHOD	127	(47.8%)	1	(0.7%)	138	FALSE-POSUTiVES	(0*7%)	24	>B84	(95kö%)	2έ,164
MCV²MCH '	66	(55.1%)	11	(8.0%)	138	1,116	(2.6%)	23	,903 _;	(93.7%)	25,164
Pearson	76		72	(52.2%)	138	1,580		24	,519	(99*3%)	25,164
Mentzer		62	(44.9%)		171		24		(97.4%)
England & Fräser					64S

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Claims

Ansprüche

Verfahren zur Erfassung von Trägern der Thalassamie, insbesondere der Beta-Thalassämie minor, gekennzeichnet durch eine an sich "bekannte Messung des mittleren Teilchenvolumens der roten Blutkörperchen sowie des mittleren Teilchenhämoglobins einer Blutprobe, durch Ableitung des Thalassämie-Index als mathematisches Produkt dieser beiden Parameter und durch Vergleich des Produkts mit einem vorbestimmten Schwellenwert des Thalassämie-Index, wobei der Betrag, um den der ^halassämie-Indexwert unter dem Schwellenwert liegt, proportional zu der Wahrscheinlichkeit ist, daß die Probe von einem Thalassämie-Träger stammt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ableitung des Thalassamie-Index der Quadratwert des mittleren Teilchenvolumens zur Bildung des Produkts mit dem mittleren Teilchenhämoglobingehalt verwendet wird.

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3· Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Blutproben einer Hämoglobin-Elektrophorese unterzogen werden, dadurch gekennzeichnet, daß der !thalassämie-Index nur für die Proben des Genotypus AA abgeleitet und verglichen wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die an sich bekannte Bestimmung von Ap mindestens an den Proben vorgenommen wird, deren Thalassämie-Index unter dem Schwellenwert liegt.
5· Verfahren' nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Schwellenwert bei 1530 liegt.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Thalassämie-Indexwert männlicher Proben vor Durchführung des Vergleichs um ca.· 6,2% reduziert wird.

7- Anordnung zur Durchführung des Verfahrens nach den vorhergehenden Ansprüchen, gekennzeichnet durch eine an sich bekannte Einrichtung (12,14) zur Messung der Parameter mittleres Teilchenvolumen und mittlerer Teilchenhämoglobingehalt der roten Blutkörperchen einer Blutprobe, durch eine Einrichtung (22) zur Ableitung des Thalassämie-Index als mathematisches Produkt der zwei gemessenen Parameter und durch eine Einrichtung (16,24) zur Darstellung des abgeleiteten Thalassämie-Index zum Vergleich mit mindestens einem vorbestimmten Standard-Index, um zu ermitteln, mit welcher Wahrscheinlichkeit die Probe von einem Träger der Thalassämie stammt.

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^ Anordnung nach Anspruch 7i dadurch, gekennzeichnet, daß die Einrichtung (22) zur Bildung des als Thalassämie-

Index dienenden Werts (MCT) _x MCH ausgelegt ist.

· Anordnung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß -mindestens die Meßeinrichtungen (12,14) und vorzugsweise auch die den Thalassämie-Index liefernde Einrichtung(22) und die darstellende Einrichtung (16,24-) Teile eines selbsttätigen Blutkörperchen-Analysiergeräts sind.

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