DE2805607C3

DE2805607C3 - Production of bio-catalysts by polymer inclusion of microorganisms

Info

Publication number: DE2805607C3
Application number: DE19782805607
Authority: DE
Inventors: Joachim Prof. Dr. Klein; Christoph Dr. 6800 Mannheim Martin; Peter Dipl.-Chem. Dr. 6450 Hanau Schara; Fritz Prof. Dr. Wagner; Peter Dipl.-Chem. 3300 Braunschweig Washausen
Original assignee: 3300 BRAUNSCHWEIG
Current assignee: 3300 BRAUNSCHWEIG
Priority date: 1978-02-10
Filing date: 1978-02-10
Publication date: 1980-08-28
Also published as: DE2805607A1; DE2805607B2

Description

Erfindungsgegenstand ist das im Patentanspruch 1 angegebene Verfahren. Die Ansprüche 2 bis 11 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.The subject of the invention is the method specified in claim 1. Call the claims 2 to 11 Refinements of the invention.

Enzyme und Enzymsysteme sind von Bedeutung für industrielle biokatalytische Produktionsverfahren sowie für Analytik, Diagnostik und medizinisch-technische Anwendung. Die Gewinnung reiner Enzyme erfordert erheblichen Aufwand und hohe Kosten durch zahlreiche und aufwendige Verfahrensschritle.Enzymes and enzyme systems are important for industrial biocatalytic production processes as well for analysis, diagnostics and medical-technical applications. Obtaining pure enzymes requires considerable effort and high costs due to numerous and complex procedural steps.

Eine praktische Nutzung dieser erfahren ist im allgemeinen nur dann möglich, wen., das Enzym an einen makroskopischen Träger fixiert wird und dadurch mehrfach zum Einsatz gelangen kann. Die Herstellung eines Biokatalysators vom Typ »trägergebundenes Enzym« erfolgt üblicherweise in einem 3-Schritt-Verfahren: Practical use of this experience is generally only possible if the enzyme is used a macroscopic carrier is fixed and can therefore be used several times. The production a biocatalyst of the »carrier-bound enzyme« type is usually carried out in a 3-step process:

a. Gewinnung des Enzyms,a. Recovery of the enzyme,

b. Herstellung der Trägermatrix,b. Production of the carrier matrix,

c. Fixierung des Enzyms in der Matrix.c. Fixation of the enzyme in the matrix.

Jede Stufe ist dabei mit Aufwand, Kosten und teilweisen hohen Verlusten verbunden. So haben sich bisher nur wenige dieser Prozesse technisch durchsetzen können.Each level is associated with effort, costs and sometimes high losses. So have yourself so far only a few of these processes have been able to technically enforce.

Es wurden deshalb schon früher, wie weiter unten ausgeführt, Vorschläge zur Fixierung von Mikroorganismen als Träger von Enzymen gemacht. Ein besonderer Vorteil der Fixierung von ganzzelligen Mikroorganismen besteht aber auch darin, daß auch gesamte Enzymsysteme in einem Arbeitsgang fixiert werden können, so daß auch biokatalytische Verfahren für komplexe Reaktionsfolgen erschlossen werden. Der Stand der Technik ist in zwei kürzlich erschienenen Obersichtsartikeln referiert worden: T. R. Jack, J. E. Zajic, Adv. Biochem. Eng., Vol. 5 (1977), S. 125-145 und I. Chibata, T. Tosa, Adv. Appl. Microbiol., Vol. 22 (1977), S. 1-27.For this reason, proposals for the fixation of microorganisms have already been made earlier, as explained below made as a carrier of enzymes. A particular advantage of the fixation of whole cell Microorganisms also consist in the fact that entire enzyme systems are also fixed in one operation so that biocatalytic processes for complex reaction sequences can also be developed. Of the State of the art has been reported in two recent review articles: T. R. Jack, J. E. Zajic, Adv. Biochem. Eng., Vol. 5 (1977), pp. 125-145 and I. Chibata, T. Tosa, Adv. Appl. Microbiol., Vol. 22 (1977), pp. 1-27.

Es wird die adsorptive Bindung von Mikroorganismen an »DEAE-Cellulose« und Anionenaustauschern von Johnson und Ciegler in Arch. Biochem. Biophys. 130 (1969), 384-388 beschrieben. Scott und Hancher berichten in Biotechn. and Bioeng. 18 (1976), 1393 über Mikroorganismen, die an Anthrazit adsorbiert sind.It is the adsorptive binding of microorganisms to »DEAE cellulose« and anion exchangers by Johnson and Ciegler in Arch. Biochem. Biophys. 130 (1969), 384-388. Scott and Hancher report in Biotechn. and Bioeng. 18: 1393 (1976) above Microorganisms that are adsorbed on anthracite.

Im allgemeinen werden jedoch Einschlußverfahren zur Fixierung von Mikroorganismen angewendet. Es wurde vorgeschlagen, Mikroorganismen in Cellulosetriacetat-Fasem einzuschließen. Dazu wird auf Dinelli, Processes Biochem. Nr. 7 (1972), S. 9—12 verwiesen. Bei dieser Arbeitsweise sind stark toxisch wirkende Lösungsmittel wie Toluol oder Methylenchlorid erforderlich. Eine Regeneration der Mikroorganismen durch Wachstum innerhalb der Trägermatrix ist deshalb kaum möglich. Biopolymere wie Gelatine, Agar, Collagen werden ebenfalls zur Fixierung von Mikroorganismen vorgeschlagen. Aus Collagen werden dabei Membranen hergestellt. Nach partieller Trocknung wird diese Membran mit Glutardialdehyd vernetzt und damit stabilisiert Es ist jedoch nicht bekannt, ob die Zellen nach der Fixierung noch fähig sind zum Wachstum.In general, however, entrapment methods are used to fix microorganisms. It it has been proposed to entrap microorganisms in cellulose triacetate fibers. To do this, on Dinelli, Processes Biochem. No. 7 (1972), pp. 9-12. In this way of working are highly toxic Solvent such as toluene or methylene chloride required. A regeneration of the microorganisms through Growth within the carrier matrix is therefore hardly possible. Biopolymers such as gelatine, agar, collagen are also proposed for the fixation of microorganisms. Collagen is turned into membranes manufactured. After partial drying, this membrane is crosslinked with glutaraldehyde and thus stabilized However, it is not known whether the cells are still capable of growth after fixation.

Dazu wird auf Venkatasubramanian et al, J. Ferm. Techn. 52 (1974), S. 268—278 und auf Biotechn. und Bioeng. 15 (1973), S. 565—569 verwiesen.For this, reference is made to Venkatasubramanian et al, J. Ferm. Techn. 52 (1974), pp. 268-278 and to Biotechn. and Bioeng. 15 (1973), pp. 565-569.

Das am häufigsten angewendete Verfahren zur Fixierung von Mikroorganismen ist der Einschluß inThe most common method used to fix microorganisms is entrapment in

ίο Polyacrylamidgel.ίο polyacrylamide gel.

In den Offenlegungsschriften 22 52 815,24 14 128 und 24 20 102 werden diese Verfahren beschrieben. Danach soll zunächst ein weicher Polyacrylamidgel-Block hergestellt werden.In laid-open specifications 22 52 815, 24 14 128 and 24 20 102 this procedure is described. Then a soft polyacrylamide gel block should first be used getting produced.

Die Formgebung des Katalysators erfolgt mittels Pressung durch ein Sieb, wobei sehr unregelmäßig geformte, stark kantige Granulate von 2,5 bis 5 mm 0 erhalten werden. Solche Polyacrylamid-Gele sind jedoch sehr weich und kompressibel und deshalb für größere Festbettreaktoren nicht gut geeignet In einem fluidisieren oder gerührten Reaktor wird durch die Scharfkantigkeit unter der Einwirkung von Scherkräften sehr schnell ein hoher Abrieb erzeugt Hält man an Acrylamid als wesentlicher Monomerkomponente fest, so würden sich brauchbare mechanische Eigenschaften der Polyacrylamid-Gele erst bei hohen Polymerkonzentrationen von etwa 40% erreichen lassen. Es entstehen jedoch bei so hohen Polymerkonzentrationen im Gel wegen der Toxizität der Monomeren hohe Verluste an Enzymaktivität. Es tritt außerdem eine starke Erniedrigung des effektiven Diffusionskoeffizienten ein, da dieser exponentiell mit der Polymerkonzentration abnimmt.
Derartige Vorschläge haben sich deshalb nicht bewährt. Dieser Stand der Technik wird durch das Verfahren der Erfindung überwunden, welches diese Nachteile bei der Herstellung von Enzymträgern vermeidet.The catalyst is shaped by means of pressing through a sieve, very irregularly shaped, strongly angular granules of 2.5 to 5 mm diameter being obtained. However, such polyacrylamide gels are very soft and compressible and therefore not well suited for larger fixed-bed reactors.In a fluidized or stirred reactor, the sharp edges under the action of shear forces very quickly generate high abrasion.If you hold on to acrylamide as an essential monomer component, then it would usable mechanical properties of the polyacrylamide gels can only be achieved at high polymer concentrations of about 40%. However, with such high polymer concentrations in the gel, high losses of enzyme activity occur because of the toxicity of the monomers. In addition, there is a strong decrease in the effective diffusion coefficient, since it decreases exponentially with the polymer concentration.
Such proposals have therefore not proven their worth. This prior art is overcome by the method of the invention which avoids these disadvantages in the production of enzyme carriers.

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, zur Herstellung perlförmiger 3iokatalysatoren durch Einschluß von Mikroorganismen an Stelle von Acrylamid Methacrylamid zu verwenden, und den Katalysator aus der Polymerisationsreakiion in direkt verwendbare Perlform zu bringen.It is an object of the invention to produce beaded 3iocatalysts by the inclusion of Microorganisms instead of acrylamide to use methacrylamide, and the catalyst from the Bring polymerization reaction in directly usable bead form.

In der Offenlegungsschrift 22 60 184 wird die Polymerisation von Acrylamid und Methacrylamid in einem »Molekularsieb-Material« — das auch ein Polymerisat sein kann — beschrieben. Es soll durch diesen Vorschlag ein stabileres Granulat erzeugt werden. Dieses soll anschließend zur kovalenten Fixierung von Enzymen und anderen Proteinen in einem weiteren Arbeitsgang verwendet werden. Dieses Verfahren bietet nicht die Möglichkeit, Mikroorganismen einzuschließen.In the laid-open specification 22 60 184, the polymerization of acrylamide and methacrylamide in a »molecular sieve material« - which can also be a polymer - is described. It should go through this proposal a more stable granulate can be produced. This should then be used for covalent Fixation of enzymes and other proteins can be used in a further operation. This Process does not offer the possibility of enclosing microorganisms.

In der Offenlegungsschrift 23 43 633 wird die Herstellung eines perlförmigen Enzymträgers durch Copolymerisation von Acrylamid oder Methacrylamid vorgeschlagen. Die Polymerisation soll jedoch nicht in wäßriger Lösung und in Gegenwart eines Enzyms erfolgen. Auch hier ist die Herstellung der Matrix ein von der anschließenden kovalenten Enzymfixierung getrennter Arbeitsgang.In laid-open specification 23 43 633, the production of a pearl-shaped enzyme carrier is carried out by Proposed copolymerization of acrylamide or methacrylamide. However, the polymerization should not be in aqueous solution and in the presence of an enzyme. Again, the making of the matrix is one operation separate from the subsequent covalent enzyme fixation.

Nach dem Stand der Technik gelingt der Einschluß ganzer Mikroorganismen, jedoch sind Form und Stabilität der auf Acrylamid basierenden Polymerisate unzu eichend. Zur Vermehrungsfähigkeit der fixierten Mikroorganismen liegt bisher kein eindeutiges Ergebnis vor (siehe Jack et al, 1977); in der Technik wurde durchAccording to the prior art, the inclusion of whole microorganisms succeeds, but form and The stability of the acrylamide-based polymers is inadequate. To the ability of the fixed ones to multiply Microorganisms so far no clear result is available (see Jack et al, 1977); in technology was through

Zerstörung der Zellen sogar bewußt darauf verzichtet (s. Chibata et aL, 1977) und somit ein anderer Weg eingeschlagen, der komplexe Reaktionsfolgen ausschließt Destruction of the cells even deliberately renounced it (see Chibata et al, 1977) and thus a different way which rules out complex reaction sequences

Polymerisationsverfahren unter Mitverwendung von Methacrylamid liefern hinsichtlich Form und Stabilität gute Produkte, sie sind jedoch in der bisher beschriebenen Form nicht zum direkten Einschluß von Mikroorganismen in einem Arbeitsgang anwendbar, sondern auch ihrer erklärten Zielsetzung nach lediglich als Vorstufe in zwingender Kombination mit einer nachfolgenden kovalenten Anbindung von Enzymen.Polymerization processes using methacrylamide provide shape and stability good products, but in the form described so far they are not intended for the direct containment of microorganisms applicable in one step, but also only as a preliminary stage in mandatory combination with a subsequent covalent attachment of enzymes.

Das Verfahren der Erfindung überwindet diesen Stand der Technik nun da^- _h, daß zur Herstellung perlförmiger Biokatalysatoren unter Direkteinschluß von Mikroorganismen in einem Arbeitsgang Methacrylamid als einzige Monovinylverbindung verwendet wird, wogegen nach dem Stand der Technik offenbar ein technisches Vorurteil bestand.The method of the invention overcomes this prior art now that for production bead-shaped biocatalysts with direct inclusion of microorganisms in one operation methacrylamide is used as the only monovinyl compound, whereas according to the prior art apparently one technical prejudice existed.

Es ist überraschend, daß schon »Gele« mit 20 Gew.-% Polymergehalt praktisch brauchbare mechanische Eigenschaften aufweisen. Es ist weiter überraschend, daß die unter »Auswahl« von Methacrylamid hergestellten Blockpolymerisate wesentlich weniger kompressibel sind. Auch eine Rißbildung oder Bruch tritt bei Verwendung von Methacrylamid erst bei höherer Belastung auf.It is surprising that even "gels" with a polymer content of 20% by weight have practical mechanical properties. It is also surprising that the block polymers produced under "Selection" of methacrylamide are significantly less compressible. When methacrylamide is used, cracking or breakage also only occurs when the load is higher.

Es ist weiter Aufgabe der Erfindung, perlförmige Biokatalysatoren herzustellen, die eine ausreichende bis hohe Aktivität der fixierten Zellen gegenüber der Aktivität freier suspendierter Zellen aufweisen. Nach dem Verfahren der Erfindung können Mikroorganismen im vermehrungsfähigen Zustand, d. h. als lebende Zelle, fixiert werden. Dies kann für eine spätere Reaktivierung von Bedeutung sein.It is a further object of the invention to produce bead-shaped biocatalysts that have a sufficient to have high activity of the fixed cells versus the activity of free suspended cells. To The method of the invention can produce microorganisms in a state capable of reproduction, i.e. H. as a living cell, be fixed. This can be important for a later reactivation.

Das Vorurteil der Fachwelt gegen die alleinige Verwendung von Methacrylamid kann auch darin begründet sein, daß MAAm langsamer polymerisiert alsThe prejudice of the professional world against the sole use of methacrylamide can also be found in it there is reason to believe that MAAm polymerizes more slowly than

ίο AAm. Der längere Kontakt der Mikroorganismen mit dem Monomeren könnte zu hohe Mobilitätsverluste bewirken. Weiterhin ist bekannt, daß höhermolekulare lineare PMAAm in Wasser nicht mehr löslich sind und daß diese schlechteren Löslichkeitseigenschaften im Rahmen einer vernetzenden Polymerisation zu einer unregelmäßigen Struktur mit geringerer Festigkeit führen könnte.ίο AAm. The prolonged contact of the microorganisms with the monomer could cause too high a loss of mobility. It is also known that higher molecular weight linear PMAAm are no longer soluble in water and that these poor solubility properties in the Within the framework of a cross-linking polymerization to an irregular structure with lower strength could lead.

In der Oberwindung dieser Vorurteile wird nun durch das Verfahren der Erfindung überraschend der technisehe Vorteil erreicht, daß Katalysatorperlen von hoher Festigkeit bei alleiniger Verwendung von MAAm auch bei Monomerkonzentrationen erhalten werden, die relativ zu AAm so niedrig sind, daß eine befriedigende Aktivitätsausbeute unter Erhalt vermehrungsfähigerIn overcoming these prejudices, the method of the invention is now surprisingly technical The advantage achieved is that catalyst beads of high strength with the sole use of MAAm also be obtained at monomer concentrations which are so low relative to AAm that a satisfactory Activity yield while maintaining reproducible

Zellen gewährleistet ist.Cells is guaranteed.

Daten zur mechanischen Festigkeit von Polymerisaten auf der Basis von MAAm im Vergleich zu AAm sind in folgender Tabelle dargestellt.Data on the mechanical strength of polymers based on MAAm compared to AAm are shown in the following table.

Table 1

Relative Maßzahlen zur Frage der mechanischen Festigkeit von vernetzten PolymerisatenRelative measures for the question of the mechanical strength of crosslinked polymers

Nr.No. MonomersystemMonomer system 4% BisAAm4% up to AAm AA. BB. 6% BisAAm6% up to AAm (kg)(kg) (kg)(kg) 11 14% AAm14% AAm 4% BisAAm4% up to AAm 6,36.3 22 22 24% AAm24% AAm 4% BisAAm 0,4% MAS4% to AAm 0.4% MAS —- 44th 33 16% MAAm16% MAAm 4% BisAAm 0,8% MAS4% to AAm 0.8% MAS 10,610.6 7,57.5 44th 15,6% MAAm15.6% MAAm 4% BisAAm4% up to AAm 10,310.3 6,06.0 55 15,2% MAAm15.2% MAAm Füllstoff)Filler) 9,89.8 5,05.0 66th 24,0% MAAm24.0% MAAm 10,910.9 8,58.5 77th Nr. 4 + 25%No. 4 + 25% 14,214.2 15,415.4

*) Vernetzte* Polymer aus 35% AAm, 40% AN, 25% BisAAm.*) Cross-linked * polymer made from 35% AAm, 40% AN, 25% BisAAm.

Die in Tab. 1 enthaltenen Meßwerte sind — in Spalte A: mit dem »Pfizer Hardness Tester« und in Spalte B: mit dem »Stokes Monsanto Hardness Tester« (beide Geräte sind beschrieben in: R. Voigt, Lehrbuch der pharmazeutischen Technologie VEB-VIg. Volk und Gesundheit, Berlin 1974,5.195) ermittelt worden.
; Es handelt sich um die Auflagegewichte in kg, bei denen die Probekörper (A: Blöcke 5x5χ5 mm, B: 10 χ 1Ox 10 mm) zerbrachen.The measured values contained in Table 1 are - in column A: with the "Pfizer Hardness Tester" and in column B: with the "Stokes Monsanto Hardness Tester" (both devices are described in: R. Voigt, textbook of pharmaceutical technology VEB- VIg.Volks and Health, Berlin 1974.5.195).
; These are the applied weights in kg at which the test specimens (A: blocks 5 × 5 × 5 mm, B: 10 × 10 × 10 mm) broke.

Der Vergleich von Reihe 3 und 6 mit Reihe 1 und 2 zeigt die Überlegenheit der MAAm-Polymerisate bei gleicher Monomerkonzentratioii. Durch die Zugabe eines Comonomeren MAS in geringen Anteilen wird die Kompressibilität erniedrigt, ohne daß die Druckfestigkeit in Spalte A und B zu stark gesenkt wird.The comparison of rows 3 and 6 with rows 1 and 2 shows the superiority of the MAAm polymers same monomer concentration. By adding a comonomer MAS in small proportions, the Compressibility reduced without the compressive strength in column A and B being reduced too much.

Die Zugabe eines feinkörnigen Granulats eines polymeren Füllstoffes — bestehend aus MAAm, AN und Bis-AAm — ist nach dem Verfahren der Erfindung nicht zwingend, kann jedoch nach Reihe 7 zu guten Druckfestigkeiten führen. Es ergiht sich damit die Möglichkeit, die im Herstellungsprozeß der Katalysatorperlen noch notwendige Monomerkonzentration und damit auch toxische Nebenwirkungen gezielt zu senken.The addition of fine-grained granules of a polymer filler - consisting of MAAm, AN and Bis-AAm - is not mandatory according to the method of the invention, but can be good after row 7 Lead compressive strengths. There is thus the possibility of using the catalyst beads in the manufacturing process any necessary monomer concentration and thus also toxic side effects reduce.

Durch den Zusatz von Comonomeren und/oder von geeeigneten Füllstoffen können aber nicht nur die Kompressibilität und Toxizität, sondern auch die Löslichkeitseigenschaften im Innern des Katalysatorkornes sowie die Transporteigenschaften der Reaktanden gezielt beeinflußt werden.By adding comonomers and / or suitable fillers, however, not only the Compressibility and toxicity, but also the solubility properties inside the catalyst grain and the transport properties of the reactants can be specifically influenced.

Es wurde gefunden, daß die Polymerisationsgeschwindigkeit bei Verwendung des MAAm langsamer ist als mit AAm. Dies bedingt eine höhere Expositionsdauer der Mikroorganismen mit der toxischen Manomerlösung. Es ist deshalb- für eine schonende Fixierung vorteilhaft, wenn die Expositionsdäuer da-It has been found that the rate of polymerization is slower using the MAAm is as with AAm. This requires the microorganisms to be exposed to the toxic manomer solution for a longer period of time. It is therefore advantageous for a gentle fixation if the exposure duration

durch vermindert wird, daß der Mikroorganismus erst nach Polymerisationsbeginn, und zwar möglichst kurz vor dem Gelpunkt zur Monomerlösung gegeben wird, so daß eine gleichmäßige Dispergierung der Mikroorganismen ermöglicht wird. Der genaue Gelpunkt einer radikalisch initiierten Polymerisation hängt nicht nur von den Konzentrationen, der Temperatur und dem Lösungsmittel ab, sondern wird auch stark durch geringfügige Verunreinigungen im Sinne einer Inhibierung beeinflußt.is reduced by the fact that the microorganism only after the start of polymerization, and as short as possible is added to the monomer solution before the gel point, so that a uniform dispersion of the microorganisms is made possible. The exact gel point of a free-radically initiated polymerization not only depends depends on the concentrations, the temperature and the solvent, but is also strongly influenced by minor impurities influenced in terms of inhibition.

Der Gelpünkt wird daher nach dem Verfa'hren der Erfindung für das jeweilige System durch eine zeitlich leicht vorgezogene parallele Polymerisation der gleichen Stammlösungen bestimmt, wodurch unabhängig von absoluten kinetischer. Daten eine »Uhr« für den Reaktionsablauf des jeweiligen Ansatzes besteht.According to the method of the invention, the gel point is therefore timed for the respective system by a slightly preferred parallel polymerization of the same stock solutions determined, thus independent of absolute kinetic. Data, there is a "clock" for the reaction sequence of the respective approach.

Wird ein Polyacrylamidgel nach dem Stand der Technik dadurch zerkleinert, daß es durch ein Sieb gedrückt wird, so entstehen unregelmäßig geformte Teilchen (Granulate), die im Festbett hohen Druckverlust und im Wirbelbett hohen Abrieb verursachen. Durch Suspensionspolymerisation der wäßrigen Monomerlösung in einer organischen Phase wird nach dem Verfahren der Erfindung erreicht, daß die Vorteile der guten mechanischen Eigenschaften und der schonenden Fixierung mit der direkten Formgebung zu Katalysatorperlen kombiniert werden. Das bedeutet einen technischen Fortschritt hinsichtlich optimaler Reaktionsbedingungen (Verhältnis Volumen zu Oberfläche), guter Packungseigenschaften und Vermeidung von Abrieb.If a polyacrylamide gel according to the prior art is comminuted by passing it through a sieve is pressed, irregularly shaped particles (granules) are created, which cause high pressure loss in the fixed bed and cause high abrasion in the fluidized bed. By suspension polymerization of the aqueous monomer solution in an organic phase is achieved by the process of the invention that the advantages of good mechanical properties and gentle fixation can be combined with direct shaping into catalyst beads. That means a technical one Progress with regard to optimal reaction conditions (ratio of volume to surface area), good Packing properties and avoidance of abrasion.

Im Gegensatz zu Suspensionspolymerisationen »öl in Wasser« sind solche des Typs »Wasser in öl« vergleichsweise wenig durchgeführt worden. Unter Verwendung von Acrylamid ist der Einschluß von Enzymen durchgeführt worden, dazu wird auf die obengenannte Literatur verwiesen. Dieser Stand der Technik hat den Nachteil, daß durch die Verwendung von Polyacrylamid Produkte mit unbefriedigender mechanischer Stabilität entstehen und die genannten Suspensionsmittel hinsichtlich Dichte und Toxizität für den Einschluß von lebensfähigen Mikroorganismen in Methacrylamid ungeeignet sind. Das Verfahren der Erfindung verwendet dagegen Di-Ester der Phthalsäure wie z. B. Dibutylphthalat, die vorzugsweise geeignet sind. Diese sind gegenüber Mikroorganismen physiologisch nahezu inert und sind in der Dichte (DBPh = 1,047 g/cm³ Temp. 20⁰C) soweit der WasserphaseIn contrast to “oil in water” suspension polymerizations, those of the “water in oil” type have been carried out comparatively little. The inclusion of enzymes has been carried out using acrylamide, for which reference is made to the literature cited above. This prior art has the disadvantage that the use of polyacrylamide results in products with unsatisfactory mechanical stability and the suspension media mentioned are unsuitable in terms of density and toxicity for the inclusion of viable microorganisms in methacrylamide. The method of the invention, however, uses di-esters of phthalic acid such as. B. dibutyl phthalate, which are preferably suitable. These are almost inert physiologically against microorganisms and are in the density (DBPH = 1.047 g / cm ³ Temp. 20 ⁰ C) insofar as the water phase

ίο ähnlich, daß eine gleichmäßige Dispersion — ohne Sedimentation oder Flotation — erhalten werden kann. Als Suspensionsstabilisator hat sich ein Blockpolymerisat aus Propylenoxid und Äthylenoxid bewährt, aber auch andere Polymere mit geeigneter hydrophober/hyurophiler Balance sind einsetzbar. Neben dem Suspensionsstabilisator zur Zurückdrängung bzw. Vermeidung der Agglomeration kann auch Tensid zugesetzt werden. Ein derartiger Zusatz wie z. B. 0,03% Cetylalkohol kann zusammen mit der Einstellung entsprechender Rührbedingungen die Perlgröße des Biokatalysators kontrollieren und steuern. Findet gegen Ende der Polymerisation eine Agglomeration der Perlen statt, die das Abtrennen der organischen Phase durchaus erleichtert, so können diese Agglomerate mit einem Sieb in Verbindung mit einer Größenklassierung wieder leicht getrennt werden. Bei dem Einschluß von Mikroorganismen in Polyacrylamid ist bekannt, daß mit Senkung der Polymerisationstemperatur die Aktivitätsausbeute steigt (Chibata u. Tosa, Appl. Microbiol. 27 [1974], 878), (Shimizu et al., J.ίο similar to that even dispersion - without Sedimentation or flotation - can be obtained. A block polymer has proven to be the suspension stabilizer Proven from propylene oxide and ethylene oxide, but also other polymers with a suitable hydrophobic / hyurophilic Balance can be used. In addition to the suspension stabilizer for suppression or avoidance surfactant can also be added to the agglomeration. Such an addition such. B. 0.03% cetyl alcohol can Check the bead size of the biocatalyst together with the setting of the appropriate stirring conditions and control. If the pearls agglomerate towards the end of the polymerization, this leads to the separation the organic phase is made easier, these agglomerates can be connected to a sieve a size classification can be easily separated again. With the inclusion of microorganisms in polyacrylamide it is known that lowering the polymerization temperature increases the activity yield (Chibata u. Tosa, Appl. Microbiol. 27 [1974], 878), (Shimizu et al., J.

Ferment. Technol. 53 [1975], 77).Ferment. Technol. 53 [1975], 77).

Dies gilt nach eigenen Untersuchungen auch für PMAAm. Es wurde für ein Polymerisat aus 20% MAAm in Fixierungsversuchen mit Candida tropicalis bei einer Polymerisationstemperatur von +22⁰C eine Aktivitätsausbe Aktivitätsausbeute von 23%, bei +5° C jedoch von 44% gefunden.According to our own research, this also applies to PMAAm. However, it was found for a polymer of 20% MAAM in fixing tests with Candida tropicalis at a polymerization temperature of +22 ⁰ C a Aktivitätsausbe activity yield of 23% at + 5 ° C of 44%.

Nach dem Verfahren der Erfindung wird in den einzelnen Stufen des Verfahrens die KontaktzeitAccording to the method of the invention, the contact time in the individual steps of the method

Abb.! Reaktivierung der fixierten MikroorganismenFig.! Reactivation of the fixed microorganisms

Katal. Akt.
[mo(_ph/h] -10⁵ Catal. Act.
[mo ( _ph / h] -10 ⁵

Reinkubationszeit (h)Re-incubation time (h)

030 235/438030 235/438

'■"τ -Λ ^: '■ "τ -Λ ^:

ίοίο

Monomer/Mikroorganismus minimiert und außerdem wird durch variable Temperaturführung in den Verfahrensstufen 3 bis 5 eine möglichst hohe Aktivitätsausbeute erzielt, ohne daß die Zeit zur Herstellung des Biokatalysators mehr als technisch erforderlich verlängertwird. Monomer / microorganism is minimized and, moreover, is achieved through variable temperature control in the process stages 3 to 5 achieved the highest possible activity yield without the time to produce the Biocatalyst is extended more than is technically necessary.

Für den Fall, daß die Aktivität direkt nach dem Fixierungsschritt dennoch zu niedrig ist, bietet die Fixierung lebender Mikroorganismen den erheblichen Vorteil, daß durch Reinkubation mit Nährmedium im Innern des Biokatalysators eine Zellvermehrung erfolgt, ; welche die Aktivität eines desaktivierten Katalysators wieder erhöht.In the event that the activity is still too low immediately after the fixation step, the offers Fixation of living microorganisms has the significant advantage that by re-incubation with nutrient medium in the Cell multiplication takes place inside the biocatalyst; which the activity of a deactivated catalyst again increased.

Die Aktivitätszunahme in Abhängigkeit von der Expositionszeit der fixierten Mikroorganismen in der Nährlösung ist in A b b. 1 dargestelltThe increase in activity as a function of the exposure time of the fixed microorganisms in the Nutrient solution is in A b b. 1 shown

Zur Bestätigung, daß die Zunahme der Aktivität durch Zellvermehrung im Innern des Katalysators erreicht wird, wurde jeweils eine Analyse auf Phosphor durchgeführt. Tabelle 3 bestätigt die Zunahme der »Biomasse« im Polymerisat.To confirm that the increase in activity due to cell proliferation inside the catalyst is achieved, an analysis for phosphorus was carried out in each case. Table 3 confirms the increase in "Biomass" in the polymer.

Table 3

Phosphorgehalt des Biokatalysators in verschiedenen Stadien der ReinkubationPhosphorus content of the biocatalyst in different stages of re-incubation

MikroorganismusMicroorganism

Reak-React

livie-livie-

rungs·rungs ·

dauerduration

(h)(H)

P*)P *)

PoIy-MAAm Candida tropicalis 5 0,002PoIy-MAAm Candida tropicalis 5 0.002

PoIy-MAAm Candida tropicalis 12 0,008PoIy-MAAm Candida tropicalis 12 0.008

PoIy-MAAm Candida tropicalis 27 0,10PoIy-MAAm Candida tropicalis 27 0.10

PoIy-MAAm Candida tropicalis 55 0,18PoIy-MAAm Candida tropicalis 55 0.18

*) Analytisches Laboratorium Ilse Beetz, 8640 Kronach.*) Analytical Laboratory Ilse Beetz, 8640 Kronach.

Wachstum neuer Zellen im Katalysator durch Reinkubation ist jedoch nicht nur auf frisch fixierte Zellen beschränkt So konnten ruhende Zellen von Candida tropicalis, die 14 Tage lang kontinuierlich Phenol oxidiert hatten, wieder zum Wachstum gebracht werden, wodurch die Aktivität wieder ihren ursprünglichen Wert erreichte. Die Reinkubation kann auch mehrmals angewendet werden, wie ein 40 Tage dauernder Versuch bestätigt Nach durchschnittlich 8tägigem Einsatz als Katalysator wurde die Aktivität durch Reinkubation wieder erhöht, so daß insgesamt 5mal reinkubiert werden konnte und über 40 Tage eine im Mittel konstante Aktivität aufrechterhalten werden konnte.However, growth of new cells in the catalyst by re-incubation is not limited to freshly fixed cells. For example, dormant cells of Candida tropicalis, which had been continuously oxidizing phenol for 14 days, could be brought back to growth, whereby the activity returned to its original value. The re-incubation can also be used several times, as confirmed by a 40-day test. After an average of 8 days of use as a catalyst, the activity was increased again by re-incubation, so that a total of 5 reincubation could be carried out and an average constant activity could be maintained over 40 days.

Das Verfahren der Erfindung ist allgemein auf die verschiedensten Mikroorganismen anwendbar, auch wenn sich die Beispiele nur auf eine Auswahl beschränken. Das Verfahren der Erfindung zur Herstellung perlförmiger Biokatalysatorträger ist in den Patentansprüchen definiertThe method of the invention is generally applicable to a wide variety of microorganisms, too if the examples are limited to a selection. The method of the invention for making Bead-shaped biocatalyst support is defined in the claims

Unter »Gelpunkt« wird nach dem Verfahren der Erfindung der Zeitpunkt verstanden, zu dem in dem Polymerisationsansatz innerhalb einiger Sekunden der Übergang von einer zunächst niedrig viskosen Flüssigkeit zu einem nicht mehr fließfähigem Gelblock stattfindet Es ist in der Praxis ausreichend, den Gelpunkt durch Schütteln des vorgezogenen Parallelansatzes visuell festzustellen.Under "gel point" is understood according to the method of the invention, the point in time at which Polymerization approach, the transition from an initially low viscosity liquid within a few seconds to a gel block that is no longer flowable. In practice, it is sufficient that the Visually determine the gel point by shaking the parallel approach.

Unter Abkürzungen werden folgende Stoffe verstanden: The following substances are understood by abbreviations:

AAm AcrylamidAm acrylamide

AN AcrylnitrilAN acrylonitrile

6-APA 6-Aminopenicillansäure6-APA 6-aminopenicillanic acid

BisAAm N,N'-MethylenbisacrylamidBisAAm N, N'-methylenebisacrylamide

BFM BiofeuchtmasseBFM bio wet mass

BTM BiotrockenmasseBTM organic dry matter

DBPh DibutylphthalatDBPh dibutyl phthalate

DMAEMA DimethylaminoäthylmethacrylatDMAEMA dimethylaminoethyl methacrylate

MAAm MethacrylamidMAAm methacrylamide

MAS MethacrylsäureMAS methacrylic acid

PMAAm PolymethacrylamidPMAAm polymethacrylamide

TEMED TetramethyläthylendiaminTEMED tetramethylethylenediamine

Tris Tris-(hydroxymethy])-aminomethan.Tris Tris (hydroxymethy]) aminomethane.

Das Verfahren der Erfindung wird nachstehend beispielhaft beschrieben.The method of the invention is described below by way of example.

example 1

Mischung A:Mixture A:

2,5 g abzentrifugierte feuchte Zellmasse von Candida tropicalis wurden in 5 ml 0,9%-NaCl-Lösung suspendiert.2.5 g of centrifuged moist cell mass from Candida tropicalis was dissolved in 5 ml of 0.9% NaCl solution suspended.

Mischung B:Mixture B:

8,0 g Methacrylamid8.0 g methacrylamide

2,0 g Bisacrylamid2.0 g bisacrylamide

0,2 ml Methacrylsäure0.2 ml methacrylic acid

0,4 ml Dimethylaminoäthylmethacrylat
(Coinitiator)0.4 ml of dimethylaminoethyl methacrylate
(Coinitiator)

20 ml H₂O dest.
20 ml Phosphatpuffer pH 9,0 (0,1 molar)20 ml H ₂ O dist.
20 ml phosphate buffer pH 9.0 (0.1 molar)

0,04 mlThioäthanol.0.04 ml of thioethanol.

Mischung C:Mixture C:

5 ml 10%ige wäßrige Lösung von (NH₄)₂S₂O₈.5 ml of 10% aqueous solution of (NH ₄ ) ₂ S ₂ O ₈ .

40 Mischung D:40 mixture D:

300 ml Dibutylphthalat300 ml of dibutyl phthalate

0,3 g des am Anmeldetag unter der0.3 g of the on the filing date under the

Handelsbezeichnung »Pluronic L 61«
bekannten Propylenoxid/Äthylen-Trade name »Pluronic L 61«
known propylene oxide / ethylene

oxid/Blockcopolymers.oxide / block copolymers.

Es wird bei 22° C 30 Min. mit N₂ entlüftet und danach die Polymerisation durch Zugabe der Lösung C zur Lösung B eingeleitet In einem Parallelversuch wird festgestellt, daß der Gelpunkt 10 Min. nach Beginn der Polymerisation bei einer Temperatur von etwa 22⁰C eintritt Es wird dann nach 9 Min. die Lösung A zur Lösung B gegeben und in dieser gleichmäßig verteilt.It is at 22 ° C for 30 min. Deaerated with N ₂ and then passed into a parallel experiment, the polymerization by adding the solution C to solution B, it is determined that the gel point for 10 min. After starting the polymerization at a temperature of about 22 ⁰ C occurs After 9 minutes, solution A is added to solution B and distributed evenly in it.

Danach wird diese Mischung in die Lösung D, die sich in einem 1-1-Rundkolben befindet, eingeführt, in welcher die wäßrige Phase mit einem Propellerrührer bei etwa 150 U/Min, verteilt wird. Nach 20 Min. sind bereits agglomerierte Perlen entstanden, und nach weiteren 30 Min. ist die Polymerisation beendeL Diese Perlen werden vom Dibutylphthalat abfiltriertThen this mixture is in the solution D, which is in a 1-1 round bottom flask is inserted into which the aqueous phase is distributed with a propeller stirrer at about 150 rpm. After 20 minutes are already agglomerated pearls were formed, and after a further 30 minutes the polymerization was complete. These pearls are filtered off from the dibutyl phthalate

Es lassen sich durch leichtes Verreiben der agglomerierten Perlen auf einem 0,75-mm-Sieb Gel-Perlen folgender Siebfraktionen erhalten:Gel beads can be produced by gently rubbing the agglomerated beads on a 0.75 mm sieve receive the following sieve fractions:

65 0,5—0,75 mm: 32,4 g (54%)
0,4—0,5 mm: 20,4 g (34%)
0,25—0,4 mm: 6,8 g (12%).65 0.5-0.75 mm: 32.4 g (54%)
0.4-0.5 mm: 20.4 g (34%)
0.25-0.4 mm: 6.8 g (12%).

Es werden 10 g dieser Perlen entsprechend 10 cm³ in 400 ml 2,5-10-³M Phenollösung mit Luft begast und gerührt. Die Abnahme der Phenolkonzentration wird mittels Extinktion bei 270 um verfolgt. Diese beträgt 7,7-10-=Mol/h.There are 10 of these beads g corresponding to 10 cm ³ in 400 ml 2,5-10- ³ M phenol solution gassed with air and stirred. The decrease in the phenol concentration is followed by means of extinction at 270 μm. This is 7.7-10- = mol / h.

Die Zellkonzentration im Bio-Katalysator beträgt 0,04 g/cm³; die Aktivität von 1 g frei suspendierter Zellmasse beträgt 7-i0-⁴ Mol/h. Die Aktivität der fixierten Zellen beträgt 28% der Aktivität frei suspendierter Zellen. ι οThe cell concentration in the biocatalyst is 0.04 g / cm ³ ; the activity of 1 g of freely suspended cell mass is 7-I0- ⁴ mol / h. The activity of the fixed cells is 28% of the activity of freely suspended cells. ι ο

Example 2

Mischung A:Mixture A:

1,25 g Candida tropicalis in 4 ml 0,9%-NaCl-Lösung. 1.25 g Candida tropicalis in 4 ml 0.9% NaCl solution.

Mischung B:Mixture B:

8 g Methacrylamid
2 g Bisacrylamid
20 ml H₂O dest.8 g methacrylamide
2 g bisacrylamide
20 ml H ₂ O dist.

20 ml Phosphatpuffer pH 6, {c, 1 molar)
0,05 ml Tetramethyläthylem'ian . (TEMED) als
Coinitiator.20 ml phosphate buffer pH 6, {c, 1 molar)
0.05 ml of tetramethylethylamine. (TEMED) as
Coinitiator.

Mischung C:
2 ml (NHMixture C:
2 ml (NH

2020th

2525th

; 10%ige wäßrige Lösung.; 10% aqueous solution.

Mischung D:Mixture D:

300 ml Dibutylphthalat300 ml of dibutyl phthalate

0,15 g des am Anmeldetag unter der Handelsbezeichnung »Pluronic L 61« bekannten Produkts. 0.15 g of the product known on the filing date under the trade name "Pluronic L 61".

Es wird in einem Versuch festgestellt, daß der Gelpunkt 9 Min. nach Beginn der Polymerisation bei einer Temperatur von etwa 22° C eintritt Die Herstellung der Gelperlen erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.It is found in an experiment that the gel point 9 minutes after the start of the polymerization at at a temperature of about 22 ° C. The gel beads are produced as in Example 1 described.

Die Ausbeute an Gelperlen beträgt 50 g, entsprechend 88%.The yield of gel beads is 50 g, corresponding to 88%.

Die Gelperien werden mit folgenden Fraktionen erhalten:The gelperia are obtained with the following fractions:

0,5-0,75 mm: 24 g(48%)0.5-0.75 mm: 24 g (48%)

0,4-0,5 mm: 18,5 g (37%)0.4-0.5 mm: 18.5 g (37%)

0,25-0,4 mm: 7g(14%).0.25-0.4mm: 7g (14%).

4545

Die Aktivität von 1 g Katalysatorperlen der Fraktion 0,4—0,5 mm bei 30⁰C und einem pH-Wert von 6,7 beträgt 3,64-10~⁶ Mol/h. Die Aktivität der fixierten Zellen beträgt somit bei einer Zellkonzentration von 0.02 g/cm³ 23% der Aktivität der frei suspendierten Zellen.The activity of 1 g catalyst beads of the fraction 0.4-0.5 mm at 30 ⁰ C and a pH value of 6.7 is 3.64 to 10 ~ ⁶ mol / h. The activity of the fixed cells is thus 23% of the activity of the freely suspended cells at a cell concentration of 0.02 g / cm ^3.

Die nach Größe fraktionierten Perlen wurden 12 h lang bei 4° C mit steriler 0,9%iger NaCl-Lösung gewaschen, um an der Oberfläche haftende Zellen zu entfernen und dann jeweils 0,5 g = 0,5 cm³ in 100 ml sterilem Nährmedium (1 g Phenol, 1 g Hefeextrakt, 2 g NH4NO3, 2 g (NH₄J₂SO₄, Ig KH₂PO₄, 2 g K₂HPO₄ · 2 H₂O, 1 g Na₂HPO₄ - 2 H₂O, 0,2 g MgSO₄ · 7 H₂O, 0,2 g KCl, 11 mg ZnSO₄, 6 mg MnSO₄ - H₂O, 1 mg FeSO₄ - 7 H₂O, 0,3 mg COSO4 - 7 H₂O, 0,04 mg CuSO₄ · 5 H₂O, 0,001 mg kj und 1 mg Äthylendiamintetraessigsäure gelöst in 1000 ml destilliertem H₂O) in einem 1000 ml Erlenmeyerkolben mit 2 Schikanen suspendiert und auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 100 U/min und +3O⁰C inkubiert Die Reinkubation wurde chargenweise zu verschiedenen Zeiten abgebrochen und nach erneutem sorgfältigen 12stündigem Waschen (0,9%-NaCl-Lösung) der Perlen wurde deren Aktivität, wie im Beispiel 1 beschrieben, bestimmt. Sie betrug nach einer Reinkubationsdauer von 5 h 2-10-⁵ Mol/h (pro g Katalysatorperlen) entsprechend 126%; nach einer Reinkubationsdauer von 13—55 h 5-10-⁵Mol/h entsprechend 316%.The size-fractionated beads were washed for 12 hours at 4 ° C. with sterile 0.9% NaCl solution in order to remove cells adhering to the surface and then each 0.5 g = 0.5 cm ³ in 100 ml sterile Nutrient medium (1 g phenol, 1 g yeast extract, 2 g NH4NO3, 2 g (NH ₄ J ₂ SO ₄ , Ig KH ₂ PO ₄ , 2 g K ₂ HPO ₄ · 2 H ₂ O, 1 g Na ₂ HPO ₄ - 2 H ₂ O, 0.2 g MgSO ₄ · 7 H ₂ O, 0.2 g KCl, 11 mg ZnSO ₄ , 6 mg MnSO ₄ - H ₂ O, 1 mg FeSO ₄ - 7 H ₂ O, 0.3 mg COSO4 - 7 H ₂ O, 0.04 mg CuSO ₄ 5 H ₂ O, 0.001 mg kj and 1 mg ethylenediaminetetraacetic acid dissolved in 1000 ml of distilled H ₂ O) suspended in a 1000 ml Erlenmeyer flask with 2 baffles and on a rotary shaker at 100 U / min and + 3O ⁰ C incubated reincubation was batch terminated at different times and after renewed careful 12 hours, washing (0.9% NaCl-solution) of the beads was the activity as described in example 1 was determined. It was, after a reincubation period of 5 h 2-10 ⁵ mol / h (per g of catalyst beads) corresponding to 126%; after a period of reincubation 13-55 h 5-10- ⁵ mol / h, corresponding to 316%.

Example 3

Mischung A:Mixture A:

10 g Candida tropicalis in 5 ml 0,9%-NaCl-Lösung.10 g Candida tropicalis in 5 ml 0.9% NaCl solution.

Mischung B:Mixture B:

83 ml folgender Mischung:83 ml of the following mixture:

16 g Methacrylamid16 g methacrylamide

4 g Bisacrylamid4 g bisacrylamide

0,5 ml Methacrylsäure0.5 ml methacrylic acid

40 ml Phosphat-Puffer pH 3,0 (0,1 molar)40 ml phosphate buffer pH 3.0 (0.1 molar)

40 ml H₂O dest.40 ml H ₂ O dist.

0,1 ml TEMED.0.1 ml TEMED.

Mischung C:Mixture C:

2 ml (NH₄J₂S₂O₈; 10%ige wäßrige Lösung.2 ml (NH ₄ I ₂ S ₂ O ₈ ; 10% aqueous solution.

Mischung D:Mixture D:

400 ml Dibutylphthalat400 ml of dibutyl phthalate

0,4 g des am Anmeldetag unter der Handelsbezeichnung »Pluronic L 61« bekannten Produkts. 0.4 g of the product known on the filing date under the trade name "Pluronic L 61".

Es werden die Lösungen A, B, D mit Eiswasser auf 0-5⁰C gekühlt.There are the solutions A, B, D cooled with ice water to 0-5 ⁰ C.

Es wird in einem Versuch festgestellt, daß der Gelpunkt bei 0—5⁰C 45 Min. nach Beginn der Polymerisation eintritt.It is found in a test that the gel point at 0-5 ⁰ C for 45 min. After the start of polymerization occurs.

Die Herstellung der Gel-Perlen erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.The gel beads are produced as in the example 1 described.

Es wurde die Zellsuspension nach 35 Min. zur Monomerlösung B zugegeben. Nach Zugabe der Lösung B zur Lösung D wird die Kühlung von der Lösung D entfernt. Diese steigt danach auf etwa 20⁰C an. Nach 3 h werden die Gel-Perlen vom Dibutylphthalat abfiltriert. Die Herstellung der Siebfraktionen erfolgt gemäß Beispiel 1. Die Aktivität von 1 g Katalysator-Perlen beträgt 2,19-10"⁵ Mol/h bei einer Zellkonzentration von 0,1 g/cm³. Da die Aktivität der frei suspendierten Zellen 5-10-⁴Mol/h beträgt, liegt die relative Aktivität der fixierten Zellen bei 44%.The cell suspension was added to monomer solution B after 35 minutes. After the addition of the solution B to the solution D, the cooling of the solution D is removed. This then rises to about 20 ^° C. After 3 hours, the gel beads are filtered off from the dibutyl phthalate. The sieve fractions are produced according to Example 1. The activity of 1 g of catalyst beads is 2.19-10 " ⁵ mol / h at a cell concentration of 0.1 g / cm ^3. Since the activity of the freely suspended cells is 5-10 - ⁴ mol / h, the relative activity of the fixed cells is 44%.

Example 4

Dieses wird wie Beispiel 2 durchgeführt, jedoch mit dem Unterschied, daßThis is carried out as in Example 2, but with the difference that

Mischung A:Mixture A:

2,5 g Escherichia coli in 5 ml 0,9%-NaCl-Lösung enthält2.5 g Escherichia coli in 5 ml 0.9% NaCl solution contains

Die Herstellung der Gel-Perlen erfolgt nach Beispiel 1. Die Aktivität der fixierten Mikroorganismen, Penicilinamidase, wird bei 37° C und einem pH-Wert von 8,0 in einem Festbettreaktor mit Rührkessel-Charakteristik (Umlauf) verfolgt Die Konzentration der gebildeten 6-Aminopenicillansäure wird nach der Methode von Balasingham et al. photometrisch bei 415 nm bestimmt (E = 100). Dazu wird auf Biochem. et Biophys. Acta 276(1972), 250—256 verwiesen.The gel beads are produced according to the example 1. The activity of the fixed microorganisms, penicillin amidase, is measured at 37 ° C and a pH of 8.0 in a fixed bed reactor with stirred tank characteristics (circulation) tracked the concentration of 6-aminopenicillanic acid formed is according to the method of Balasingham et al. photometric at 415 nm determined (E = 100). For this purpose, Biochem. et Biophys. Acta 276 (1972), 250-256.

Es werden 0,5 ml Reaktorinhalt mit 3,5 ml Reagenzlösung versetzt. Es wird danach die Extinktion nach 15 Min. bestimmt.There are 0.5 ml of reactor contents with 3.5 ml of reagent solution offset. The extinction is then determined after 15 minutes.

Die Reagenzlösung hat folgende Zusammensetzung:The reagent solution has the following composition:

0,5 ml Dimethylaminobenzaldehyd;
0,5% (w/v) in Methanol
2,OmI Eisessig; 20%ige Lösung
1,0 ml NaOH; 0,5 M.0.5 ml of dimethylaminobenzaldehyde;
0.5% (w / v) in methanol
2, OmI glacial acetic acid; 20% solution
1.0 ml NaOH; 0.5 M.

Die Aktivität der Penicillinamidase von 2,5 g frei suspendierten Escherichia coli Zellen beträgt 1,25 mMol 6-APA/h.The penicillin amidase activity of 2.5 g of freely suspended Escherichia coli cells is 1.25 mmol 6-APA / h.

Die Aktivität der ge —,nen fixierten Zellmenge beträgt 0,9 mMol 6-APA/h, entsprechend 73% der Aktivität der frei suspendierten Zellen.The activity of the gene, fixed amount of cells is 0.9 mmol 6-APA / h, corresponding to 73% of the activity of the freely suspended cells.

Example 5

Mischung A:Mixture A:

10 g E. coli Biofeuchtmasse
5 ml 0,9%-NaCl-Lösung.10 g E. coli wet biomass
5 ml 0.9% NaCl solution.

Mischung B:Mixture B:

8 g Methacrylamid8 g methacrylamide

2 g Ν,Ν'-Methylendiacrylamid2 g Ν, Ν'-methylenediacrylamide

20 ml Phosphat-Puffer pH 6,7 (0,1molar)
10 ml H₂Odest.20 ml phosphate buffer pH 6.7 (0.1 molar)
10 ml H ₂ Odest.

03 ml TEMED.03 ml TEMED.

Mischung C:Mixture C:

4 ml (NH₄J₂S₂O₈; 10%ige wäßrige Lösung.4 ml (NH ₄ I ₂ S ₂ O ₈ ; 10% aqueous solution.

Mischung D:Mixture D:

300 ml Dibutylphthalat300 ml of dibutyl phthalate

0,3 g des am Anmeldetag unter der Handelsbezeichnung »PluronicL61« bekannten Produkts. 0.3 g of the product known on the filing date under the trade name »PluronicL61«.

Zur Lösung B wird als Initiator die Lösung C gegeben. In diesen Polymerisationsansatz wird kurz vor Erreichen des Gel-Punktes die Lösung A eingerührt, dann wird die Mischung aus A, B und C in D suspendiert Nach einer Stunde Rühren werden die erhaltenen Polymerisatperlen durch Filtrieren abgetrennt und durch Waschen mit 0,9%iger NaCl-Lösung vom anhaftenden Dibutylphthalat befreitSolution C is added to solution B as an initiator. Solution A is stirred into this polymerization mixture shortly before the gel point is reached, then the mixture of A, B and C is suspended in D After stirring for one hour, the obtained Polymer beads separated by filtration and washed with 0.9% NaCl solution from adhering dibutyl phthalate freed

Sowohl die Reaktoren als auch die Monomeren müssen vorher durch Stickstoff sorgfältig sauerstofffrei gemacht werden. Bis zum Gelpunkt wird die Temperatur auf 0°C gehalten, dann vollzieht sich die Polymerisation bei Raumtemperatur. Der zeitliche Eintritt des Gelpunktes wird an einem Parallelversuch (Monomere + Initiator) — der unter den oben· angegebenen Bedingungen stattfindet — festgestellt.Both the reactors and the monomers must first be carefully deoxygenated by means of nitrogen be made. The temperature is kept at 0 ° C up to the gel point, then it takes place Polymerization at room temperature. The timing of the gel point is based on a parallel experiment (Monomers + initiator) - which takes place under the conditions given above - determined.

Die Ausbeute beträgt 51 g Katalysatorfeuchtmasse (Perldurchmesser 0,25—0,75 mm).The yield is 51 g of wet catalyst mass (bead diameter 0.25-0.75 mm).

Die fixierten Mikroorganismen besitzen noch 57% der Aktivität frei suspendierter Zellen.The fixed microorganisms still have 57% of the activity of freely suspended cells.

Example 6

Mischung A:Mixture A:

2,5 g BFM Bovista plumbea = 300 mg Βΐν,-Trokkenmasse (BTM) (bereits zerklei. rt) wur2.5 g BFM Bovista plumbea = 300 mg Βΐν, dry matter (BTM) (already chopped up) was

den in 10 ml Phosphat-Puffer 0,1 ,H 6,7 suspendiert.suspended in 10 ml of phosphate buffer 0.1, H 6.7.

Mischung B:Mixture B:

16 mg Methacrylamid16 mg methacrylamide

4 g Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid4 g Ν, Ν'-methylenebisacrylamide

25 ml Phosphat-Puffer pH 6,7 (0,1 molar)25 ml phosphate buffer pH 6.7 (0.1 molar)

55 ml H₂O dest55 ml H ₂ O dist

0,2 ml TEMED = 0,2%.0.2 ml TEMED = 0.2%.

Mischung C:Mixture C:

4 ml 10%ige wäßrige Lösung von (NRt)₂S₂O₈.4 ml of 10% aqueous solution of (NRt) ₂ S ₂ O ₈ .

Mischung D:Mixture D:

250 ml Dibutylphthalat250 ml of dibutyl phthalate

0,125 g des am Anmeldetag unter der Handelsbezeichnung »PluronicL61« bekannten Produkts. 0.125 g of the on the filing date under the trade name »PluronicL61« known product.

A und D wurden mit Eiswasser gekühlt. 25 ml von B und 1 ml von C wurden im vorgezogenen Parallelversuch zur Bestimmung des Gelpunktes abgezweigt.A and D were cooled with ice water. 25 ml of B and 1 ml of C were used in the preferred parallel experiment branched off to determine the gel point.

Drei Min. danach wurde C zu B zugegeben und damit auch dort die Polymerisation gestartet Der Gelpunkt trat nach 8 Min. auf, eine Minute später, also 2 Min. vor dem erwarteten Gelpunkt, wurde A zu B gegeben und dort durch Schütteln des Gefäßes gut verteilt und dann sofort zu D gegeben und mit einem Propellerrührer bei Ϊ50 U/Min, suspendiert. Die Kühlung von D wurde nun entfernt, um eine schnellere und bessere Aushärtung der Perlen zu erreichen. Nach 1 h wurde die Polymerisation beendet, die entstandenen Perlagglomerate mit einem Sieb vom Dibutylphthalat abgetrennt und mit Wasser gewaschen. Über eine Siebfraktionierung wurden die 'Katalysatorperlen gewonnen, die im Korngrößenbereich d = 0,25—0,75 mm 65% der Masse des Biokatalysators darstellen.Three minutes later, C was added to B and the polymerization started there too. The gel point occurred after 8 minutes, one minute later, i.e. 2 minutes before the expected gel point, A was added to B and there by shaking the vessel well distributed and then immediately added to D and suspended with a propeller stirrer at Ϊ50 rpm. The cooling of D has now been removed in order to achieve a faster and better hardening of the beads. After 1 hour, the polymerization was ended, and the resulting pearl glomerates were separated from the dibutyl phthalate with a sieve and washed with water. The catalyst pearls, which represent 65% of the mass of the biocatalyst in the particle size range d = 0.25-0.75 mm, were obtained by sieve fractionation.

Messung der Reaktionsgeschwindigkeit der Spaltung von Penicillin V zu 6-Aminopenicillansäure: Die PerlenMeasurement of the reaction rate of the cleavage of penicillin V to 6-aminopenicillanic acid: The pearls

so wurden bei 37° C in 80 ml einer 0,05molaren Lösung von Penicillin V in O.lmolarem Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) 2 h lang geschüttelt Die Aktivität dieser Perlen betrug 41 % bezogen auf die Aktivität der eingesetzten freien Zellmasse.so were at 37 ° C in 80 ml of a 0.05 molar solution of Penicillin V in 0.1 molar Tris-HCl buffer (pH 7.5) for 2 h shaken for a long time The activity of these beads was 41% based on the activity of the free ones used Cell mass.

Claims

Patent claims:

1. Process for the production of biocatalysts by polymer inclusion of microorganisms, characterized in that in stage 1 the mixtures

A. consisting of the components:

a) the wet or dry cell mass of reproductive or dead microorganisms and

. b) a physiological aqueous salt solution that may be required to achieve this the flowability of A,

B. consisting of the solution or dispersion of the components:

c) Methacrylamide in an amount of 60 to 90 wt .-%, based on the sum of the Components c) and d),

d) a water-soluble divinyl compound '■ such as Ν, Ν'-methylenebisacrylamide as a crosslinking agent in an amount of 10 to 30% by weight, based on the total monomer amount c) and d), in

e) water, which is used to adjust a pH value of 7 to 9 in the mixture B acids, Alkalis or buffer substances are added,

C. consisting of:

f) a water-soluble free radical initiator such as peroxodisulfate in an amount of 0.05 to 2.0% by weight, based on the sum of components b) to g), and

g) water in the ratio f) to g) up to 30: 100,

D. consisting of:

h) a water-immiscible suspension

sion liquid and a
i) suspension stabilizer in the ratio of h) to i) = 10,000: 1 to 1,000 parts by weight,

be prepared in such a way that, in order to achieve high mechanical stability, the sum of components c) to d) is 10 to 50% by weight of the sum of components b) to g), component a) is up to 40% by weight, based on the sum of the mixtures A + B + C, the volume ratio of the mixture D to the sum of the mixtures A + B + C is at least or greater than 2: 1,
then in stage 2 the polymerization by preparing a mixture of B and C from stage 1, in such a ratio that in the system of components b) to g) a concentration of f) in the range from 0.05 to 2 , 0 wt .-% is set, is introduced at a temperature between -5 ⁰ C and + 8O ⁰ C with stirring and in stage 3 shortly before entry of the gel point of mixture A from stage 1 and the mixture from stage 2 by stirring a uniform distribution is brought about in such a way that in the system of components a) to g) the sum of components c) to d) is 0 to 50% by weight and the amount of components a) to 40% by weight .-% of the mixture a) to g) makes up,

then in stage 4 the system from stage 3 is introduced into the mixture D from stage 1 with stirring to produce a pearly liquid-liquid suspension in the volume ratio of the system from stage 3 to mixture D at least of 2: 1, so that a suspension of aqueous reached in the non-aqueous phase and the suspension polymerization is carried out at a temperature between -5 ° C and + 80 ⁰ C until completion,

then in stage 5 the bead-shaped bio-catalyst produced from the liquid suspension phase separated and washed with physiological saline solution.

2. The method according to claim 1, characterized in that that in stage 1 comonomers to set certain network properties in a Amount of up to 30% by weight, based on c) to d), can be added.

3. The method according to claim 2, characterized in that in step 1 as comonomers methacrylic acid and / or dimethylaminoethyl methacrylate in an amount of up to 30% by weight, based on the Components c) to d) are added.

4. The method according to claim 1, characterized in that in step 1 to accelerate the Initiator disintegration a coinitiator in an amount of 0.05 to 2.0 wt%, based on the sum of the Components b) to g) is added.

5. The method according to claim 1, characterized in that in step 1 to accelerate the Initiator decay as a coinitiator in tetramethylethylenediamine or dimethylaminoethyl methacrylate in an amount of 0.05 to 2.0% by weight, based on the sum of components b) to g) will.

6. Method according to claim 1, wherein in stage 1 to Increasing the compressive strength of the bio-catalyst in reactions in aqueous systems a water-insoluble one polymer filler is used in finely divided form, characterized in that as water-insoluble polymer filler in finely divided form a hydrophilic, water-insoluble polymer Filler is used.

7. The method according to claim 6, characterized in that the hydrophilic, water-insoluble polymer filler a polymer made from bisacrylamide or a terpolymer of N, N ~ -methylene bisacrylamide, Methacrylamide and acrylamide is used.

8. The method according to claims 1 to 7, characterized in that for the production of a bio-catalyst, which contains viable microorganisms, in stage 4 a diester of phthalic acid with alkanols from Ci to C10 as suspension liquid is used.

9. Process according to claims 1 to 8, characterized in that as a suspension stabilizer in Stage 4 block copolymers of propylene oxide with ethylene oxide with a predominant proportion of propylene oxide and having a molecular weight over 1000 or random copolymers of methyl methacrylate and Acrylamide in a ratio of 4 to 9: 1 in a concentration of 0.05 to 5% by weight, based on component 1 can be used.

10. The method according to claim 1, characterized in that for the production of a bio-catalyst, which contains viable microorganisms, in

in stages 3 and "4 a temperature of -5" C to + 10 ⁰ C and in stage 5 a temperature of 0 ⁰ C to + 30 ° C is set.

11. The method according to claim 1, characterized in that there is located in the bio-catalyst Microorganisms in addition in a nutrient medium necessary for growth for one reincubated one or more times for a certain period of time