DE2729124B2

DE2729124B2 - Enzymatic cholesterol assay reagent and method for determining the concentration of cholesterol in a sample containing cholesterol using this reagent

Info

Publication number: DE2729124B2
Application number: DE19772729124
Authority: DE
Inventors: Andrew W. Anaheim Calif. Perry (V.St.A.)
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1976-07-01
Filing date: 1977-06-28
Publication date: 1980-08-21
Also published as: CA1096282A; JPS587280B2; FR2356937A1; CH623935A5; FR2356937B1; JPS533890A; DE2729124A1

Description

a) etwa 0,2 bis etwa 5 internationale Einheiten Cholesterinoxidase pro ml Reagens,a) about 0.2 to about 5 international units of cholesterol oxidase per ml of reagent,

b) etwa 0 bis etwa 5 internationale Einheiten Cholesterinesterase pro ml Reagens,b) about 0 to about 5 international units of cholesterol esterase per ml of reagent,

dadurch gekennzeichnet, daß es außerdemcharacterized in that it is also

c) etwa 0,01 bis etwa 0,4 Gew.-%, bezogen auf das Reagens, des kationischen oberflächenaktiven Mittels enthältc) from about 0.01 to about 0.4% by weight, based on the reagent, of the cationic surfactant Contains means

2525th

3. Reagens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet daß das kationische oberflächenaktive Mittel ausgewählt wird aus einer Gruppe, die besteht aus quaternären Imidazolinium-, Pyridinium-, Chinolinium- und quaternären Ammonium- oberflächen- aktiven Mitteln.3. Reagent according to claim 2, characterized in that the cationic surface-active Agent is selected from a group consisting of quaternary imidazolinium, pyridinium, quinolinium and quaternary ammonium surface active means.

4. Reagens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet daß es sich bei dem kationischen quaternären Ammonium- oberflächenaktiven Mittel um ein Alkyldimethylbenzylammoniumsalz handelt J5 4. Reagent according to claim 3, characterized in that the cationic quaternary ammonium surfactant is an alkyldimethylbenzylammonium salt J5

5. Reagens nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkyldimethylbenzylammoniumsalz ausgewählt wird aus einer Gruppe, die besteht aus Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid und Mischungen davon, wobei der Alkylrest 8 bis 18 Kohlenstoffatome enthält.5. Reagent according to claim 4, characterized in that the alkyldimethylbenzylammonium salt is selected from a group consisting from alkyldimethylbenzylammonium chloride and mixtures thereof, the alkyl radical 8 to 18 Contains carbon atoms.

6. Reagens nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Alkyldimethylbenzylammoniumsalz um eine Mischung aus etwa 50%6. reagent according to claim 4, characterized in that it is a mixture of about 50% in the alkyldimethylbenzylammonium salt Natriumtetradecyldimethylbenzylammoniumchlorid, etwa 40% Natriumdodecyldimethylbenzylammoniumchlorid und etwa 10% Natriumhexadecyldimethylbenzylammoniumchlorid handelt.Sodium tetradecyldimethylbenzylammonium chloride, about 40% sodium dodecyldimethylbenzylammonium chloride and about 10% sodium hexadecyldimethylbenzylammonium chloride.

7. Reagens nach den Ansprüchen 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem ein Gallensäuresalz und ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel enthält. 7. Reagent according to claims 2 to 6, characterized in that it also contains a bile acid salt and a non-ionic surfactant.

8. Reagens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Gallensäuresalzgehalt etwa 0,01 bis etwa 0,1 Gew.-% und der Gehalt des « nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels etwa 0,05 bis etwa 0,4 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Reagens, betragen. 8. reagent according to claim 7, characterized in that the bile acid salt content about 0.01 to about 0.1 wt .-% and the content of the "nonionic surfactant about 0.05 to about 0.4 wt .-%, each based on the reagent.

9. Reagens nach Anspruch 8, bestehend aus oder enthaltend: mi9. Reagent according to claim 8, consisting of or containing: mi

a) den Puffer in einer zur Herstellung einer Lösung mit einem pH-Wert von etwa 6 ausreichenden Menge,a) the buffer in one for the preparation of a solution with a pH value of about 6 sufficient quantity,

b) etwa 1,2 internationale Einheiten Cholesterin- μ oxidase pro ml Reagens,b) about 1.2 international units of cholesterol- μ oxidase per ml of reagent,

c) etwa 0,014 internationale Einheiten Cholesterinesterase pro mi Reagens, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem enthält: c) about 0.014 international units of cholesterol esterase per ml of reagent, characterized in that it also contains:

d) etwa 0,08 Gew.-% des Gallensäuresalzes, bezogen auf das Reagens,d) about 0.08% by weight of the bile acid salt, based on the reagent,

e) etwa 0,05 Gew.-% Isooctylphenoxypolyäthoxyäthanol, bezogen auf das Reagens, unde) about 0.05% by weight of isooctylphenoxypolyethoxyethanol, based on the reagent, and

f) etwa 0,1 Gew.-% eines Alkyldimethylbenzylammoniumsalzes, bezogen auf das Reagens.f) about 0.1% by weight of an alkyldimethylbenzylammonium salt, based on the reagent.

10. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es in gefriergetrockneter Form vorliegt10. Reagent according to claim 1, characterized in that it is in freeze-dried form is present

11. Verfahren zur Bestimmung der Cholesierinkonzentration in einer Cholesterin enthaltenden Probe, welches die folgenden Stufen umfaßt:11. Method for determining the concentration of cholesierin in a containing cholesterol Sample, which comprises the following stages:

a) Oxidieren des in der Probe in einer mit Sauerstoff gesättigten wäßrigen Lösung enthaltenden Cholesterins mittels eines enzymatischen Cholesterin-Assay-Reagens nach den Ansprüchen 1 bis 10, das Cholesterinoxidase und gegebenenfalls Cholesterinesterase und einen Puffer in einer Menge zur Erzielung einer Lösung mit einem pH-Wert zwischen etwa 5,5 und etwa 8 enthält, in Gegenwart eines Sensors, der dazu dient eine Eigenschaft des Sauerstoffs in der Lösung, die in Beziehung steht zu der Sauerstoffkonzentration derselben, zu überwachen,a) Oxidizing the cholesterol contained in the sample in an aqueous solution saturated with oxygen by means of an enzymatic cholesterol assay reagent according to the Claims 1 to 10, the cholesterol oxidase and optionally cholesterol esterase and a buffer in an amount to achieve a solution having a pH between about 5.5 and contains about 8, in the presence of a sensor, which serves a property of the oxygen in the solution, which is related to the oxygen concentration thereof, to be monitored,

b) Erzeugen eines ersten elektrischen Signals in Abhängigkeit von der Sauerstoffkonzentration,b) generating a first electrical signal as a function of the oxygen concentration,

c) Differenzieren des ersten elektrischen Signals zur Erzeugung eines Ausgangssignals proportional zu der augenblicklichen Änderungsrate der Sauerstoffkonzentration undc) differentiating the first electrical signal to produce an output signal proportional to the instantaneous rate of change the oxygen concentration and

d) Messen des Ausgangssignals zur Bestimmung der Cholesterinkonzeniration,d) measuring the output signal to determine the cholesterol concentration,

dadurch gekennzeichnet, daß mancharacterized in that one

e) praktisch alle Sauerstoffverbrauchshemmwirkungen der in der zu untersuchenden Probe vorhandenen Hemmittel neutralisiert durch Zugabe eines kationischen oberflächenaktiven Mittels.e) practically all oxygen consumption inhibiting effects in the sample to be examined Any inhibitor present is neutralized by adding a cationic surfactant Means.

Beschreibungdescription

Die Erfindung betrifft ein enzymatisches Cholesterin-Assay-Reagens, das Cholesterinoxidase und gegebenenfalls Cholesterinesterase und einen Puffer in einer solchen Menge enthüll, daß eine Lösung mit einem pH-Wert zwischen etwa 5,5 und etwa 8 erzielt wird, sowie ein Verfahren zur Bestimmung der Cholesterinkonzentration in einer Cholesterin enthaltenden Probe, das unter Verwendung dieses Reagens durchgeführt wird. The invention relates to an enzymatic cholesterol assay reagent which reveals cholesterol oxidase and optionally cholesterol esterase and a buffer in such an amount that a solution with a pH value between about 5.5 and about 8 is obtained, and a method for determining the Concentration of cholesterol in a sample containing cholesterol carried out using this reagent.

Die derzeit im Handel erhältlichen enzymatischen Reagentien, in denen Cholesterinoxidase zur Bestimmung des Cholesterins in einer Probe verwendet wird, messen die Menge des durch die Umsetzung zwischen Sauerstoff und Cholesterin gebildeten Wasserstoffperoxids, die als Maß für den Cholesteringehalt in der Probe genommen und aus der der Cholesteringehalt der Probe errechnet wird. Die Wasserstoffperoxidrnessungen beruhen im allgemeinen auf der Umsetzung The currently commercially available enzymatic reagents in which cholesterol oxidase is used to determine the cholesterol in a sample, measure the amount of hydrogen peroxide formed by the reaction between oxygen and cholesterol, which is taken as a measure of the cholesterol content in the sample and from that of the cholesterol content the sample is calculated. The hydrogen peroxide measurements are generally based on the reaction

zwischen Wasserstoffperoxid und einem Farbstoff, die eine Farbänderung hervorruft Diese Farbänderung wird bestimmt und daraus wird ein Wert errechnet, der die Menge des vorhandenen Wasserstoffperoxids anzeigt sbetween hydrogen peroxide and a dye that causes a color change This color change is determined and from this a value is calculated that indicates the amount of hydrogen peroxide present s

Reduzierende Substanzen, wie Glutathion, Ascorbinsäure und Harnsäure, die in menschlichen Flüssigkeiten vorkommen, reagieren mit Wasserstoffperoxid und verhindern die Umsetzung des Wasserstoffperoxids mit dem Farbstoff. Dies führt zu einem Verlust an Genauigkeit in dem Cholesterin-Assay.Reducing substances, such as glutathione, ascorbic acid, and uric acid, are found in human fluids occur, react with hydrogen peroxide and prevent the conversion of the hydrogen peroxide with the dye. This leads to a loss of accuracy in the cholesterol assay.

Man hat nun versucht, dieses Problem zu lösen durch Bestimmung der Geschwindigkeit des Verbrauchs des Sauerstoffs bei der enzymatischen Umwandlung von Cholesterin in Cholest-4-en-3-on und Wasserstoffperoxid und Umrechnung des dabei erhaltenen Wertes in den Cholesteringehalt Aus den US-Patentschriften 38 57 771 und 39 33593 sind ein Sauerstoffbestimmungsanalysator und ein Verfahren zur Durchführung einer solchen Messung bekanntAttempts have now been made to solve this problem through Determination of the rate of consumption of oxygen in the enzymatic conversion of Cholesterol in Cholest-4-en-3-one and hydrogen peroxide and conversion of the value obtained into the cholesterol content From the US patents 38 57 771 and 39 33593 an oxygen determination analyzer and a method for performing such a measurement are known

Obgleich SauerstoffbestimmungsmeBsysteme, z. B. solche, wie sie in den obengenannten US-Patentschriften beschrieben sind, mit Erfolg zur Bestimmung des Gesamtcholesteringehaltes in einer Probe angewendet werden können, kann die Anwesenheit von Substanzen in der Probe, welche die Umsetzung der Enzyme mit Cholesterin und/oder Cholesterinestern hemmt oder die Verfügbarkeit des Cholesterins für die Umsetzung mit den Enzymen hemmt (nachfolgend als »Hemmmittel« bezeichnet) zu Ungenauigkeiten bei diesen Messungen führen. Insbesondere scheinen HemmitteL die in einem trüben Serum enthalten sind, das mehr als die normale Konzentration an Triglyceriden enthält, die Verfügbarkeit von umsetzbarem Cholesterin zu vermindern und/oder die Geschwindigkeit herabzusetzen, mit der die Enzyme Reaktionen katalysieren, die zu dem Verbrauch des Sauerstoffs führen (nachfolgend als »Sauerstoffverbrauchshemmwirkungen« bezeichnet). In jedem Falle erhält man als Ergebnis eine Herabsetzung der normalen Sauerstoff-Verbrauchsgeschwindigkeit, so daß die Messung der Sauerstoffverbrauchsgeschwindigkeit in Gegenwart solcher Hemmittel nicht zu dem gewünschten genauen Wert für die Cholesterinkonzentration führt So wurde beispielsweise gefunden, daß dann, wenn das Sauerstoffbestimmiingssystem zur Bestimmung des Gesamtcholesteringehalts in bestimmten Proben angewendet wird, die Sauerstoffverbrauchsgeschwindigkeit niedriger war als auf Grund des Cholesteringehaltes der Probe zu erwarten gewesen wäre, wobei der tatsächliche Cholesteringehalt der Probe nach dem anerkannten Assay für die Gesamtcholesterinbestimmung von Abell et al. in »J. Biol. Chem.«, 195,367 (1952), vorher bestimmt worden war.Although oxygen determination systems, e.g. B. those as described in the aforementioned US patents have been used successfully for determination of the total cholesterol in a sample can be applied, the presence of Substances in the sample that cause the enzymes to react with cholesterol and / or cholesterol esters inhibits or the availability of the cholesterol for the conversion with the enzymes (hereinafter referred to as “Inhibitor”) lead to inaccuracies in these measurements. In particular, seem Inhibitors contained in a cloudy serum that contains more than the normal concentration of triglycerides reduce the availability of actionable Decrease cholesterol and / or slow down the rate at which the enzymes react catalyze that lead to the consumption of oxygen (hereinafter referred to as "oxygen consumption inhibiting effects"). In either case, the The result is a decrease in the normal rate of oxygen consumption, so that the measurement of the Oxygen consumption rate in the presence of such inhibitors does not come to the exact desired level For example, it has been found that when the oxygen determination system is used to determine the total cholesterol content in certain samples, the rate of oxygen consumption was lower than due to the cholesterol content of the sample would have been expected, the actual cholesterol content of the sample being recognized according to the Assay for Total Cholesterol Determination by Abell et al. in »J. Biol. Chem. ”, 195, 367 (1952), previously determined had been.

Aus »Klin. Chem.«, Band 22, Heft 3, 1976, S. 330 bis 340, ist bereits ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Cholesterin unter Anwendung des polarographischen Sauerstoffbestimmungsverfahrens bekannt, bei dem ein Reagens verwendet wird, das ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel enthält, welches das Enzym aktiviert Das in diesem Verfahren verwendete Reagens ist jedoch nicht in der Lage, die Sauerstoffverbrauchshemmwirkungen in der Probelösung zu neutralisieren (vgl. das weiter unten folgende Beispiel 9).From »Klin. Chem. ", Volume 22, Issue 3, 1976, pp. 330 bis 340, is already a method for the enzymatic determination of cholesterol using the polarographic oxygen determination method is known in which a reagent is used which is a contains non-ionic surfactant which activates the enzyme that is used in this process however, the reagent used is unable to neutralize the oxygen consumption inhibiting effects in the sample solution (see the following below Example 9).

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein enzymatisches Cholesterin-Assay-Reagens und ein Verfahren zur Bestimmten** der Cholesteririkcnzeritrat^r! in s'T^rThe object of the invention was therefore to provide an enzymatic cholesterol assay reagent and a method to determine ** the cholesterol nitrate! in s'T ^ r Cholesterin enthaltenden Probe zu entwickeln, die es ermöglichen, praktisch alle Sauerstoffverbrauchähemmwirkungen der in einer zu untersuchenden Probe vorhandenen Hemmittel zu neutralisieren.To develop cholesterol-containing sample, which make it possible to practically all of the oxygen consumption-inhibiting effects in a sample to be examined to neutralize existing inhibitors.

Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe erfindungsgemäß gelöst werden kann durch ein enzymatisches Cholesterin-Assay-Reagens, das zusätzlich zu Cholesterinoxidase und gegebenenfalls Cholesterase und einem Puffer noch ein kationisches oberflächenaktives Mittel in einer zum Neutralisieren praktisch aller Sauerstoffverbrauchshemmwirkungen der in der zu untersuchenden Probe vorhandenen Hemmittel ausreichenden Menge enthältIt has now been found that this object can be achieved according to the invention by a enzymatic cholesterol assay reagent which, in addition to cholesterol oxidase and possibly cholesterase and a buffer, also contains a cationic surfactant in one for neutralizing virtually all oxygen depletion inhibiting effects contains a sufficient amount of the inhibiting agent present in the sample to be examined

Gegenstand der Erfindung ist ein enzymatisches Cholesterin-Assay-Reagens, das Cholesterinoxidase und gegebenenfalls Cholesterinesterase und einen Puffer in einer solchen Menge enthält, daß eine Lösung mit einem pH-Wert zwischen etwa 53 und etw 8 erzielt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Reagens außerdem ein kationisches oberflächenaktives Mittel in einer Menge enthält, die ausreicht, um praktisch alle Sauerstoffverbrauchshemmwirkungen der in einer zu untersuchenden Probe vorhandenen Hemmittel zu neutralisieren.The invention relates to an enzymatic cholesterol assay reagent, the cholesterol oxidase and optionally contains cholesterol esterase and a buffer in an amount such that a solution achieved with a pH between about 53 and about 8 which is characterized in that the reagent also contains a cationic surfactant in an amount sufficient to cover virtually all of the Oxygen consumption inhibiting effects of the inhibiting agents present in a sample to be examined neutralize.

Mit dem erfindungsgemäßen enzymatischen Cholesterin-Assay-Reagens ist es erstmals möglich, praktisch alle Sauerstoffverbrauchshemmwirkungen der in der zu untersuchenden Probe vorhandenen Hemmittel zu neutralisieren, so daß die Sauerstoffverbrauchsgeschwindigkeit bei der Umsetzung der Cholesterinoxidase mit Cholesterin und/oder Cholesterinestern durch die Gegenwart der obengenannten Hemmittel in der zu untersuchenden Probe praktisch nicht beeinflußt wird. Dadurch kann die Sauerstoffverbrauchsgeschwindigkeit die mit den in den obengenannten US-Patentschriften beschriebenen Sauerstoffbestimmungsanalysatoren ermittelt werden kann, innerhalb eines Zeitraums von Sekunden gemessen werden und sie stellt ein genaues Maß für den Gesamtcholesteringehalt in der analysierten Probe dar.With the enzymatic cholesterol assay reagent according to the invention it is possible for the first time, practically all oxygen consumption inhibiting effects of the inhibitors present in the sample to be examined neutralize, so that the oxygen consumption rate in the implementation of cholesterol oxidase with cholesterol and / or cholesterol esters by the presence of the above-mentioned inhibiting agents in the sample to be examined is practically not influenced. As a result, the oxygen consumption rate, which can be determined with the oxygen determination analyzers described in the above-mentioned US patents, can be measured within a period of seconds and it adjusts is an exact measure of the total cholesterol content in the analyzed sample.

Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung enthält das Reagens etwa 0,2 bis etwa 5 internationale Einheiten Cholesterinoxidase pro ml Reagens, etwa 0 bis' etwa 5 internationale Einheiten Cholesterinesterase pro ml Reagens sowie etwa 0,01 bis etwa 0,4 Gew.-%, bezogen auf das Reagens, des kationischen oberflächenaktiven Mittels.In a preferred embodiment of the invention, the reagent contains from about 0.2 to about 5 international units of cholesterol oxidase per ml of reagent, about 0 to about 5 international units Cholesterol esterase per ml of reagent and about 0.01 to about 0.4% by weight, based on the reagent, of des cationic surfactant.

Als kationisches oberflächenaktives Mittel wird vorzugsweise ein quaternäres Imidazolinium-, Pyridinium-, Chinolinium- und/oder quaternäres Ammonium-oberflächenaktives Mittel verwendet. Besonders bevorzugt ist die Verwendung eines Alkyldimethylbenzylammoniumsalzes als kationisches quaternäres Ammonium-oberflächenaktives Mittel. Als Alkyldimethylbenzylammoniumsalz kann insbesondere Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen im Alkylrest oder eine Mischung davon verwendet werden. Bei dem Alkyldimethylbenzylammoniumfalz kann es sich speziell um eine Mischung aus etwa 50% Natriumtetradecyldiinethylbenzylammoniumchlorid, etwa 40% Natriumdodecyldimethylbenzylammoniumchlorid und etwa 10% Natriumhexadecyldimethylbenzylammoniumchlond handeln.As the cationic surfactant, a quaternary imidazolinium, pyridinium, quinolinium and / or quaternary ammonium surfactant is preferably used. Particularly the use of an alkyldimethylbenzylammonium salt as the cationic quaternary is preferred Ammonium surfactant. Alkyldimethylbenzylammonium chloride with 8 to 18 carbon atoms in the alkyl radical or a mixture thereof can in particular be used as the alkyldimethylbenzylammonium salt be used. The alkyldimethylbenzylammonium fold can specifically be a mixture about 50% sodium tetradecyldimethylbenzylammonium chloride, about 40% sodium dodecyldimethylbenzylammonium chloride and about 10% sodium hexadecyldimethylbenzylammonium chloride.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung enthält das erfindungsgemäße Reagens zusätzlich noch ein Gallensäuresalz und ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel. Dabei beträgt der Gallensäuresalzgehalt vorzugsweise etwa π 01 Kjc ptu/a ο ι rjj^w-^¹ nnH H**r According to a further preferred embodiment, the reagent according to the invention additionally contains a bile acid salt and a non-ionic surface-active agent. The bile acid salt content is preferably about π 01 Kjc ptu / a ο ι rjj ^ w- ^ ¹ nnH H ** r

Gehalt an dem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel beträgt vorzugsweise etwa 0,05 bis etwa 0,4 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Reagens.The content of the nonionic surfactant is preferably from about 0.05 to about 0.4 % By weight, in each case based on the reagent.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung enthält das erfindungsgemäße Reigens den Puffer in einer zur Herstellung einer Lösung mit einem pH-Wert von etwa 6 ausreichenden Menge, etwa 1,2 internationale Einheiten Cholesterinoxidase pro m', etwa 0,014 internationale Einheiten Cholesterinesterase pro ml Reagens sowie etwa 0,08 Gew.-% eines Gallensäuresalzes, etwa 0,05 Gew.-% Isooctylphenoxypolyäthoxyäthanol und etwa 0,1 Gew.-% eines Alkyldimethylbenzylammoniumsalzes, jeweils bezogen auf das Reagens. According to a further preferred embodiment, the round according to the invention contains the buffer in an amount sufficient to produce a solution with a pH of about 6, about 1.2 international units of cholesterol oxidase per m ', about 0.014 international units of cholesterol esterase per ml of reagent and about 0 .08% by weight of a bile acid salt, about 0.05% by weight of isooctylphenoxypolyethoxyethanol and about 0.1% by weight of an alkyldimethylbenzylammonium salt, each based on the reagent.

Das erfindungsgemäße Reagens liegt vorzugsweise in gefriergetrockneter Form vor.The reagent according to the invention is preferably in a freeze-dried form.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Bestimmung der Cholesterinkonzentration in einer Cholesterin enthaltenden Probe, das die folgenden Stufen umfaßt:The invention also relates to a method for determining the cholesterol concentration in a A sample containing cholesterol, comprising the following steps:

a) Oxidieren des in der Probe in einer mit Sauerstoff gesättigten wäßrigen Lösung enthaltenen Cholesterin mittels eines enzymatischen Cholesterin-Assay-Reagens, wie es vorstehend beschrieben worden ist, das Cholesterinoxidase und gegebenenfalls Cholesterinesterase sowie einen Puffer in einer Menge zur Erzielung einer Lösung mit einem pH-Wert zwischen etwa 5,5 und etwa 8 ausreichenden Menge enthält, in Gegenwart eines Sensors, der dazu dient, eine Eigenschaft des Sauerstoffs in der Lösung, die in Beziehung steht zu der Sauerstoffkonzentration derselben, zu überwachen,a) Oxidation of the cholesterol contained in the sample in an aqueous solution saturated with oxygen by means of an enzymatic cholesterol assay reagent as described above has been, the cholesterol oxidase and optionally cholesterol esterase and a buffer in one Amount sufficient to achieve a solution with a pH between about 5.5 and about 8 Amount contains, in the presence of a sensor, which serves to determine a property of the oxygen in monitor the solution related to its oxygen concentration,

b) Erzeugen eines ersten elektrischen Signals in Abhängigkeit von der Sauerstoffkonzentration,b) generating a first electrical signal as a function of the oxygen concentration,

c) Differenzieren des ersten elektrischen Signals zur Erzeugung eines Ausgangssignals proportional zu der augenblicklichen Änderungsrate der Sauerstoffkonzentration undc) differentiating the first electrical signal to generate an output signal proportional to the instantaneous rate of change in oxygen concentration and

d) Messen des Ausgangssignals zur Bestimmung der Cholesterinkonzentration, das dadurch gekennzeichnet ist, daß mand) measuring the output signal for determining the cholesterol concentration, which is characterized is that one

e) praktisch alle Sauerstoffverbrauchshemmwirkungen der in der zu untersuchenden Probe vorhandenen Hemmittel neutralisiert durch Zugabe eines kationischen oberflächenaktiven Mittels.e) practically all oxygen consumption inhibiting effects in the sample to be examined any inhibiting agent present is neutralized by the addition of a cationic surfactant.

Um zu vermeiden, daß die Probe einom getrennten Verseifungsverfahren unterworfen werden muß, enthält das erfindungsgemäße enzymatische Cholesterin-Assay-Reagens außerdem Cholesterinesterase. Es wird angenommen, daß die Cholesterinesterase die Umsetzung zwischen Wasser und den in der Probe vorhandenen Cholesterinestern katalysieit unter Bildung von Cholesterin und eines Fettsäure-Nebenproduktes. Das durch die Cholesterinesterase gebildete Cholesterin und eventuelles anfänglich in der Probe vorhandenes Cholesterin werden unter der katalytischen Einwirkung der Cholesterinoxidase mit Sauerstoff umgesetzt, wobei Cholest-4-en-3-on und Wasserstoffperoxid gebildet werden. Die Geschwindigkeit, mit der der Sauerstoff bei der Umsetzung mit Cholesterin verbraucht wird, kann auf bekannte Weise in die Cholesterinkonzentration umgerechnet werden.To avoid having to subject the sample to a separate saponification process the enzymatic cholesterol assay reagent of the present invention also cholesterol esterase. It is believed that cholesterol esterase is the Conversion between water and the cholesterol esters present in the sample catalyzes with formation of cholesterol and a fatty acid by-product. That formed by cholesterol esterase Cholesterol and any cholesterol initially present in the sample are placed under the catalytic Action of cholesterol oxidase reacted with oxygen, with cholest-4-en-3-one and hydrogen peroxide are formed. The rate at which the oxygen reacts with cholesterol is consumed can be converted into the cholesterol concentration in a known manner.

Die erfindungsgemäß eingesetzten kationischen oberflächenaktiven Mittel werden in einer Menge verwendet, die ausreicht, um die Sauerstoffverbrauchshemmwirkungen der Trigiyceride und anderer Hemmittel zu neutralisieren. Ein Verfahren zur Bestimmune der minimalen und maximalen Menge und somit des Mengenbereichs des kationischen oberflächenaktiven Mittels, der für die Verwendung in dem enzymatischen Cholestenn-Assay-Reagens geeignet ist, ist das folgende: The cationic surfactants used in the present invention are used in an amount sufficient to neutralize the oxygen consumption inhibitory effects of the triglycerides and other inhibitors. One method of determining the minimum and maximum amounts, and thus the range of amounts, of the cationic surfactant suitable for use in the Cholestennium enzymatic assay reagent is as follows:

Die Menge des Gesamtcholesterins wird in einer Reihe von Proben zuerst unter Anwendung eines Bezugsverfahrens bestimmt, beispeilsweise unter Anwendung des obengenannten Verfahrens von Abell et al.The amount of total cholesterol in a series of samples is first measured using a Reference method determined, for example using the above method of Abell et al.

ίο Die Gesamtcholesteringehalte dieser Reihe von Proben werden dann unter Anwendung des Sauerstoffbestimmungsverfahrens, wie es beispielsweise in den US-Patentschriften 39 33 593 und 38 57 771 beschrieben ist, gemessen unter Verwendung eines erfindungsgemä-ίο The total cholesterol levels in this series of samples are then using the oxygen determination method, as for example in the U.S. Patents 3,933,593 and 3,857,771 is measured using an inventive

is Ben enzymatischen Reagens, wie beispielsweise in den nachfolgenden Beispielen 1 bis 8 beschrieben, wobei die jeweils verwendeten Reagentien variierende Mengen des kationischen oberflächenaktiven Mittels enthalten. Die erforderliche Minimalrnenge des kationischen oberflächenaktiven Mittels ist die Menge, die bei allen Proben Gesamtcholesteringehalte ergibt, die gleich den Gehalten sind, die nach dem Bezugsverfahren ermittelt wurden (wie weiter oben erläutert, scheinen die Gesamtcholesteringehalte für bestimmte Proben bei Werten unterhalb des Minimums des kationischen oberflächenaktiven Mittels niedriger zu sein als diejenigen des Bezugsverfahrens).is ben enzymatic reagent, such as in the Examples 1 to 8 described below, the amounts of the reagents used in each case varying of the cationic surfactant. The required minimum amount of the cationic Surfactant is the amount that gives total cholesterol levels equal to, in all samples Are held that are determined according to the reference procedure (as explained above, the total cholesterol levels for certain samples appear to be Values below the minimum of the cationic surfactant to be lower than those of the referral procedure).

Wenn das kationische oberflächenaktive Mittel in einer Menge vorliegt, die oberhalb der gewünschten Maximalmenge liegt, tritt eine Denaturierung der Cholesterinoxidase und der gegebenenfalls vorhandenen Cholesterinesterase durch das oberflächenaktive Mittel ein. Diese Denaturierung führt zu einer Abnahme der Umwandlungsgeschwindigkeit der Cholesterinester in Cholesterin sowie auch zu einer Abnahme der Umwandlungsgeschwindigkeit des Choiesterins in Cholest-4-en-3-on. Wenn die Menge des kationischen oberflächenaktiven Mittels oberhalb dieser Maximalmenge liegt, nimmt die Sauerstoffverbrauchsgeschwindigkeit der Reaktion immer mehr ab, bis sie für die Messung dieser Geschwindigkeit unbrauchbar wird.When the cationic surfactant is present in an amount in excess of that desired If the maximum amount is higher, the cholesterol oxidase and any cholesterol oxidase that may be present are denatured Cholesterol esterase by the surfactant. This denaturation leads to a decrease the rate of conversion of cholesterol esters into cholesterol as well as a decrease in the Rate of conversion of choiesterine into cholest-4-en-3-one. When the amount of the cationic surfactant is above this maximum amount the rate of oxygen consumption decreases the reaction decreases more and more until it becomes unusable for measuring this speed.

Vorzugsweise enthält das erfindungsgemäße Reagens etwa 0,01 bis etwa 0,4, insbesondere etwa 0,05 bis etwa 0,2 Gew.-%, bezogen auf das fertige Reagens, des kationischen oberflächenaktiven Mittels. Besonders bevorzugt ist ein Reagens, das 0,1 Gew.-% des kationischen oberflächenaktiven Mittels enthältThe reagent according to the invention preferably contains from about 0.01 to about 0.4, in particular from about 0.05 to about 0.2% by weight, based on the finished reagent, of the cationic surfactant. Particularly preferred is a reagent containing 0.1% by weight of the cationic surfactant

Es kann praktisch jedes beliebige kationische oberflächenaktive Mittel erfindungsgemäß verwendet werden. Eine Zusammenstellung der im Handel erhältlichen kationischen oberflächenaktiven Mittel, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, ist in »McCutcheon's Detergents & Emulsifieres«, 1975, North American Edition, McCutcheon Division, McPublishing Co, Glen Rock, N.J./USA, zu finden. Erfindungsgemäß geeignet sind insbesondere kationische quatemäre Imidazolinium-, Pyridinium-, Chinolinium- und Ammonium-oberflächenaktive Mittel. Typische Beispiele für kationische oberflächenaktive Mittel, die für die erfindungsgemäße Verwendung besonders geeignet sind, sindVirtually any cationic surfactant can be used in the present invention will. A compilation of the commercially available cationic surfactants that can be used according to the invention is in "McCutcheon's Detergents & Emulsifieres", 1975, North American Edition, McCutcheon Division, McPublishing Co, Glen Rock, N.J./USA. Particularly suitable according to the invention are cationic quaternary imidazolinium, pyridinium, quinolinium and ammonium surfactants. Typical examples of cationic surfactants, which are particularly suitable for the use according to the invention are

0-Hydroxyäthylbenzylstearylimid-0-Hydroxyäthylbenzylstearylimid-

azoliniumchlorid,
Laurylpyridiniumchlorid und
Laurylisochinoliniumbromid.azolinium chloride,
Laurylpyridinium chloride and
Laurylisoquinolinium bromide.

Eine besonders bevorzugte Klasse von kationischen oberflächenaktiven Mitteln sind ferner quaternäreAlso, a particularly preferred class of cationic surfactants are quaternary

kationische Ammonium-oberflächenaktive Mittel, wie z.B.cationic ammonium surfactants, e.g.

Diisobutylphenoxyäthoxyäthyldimethylbenzyl-Diisobutylphenoxyäthoxyäthyldimethylbenzyl-

ammoniumchlorid,
Diisobutylkresoxyäthoxyäthyldimethylbenzyl-ammonium chloride,
Diisobutylkresoxyäthoxyäthyldimethylbenzyl-

ammoniumchlorid und
Methyldodecylbenzyltrimethyl-ammonium chloride and
Methyldodecylbenzyltrimethyl-

ammoniumchlorid.ammonium chloride.

Eine besonders bevorzugte Klasse von kationischen quaternären Ammonium-oberflächenaktiven Mitteln sind insbesondere die Alkyldimethylbenzylammoniumsalze. Besonders geeignet ist Natriumalkyldimethylbenzylammoniumchlorid, bei dem die Alkylgruppe ein Alkylgemisch darstellt, das etwa 50% CmHn . etwa 40% C12H25 und etwa 10% C16H33 enthält. Besonders gut geeignet ist auch Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid, bei dem die Alkylgruppe ein Alkylgemisch von C₈H17 bis Ci₈H₃? darstellt.In particular, a particularly preferred class of quaternary ammonium cationic surfactants are the alkyldimethylbenzylammonium salts. Sodium alkyldimethylbenzylammonium chloride, in which the alkyl group is an alkyl mixture containing about 50% CmHn, is particularly suitable. contains about 40% C12H25 and about 10% C16H33. Alkyldimethylbenzylammonium chloride, in which the alkyl group is an alkyl mixture of C ₈ H17 to Ci ₈ H ₃ ? represents.

Erfindungsgemäß kann jeder beliebige Puffer verwendet werden, der mit den übrigen Komponenten des erfindungsgemäßen Reagens verträglich ist. Beispiele für erfindungsgemäß verwendbare Puffer sind Phosphatsalze, wie Kaliumorthophosphat, Citratsalze, wie Natriumeitrat, oder Acetatsalze, wie Natriumacetat. Der Puffer ist in einer Menge vorhanden, die ausreicht, um eine Lösung mit einem pH-Wert zwischen etwa 5,5 und etwa 8, vorzugsweise mit einem pH-Wert von etwa 6, zu ergeben.According to the invention, any buffer can be used which is compatible with the other components of the Reagent according to the invention is compatible. Examples of buffers which can be used according to the invention are phosphate salts, such as potassium orthophosphate, citrate salts such as sodium citrate, or acetate salts such as sodium acetate. The buffer is present in an amount sufficient to make a solution with a pH between about 5.5 and about 8, preferably with a pH of about 6.

In dem erfindungsgemäßen Reagens kann jede beliebige Cholesterinoxidase verwendet werden. Die genaue Menge der in dem Reagens enthaltenen Cholesterinoxidase ist nicht kritisch. Vorzugsweise werden etwa 0,2 bis etwa 5, insbesondere etwa 0,5 bis etwa 2, speziell etwa 1 bis etwa 1,5 internationale: Einheiten Cholesterinoxidase pro ml Reagens erfindungsgemäß verwendet. Am zweckmäßigsten werden etwa 1,2 internationale Einheiten Cholesterinoxidase pro ml Reagens verwendet.Any cholesterol oxidase can be used in the reagent of the present invention. the the exact amount of cholesterol oxidase contained in the reagent is not critical. Preferably are about 0.2 to about 5, in particular about 0.5 to about 2, especially about 1 to about 1.5 international: Units of cholesterol oxidase per ml of reagent used according to the invention. Become most expedient about 1.2 international units of cholesterol oxidase per ml of reagent used.

Erfindungsgemäß kann gegebenenfalls auch jede beliebige Cholesterinesterase verwendet werden. Die genaue Menge der erfindungsgemäS verwendeten Cholesterinesterase ist nicht kritisch. Zweckmäßig werden etwa 0 bis etwa 5, vorzugsweise etwa 0,001 bis etwa 1, insbesondere etwa 0,005 bis etwa 0,05 internationale Einheiten Cholesterinesterase pro ml Reagens verwendet. Am zweckmäßigsten werden etwa 0,014 internationale Einheiten Cholesterinesterase pro ml Reagens verwendet.Any desired cholesterol esterase can optionally also be used according to the invention. the the exact amount of the cholesterol esterase used according to the invention is not critical. Appropriate become about 0 to about 5, preferably about 0.001 to about 1, in particular about 0.005 to about 0.05 international units of cholesterol esterase per ml of reagent used. Most useful are about 0.014 international units of cholesterol esterase per ml of reagent used.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird zusätzlich ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel verwendet, um das Cholesterin und die Cholesterinester des Serums in Lösung zu halten. Wenn es in dem erfindungsgemäßen Reagens enthalten ist, ist die Menge des verwendeten nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels nicht kritisch, vorzugsweise liegt es jedoch in einer Menge von etwa 0,01 bis etwa OA insbesondere von etwa 0,05 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Reagens, vor. Erfindungsgemäß kann praktisch jedes beliebige nicht-ionische oberflächenaktive Mittel verwendet werden. Eine Aufzählung der im Handel erhältlichen nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, ist in der obengenannten Publikation »McCutcheon's Detergents & Emulsifieres« zu finden. Beispiele für nicht-ionische oberflächenaktive Mittel, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind Nonylphenoxypolyäthylenoxyäthanol und polyoxyäthyliertes Sorbitmonolaurat.In a preferred embodiment of the invention, a non-ionic surface-active agent is additionally used Agent used to keep serum cholesterol and cholesterol esters in solution. if it is contained in the reagent of the present invention is the amount of the nonionic surfactant used Medium is not critical, but is preferably in an amount from about 0.01 to about OA especially about 0.05% by weight based on the weight of the reagent. According to the invention can virtually any nonionic surfactant can be used. A list of the commercially available nonionic surfactants used in the present invention can be found in the above publication »McCutcheon's Detergents & Emulsifieres «. Examples of nonionic surfactants which can be used in accordance with the present invention Can be used are nonylphenoxypolyäthylenoxyäthanol and polyoxyethylated sorbitol monolaurate.

Zufriedenstellende Ergebnisse werden erhalten bei Verwendung von Isooctylphenoxypolyäthoxyäthanol als nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel in einer Menge von etwa 0,05 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Reagens.Satisfactory results are obtained using isooctylphenoxypolyethoxyethanol as a nonionic surfactant in an amount of about 0.05% by weight based on the Total weight of reagent.

Es ist auch bevorzugt, dem erfindungsgemäßen Reagens ein Gallensäuresalz zuzusetzen. Wenn dieses in dem erfindungsgemäßen Reagens enthalten ist, ist die Menge des verwendeten Gallensäuresalzes nicht kritisch, sie liegt jedoch vorzugsweise innerhalb des Bereichs von etwa 0,01 bis etwa 0,1, insbesondere bei etwa 0,08 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Reagens. Gallensäuresalze scheinen Cholesterinester und Cholesterin in einem löslichen Zustand zu halten und machen sie dadurch für die Umsetzung mit den Enzymen verfügbar. Beispiele für geeignete Gallensäuresalze, die in dem erfindungsgemäßen Reagens verwendet werden können, sind Natriumcholat, Taurocholat, Desoxycholat und Taurodesoxycholat. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Natriumcholat.It is also preferred to add a bile acid salt to the reagent of the present invention. If this is in is contained in the reagent of the present invention, the amount of the bile acid salt used is not critical, but it is preferably within the range from about 0.01 to about 0.1, in particular at about 0.08 weight percent based on the total weight of the reagent. Bile acid salts appear to be cholesterol esters and to keep cholesterol in a soluble state and thereby make them ready for implementation with the Enzymes available. Examples of suitable bile acid salts which can be used in the reagent according to the invention can be used are sodium cholate, taurocholate, Deoxycholate and taurodeoxycholate. The use of sodium cholate is particularly preferred.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, in denen Zusammensetzungen von bevorzugten erfindungsgemäßen Reagenssystemen beschrieben sind, näher erläutert. Dabei steht IU für internationale Einheiten.The invention is illustrated by the following examples, in which compositions of preferred according to the invention Reagent systems are described, explained in more detail. IU stands for international Units.

Beispiel 1example 1 CholesterinesteraseCholesterol esterase Beispiel 2Example 2 CholesterinesteraseCholesterol esterase Beispiel 3Example 3 CholesterinesteraseCholesterol esterase Beispiel 4Example 4 CholesterinesteraseCholesterol esterase 0,007 IU/ml0.007 IU / ml CholesterinoxidaseCholesterol oxidase CholesterinoxidaseCholesterol oxidase CholesterinoxidaseCholesterol oxidase CholesterinoxidaseCholesterol oxidase 1 IU/ml1 IU / ml K2HPO4 und KH2PO4, gemischt zurK2HPO4 and KH2PO4, mixed with K₂HPO₄ und KH₂PO₄ , gemischt zurK ₂ HPO ₄ and KH ₂ PO ₄ , mixed for K₂HPO₄ und KH₂PO₄, gemischt zurK ₂ HPO ₄ and KH ₂ PO ₄ , mixed for Citronensäure und Natriumeitrat,Citric acid and sodium citrate, Herstellung einer Lösung mit einemMaking a solution with a Herstellung einer Lösung mit einemMaking a solution with a Herstellung einer Lösung mit einemMaking a solution with a gemischt zur Herstellung einermixed to make a pH-Wert von 6,0pH 6.0 pH-Wert von 6,0pH 6.0 pH-Wert von 6,0pH 6.0 Lösung mit einem pH-Wert von 6,0Solution with a pH of 6.0 1,0-molar1.0 molar IsooctylphenoxypolyäthoxyäthanolIsooctylphenoxypolyethoxyethanol NatriumcholatSodium cholate IsooctylphenoxypolyäthoxyäthanolIsooctylphenoxypolyethoxyethanol IsooctylphenoxypolyäthoxyäthanolIsooctylphenoxypolyethoxyethanol 0,05%0.05% NatriumcholatSodium cholate Natriumalkyldimethylbenzyl-Sodium alkyldimethylbenzyl Natrium taurocholatSodium taurocholate Natriumalkyldimethylbenzyl-Sodium alkyldimethylbenzyl 0,08%0.08% Natriumalkyldimethylbenzyl-Sodium alkyldimethylbenzyl ammoniumchloridammonium chloride ß-Hydroxyäthylbenzyl-stearylimidazo-ß-Hydroxyäthylbenzyl-stearylimidazo- ammoniumchloridammonium chloride ammoniumchloridammonium chloride liniumchloridlinium chloride NatriumcholatSodium cholate 0,1 %0.1% 1 IU/ml1 IU / ml 1 IU/ml1 IU / ml 1,0-molar1.0 molar 0,08%0.08% 0,08%0.08% 1 IU/ml1 IU / ml 1 IU/ml1 IU / ml 1,0-molar1.0 molar 0,05%0.05% 0,08%0.08% 0,1%0.1% 1 IU/ml1 IU / ml 1 IU/ml1 IU / ml 1,0-molar1.0 molar 0,5%0.5% 0,1%0.1% 0,08%0.08%

example

Cholesterinesterase Cholesterinoxidase Essigsäure und Natriumacetat, gemischt zur Herstellung einer Lösung mit einem pH-Wert von 6,0 Natriumalkyldimethylbenzylammoniumchlorid Isooctylphenoxypolyäthoxyäthanol NatriumtaurocholatCholesterol esterase cholesterol oxidase acetic acid and sodium acetate, mixed to produce a solution with a pH of 6.0 sodium alkyldimethylbenzylammonium chloride Isooctylphenoxypolyethoxyethanol sodium taurocholate

example

Cholesterinesterase CholesterinoxidaseCholesterol esterase cholesterol oxidase

Beispiel 5Example 5 CholesterinesteraseCholesterol esterase Beispiel 6Example 6 CholesterinesteraseCholesterol esterase 0,014 lU/ml0.014 IU / ml CholesterinoxidaseCholesterol oxidase CholesterinoxidaseCholesterol oxidase 1 IU/ml1 IU / ml Citronensäure und Natriumeitrat,Citric acid and sodium citrate, Essigsäure und Natriumacetat,Acetic acid and sodium acetate, gemischt zur Herstellung einermixed to make a gemischt zur Herstellung einermixed to make a Lösung mit einem pH-Wert von 6,0Solution with a pH of 6.0 Lösung mit einem pH-Wert von 6,0Solution with a pH of 6.0 1,0-molar1.0 molar LaurylpyridiniumchloridLauryl pyridinium chloride Natriumalkyldimethylbenzyl-Sodium alkyldimethylbenzyl 0,1%0.1% NatriumcholatSodium cholate ammoniumchioridammonium chloride 0,08%0.08% polyoxyäthyliertesSorbitmonolaurat-polyoxyethylated sorbitol monolaurate natriumsodium 1 IU/ml1 IU / ml 1 IU/ml1 IU / ml 1,0-molar1.0 molar 0,1%0.1% 0,05%0.05%

!5! 5

1 IU/ml 1 IU/ml1 IU / ml 1 IU / ml

1,0-molar1.0 molar

O,O8O/o 0,05% 0,08%0.05% 0.08%

0,014 IU/ml U IU/ml0.014 IU / ml U IU / ml

K₂HPO₄ und KH₂PO₄, gemischt zurK ₂ HPO ₄ and KH ₂ PO ₄ , mixed for

Herstellung einer Lösung mit einemMaking a solution with a

pH-Wert von 6,0 1,0-molarpH of 6.0 1.0 molar

Isooctylphenoxypolyäthoxyäthanol 0,05%Isooctylphenoxypolyethoxyethanol 0.05%

Natriumcholat 0,08%Sodium cholate 0.08%

Natriumalkyldimethylbenzyl-Sodium alkyldimethylbenzyl

ammoniumchlorid 0,1%ammonium chloride 0.1%

1010

Weitere Beispiele für bevorzugte Reagenssysteme sind solche, wie sie in Beispiel 1 angegeben worden sind, in denen jedoch das Natriumalkyldimethylbenzylammoniumchlorid durch etwa 0,1 Gew.-% irgendeines der weiter oben aufgezählten kationischen und kationischen quaternären Ammonium-oberflächenaktiven Mitteln ersetzt ist.Further examples of preferred reagent systems are those as given in Example 1, however, in which the sodium alkyldimethylbenzylammonium chloride by about 0.1% by weight of any of the cationic and cationic quaternary ammonium surfactants enumerated above is replaced.

B e i s ρ i e 1 9B e i s ρ i e 1 9

(Vergleichsbeispiel)(Comparative example)

In zwei Serumproben A und B (Probe A: normale Serumprobe; Probe B: Sauerstoffverbrauchshemmittel enthaltende Serumprobe) wurde der Gesamtcholesteringehalt unter Verwendung eines Sauerstoffanalysators bestimmt, wobei die in der folgenden Tabelle I angegebenen Ergebnisse erhalten wurden.In two serum samples A and B (sample A: normal serum sample; sample B: oxygen depletion inhibitor containing serum sample), the total cholesterol content was determined using an oxygen analyzer determined, the results given in Table I below being obtained.

3030th

Table I.

3535

Serumprobe A Serumprobe BSerum sample A Serum sample B

Gesamtcholesteringehalt (mg/dl)Total cholesterol content (mg / dl)

263263

346346

4040

Danach wurden die in der folgenden Tabelle angegebenen enzymatischen Cholesterin-Assay-Reagentien I bis IV hergestelltThis was followed by the enzymatic cholesterol assay reagents shown in the table below I to IV produced

Table II

Komponentecomponent

Enzymatisches
Reagens IEnzymatic
Reagent I.

Enzymatisches
Reagens IIEnzymatic
Reagent II

Enzymatisches
Reagens IIIEnzymatic
Reagent III

Enzymatisches Reagens IVEnzymatic reagent IV

Kationisches oberflächenaktives Mittel (Natriumalkyldimethylbenzylammoniumchlorid) (Gew.-%) Nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel (Isooctylphenoxypolyäthoxyäthanol) (Gew.-%)Cationic surfactant (sodium alkyldimethylbenzylammonium chloride) (% By weight) Non-ionic surfactant (isooctylphenoxypolyethoxyethanol) (Wt .-%)

Anionisches oberflächenaktives Mittel (Natriumdodecylsulfat) (Gew.-%) Natriumcholat (Gew.-%) Cholesterinesterase (IU) Cholesterinoxidase (IU) Phosphatpuffer, pH 6,6 (M) 0,1Anionic surfactant (sodium dodecyl sulfate) (wt%) Sodium cholate (wt%) Cholesterol esterase (IU) Cholesterol oxidase (IU) Phosphate buffer, pH 6.6 (M) 0.1

0,10.1

0,080.08 0,080.08 0,080.08 0,080.08 0,140.14 0,140.14 0,140.14 0,140.14 1,01.0 1,01.0 1,01.0 1,01.0 1,01.0 1,01.0 1,01.0 1,01.0

Unter Verwendung der enzymatischen Reagentien I bis IV wurden mittels eines Glukoseanalysators die Serumprobe A und die Serumprobe B untersucht, wobei die in der folgenden Tabelle angegebenen Werte erhalten wurden.Using the enzymatic reagents I to IV, the Serum sample A and serum sample B examined, using the values given in the following table were obtained.

Table III

Enzymatisches ReagensEnzymatic reagent Choleste ringehaltCholeste ring content (mg/dl)(mg / dl) Serumprobe ΛSerum sample Λ Serumprobe BSerum sample B II. 164164 104104 IIII 263, 261263, 261 281, 276281, 276 IIIIII <10')<10 ') <10<10 IVIV 263, 262263, 262 348, 343348, 343 Liberman-B urchard-Liberman-B urchard- 263263 346346 EndpunktsmethodeEndpoint method

') Unterhalb der Nachweisgrenze des Analysator.') Below the detection limit of the analyzer.

Die in der vorstehenden Tabelle angegebenen Werte zeigen eindeutig, daß nur kationische oberflächenaktive Mittel in der Lage sind, praktisch alle Sauerstoffhemmwirkungen der in den untersuchten Proben vorhandenen Hemmittel zu neutralisieren. Weder die anionischen noch die nicht-anionischen oberflächenaktiven Mittel besitzen diese einzigartige Eigenschaft Die Daten der vorstehenden Tabelle zeigen ferner, daß anionische oberflächenaktive Mittel zu einer Hemmung des enzymatischen Cholesterinassays führen.The values given in the table above clearly show that only cationic surface-active Means are capable of practically all oxygen inhibiting effects to neutralize the inhibiting agents present in the samples examined. Neither the anionic nor do the non-anionic surfactants have this unique property The above table also shows that anionic surfactants can inhibit the conduct enzymatic cholesterol assays.

In den hier beschriebenen bevorzugten Reagenssystemen wird Cholesterinesterase zum Hydrolysieren der Cholesterinester zu Cholesterin verwendet Die Erfindung ist jedoch keineswegs auf die Verwendung von Cholesterinesterase zur Durchführung dieser Hydrolyse beschränkt, sondern sie umfaßt auch Reagentien, in denen andere Hydrolysemittel, wie z. B. alkalische Materialien, verwendet werden, die an Stelle von Cholesterinesterase eingesetzt werden können. Beispiele für solche alkalischen Materialien sind Kaliumhydroxid in Äthanol und Natriumhydroxid in Äthanol.In the preferred reagent systems described herein, cholesterol esterase is used to hydrolyze the cholesterol ester used to cholesterol The invention, however, is by no means limited to its use limited by cholesterol esterase to carry out this hydrolysis, but it also includes Reagents in which other hydrolysis agents, e.g. B. alkaline materials, that are used in place of cholesterol esterase can be used. Examples of such alkaline materials are Potassium hydroxide in ethanol and sodium hydroxide in ethanol.

Wenn Cholesterinesterase durch ein alkalisches Material ersetzt wird, um die Hydrolyse der Cholesterinester zu bewirken, muß das Serum zuerst mit dem alkalischen Material umgesetzt werden. Ein aliquoter Anteil wird dann mit einem Reagenssystem umgesetzt, das dem in den obigen Beispielen angegebenen ähnelt, wobei diesmal jedoch das Reagenssystem keine Cholesterinesterase enthält.When cholesterol esterase is replaced by an alkaline material, the cholesterol ester hydrolyzes To effect this, the serum must first be reacted with the alkaline material. An aliquot Portion is then reacted with a reagent system similar to that given in the examples above, however, this time the reagent system does not contain cholesterol esterase.

Das hier beschriebene erfindungsgemäße Reagenssystem kann als einzelnes Reagens hergestellt werden,The inventive reagent system described herein can be prepared as a single reagent,

ίο das alle oben angegebenen Komponenten enthält, oder es kann als Testpackung (Kit) hergestellt werden, die (der) aus zwei oder drei Reagentien besteht. Bei der Herstellung einer aus zwei Reagentien bestehenden Reagens-Testpackung enthält ein Reagens Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase und das restliche Reagens enthält die Pufferlösung und eventuelle andere Komponenten, wie weiter oben angegeben. Bei der Herstellung einer Reagenstestpackung, die aus drei getrennten Reagentien besteht, besteht das erste Reagens aus einer Lösung von Cholesterinoxidase, das zweite Reagens besteht aus Cholesterinesterase und das dritte Reagens besteht aus einer wäßrigen Pufferlösung, einem oberflächenaktiven Mittel und irgendwelchen anderen Komponenten, wie vorstehend angegeben.ίο that contains all of the above components, or it can be produced as a kit consisting of two or three reagents. In the A two-reagent kit preparation contains a cholesterol esterase reagent and cholesterol oxidase and the remaining reagent contains the buffer solution and any others Components as stated above. When making a reagent test kit, which consists of three consists of separate reagents, the first reagent consists of a solution of cholesterol oxidase, the second reagent consists of cholesterol esterase and the third reagent consists of an aqueous buffer solution, a surfactant and any other components as noted above.

Bei dem Reagenssystem kann es sich auch um eine Testpackung (Kit) handeln, die (der) aus zwei getrennten Reagentien besteht, weil angenommen wird, daß die Haltbarkeit (Gebrauchsdauer) des Reagenssystems größer ist, wenn die Enzyme und die übrigen Komponenten des Reagens bis unmittelbar vor ihrer Verwendung voneinander getrennt bleiben. Dadurch wird die Möglichkeit des Auftretens irgendwelcher Reaktionen zwischen den Komponenten des Reagenssystems verhindert, wenn sie miteinander gemischt und vor ihrer Verwendung längere Zeiträume sich selbst überlassen werden.The reagent system can also be a test pack (kit) that consists of two separate kits Reagents exists because it is believed that the shelf life (useful life) of the reagent system is greater when the enzymes and the remaining components of the reagent up just before their Use to remain separate from each other. This eliminates the possibility of any Reactions between the components of the reagent system are prevented when mixed with one another and left to their own devices for long periods of time before using them.

Das erfindungsgemäße Reagenssystem kann in Form einer wäßrigen Lösung gelagert und verwendet werden oder die Lösung kann auf konventionelle Weise gefriergetrocknet und unmittelbar vor ihrer Verwendung mit entionisiertem Wasser wieder angerührt werden. Das Reagenssystem kann auch hergestellt werden unter Verwendung seiner Komponenten in Pulverform, die unmittelbar vor ihrer Verwendung mit Wasser gelöst werden.The reagent system according to the invention can be stored and used in the form of an aqueous solution or the solution can be freeze-dried in a conventional manner and immediately prior to use be stirred again with deionized water. The reagent system can also be prepared are made using its components in powder form immediately before using them Dissolved in water.

Claims

Claims: 20

1. Enzymatisches Cholesterin-Assay-Reagens, das Cholesterinoxidase und gegebenenfalls Cholesterinesterase und einen Puffer in einer solchen Menge enthält, daß eine Lösung mit einem pH-Wert zwischen etwa 5,5 und etwa 8 erzielt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens außerdem ein kationisches oberflächenaktives Mittel in einer Menge enthält, die ausreicht, um praktisch alle Sauerstoffverbrauchshemmwirkungen der in einer zu untersuchenden Probe vorhandenen Hemmittel zu neutralisieren.1. Enzymatic Cholesterol Assay Reagent, which Cholesterol oxidase and optionally cholesterol esterase and a buffer in such an amount contains that a solution with a pH value between about 5.5 and about 8 is achieved, characterized in that the reagent also contains a cationic surfactant in an amount sufficient to practically all oxygen consumption inhibiting effects of those present in a sample to be examined Neutralize inhibitors.

2. Reagens nach Anspruch 1, bestehend aus oder enthaltend:2. Reagent according to claim 1, consisting of or containing: