DE2704096A1

DE2704096A1 - Electrophoretic sepn. of protein - with introduction of protein into carrier gel as mixt. with dextran swollen with sucrose soln.

Info

Publication number: DE2704096A1
Application number: DE19772704096
Authority: DE
Inventors: Siegbert Bissbort
Original assignee: BISSBORT SIEGBERT DIPL BIOLOGE
Current assignee: BISSBORT SIEGBERT DIPL BIOLOGE
Priority date: 1977-02-01
Filing date: 1977-02-01
Publication date: 1978-08-03

Abstract

In a new procedure for the electrophoretic examination of proteins (enzymes, serum proteins, tissue, homogenates) involving introduction of the proteins by means of a carrier medium into holes in a flat layer of carrier gel (agar, starch or polyacrylamide gel), there is used as the carrier medium a swollen gel (preF. with a low degree of crosslinking) in the form of dextran swollen with water or buffer soln. with the addition of sucrose. Use of sucrose-contg. dextran gel as carrier medium enables protein to be applied to the carrie medium by simple pipetting. the sucrose stabilises the proteins against damage while passing through the dextran. Larger amts. of protein can be used than with known methods, and even minor proteins (e.g. human erythrocyte phospho-glucomutase isoenzyme 3) can be detected.

Description

Verfahren zur elektrophoretischen Untersuchung von ProteinenMethod for the electrophoretic investigation of proteins

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur elektrophoretischen Untersuchung von Proteinen, vornehmlich Enzymen im Wege der Charakterisierung durch Auftrennung.The invention relates to a method for electrophoretic Investigation of proteins, primarily enzymes, by way of characterization Separation.

Es ist bekannt (CH. ebi, Einführung in die prakt. Biochemie, 2.Auflage, Seite 197 ff) Proteingemische dadurch zu charakterisieren, daß die auf einen Träger einem elektrischen Feld ausgesetzt werden. Dieses als Trägerelektrophorese bekannte Verfahren wird im allgemeinen dadurch realisiert, daß eine Trägerschicht aus einem Trägergel vorbereitet wird, in welchem Ausnehmungen, sogenannte Impf löcher, angebracht werden, in welche das Proteingemisch mit Hilfe eines Trägermediums eingebracht wird.It is known (CH. Ebi, Introduction to Practical Biochemistry, 2nd Edition, Page 197 ff) to characterize protein mixtures in that the on a carrier exposed to an electric field. This is known as carrier electrophoresis Method is generally realized in that a carrier layer consists of a Carrier gel is prepared in which recesses, so-called inoculation holes, are made into which the protein mixture is introduced with the help of a carrier medium.

Das elektrische Feld wird dann zwischen zwei an entgegengesetzten Seiten der Trägerschicht angebrachten Elektroden aufgebaut.The electric field is then opposite between two at Electrodes attached to the sides of the carrier layer are built up.

Das elektrische Feld ruft dabei eine Wanderung der einzelnen Proteine hervor. Diese Tatsache ist unter dem Begriff Elektrophorese bekannt.The electric field causes the individual proteins to migrate emerged. This fact is known under the term electrophoresis.

Die elektrophoretische Beweglichkeit eines geladenen Proteinteilchens hängt ab von der Größe der Ladung, sowie der Größe und der Form der einzelnen Teilchen. Darüberhinaus gehen auch die Eigenschaften des Trägermediums auf die Wanderungsgeschwindigkeit ein.The electrophoretic mobility of a charged protein particle depends on the size of the charge, as well as the size and shape of the individual particles. In addition, the properties of the carrier medium also affect the speed of migration a.

Für bekannte und elektrophoretische Untersuchungen werden die Proteingemische nlit Hilfe eines Trägermediums in Form eines Papierstreifens (Zellulosestreifens) in die Ausnehmungen der Trägerscbicht aus einem inerten Gel,vorzugsweise einem Agar-, Stärke- oder Polyacrylamidgel eingebracht. Die in einer bestimmten Zeiteinheit durchgeführten Wanderungswege der einzelnen Proteinpartikelchen läßt einen genauen Rückschluß auf die Zusammensetzung des Proteingemisches zu bzw. ermöglicht eine Trennung des Protcingemisches nach den einzelnen Komponenten (einzelnen Enzymen).The protein mixtures With the help of a carrier medium in the form of a paper strip (cellulose strip) into the recesses of the carrier sheet made of an inert gel, preferably an agar, Starch or polyacrylamide gel introduced. The ones carried out in a certain unit of time The migration paths of the individual protein particles allow an exact conclusion the composition of the protein mixture or enables the protein mixture to be separated according to the individual components (individual enzymes).

Bei dem bekannten Verfahren hat die Verwendung eines Papierstreifens als Trägermedium für das Proteingemisch verschiedene Nachteile. Im besonderen besteht eine Wechselwirkung zwischen der Zellulose und den Proteinen, welche die Mobilität der Proteine nachteilig beeinflußt. Darüberhinaus wird durch die Impf löcher zur Aufnahme der mit dem Proteingemisch getränkten Papierstreifen eine Feldverzerrung der für d.e elektrophoretische Beeinflussung notwendigen Feldlinien erzeugt, die abhängig von der Leitfähigkeit des mit dem Proteingemisch getränkten Papiers ist. Dies bedeutet, daß sich die Feldverzerrung während des Auftrennvorganges ändert, daß mit dem Auswandern der einzelnen Proteine aufgrund des elektrischen Feldes sich die Leitfähigkeit des Papierstreifens verändert. Zudem ist die Menge des aufzutrennenden Proteingemisches stark begrenzt.In the known method, the use of a paper strip various disadvantages as a carrier medium for the protein mixture. In particular, there is an interaction between the cellulose and the proteins that increase mobility which adversely affects proteins. In addition, through the vaccination holes for Image of the paper strips soaked with the protein mixture shows a field distortion the field lines necessary for the electrophoretic influence generated which depends on the conductivity of the paper soaked with the protein mixture. This means that the field distortion changes during the cutting process, that with the migration of the individual proteins due to the electric field changes the conductivity of the paper strip. In addition, the amount of the to be separated Protein mix very limited.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Trägermedium anzugeben, welches einen gleichltäßigen Stromfluß durch die Ausnehmungen in der Träyerschicht, den sogenannten Impflechern auch nach dem Auswandern der Proteine garantiert, welches sich inert gegenüber den Proteinen verhält, welches leicht verarbeitbar ist und welches mit jedem Proteingemisch leicht vermengt werden kann, zudem können mit diesem Verfahren wesentlich größere Mengen von Proteingemischen aufgetrennt werden.The object of the invention is to provide a carrier medium which a uniform current flow through the recesses in the Träyerschicht, the So-called vaccination boxes, even after the proteins have emigrated, guarantees which one behaves inert towards the proteins, which is easy to process and which can be easily mixed with any protein mixture, and can also be used with this Process, significantly larger amounts of protein mixtures are separated.

Das Verfahren nach der Erfindung gibt hierzu ein Trägermedium an, wie es im Kennzeichen des Patentanspruches 1 charakterisiert ist. Das Trägermedium für eine elektrophoretische Untersuchung von Proteinen besteht demgemäß aus einen gequollenen, vorzugsweise wenig vernetztem Gel in Form von in Wasser gequollenen Dextranen, welchem Saccharose (Zucker) zugesetzt ist.The method according to the invention specifies a carrier medium for this purpose, as it is characterized in the characterizing part of claim 1. The carrier medium for an electrophoretic investigation of proteins accordingly consists of one swollen, preferably slightly crosslinked gel in the form of gel swollen in water Dextrans to which sucrose (sugar) is added.

Gemäß dem Verfahren nach der Erfindung wird also als Trägermaterial ein Gel verwendet, welches hinsichtlich seiner Konssistenz und insbesondere auch der elektrischen Leitfähigkeit ähnlich dem Trägergel der ebenen Trägerschicht ist, in welchem die Ausnehmungen (Impflöcher) zum Einbringen des zu untersuchender. Proteingemisches auf dem genannten Trägermedium angeordnet sind.According to the method according to the invention, the carrier material a gel used, which in terms of its consistency and in particular also the electrical conductivity is similar to the carrier gel of the flat carrier layer, in which the recesses (inoculation holes) for introducing the to be examined. Protein mixture are arranged on said carrier medium.

Das Volumen der Impf löcher kann bis zu dem Fünffachen des bisher Möglichen vervielfacht werden, da das Dextrangel von sich aus ein Sammelgel darstellt, das bisher nur bei der Discelektrophorese angewandt werden konnte. D.h., alle homogenen Proteinfraktionen wandern als scharfe Bande in das Trenngel ein. Die Zonenbreite, der aus dem Gel-Proben-Gemisch im Impfschlitz in das Trenngel (Agarose-, Stärke- oder Polyacrylamidgel) einwandernden Proteinfraktionen, ist also wesentlich geringer, als die Breite des Impfschlitzes selbst.The volume of the inoculation holes can be up to five times the previous one Possible to be multiplied, since the dextran gel itself is a stacking gel, which up to now could only be used in disc electrophoresis. That is, all homogeneous Protein fractions migrate into the separating gel as a sharp band. The zone width, from the gel-sample mixture in the inoculation slot into the separating gel (agarose, starch or polyacrylamide gel) immigrating protein fractions, is therefore much lower, than the width of the inoculation slot itself.

Für die Zwecke der Erfindung hat es sich hierbei als besonders vorteilhaft erwiesen, dem als Trägermedium zu verwendenden Gel in Form von Dextran ein Mono- oder Disaccharid zuzusetzen. Das Zusetzen eines möglichst niederwertigen Saccharids zu dem Trägermedium dient dazu, die Enzyme zu stabilisieren.For the purposes of the invention, this has proven to be particularly advantageous proved that the gel to be used as carrier medium in the form of dextran is a mono- or to add disaccharide. The addition of the lowest possible saccharide possible to the carrier medium serves to stabilize the enzymes.

Als Dextrane im Sinne dieser Erfindung eignen sich besonders Dextrane mit einer sehr hohen molekularen Ausschlußgrenze, die dementsprechend pro Volumenseinheit besonders viel Proteinsubstanz aufzunehmen vermögen. Solche Dextrine sind im Handel erhältlich.Dextrans are particularly suitable as dextrans for the purposes of this invention with a very high molecular exclusion limit, which is accordingly per unit volume able to absorb a particularly large amount of protein substance. Such dextrins are commercially available available.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß das Verfahren nach der Erfindung die Verwendung eines in Wasser oder Pufferlösung gequollenen Dextrans, d.i. ein makromulekulares, hydrophiles Polysaccharid bakteriellen Ursprungs unter Zusatz von Saccharose vorschlägt, wobei sich für die Zwecke der Erfindung besonders ein Mono-oder Disaccharid eignet.In summary, it can be stated that the method according to the Invention the use of a dextran swollen in water or buffer solution, i.e. a macromolecular, hydrophilic polysaccharide of bacterial origin Suggests addition of sucrose, being particularly useful for the purposes of the invention a mono- or disaccharide is suitable.

Dabei wird erfindungsgemäß das gequollene Gel, d,h, also das unter Zusatz von Saccharose in Wasser gequollene Dextran mit dem zu untersuchenden Proteingemisch vermengt.According to the invention, the swollen gel, that is to say the under Addition of sucrose swollen dextran in water with the protein mixture to be examined mixed up.

Die so erhaltene mit Proteinen angereicherte Dextrankügelchen werden mit Hilfe einer Pipette in die Impflöcher einer Gelträgerschicht eingebracht, wobei die Impf löcher, d.h. die Ausnehmungen in der Trägerschicht mit dem mit Protein getränkten Trägermedium voll ausgefüllt werden. Auf diese Weise wird ein gleichmäßiger Feldlinienverlauf bzw. Stromfluß auch nach Austritt der Proteine aus den Impflöchern garantiert.The protein-enriched dextran beads thus obtained become introduced into the inoculation holes of a gel carrier layer with the aid of a pipette, wherein the inoculation holes, i.e. the recesses in the carrier layer with the protein soaked carrier medium must be completely filled out. This way it becomes a smoother Field lines or current flow even after the proteins have emerged from the inoculation holes guaranteed.

Das Verfahren nach der Erfindung ermöglicht die Einbringung wesentlich größerer Mengen von aufzutrennenden Stoffgemischen, als mit bisher bekannten Methoden möglich war. Die Kombination zweier bisher nur isoliert anwendbarer Methoden, nämlich Sammelgeleffekt und horizontale Gelblockelektrophorese in einem Elektrophoresesystem ermöglicht die Untersuchung von um ein vielfaches erhöhten Probemengen bei gleichzeitiger Verschärfung der Banden.The method according to the invention enables the introduction to be substantial larger amounts of mixtures of substances to be separated than with previously known methods was possible. The combination of two that were previously only applicable in isolation Methods, namely stacking gel effect and horizontal gel block electrophoresis in one Electrophoresis system allows the study of many times increased Sample amounts with simultaneous tightening of the bands.

So konnte mit diesem Verfahren erstmals das Vorhandensein des Isoenzyms 3 der Phosphoglukomutasen aus menschlichen Erythrozyten demonstriert werden. Es können also Minorfraktionen nachgewiesen werden, die bisher nur nach vorheriger Anreicherung möglich waren. Das Verfahren hat sich zudem bei allen elektrophoretisch nachweisbaren Polymorphismen des menschlichen Blutes bewährt. Zudem ist es geeignet zur Einbringung von Homoyenaten aus menschlichen, tierischen und pflanzlichen Geweben in die Elektrophoreseapparatur. Auch zur präparativen Elektrophorese ist es anwendbar.This was the first time that the isoenzyme was present 3 of the phosphogluco mutases from human erythrocytes can be demonstrated. It so minor fractions can be detected, which so far only after previous Enrichment were possible. The process has also proven to be electrophoretical in all proven polymorphisms of human blood. It is also suitable for the introduction of homoyenates from human, animal and plant tissues into the electrophoresis apparatus. It can also be used for preparative electrophoresis.

Da gemäß dem Verfahren nach der Erfindung die Proteine zusammen mit dem Trägermedium durch Pipettieren eingebracht werden können, ergibt sich bei der Vorbereitung der Auftrennung durch Elektrophorese eine Arbeitsersparnis von bis zu 70%. Darüberhinaus sind die Proteine mit Rücksicht auf die Durchsetzung des Dextrans mit Saccharose besonders beständig.Since, according to the method according to the invention, the proteins together with can be introduced into the carrier medium by pipetting, results in the Preparing the separation by electrophoresis a labor saving of up to to 70%. In addition, the proteins are with regard to the enforcement of the dextran particularly resistant with sucrose.

Im Rahmen der Erfindung sind verschiedene Abwandlungen des Verfahrens möglich. Insbesondere können für konkrete Zwecke auch Dextrane mit höherer oder niedrigerer molekularer Ausschlußgrenze angewandt werden. Auch hinsichtlich der Anwendung von Saccharose ergeben sich gewisse Variationen. Wesentlich ist, daß sich die anzuwendenden Dextrane und die Saccharose absolut inert gegenüber den zu untersuchenden Proteinen (Enzymen) verhalten. Zudem können für spezielle Zwecke (z.B. Auftrennung von Proteinextrakten verschiedener Herkunft) das Dextrangel mit Hilfe geeigneter Puffer auf die optimale Leitfähigkeit eingestellt werden.Various modifications of the method are within the scope of the invention possible. In particular, dextrans with higher or higher can also be used for specific purposes lower molecular exclusion limit can be applied. Also with regard to the Application of sucrose results in certain variations. What is essential is that the dextrans to be used and the sucrose are absolutely inert to those to be examined Proteins (enzymes). In addition, for special purposes (e.g. separation of protein extracts of various origins) the dextran gel with the help of suitable Buffer can be adjusted to the optimal conductivity.

- Patentansprüche - - patent claims -

Claims

Claims fiMethod for electrophoretic investigation (Characterization by separation) of proteins (enzymes, serum proteins, tissue homogenates) by introducing the proteins into recesses (inoculation holes) using a carrier medium a flat carrier layer made of a carrier gel (agar gel, starch gel, polyacrylamide gel), characterized in that as a carrier medium for introducing the proteins into the Layer recesses a swollen, preferably slightly crosslinked gel in the form of Dextrans swollen in water or buffer solution with the addition of sucrose are used will.

2. The method according to claim 1, characterized in that the dextran a mono- or disaccharide is added.

3. The method according to claim 1, characterized by the use of dextrans as a carrier medium.

see method according to one of claims 1 to 3, characterized in that that the carrier medium and proteins are first mixed and the totality of the mixture in the recesses (inoculation holes) of the carrier layer is introduced by pipetting.