DE2656063C3

DE2656063C3 - Process for the production of cholesterol oxidase

Info

Publication number: DE2656063C3
Application number: DE19762656063
Authority: DE
Inventors: Charles Thomas Rochester N.Y. Goodhue
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1975-12-11
Filing date: 1976-12-10
Publication date: 1984-06-28
Also published as: JPS5746839B2; DE2656063A1; CA1067844A; FR2334748B2; FR2362927B1; FR2362927A1; GB1551452A; DE2656063B2; JPS5290689A; FR2334748A2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cholesterin-Oxidase durch Kultivierung eines Choleste-in-Oxidase erzeugenden Mikroorganismus in einem einen Kohlenstofflieferanten, einen Cholesterin-Oxidase-Auslöser, eine nichttoxische nichtionogene, oberflächenaktive Verbindung, Hefehydrolysat sowie Spuren von Metallsalzen enthaltenden Nährmedium und Abtrennung der erzeugten Cholsterin-Oxidase.The invention relates to a method for producing cholesterol oxidase by cultivating a cholesterol oxidase producing microorganism in a carbon supplier, a cholesterol oxidase trigger, a non-toxic nonionic surfactant compound, yeast hydrolyzate as well Nutrient medium containing traces of metal salts and separation of the cholesterol oxidase produced.

Mikroorganismen, die die Fähigkeit zur Metabolisierung von Cholesterin haben, sind bekanntlich potentielle Lieferanten von Enzymen, die sich für die enzymatische Bestimmung von Cholesterin in komplexen Mischungen, beispielsweise Blutserum eignen. Dies gilt insbesondere dann, wenn die Mikroorgansismen Cholesterin als einzigen Kohlenstofflieferanten verwenden können, da bei diesem Bestimmungsverfahren Cholesterin durch oxidative Enzyme abgebaut werden muß.Microorganisms that have the ability to metabolize cholesterol are known to be potential Suppliers of enzymes suitable for the enzymatic determination of cholesterol in complex mixtures, for example blood serum are suitable. This is especially true when the microorganisms cholesterol as only one source of carbon can use, since with this determination method cholesterol through oxidative enzymes must be broken down.

T. C. S t a d 1 m a η in »Methods in Enzymology«, Band 1, Herausgeber: S. P. Colowick und N. O. Kaplan, »Academic Press«. N. Y., 1955, Seite 678 sowie T. C. S t a d t m a η. A. C Ii c r k e s sowie J. Λ η Γ i π s e η in »Biol. Chem.«, 206 (1954), Seite 510, berichten über dieT. C. S t a d 1 m a η in "Methods in Enzymology", volume 1, editors: S. P. Colowick and N. O. Kaplan, "Academic Press". N. Y., 1955, page 678 and T. C. S t a d t m a η. A. C Ii c r k e s and J. Λ η Γ i π s e η in “Biol. Chem. ”, 206 (1954), p. 510, report on the

Reinigung eines Enzymes von Nocardia cholesterolicum, einem Organismus, der zuerst von S c h a t ζ und Mitarbeitern (vgl. A. Schatz, K. Savard und I. J. P i η t η ε r in »J. Bacteriol.«, 58 [1949], Seite 117 bis 125) isoliert wurde. Das Enzym von Stadt man, als »Cholesterin- Dehydrogenase« bezeichnet, wurde für die Verwendung im Rahmen einer Cholesterin-Bestimmung gereinigt, die auf der Messung des Anstieges der Absorption bei 250 nm aufgrund der Bildung von Cholest-4-en-3-on beruht Da, wie nunmehr festgestellt wurde, der direkte Akzeptor von Cholesterin-Elektronen bei dieser Oxidation Sauerstoff ist, muß das Enzym richtigerweise als Cholesterin-Oxidase bezeichnet werden. Purification of an enzyme from Nocardia cholesterolicum, an organism that was first identified by S c h a t ζ and co-workers (cf. A. Schatz, K. Savard and I. J. P i η t η ε r in »J. Bacteriol. «, 58 [1949], pages 117 to 125) was isolated. Stadtman's enzyme called "cholesterol dehydrogenase" was used for the use in the context of a cholesterol determination purified based on the measurement of the increase in absorbance at 250 nm due to the formation of Cholest-4-en-3-one is based there, as has now been established, the direct acceptor of cholesterol electrons if this oxidation is oxygen, the enzyme must properly be called cholesterol oxidase.

Die Bakterienstämme, die von S t a d t m a η beschrieben werden, erzeugen, wenn sie nach den in den zitierten Literaturstellen beschriebenen Verfahren kultiviert werden, nur sehr geringe Enzymkonzentrationen, weiche für eine technische Verwertung zu gering sind. Die nach den bekannten Methoden herstellbaren Konzentrationen sind derart gering, daß eine Reinigung des Enzyms für die Praxis praktisch nicht in Frage kommt.The bacterial strains described by S t a d t m a η produce, if after the in the cited literature references are cultivated processes described, only very low enzyme concentrations, which are too low for technical recovery. Those which can be produced by the known methods Concentrations are so low that purification of the enzyme is practically out of the question in practice comes.

Aus der US-PS 39 09 359 ist des weiteren ein verbessertes Verfahren für die Erzeugung der Stadtmanschen Cholesterin-Oxidase bekannt, welches
den folgenden Verfahrensstufen besteht:From US-PS 39 09 359 an improved process for the production of Stadtman's cholesterol oxidase is known which
consists of the following procedural stages:

austhe end

(a) Züchtung des Bakteriums Nocardia cholesterolicum Art NRRL 5767 oder NRRL 5768 in einem Medium, in dein Cholesterin oder ein geeignetes Derivat hiervon als Hilfs-Kohlenstofflieferant wirkt und(a) Cultivation of the bacterium Nocardia cholesterolicum Art NRRL 5767 or NRRL 5768 in one Medium, in your cholesterol or a suitable derivative thereof as an auxiliary carbon supplier acts and

(b) Isolierung eines zellenfreien Extraktes mit dem aktiven Enzym aus dem Medium.(b) Isolation of a cell-free extract with the active enzyme from the medium.

Das in der US-PS 39 09 359 beschriebene Verfahren stellt eine wesentliche Verbesserung des von Stadtm a η beschriebenen Syntheseverfahrens dar. Es ermöglicht die Herstellung von Cholesterin-Oxidase im technischen Maßstab.The method described in US-PS 39 09 359 is a significant improvement of Stadtm a η described synthesis process. It enables the production of cholesterol oxidase im technical scale.

Aus der GB-PS 13 85 319 und der DE-OS 22 46 695 sind des weiteren Enzympräparate mit Cholesterin-Oxidase-Aktivität und ein Verfahren zur Herstellung derselben aus Kulturen der Mikroorganismen Nocardia NRRL 5635 und NRRL 5636 bekannt. Die Kultivierung der Mikroorganismen erfolgt dabei in einem Nährmedium, das pro Liter 20 g Hefeextrakt enthält. Während der Kultivierung wird dem Medium langsam Cholesterin zugesetzt, vorzugsweise in Form einer Dispersion mit einer nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindung. Das Cholesterin wird dabei in Mengen von insgesamt 1,2 g pro Liter Medium zugesetzt. Die zugesetzte Menge an nichtionogener, oberflächenaktiver Verbindung ist unbedeutend. Sie liegt nach dem Beispiel der GB-PS 13 85 319 (Beispiel 1 der DE-OS 22 46 695) bei 0,127 g/l. Bei dem bekannten Verfahren kann die Cholesterin-Oxidase ferner nach der Kultivierung aus den geernteten Zellen ohne Zerstörung derselben mittels einerFrom GB-PS 13 85 319 and DE-OS 22 46 695 are further enzyme preparations with cholesterol oxidase activity and a method for producing the same from cultures of the microorganisms Nocardia NRRL 5635 and NRRL 5636 known. The cultivation of the microorganisms takes place in a nutrient medium, which contains 20 g of yeast extract per liter. During the cultivation, the medium slowly becomes cholesterol added, preferably in the form of a dispersion with a nonionic surface-active compound. The cholesterol is added in amounts totaling 1.2 g per liter of medium. The amount added of nonionic, surface-active compound is insignificant. It is based on the example of the GB-PS 13 85 319 (Example 1 of DE-OS 22 46 695) at 0.127 g / l. In the known method, the cholesterol oxidase furthermore after culturing from the harvested cells without destroying them by means of a

fco nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindung extrahiert werden.fco nonionic surfactant compound extracted will.

Ein Nährmedium, das 20.0 g Hefeextrakt pro Liter enthält, ist lerner aus der Literaturstelle »Industrial Aspects of Biochemistry«, Bd. 30, 1974, S. 65-69, be-A nutrient medium that contains 20.0 g of yeast extract per liter is lerner from the reference »Industrial Aspects of Biochemistry ", Vol. 30, 1974, pp. 65-69, be

·" kannt.· "Knows.

Aus einer von E. T. R e e s e und A. M a g u i r e unter der Überschrift »Surfactants as Stimulants of Enzyme Production be Microorganismus«, veröffentlichtenFrom a by E. T. R e e s e and A. M a g u i r e under the heading “Surfactants as Stimulants of Enzyme Production be Microorganism «published

»ν iii »Ν iii

Arbeit in der Zeitschrift »Applied Microbiology«, Februar 1969, Seiten 242-245, ist es des weiteren bekannt, daß der Zusatz von Sorbitanpolyoxyäthylenmonoleat und anderer nichtionogener oberflächenaktiver Verbindungen zu Pilzkulturen, die normalerweise Enzyme extrazellular erzeugen, zu einem Anstieg der Enzymausbeute führt.Work in the journal "Applied Microbiology", February 1969, pages 242-245, is further known that the addition of sorbitan polyoxyethylene monoleate and other nonionic surface-active compounds to fungal cultures that normally Generating enzymes extracellularly leads to an increase in enzyme yield.

Aus der südafrikanischen Patentschrift 73/3259 ist schließlich die Herstellung von Cholesterin-Oxidase unter Verwendung von Proactinomyces erythropolis NBC 9158, ATC 17 895, ATCC 4277 und Nocardia formica ATCC 14 811 bekannt Die Fermentation erfolgt dabei in einem Pepton enthaltenden Mineralsalzmedium, wobei, wenn die logarithmische Wachstumsphase erreicht ist, langsam Cholesterin in Form einer wäßrigen Suspension zugegebei. wird, und zwar im Verhältnis zum Wachstum des Mikroorganismus, derart, daß die zugesetzte Cholesterinmenge insgesamt pro Liter Medium 1 bis 20 g beträgt. Gemäß Beispiel 2 der Patentschrift kann eine vergleichsweise geringe Menge an Cholesterin (0,05%) dem Medium von Anfang an zugesetzt werden. Ein Anstieg der Ausbeute an Cholesterin-Oxidase-Aktivität' wird dadurch erreicht, daß der Cholesterin-Suspension Hefeextrakt als Emulgiermittel in einer Menge von 0,02 bis 1 Gew.-% der Cholesterin-Suspension zugesetzt wird. Aus der Patentschrift ergibt sich, daß lediglich eine sehr geringe Menge an Hefeextrakt dem Medium zugesetzt wird. Während der Fermentierung ist keine oberflächenaktive Verbindung zugegen.The production of cholesterol oxidase is finally from the South African patent specification 73/3259 using Proactinomyces erythropolis NBC 9158, ATC 17 895, ATCC 4277 and Nocardia formica ATCC 14 811 known The fermentation takes place in a peptone-containing mineral salt medium, where, when the logarithmic growth phase is reached, cholesterol slowly takes shape added to an aqueous suspension. in relation to the growth of the microorganism, such that the total amount of cholesterol added per liter of medium is 1 to 20 g. According to example 2 The patent can add a comparatively low amount of cholesterol (0.05%) to the medium from the start to be added. An increase in the yield of cholesterol oxidase activity is achieved by that the cholesterol suspension yeast extract as an emulsifier in an amount of 0.02 to 1 wt .-% of the Cholesterol suspension is added. The patent shows that only a very small amount of yeast extract is added to the medium. There is no surfactant compound during fermentation present.

Aus der genannten südafrikanischen Patentschrift und der DE-OS 23 07 518 ist es ferner bekannt, zur Gewinnung von Cholestrin-Oxidase die genannten Mikroorganismen zunächst in einem Nährmedium mit Acetat als alleiniger Kohlenstoffquelle und danach in einem Nährmedium mit Cholesterin als alleiniger Kohlenstoffquelle zu züchten. Je Liter Wachstumsbrühe werden dabei 1 bis 20 g Cholesterin und 0,02 bss 1 % Hefeextrakt verwendet.From the above-mentioned South African patent and DE-OS 23 07 518 it is also known for extraction of cholestrin oxidase the mentioned microorganisms first in a nutrient medium with acetate as the sole carbon source and then in a nutrient medium with cholesterol as the sole carbon source to breed. 1 to 20 g of cholesterol and 0.02 to 1% yeast extract are used per liter of growth broth used.

Aus der DE-OS 25 12 606 ist schließlich bereits ein Verfahren zur Herstellung eines Cholesterin-Oxidase-Enzyms durch Züchtung eines Mikroorganismus vom Typ Nocardia Art NRRL 5767 und NRRL 5768 in einem wäßrigen Nährmedium mit einem primären Kohlenstofflieferanten, wie z. B. Glycerin und einem sekundären Kohlenstofflieferanten, wie z. B. Cholesterin bekannt. Der sekundäre Kohlenstofflieferant kann dem wäßrigen Nährmedium dabei in Form einer Suspension zugesetzt werden, die unter Verwendung einer nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindung in Konzentrationen von 0,01 bis 0,20%, d. h. 0,1 bis 2,0 g/l bereitet wird, so daß die Konzentration der oberflächenaktiven Verbindung im Nährmedium 0,01 bis 0,2 g/l beträgt.Finally, DE-OS 25 12 606 already discloses a method for producing a cholesterol oxidase enzyme by cultivating a microorganism of the type Nocardia Art NRRL 5767 and NRRL 5768 in one aqueous nutrient medium with a primary carbon supplier, such as. B. glycerin and a secondary Carbon suppliers such as B. known as cholesterol. The secondary carbon supplier can do that aqueous nutrient medium are added in the form of a suspension, using a nonionic surfactant compound in concentrations from 0.01 to 0.20%; d. H. 0.1 to 2.0 g / l prepared so that the concentration of the surface-active compound in the nutrient medium is 0.01 to 0.2 g / l.

Aufgabe der Erfindung war es, ein Verfahren anzugeben, nach dem sich Cholesterin-Oxidase in besonders hohen Ausbeuten gewinnen läßt.The object of the invention was to provide a method according to which cholesterol oxidase in particular can win high yields.

Gelöst wird diese Aufgabe mit einem Verfahren, wie es in den Ansprüchen gekennzeichnet ist, demzufolge zur Kultivierung eines Cholesterin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismus ein Nährmedium verwendet wird, das im Vergleich zu den Nährmedien des Standes der Technik eine besonders hohe Konzentration an nichtionogener oberflächenaktiver Verbindung enthält.This object is achieved with a method as characterized in the claims, accordingly a nutrient medium is used to cultivate a microorganism which produces cholesterol oxidase is, in comparison to the nutrient media of the prior art, a particularly high concentration contains nonionic surface-active compound.

Aus dem Nährmedium läßt sich die erzeugte Cholesterin-Oxidase nach üblichen bekannten Methoden isolieren. The cholesterol oxidase produced can be isolated from the nutrient medium by customary known methods.

Der Cholesterin-Oxidase-Auslöser kann zusätzlich als Hilfskohlenstofflieferant dienen. Die nichtionogene, oberflächenaktive Verbindung soll nichttoxisch gegenüber dem zu kultivierenden Mikroorganismus seiaThe cholesterol oxidase trigger can also serve as an auxiliary carbon supplier. The non-ionic, Surface-active compound should be non-toxic to the microorganism to be cultivated

Unter einem »Hefehydrolysat« ist ein übliches, durch Hydrolyse von Hefe mit Wasser erhaltenes Produkt zu verstehen. Zu Hefehydrolysaten im weitesten Sinne gehören auch die üblichen Hefeextrakte, d. h. Heißwasserextrakte von Hefehydrolysaten sowie durch enzymatischen Aufschluß von Kulturhefen gewonnene Präparate. Under a "yeast hydrolyzate" is a common one To understand hydrolysis of yeast with water product obtained. To yeast hydrolyzates in the broadest sense also include the usual yeast extracts, d. H. Hot water extracts from yeast hydrolysates as well as by enzymatic ones Preparations obtained from culture yeast digestion.

ι» Die Abkürzung »NRRL« bedeutet dabei, daß Kulturen der angegebenen Mikroorganismen in den USA in dem »Agricultural Collection Investigations Fermentation Laboratory«, Peoria, Illinois, hinterlegt wurden.ι »The abbreviation» NRRL «means that cultures of the specified microorganisms in the USA deposited in the Agricultural Collection Investigations Fermentation Laboratory, Peoria, Illinois became.

Die Abkürzung »ATCC« bedeutet, daß Kulturen der Mikroorganismen in den USA bei der »American Type Culture Collection« hinterlegt wurden.The abbreviation »ATCC« means that cultures of the microorganisms in the USA are of the »American Type Culture Collection «.

Bei dem Verfahren zur Erzeugung von Cholesterin-Oxidase nach der US-PS 39 09 359, bei dem Cholesterin-Oxidase intrazellular erzeugt wird, führt die Verwendung eines üblichen primären Kohlenstofflieferanten, wie beispielsweise Glyzerin, in Kombination mit einem sekundären oder Hilfskohlenstofflieferanten, wie beispielsweise Cholesterin, Cholest-4-en-3-on oder Cholesteryllinoleat, bei denen es sich sämtlich um Cholesterin-Oxidase-Auslöser handelt, zu einer Erhöhung der Ausbeute an Cholesterin-Oxidase-Enzym, die etwa lOOmal so groß ist als die Ausbeute, die dann erhalten wird, wenn kein Cholesterin-Oxidase-Auslöser verwendet wird, wenn kein Cholesterin-Oxidase-Auslöser verwendet wird oder wenn Cholesterin als einziger Kohlenstofflieferant verwendet wird.In the process for the production of cholesterol oxidase according to US Pat. No. 39 09 359, in the case of the cholesterol oxidase is generated intracellularly, the use of a common primary carbon supplier leads to such as glycerine, in combination with a secondary or auxiliary carbon supplier such as Cholesterol, cholest-4-en-3-one or cholesteryl linoleate, which are all cholesterol oxidase triggers, to an increase in the Yield of cholesterol oxidase enzyme about 100 times the yield then obtained is when a cholesterol oxidase inducer is not used, when not a cholesterol oxidase inducer or when cholesterol is used as the sole source of carbon.

So werden nach dem aus der US-PS 39 00 359 bekannten Verfahren erhöhte Ausbeuten an Cholesterin-Oxidase dann erhalten, wenn das bacterium Nocardia cholesterolicum in einem üblichen Nährmedium von üblicher bekannter Zusammensetzung kultiviert wird, das im allgemeinen einen Stickstofflieferanten enthält, z. B. Ammoniumsulfat, ferner einen Kalium- und einen Phosphorlieferanten, z. B. Kaliumphosphat, Spuren an Metallionen sowie ferner eine Mischung aus einem primären Kohlenstofflieferanten, z. B. Glyzerin und einem Cholesterin-Oxidase-Auslöser, bestehend aus Cholesterin, Cholest-4-en-3-on, Cholesteryllinoleat oder Mischungen hiervon. Der pH-Wert des Mediums liegt dabei zwischen etwa 5,0 und 8,0, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5. Die Temperatur des Nährmediums liegt bei etwa 25 bis 35° C, vorzugsweise bei etwa 30°C. Die Kultivierungsdauer beträgt etwa 18 bis etwa 40 Stunden, vorzugsweise etwa 20 bis etwa 24 Stunden.Thus, according to the method known from US Pat. No. 3,900,359, increased yields of cholesterol oxidase are obtained obtained when the bacterium Nocardia cholesterolicum in a normal nutrient medium cultivated of a conventionally known composition, which is generally a nitrogen source contains, e.g. B. ammonium sulfate, also a potassium and a phosphorus supplier, e.g. B. Potassium phosphate, traces of metal ions and also a mixture of a primary carbon supplier, e.g. B. glycerine and a cholesterol oxidase inducer consisting of cholesterol, cholest-4-en-3-one, cholesteryl linoleate or Mixtures thereof. The pH of the medium is between about 5.0 and 8.0, preferably between 6.5 and 7.5. The temperature of the nutrient medium is around 25 to 35 ° C, preferably around 30 ° C. the Cultivation time is about 18 to about 40 hours, preferably about 20 to about 24 hours.

Die Mengen an Stickstoff-, Kalium- und Phosphorlieferanten sowie Metallionen liegen in der üblichen Größenordnung.The quantities of nitrogen, potassium and phosphorus suppliers as well as metal ions are in the usual range Magnitude.

Zu den bevorzugt verwendeten primären Kohlen-Stofflieferanten gehören nach den Angaben der US-PS 39 09 359 beispielsweise Glyzerin, Glukose und Essigsäure. Dabei werden übliche bekannte Konzentrationen an primären Kohlenstofflieferanten verwendet. Diese liegen im allgemeinen bei etwa 5 bis etwa 50 g pro Liter.The preferred primary suppliers of carbon include, according to the information in the US Pat 39 09 359 for example glycerine, glucose and acetic acid. The usual known concentrations used on primary carbon suppliers. These are generally from about 5 to about 50 grams per liter.

Die Konzentration an Cholesterin-Oxidase-Auslöser liegt vorzugsweise bei etwa 2 bis etwa 5 g pro Liter.The concentration of cholesterol oxidase inducer is preferably about 2 to about 5 g per liter.

Das Verfahren der Erfindung ermöglicht die Herstellung von Cholesterin-Oxidase nach dem aus der US-PS 39 09 359 bekannten Verfahren mit der Ausnahme jedoch, daß auch andere Cholesterin-Oxidase erzeugende Mikroorganismen als in der Patentschrift angegeben verwendet werden können und das Nährmedium Hefehydrolysat und eine nichtionogene, oberflächenak-The process of the invention enables the production of cholesterol oxidase according to that of the US-PS 39 09 359 known methods with the exception, however, that other cholesterol oxidase-producing Microorganisms as indicated in the patent can be used and the nutrient medium Yeast hydrolyzate and a non-ionic, surface-ac-

tive Verbindung in den angegebenen Konzentrationen enthält. Die Tatsache, daß sich dadurch die intrazellulare Erzeugung von Cholesterin-Oxidase wesentlich erhöhen läßt, war nicht voraussehbar.contains active compound in the specified concentrations. The fact that thereby the intracellular The production of cholesterol oxidase can be increased significantly, was not foreseeable.

Der Zusatz von Hefehydrolysat hat sich als wesentlich erwiesen, um eine erhöhte Ausbeute an Cholesterin-Oxidase zu erreichen. Der Zusatz von steigenden Mengen an Hefehydrolys&t erhöht die Ausbeute an Cholesterin-Oxidase, bis ein Maximum erreicht wird, wonach eine weitere Zugabe von Hefehydrolysat die Ausbeute an Cho'esterin-Oxidase unterdrückt, wie sich aus den später folgenden Beispielen ergibt. Die Ausbeute an Cholesterin-Oxidase läßt sich bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens um beispielsweise 5000% gegenüber bekannten Verfahren durch Zusatz optimaler Mengen an Hefehydrolysat zum Nährmedium erhöhen.The addition of yeast hydrolyzate has been found to be essential in order to increase the yield Achieve cholesterol oxidase. The addition of increasing amounts of yeast hydrolyz & t increases the Yield of cholesterol oxidase until a maximum is reached, after which a further addition of Yeast hydrolyzate suppresses the yield of choesterol oxidase, as can be seen from the following Examples. The yield of cholesterol oxidase can be determined when carrying out the invention Process by, for example, 5000% compared to known processes by adding optimal amounts of Increase yeast hydrolyzate to the nutrient medium.

Ais vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn dem Nährmedium 20 g Hefehydrolysat oder Ϊ Iefeextrakt pro Liter zugesetzt werden. Zu bemerken ist dabei, daß die im Einzelfalle optimale Menge an Hefehydrolysat oder Hefeextrakt etwas von dem Typ oder dem Lieferanten des Hefehydrolysates bzw. Hefeextraktes abhängen kann.It has proven to be advantageous if the nutrient medium contains 20 g of yeast hydrolyzate or Ϊ yeast extract per Liters can be added. It should be noted that the im Individual optimal amount of yeast hydrolyzate or yeast extract something from the type or supplier of the yeast hydrolyzate or yeast extract can depend.

Wenn im folgenden von Hefeextrakten die Rede ist, so bedeutet dies, daß anstelle derselben ganz allgemein Hefehydrolysate verwendet werden können.When yeast extracts are mentioned in the following, this means that instead of them, quite generally Yeast hydrolysates can be used.

Die Erzeugung von Cholesterin-Oxidase wird ferner stark durch den Zusatz einer nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindung zum Nährmedium beeinflußt. Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung eignen sich übliche bekannte nichtionogene oberflächenaktive Verbindungen, z. B. Polyäthylenglykole, Polyvinylalkohol, Polyether, Polyester und Polyhalogenide.The generation of cholesterol oxidase is further increased by the addition of a nonionic surface-active agent Affects connection to the nutrient medium. Suitable for carrying out the method of the invention customary known nonionic surface-active compounds, e.g. B. polyethylene glycols, polyvinyl alcohol, Polyethers, polyesters and polyhalides.

Wesentlich für die erfolgreiche Durchführung des Verfahrens der Erfindung sind folgende Kriterien:The following criteria are essential for the successful implementation of the method of the invention:

(1) weder die im Einzelfalle verwendete nichtionogene oberflächenaktive Verbindung noch ihre Zerfallsprodukte dürfen in den angewandten Konzentrationen gegenüber dem zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendeten Mikroorganismus toxisch sein und(1) Neither the non-ionic surface-active compound used in the individual case nor its decomposition products allowed in the concentrations used against the microorganism used to carry out the method of the invention be toxic and

(2) die Menge an verwendeter oberflächenaktiver Verbindung darf die Enzymproduktion nicht inhibieren.(2) the amount of the surface active compound used does not allow the enzyme production inhibit.

Die Toxizität von Zerfallsprodukten der oberflächenaktiven Verbindungen läßt sich theoretisch, wie im folgenden noch näher erläutert werden wird, voraussagen. Ein positiver Test für ein solches Kriterium ist die Durchführung eines Tests mit dem zu verwendendenThe toxicity of decay products of the surface-active Compounds can be predicted theoretically, as will be explained in more detail below. A positive test for such a criterion is performing a test on the one to be used

ίο Nährmedium und die Beobachtung der Effekte der erzeugten Nebenprodukte.ίο culture medium and observing the effects of the generated by-products.

Zu nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindungen gehört eine Vielzahl von Verbindungen. Für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung sind alle die nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindungen geeignet, die den beiden angegebenen Kriterien genügen.A variety of compounds belong to the nonionic surfactant compounds. For the All of the nonionic surface-active compounds are used to practice the method of the invention suitable that meet the two specified criteria.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens der Erfindung werden zur Durchführung des Verfahrens nichtionogene oberflächenaktive Verbindungen verwendet, die einen hydrophilen Rest mit Oxyäthylengruppen und einen lipophilen Rest mit einem Fettsäurerest aufweisen. Vorteilhafte nichtionogene oberflächenaktive Verbindungen dieses Typs sind beispielsweise solche mit 20 Oxyäthyleneinheiten und einem Fettsäurerest mit 16 Kohlenstoffatomen. Als besonders vorteilhaft haben sich ganz allgemein nichtionogene oberflächenaktive Verbindungen erwiesen, die einen hydrophilen Oxyäthylen- oder Polyglycidolrest aufweisen und einen lipophilen Rest mit mindestens 9 Kohlenstoffatomen. Besonders vorteilhafte nichtionogene oberflächenaktive Verbindungen dieses Typs sind solche, in denen der lipophile Rest aus einem Fettsäurerest mit mindestens 10 Kohlenstoffatomen besteht.According to a particularly advantageous embodiment of the method of the invention, for implementation of the process uses nonionic surface-active compounds that have a hydrophilic residue Have oxyethylene groups and a lipophilic radical with a fatty acid radical. Advantageous non-ionic Surface-active compounds of this type are, for example, those with 20 oxyethylene units and a fatty acid residue with 16 carbon atoms. In general, they have been found to be particularly advantageous Nonionic surface-active compounds have been shown to have a hydrophilic oxyethylene or polyglycidol residue have and a lipophilic radical with at least 9 carbon atoms. Particularly advantageous Nonionic surface-active compounds of this type are those in which the lipophilic residue is made up consists of a fatty acid residue with at least 10 carbon atoms.

Optimale Ergebnisse werden beispielsweise dann erhalten, wenn der Fettsäurerest mindestens 16 Kohlenstoffatome aufweist und der hydrophile Rest etwa 20 Oxyäthyleneinheiten.Optimal results are obtained, for example, if the fatty acid residue is at least 16 Has carbon atoms and the hydrophilic radical has about 20 oxyethylene units.

In der folgenden Tabelle sind einige typische oberflächenaktive Verbindungen angegeben, die sich in vorteilhafter Weise zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung eignen:The following table shows some typical surface-active compounds that can be found in are advantageously suitable for carrying out the method of the invention:

HLB*) Oberflächen- Hydrophiler RestHLB *) surface hydrophilic residue

aktive
Verbindungactive
link

Anzahl Lipophiler Rest AnzahlNumber of lipophilic remainder number

Einheiten EinheitenUnits units

16,716.7 S-IS-I 13.313.3 S-2S-2 15,615.6 S-3S-3 14,914.9 S-4S-4 6,96.9 S-5S-5 10.510.5 S-6S-6 15,015.0 S-7S-7 10.010.0 S-RS-R

SorbitanSorbitan 11 LaunnsäureAlkaline acid 11 PolyoxyälhylenPolyoxyethylene 2020th SorbitanSorbitan 11 LaurinsäureLauric acid 11 OxyäthylenOxyethylene 44th SorbitanSorbitan 11 PalmitinsäurePalmitic acid 11 OxyäthyienOxyethyias 2020th SorbitanSorbitan 11 StearinsäureStearic acid 11 OxyäthylenOxyethylene 2020th SorbitanSorbitan 11 StearinsäureStearic acid 11 OxyäthylenOxyethylene 44th SorbitanSorbitan 11 StearinsäureStearic acid 33 OxyäthylenOxyethylene 2020th SorbitanSorbitan 11 OleinsäureOleic acid 11 OxyäthylenOxyethylene 2020th SorbitanSorbitan 11 OleinsäureOleic acid 11 OxväthylenOxethylene 55

Fortsetzungcontinuation Oberflächen
aktive
Verbindungsurfaces
active
link 26 5626 56 063063 88th Lipophiler RestLipophilic residue Anzahl
Einheitennumber
units 77th HLB*)HLB *) S-9
S-IO
S-Il
S-12
S-13S-9
S-IO
S-Il
S-12
S-13 Nonylphenyl
Nonylphenyl
Nonylphenyl
Nonylphenyl
NonylphenylNonylphenyl
Nonylphenyl
Nonylphenyl
Nonylphenyl
Nonylphenyl 1
1
1
1
11
1
1
1
1 17,1
15,0
13,3
13,3
13,517.1
15.0
13.3
13.3
13.5 Hydrophiler RestHydrophilic residue Anzahl
Einheitennumber
units Oxyäthylen
Oxyäthylen
Oxyäthylen
Glycidol
GlycidolOxyethylene
Oxyethylene
Oxyethylene
Glycidol
Glycidol 10
15
30
6
1010
15th
30th
6th
10

*) Hydrophile-Lipophile-Balance.*) Hydrophile-lipophile balance.

Die im Einzelfalle optimale Konzentration an nichtionogener oberflächenaktiver Verbindung im Nährmedium hängt stark von der Zusammensetzung des Nährmediums ab, der Empfindlichkeit des Nährmediums gegenüber der speziell verwendeten oberflächenaktiven Verbindung und der verwendeten Verbindung selbst. Bei Konzentrationen über 5,0 g pro Liter neigt die oberflächenaktive Verbindung im allgemeinen dazu, die Produktion von Cholesterin-Oxidase zu inhibieren. Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, die oberflächenaktive Verbindung in Konzentrationen von 1,0 bis 3,0 g pro Liter Medium zu verwenden.The optimal concentration of nonionic surface-active compound in the individual case Nutrient medium depends heavily on the composition of the nutrient medium, the sensitivity of the nutrient medium versus the specific surface-active compound used and the compound used itself. At concentrations above 5.0 g per liter, the surface-active compound generally tends to inhibit the production of cholesterol oxidase. It has proven to be particularly advantageous that the surface-active compound to be used in concentrations of 1.0 to 3.0 g per liter of medium.

Die Verwendung eines Nährmediums mit einer nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindung kann gelegentlich zu einem Schäumen führen. Um eine Schaumbildung zu steuern, insbesondere bei größeren Ansätzen, kann deshalb die Verwendung eines üblichen, die Schäumung steuernden Mittels ratsam sein.The use of a nutrient medium with a nonionic surface-active compound can occasionally cause foaming. To control foam formation, especially with larger ones Approaches, the use of a conventional foaming agent may therefore be advisable.

Abgesehen von Cholesterin, Cholest-4-en-3-on und Cholesteryllinoleat, die nach den Angaben der US-PS 39 09 359 Cholesterin-Oxidase-Auslöser sind, können die verschiedensten anderen Sterine und Cholesterinester als Auslöser für die Cholesterin-Oxidase verwendet werden. Andere besonders vorteilhafte Auslöser sind beispielsweise 3-ß-Hydroxysterine, z. B. jS-Sitosterin und 5-a-Cholestan-3-^-ol sowie andere Cholesterinester wie beispielsweise Cholesteryloleat, Cholesterinlinoleat, Cholesterylformiat und Cholesterylpropionat.Apart from cholesterol, cholest-4-en-3-one and cholesteryl linoleate, which according to the details of the US-PS 39 09 359 Cholesterol oxidase triggers can be caused by a wide variety of other sterols and cholesterol esters used as a trigger for cholesterol oxidase. Other particularly beneficial triggers are for example 3-ß-hydroxysterines, z. B. jS-sitosterol and 5-α-Cholestan-3 - ^ - ol and other cholesterol esters such as cholesteryl oleate, cholesterol linoleate, cholesteryl formate and cholesteryl propionate.

Der Fermentationsprozeß erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 18 bis etwa 35° C. Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen bei Temperaturen unterhalb 30° C zu arbeiten, vorzugsweise bei Temperaturen von 20 bis 30° C.The fermentation process is preferably carried out at a temperature of about 18 to about 35 ° C. As It has proven particularly advantageous to work at temperatures below 30.degree. C., preferably at temperatures of 20 to 30 ° C.

Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren der Erfindung weiter veranschaulichen. Die folgenden Erläuterungen dienen der Kennzeichnung der in den Beispielen verwendeten Begriffe:The following examples are intended to further illustrate the process of the invention. The following Explanations serve to identify the terms used in the examples:

(1) Kultur(1) culture

Das verwendete Nocardia cholesterolicum wurde erhalten von Dr. Theresa Stadtman (N.I.H, Bethesda, Md.). Verwendet wurde eine rauhe Kolonie-Variante (NRRL 5767) sofern nichts anderes angegeben istThe used was Nocardia cholesterolicum received from Dr. Theresa Stadtman (N.I.H, Bethesda, Md.). A rough colony variant was used (NRRL 5767) unless otherwise stated

(2) Nährmedium(2) nutrient medium

Die Zusammensetzung des Nährmediums, das in den Beispielen verwendet wurde, war wie folgt:The composition of the nutrient medium used in the examples was as follows:

(A) Glyzerinmedium(A) Glycerin medium

Ammoniumsulfat
Dibasisches. wasserfreiesAmmonium sulfate
Dibasic. anhydrous

pro Liter
2,0 gper liter
2.0 g

(A) Giyzerinmedium(A) gycerol medium

Kaliumphosphat 2,0 gPotassium phosphate 2.0 g

Salzlösung »C« 5,0 mlSaline solution "C" 5.0 ml

Glyzerin 5,0 gGlycerin 5.0 g

Trypton 0,1 g Mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 LiterTryptone 0.1 g Made up to 1 liter with distilled water

Salzlösung »C«Saline solution "C"

MgSO₄ MgSO ₄

CaCl₂ ·CaCl ₂

FeSO₄ FeSO ₄

MnSO₄ MnSO ₄

ZnSO₄ ZnSO ₄

NaCINaCl

(B) Inoculum(B) inoculum

• 7H₂O
2H₂O• 7H ₂ O
2H ₂ O

7H₂O7H ₂ O

• H₂O
7H₂O• H ₂ O
7H ₂ O

GlukoseGlucose

Hefeextrakt*)Yeast extract *)

Dibasisches wasserfreies KaliumphosphatDibasic anhydrous potassium phosphate

Salzlösung A-ISaline solution A-I

Salzlösung A-2Saline A-2

AgarAgar

pro Liter einer 0,1 N HCL-Lösungper liter of a 0.1 N HCl solution

25,0 g 0,1g 2,8 g25.0 g 0.1 g 2.8 g

1.7 g 0,06 g 0,6 g1.7 g 0.06 g 0.6 g

pro Literper liter

10,0 g 10,0 g10.0 g 10.0 g

1,0 g 2,0 ml 2,0 ml 20,0 g1.0 g 2.0 ml 2.0 ml 20.0 g

pH-Wert eingestellt auf 7,0 und mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 LiterpH adjusted to 7.0 and topped up with distilled water 1 liter

Salzlösung A-I pro LiterSaline A-I per liter

MgSO₄-7 H₂O 100,0 gMgSO ₄ -7 H ₂ O 100.0 g

FeSO₄ -7 H₂O 10,0 gFeSO ₄ -7 H ₂ O 10.0 g

MnSO₄ -7 H₂O 1,0 gMnSO ₄ -7 H ₂ O 1.0 g

NaMoO₄ · 2 H₂O 0,5 g Eingestellt auf 1 Liter einer 0,1 N HCl-LösungNaMoO ₄ · 2 H ₂ O 0.5 g Adjusted to 1 liter of a 0.1 N HCl solution

Salzlösung A-2 pro LiterSaline A-2 per liter

CaCl₂ ■ 2 H₂O 10,0 gCaCl ₂ · 2 H ₂ O 10.0 g

Mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 LiterMade up to 1 liter with distilled water

·) Es wurde ein handelsüblicher Hefeextrakt verwendet, im vorliegenden Falle ein Hefeextrakt mit der Bezeichnung »Bacto yeast extract«, Hersteller Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA.A commercial yeast extract was used, in the present case a yeast extract called "Bacto yeast extract", manufacturer Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA.

(C) Modifiziertes Glyzerin-Medium(C) Modified glycerine medium

Ammoniumsulfat
Dibasisches wasserfreiesAmmonium sulfate
Dibasic Anhydrous

pro Liter 2,0 gper liter 2.0 g

(C) Modifiziertes Glyzerin-Medium(C) Modified glycerine medium

pro Liierper Liier

Kaliuniphosphat 2,0 gPotassium phosphate 2.0 g

Salzlösung »C« 5,0 mlSaline solution "C" 5.0 ml

Glyzerin 5,0 gGlycerin 5.0 g

OberflächenaktiveSurface active

Verbindung S-3 3,0 gCompound S-3 3.0 g

Hefeextrakt*) 20,0 gYeast extract *) 20.0 g

Choiesierin 1,0 gChoiesierin 1.0 g

M it destilliertem Wasser aufgefüllt aufMade up with distilled water

1 Liter1 liter

*) Es wurde der gleiche Hefeextrakt wie zur Bereitung des Inoculums verwendet.*) The same yeast extract was used as for the preparation of the inoculum used.

(3) Aufbewahrung der Kulturen(3) Storage of cultures

Die Kulturen wurden auf den Schrägen des Glyzerin-Mediums mit einem Gehalt an Cholesterin aufbewahrt und jeden zweiten Tag auf eine andere Schräge eines Glyzerin-Mediums mit einem Cholesteringehalt übertragen. Des weiteren wurden die Kulturen in flüssigem Stickstoff gefroren aufbewahrt.The cultures were on the slopes of the glycerol medium containing cholesterol and every other day on a different slope of a glycerin medium with a cholesterol content transfer. The cultures were also stored frozen in liquid nitrogen.

(4) Herstellung eines Inoculums (kleiner Ansatz)(4) Production of an inoculum (small batch)

Eine Inoculum-Schräge wurde mit Nocardia cholesteroücum (rauh) von einer zwei Tage alten Glyzerin-Schräge inoculiert und 48 Stunden lang bei 30°C inkubiert. Die Kultur von dieser Schräge wurde mit einer Drahischleife abgeschabt und in 25 ml sterilem destilliertem Wasser durch kräftiges Schütteln resuspendiert Die Trübung dieser Suspension lag bei 1,8 bis 2,2 O.D.-Einheiten bei 660 nm. 60 ml dieser Suspension wurden als Inoculum pro Liter Nährmedium verwendet.An inoculum bevel was made with Nocardia cholesteroücum (rough) inoculated from a two day old glycerine slope and inoculated for 48 hours at 30 ° C incubated. The culture from this slope was scraped off with a wire loop and placed in 25 ml sterile distilled water resuspended by vigorous shaking. The turbidity of this suspension was 1.8 to 2.2 O.D. units at 660 nm. 60 ml of this suspension were used as inoculum per liter of nutrient medium.

(5) Herstellung eines Inoculums für eine
Fermentation in größerem Maßstab(5) Making an inoculum for a
Fermentation on a larger scale

Nocardia cholesterolicum (rauh) wurde nach 48stündiger Züchtung auf Inoculum-Schrägen zur Inoculierung von 7,5 Litern sterilisiertem modifiziertem Glyzerinmedium in einem 14 Liter fassenden Fermentationsgerät (Chemapec, Männedorf, Schweiz) verwendet. Zu diesem Zweck wurden acht Schrägen verwendet. Das Medium wurde belüftet, und zwar mit 0,5 Volumenteilen Luft pro Volumenteil Medium pro Minute und mit einem flachen, 3-Blatt-Turbinenröhrer, der mit einer Geschwindigkeit von 1300 Umdrehungen pro Minute umlief, in Bewegung gehalten. Die Temperatur wurde auf 30° C eingestellt Nach einer i8stündigen Inkubationsdauer wurde der Inhalt des Fermentiergerätes aseptisch in ein 150 Liter fassendes Fermentiergerät überführtNocardia cholesterolicum (rough) became less than 48 hours Cultivation on inclined inoculum to inoculate 7.5 liters of sterilized modified glycerine medium used in a 14 liter fermentation device (Chemapec, Männedorf, Switzerland). To this Eight slopes were used for this purpose. The medium was aerated with 0.5 parts by volume of air per Volume part of medium per minute and with a flat, 3-blade turbine tube operating at one speed rotated at 1300 revolutions per minute, kept in motion. The temperature rose to 30 ° C After an incubation period of 18 hours, the contents of the fermenter were aseptically poured into a 150 liter fermenter transferred

(6) Fermentation
(A) In kleinem Maßstab(6) fermentation
(A) On a small scale

Die Fermentationen wurden in 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben durchgeführt Das Volumen des Mediums in den Erlenmeyer-Ko'ben betrug 25 ml. Das Medium der Kolben wurde in der beschriebenen Weise inoculiert, worauf bei 30° C inkubiert wurde. Die Schüttelgeschwindigkeit lag bei 200 Umdrehungen pro Minute (5,08 cm Schüttelweg). Die Prüflinge wurden alle 24 Stunden aseptisch auf die Cholesterin-Oxidase-Aktivität untersuchtThe fermentations were carried out in 250 ml Erlenmeyer flasks Medium in the Erlenmeyer flask was 25 ml. The medium of the flask was in the manner described inoculated, followed by incubation at 30 ° C. The shaking speed was 200 revolutions per Minute (5.08 cm shaking path). The test subjects were aseptically examined every 24 hours for cholesterol oxidase activity examined

(B) Im großen Maßstab(B) On a large scale

Das 150 Liter fassende Fermentiergerät wurde mit 75 Litern sterilisiertem modifiziertem Glyzerin-Medium gefüllt. Nach erfolgter Inoculierung wie, unter (5) beschrieben, wurde das Medium bei einer Temperatur von 30°C belüftet und bewegt. Der Belüftungsgrad entsprach 0,5 vvm, d. h. 0,5 Volumenteilen Luft pro Volumenmedium pro Minute. Die Umdrehungsgeschwindigkeit des Rührers im Medium lag bei 250 Umdrehungen pro Minute. Alle 2'/2 Stunden wurden mittels eines automatischen Probenehmers aseptisch Proben abgezogen. Die Proben wurden dann wie unter (8) beschrieben auf ihre Cholesterin-Oxidase-Aktivität untersucht. Die Zellen wurden »geerntel« nachdem die Cholesterin-Oxidase-Konzentration einen maximalen Wert erreicht hatte. Die für die Fermentation erforderliche Zeitspanne lag bei 17 bis 25 Stunden.The 150 liter fermenter was filled with 75 liters of sterilized modified glycerine medium filled. After inoculation as described under (5), the medium was at a temperature of 30 ° C ventilated and moved. The degree of ventilation corresponded to 0.5 vvm, i.e. H. 0.5 parts by volume of air per Volume medium per minute. The speed of rotation of the stirrer in the medium was 250 Revolutions per minute. Every 2½ hours were aseptic using an automatic sampler Samples withdrawn. The samples were then tested for their cholesterol oxidase activity as described under (8) examined. The cells were "harvested" after the cholesterol oxidase concentration reached its maximum Had reached value. The time required for fermentation was 17 to 25 hours.

(7) Abtrennung der Zellen
(A) In kleinem Maßstab(7) Separation of the cells
(A) On a small scale

Die Zellen wurden geerntet (d. h. von der Fermentationsbrühe abgetrennt) durch 15 Minuten langes Zentrifugieren in einer gekühlten Zentrifuge (Hersteller DuPont Co., Instrument Products Div., Sorvall Operations, Newton. Conn., USA) bei 12 350 χ g.The cells were harvested (i.e. separated from the fermentation broth) for 15 minutes Centrifugation in a refrigerated centrifuge (manufacturer DuPont Co., Instrument Products Div., Sorvall Operations, Newton. Conn., USA) at 12,350 χ g.

(B) In großem Maßstab(B) On a large scale

Das Fermentationsgerät wurde mit kaltem Wasser gekühlt, wenn die Produktion des Enzymes den maximalen Wert erreicht hatte. Die Zellen wurden von der Brühe mittels einer kontinuierlich arbeitenden Zentrifuge abgetrennt, die eine Kugel mit einer Kapazität von 8 Litern aufwies (verwendet wurde eine Cepa-Zer.trifuge, hergestellt in der Bundesrepublik Deutschland). Die Zellen wurden des weiteren zum Zwecke der Isolierung und Reinigung von Cholesterin-Oxidase aufgearbeitet.The fermentation device was cooled with cold water when the production of the enzyme ceased had reached the maximum value. The cells were removed from the broth by means of a continuously operating Separated centrifuge, which had a ball with a capacity of 8 liters (a Cepa-Zer.trifuge, manufactured in the Federal Republic of Germany). The cells were further used to Purposes of isolation and purification of cholesterol oxidase worked up.

(8) Bestimmung der Cnolesterin-Oxidase-Aktivität(8) Determination of the cnolesterol oxidase activity

(A) Herstellung von Zellenfraktionen für die
Bestimmung der Cholesterin-Oxidase(A) Preparation of cell fractions for the
Determination of cholesterol oxidase

Die Cholesterin-Oxidase kann außerhalb der Zellen oder extrazellular und innerhalb der Zellen oder intrazellular vorliegen. Des weiteren kann das intrazellulare Enzym als freies oder lösliches Enzym vorliegen und als gebundendes oder unlösliches Enzym. Das extrazellulare Enzym kann in der Brühe nach Entfernung der Zellen durch Zentrifugieren bestimmt werden. Zur Ermittlung des intrazellularen Enzyms werden die Zellen durch Ultraschallbehandlung zerstört Das Zellenkügelchen, das durch Zentrifugieren erhalten wurde, wurde in 1 Liter destilliertem Wasser suspendiert, worauf durch Zusatz eines 50 mM Kaliumphosphatpuffers (pH-Wert 7,0) auf 20 ml verdünnt wurde. Die Suspension wurde dann 5 Minuten lang in einem Eis-Wasserbad einer Ultraschallbehandlung ausgesetzt, wobei nach einer Ultraschallbehandlung von 1 Minute eine Ruhepause von 30 Sekunden eingelegt wurde, bis von neuem eine Ultraschallbehandlung von 1 Minute erfolgte. Die behandelten Suspensionen wurden dann in der Kälte 15 Minuten lang bei 27 000 χ g zentrifugiert Die Aktivität der überstehenden Flüssigkeit wird als intrazellulare, lösliche Aktivität bezeichnet. Die Zelienmasse wurde in einer 2%igen Natriumdeoxycholatlösung resuspendiert und im Eis 10 Minuten langThe cholesterol oxidase can be outside the cells or extracellularly and inside the cells or present intracellularly. Furthermore, the intracellular enzyme can be present as a free or soluble enzyme and as a bound or insoluble enzyme. The extracellular enzyme can be in the broth after removal of cells can be determined by centrifugation. To determine the intracellular enzyme, the Cells destroyed by ultrasound treatment The cell pellet obtained by centrifugation was suspended in 1 liter of distilled water, followed by the addition of a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) was diluted to 20 ml. The suspension was then in a for 5 minutes Ice water bath subjected to ultrasound treatment, after an ultrasound treatment of 1 minute, a rest period of 30 seconds was inserted until an ultrasound treatment of 1 minute was carried out again. The treated suspensions were then in Centrifuged the cold for 15 minutes at 27,000 χ g. The activity of the supernatant fluid is called intracellular soluble activity. The cell mass was dissolved in a 2% sodium deoxycholate solution resuspended and on ice for 10 minutes

stehengelassen. Daraufhin wurde die Suspension 15 Minuten lang in der Kälte bei 27 000 χ g zentrifugiert. Die Cholesterin-Oxidase-Aktivität in der überstehenden Flüssigkeit wird als intrazellulare unlösliche Aktivität bezeichnet. Die Summe aus der extrazellularen, der löslichen intrazellularen und der unlöslichen intrazellularen Aktivität wird als Gesamtaktivität bezeichnet. Es ist des weiteren auch möglich, die Gesamtaktivität ohne Aufbrechen der Zellen zu ermitteln. Zu diesem Zweck wird die gesamte Fermentationsbrühe mit den Zellen to verdünnt, um Störungen aufgrund der Trübung der Brühe auf ein Minimum zu reduzieren, worauf die verdünnte Brühe als Enzymlösung verwendet wird.ditched. The suspension was then centrifuged in the cold at 27,000 χ g for 15 minutes. The cholesterol oxidase activity in the supernatant Fluid is known as intracellular insoluble activity. The sum of the extracellular, the soluble intracellular and insoluble intracellular activity is referred to as total activity. It it is also possible to determine the total activity without breaking the cells. To this end the entire fermentation broth with the cells is diluted to avoid disturbances due to the turbidity of the Reduce the broth to a minimum, after which the diluted broth is used as an enzyme solution.

(9) Enzym-Bestimmung ₎₅ (9) enzyme determination _{) 5}

Die Cholesterin-Oxidase-Aktivität läßt sich nach folgendem Verfahren ermitteln:The cholesterol oxidase activity can be determined according to the following procedure:

(A) Reagenzien(A) reagents

2020th

1. 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert = 7,0 (KP-Puffer): 30,5 ml einer 0,2molaren K₂HPO₄-Losung + 19,5 ml einer 0,2molaren KH₂PO4-Lösung, mit Wasser aufgefüllt auf ein Endvolumen von 200 ml.1. 50 mM potassium phosphate buffer, pH = 7.0 (KP buffer): 30.5 ml of a 0.2 molar K ₂ HPO ₄ solution + 19.5 ml of a 0.2 molar KH ₂ PO4 solution, with water made up to a final volume of 200 ml.

2. O,l°/oige Dianisidinlösung: 10 mg 3,3'-Dimethoxybenzidändihydrochlorid pro ml Wasser. Keine pH-Werteinstellung.2. 0.1% dianisidine solution: 10 mg of 3,3'-dimethoxybenzidene dihydrochloride per ml of water. No pH adjustment.

3. Reagenzpuffer: Zu 40 ml des beschriebenen KP-Puffers wurden 0,5 ml Dianisidinlösung und 1,4 mg Peroxidasepulver (Sigma-Type II, Meerrettich-3. Reagent buffer: 0.5 ml of dianisidine solution and 1.4 mg were added to 40 ml of the KP buffer described Peroxidase powder (Sigma-Type II, horseradish

Peroxidase, RZ 1,0 bis 1,5 Nr. P 8250) zugegeben, worauf gründlich vermischt und durch Zusatz von KP-Pufferlösung auf ein Volumen von 40 ml verdünnt wurde. Bei Zugabe der Dianisidinlösung erfolgt zunächst eine Trübung, die jedoch beim Mischen der Komponenten wieder verschwindet. Die Lösung soll nach Möglichkeit bis zur Verwendung im Kalten aufbewahrt werden. Im vorliegenden Falle wurde der Reagenzpuffer 3 Tage lang bei 4°C ohne Probleme aufbewahrt. In vorteilhafter Weise wird die Pufferlösung jedoch täglich frisch von neuem bereitet.
4. Cholesterin-Lösung:Zu 10 ml einer oberflächenaktiven Verbindung, bestehend aus einem Alkylarylpolyätheralkohol (Triton X-100. Hersteller Rohm und Haas, Philadelphia, Pa., USA), die auf einer Heizplatte erwärmt wurde, wurden 500 ml pulverförmiges Cholesterin zugesetzt, worauf die Mischung mittels eines Magnetrührers so lange gerührt wurde, bis eine klare Lösung erhalten wurde. Dann wurden 90 ml Wasser zugesetzt, worauf weiter gerührt wurde. Die Lösung wurde zunächst trüb. Bei weiterem Mischen und bei Kühlung mittels eines Stromes von kaltem Wasser wurde die Lösung wieder klar. Die Trübung erfolgte dadurch, daß sich die oberflächenaktive Verbindung aus der Lösung ausschied. Durch die erfolgte Kühlung wurde die Verbindung wieder rehydratisiert und das Steroid wurde vollständig gelöst. Die Lösung erwies sich auf eine Dauer von einer Woche stabil, wenn sie bei Raumtemperatur aufbewahrt wurde.Peroxidase, RZ 1.0 to 1.5 No. P 8250) was added, which was then mixed thoroughly and diluted to a volume of 40 ml by adding KP buffer solution. When the dianisidine solution is added, it initially becomes cloudy, but this disappears again when the components are mixed. If possible, the solution should be kept in the cold until use. In the present case, the reagent buffer was stored for 3 days at 4 ° C without problems. Advantageously, however, the buffer solution is freshly prepared every day.
4. Cholesterol solution: 500 ml of powdered cholesterol were added to 10 ml of a surface-active compound consisting of an alkylaryl polyether alcohol (Triton X-100, manufacturer Rohm and Haas, Philadelphia, Pa., USA), which was heated on a hot plate, whereupon the mixture was stirred by means of a magnetic stirrer until a clear solution was obtained. Then 90 ml of water was added, followed by further stirring. The solution initially became cloudy. Upon further mixing and cooling with a stream of cold water, the solution became clear again. The cloudiness occurred because the surface-active compound precipitated out of the solution. The cooling that occurred rehydrated the compound and completely dissolved the steroid. The solution was found to be stable for a week when stored at room temperature.

(B) Reaktionen oberflächenaktive Verbindune(B) Surface-active compound reactions

Cholesterin + 0-,Cholesterol + 0-,

Oxidase ->· Cholest-4-en-3-on + H₂O₁ Oxidase -> Cholest-4-en-3-one + H ₂ O ₁

Peroxidase H₂O₂ + Dianisidin '2H₂O + FarbstoffPeroxidase H ₂ O ₂ + dianisidin '2H ₂ O + dye

(C) Bestimmung(C) determination

6 m! Reagenzpuffer -I- 0,1ml Substrat + 0,9 rr-l Wasser wurden in einem Teströhrchen miteinander vereinigt und vermischt, worauf das Teströhrchen mit der Mischung in ein Wasserbad einer Temperatur von 37°C gebracht wurde. Nach 5 Minuten wurden 1,0 ml Enzym zugesetzt, so daß das Volumen in dem Teströhrchen 8 ml betng. Das Röhrchen wurde dann in ein Spektrophotometer gebracht (Typ Spectronic 20 Spektrophotometer, Hersteller Bausch und Lomb. USA) wonach die Durchlässigkeit bei 430 nm ermittelt wurde. Das Röhrchen wurde danach wiederum in das Wasserbad eingesetzt Alle 5 Minuten lang (insgesamt 25 Minuten lang) wurde das Teströhrchen von neuem in das Spektrophotometer eingesetzt und untersucht. Ermittelt wurde die Geschwindigkeit der Farbentwicklung aus einer Kurve eines Diagrammes, in dem die O.D.-Veränderung in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen wurde, indem ein Mittelwert der O.D.-Veränderung des linearen Anteils der Kurve gebildet wurde. Die Aktivität wurde unter Verwendung einer Konstante (molarer Extinktionskoeffizient) berechnet, die vorher für das Farbstoffsystem aus einer Standardkurve ermittelt wurde. Die Enzym-Präparate wurden verdünnt, so daß 0,005 bis 0,06 Einheiten Cholesterin-Oxidase pro Bestimmungsröhrchen verwendet wurden. Eine Cholesterin-Oxidase-Aktivitäts-Einheit ist gleichzusetzen mit der Menge an Enzym, welche die Erzeugung von 1 μΜοΙ H₂O2/Min. bei 37° C und einem pH-Wert von 7,0 katalysiert.6 m! Reagent buffer -I- 0.1 ml substrate + 0.9 ml-l water were combined and mixed in a test tube, after which the test tube with the mixture was placed in a water bath at 37 ° C. After 5 minutes, 1.0 ml of enzyme was added so that the volume in the test tube was 8 ml. The tube was then placed in a spectrophotometer (type Spectronic 20 spectrophotometer, manufacturer Bausch and Lomb. USA), after which the transmittance was determined at 430 nm. The tube was then reinserted into the water bath. Every 5 minutes (for a total of 25 minutes) the test tube was reinserted into the spectrophotometer and examined. The speed of color development was determined from a curve of a diagram in which the OD change was plotted as a function of time by forming an average value of the OD change of the linear portion of the curve. The activity was calculated using a constant (molar extinction coefficient) previously determined for the dye system from a standard curve. The enzyme preparations were diluted so that 0.005 to 0.06 units of cholesterol oxidase were used per detection tube. A cholesterol oxidase activity unit is equivalent to the amount of enzyme that generates 1 μΜοΙ H ₂ O2 / min. catalyzed at 37 ° C and pH 7.0.

(10) Bestimmung der Cholesterin-Esterase-Aktivität(10) Determination of cholesterol esterase activity

Die Esterase-Aktivität wurde durch enzymatischeThe esterase activity was determined by enzymatic

Ermittlung des durch Hydrolyse von Cholesterinlinoleat freigesetzten Cholesterins ermittelt Zellfraktionen für die Bestimmung der Cholesterin-Esterase wurden in gleicher Weise wie unter (8) (A) beschrieben, bestimmtDetermination of the cholesterol released by the hydrolysis of cholesterol linoleate determines cell fractions for the determination of the cholesterol esterase were determined in the same way as described under (8) (A)

(A) Reagenzien(A) reagents

1. Substrat-Emulsion: 6/10 g Cholesteryllinoleat wurden in 10,0 g einer heißen Lösung der beschriebenen oberflächenaktiven Verbindung (Triton X-100) gelöst, worauf die Lösung durch Zusatz von deionisiertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml gebracht wurde. Die Lösung wurde unter fließendem kaltem Wasser gekühlt, so daß sich die oberflächenaktive Verbindung löste. Es wurde eine milchigweiße Emulsion von Cholesteryllinoleat erhalten.1. Substrate emulsion: 6/10 g of cholesteryl linoleate were in 10.0 g of a hot solution of the described Surface-active compound (Triton X-100) dissolved, whereupon the solution by adding deionized water was brought to a total volume of 100 ml. The solution was taking running cold water, so that the surface-active compound dissolved. there has been a obtained milky white emulsion of cholesteryl linoleate.

2. Esterase-Bestimmungsmischung: Die Esterase-Bestimmungsmischung enthielt 6,7 ml Pufferlösung, 0,3 ml Cholesieryllinoleatemulsion, 0,5 ml Cholesterin-Oxidaselösung (1 U/ml) und 0,5 ml einer verdünnten Zellsuspension.2. Esterase Determination Mixture: The Esterase Determination Mixture contained 6.7 ml of buffer solution, 0.3 ml of cholesieryl linoleate emulsion, 0.5 ml of cholesterol oxidase solution (1 U / ml) and 0.5 ml of a dilute cell suspension.

(B) Bestimmungsmethode(B) Determination method

Teströhrchen mit der Bestimmungsmischung ohne Zellsuspension wurden in einem Wasserbad 15 Minuten lang bei 37'C geschüttelt. Daraufhin wurde die zu untersuchende Zellsuspension zugesetzt, worauf in Abständen von 5 Minuten in dem beschriebenen Spektrophoiometer die Durchlässigkeit bei 430 nm ermittelt wurde. Die Menge an Enzym ergibt sich aus der Geschwindigkeit der Farbentwicklung. Das Bestimmungsverfahren ist dem Bestimmungsverfahren zur Ermittlung der Cholesterin-Oxidase somit sehr ähnlich. Test tubes with the determination mixture without cell suspension were shaken in a water bath for 15 minutes at 37.degree. The cell suspension to be examined was then added, whereupon the permeability at 430 nm was determined in the spectrophoiometer described at intervals of 5 minutes. The amount of enzyme results from the speed of color development. The determination method is therefore very similar to the determination method for determining cholesterol oxidase.

Eine Cholesterin-Esterase-Aktivitäts-Einheit entspricht der Menge, welche die Hydrolyse von 1 μΜοΙ Cholesterinlinoleat pro Minute bei 37°C und einem pH-Wert von 7.0 katalysiert.One cholesterol esterase activity unit corresponds to the amount that the hydrolysis of 1 μΜοΙ Cholesterol linoleate catalyzed per minute at 37 ° C and a pH of 7.0.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.The following examples are intended to illustrate the invention in more detail.

Sofern nichts anderes angegeben wurde, beziehen sich die angegebenen Konzentrationen auf Gew.-%. Die Ausbeuten von Versuchen, die im kleinen Maßstab unter Verwendung von Flaschen durchgeführt wurden, waren im allgemeinen geringer als die Ausbeuten von Versuchen, die im großen Maßstab in Fermentiergeräten durchgeführt wurden. Es zeigte sich jedoch, daß die relativen Effekte der verschiedenen Fermentationsparameier sehr ähnlich waren.Unless otherwise stated, the stated concentrations relate to% by weight. the Yields from experiments run on a small scale using bottles were generally lower than the yields from experiments carried out on a large scale in fermentation equipment were carried out. It was found, however, that the relative effects of the various fermentation parameters were very similar.

Beispiel 1
Einfluß von Hefeextraktexample 1
Influence of yeast extract

Hefeextrakt erwies sich als wesentlich für die Erzeugung von Cholesterin-Oxidase, wie sich aus der folgenden Tabelle 1 ergibt.Yeast extract was found to be essential for the production of cholesterol oxidase, as evidenced by the Table 1 below results.

Die Ausbeute an Enzym stieg von 2,7 Einheiten pro Liter in Abwesenheit von Hefeextrakt auf !40,4 Einheiten pro Liter im Falle der Zugabe von 2,0% Hefeextrakt an. Eine· weitere Erhöhung der Hefeextraktkonzentration unterdrückte die Synthese des Enzyms. Der Hefeextrakt beeinflußte des weiteren den Ort der Enzym-Produktion. In Gegenwart von Hefeextrakt wurden höchstens 5% des Enzyms extrazellular erzeugt, während der Rest intrazellular erzeugt wurde. Eine maximale Enzymmenge ergab sich nach 24 Stunden.The yield of enzyme increased from 2.7 units per liter in the absence of yeast extract to 40.4 Units per liter in the case of the addition of 2.0% yeast extract. A further increase in the yeast extract concentration suppressed the synthesis of the enzyme. The yeast extract also affected the Place of enzyme production. In the presence of yeast extract, at most 5% of the enzyme became extracellular while the remainder was generated intracellularly. A maximum amount of enzyme resulted after 24 Hours.

Table 1

Einfluß von Hefeextrakt auf die Erzeugung von
Cholesterin-OxidaseInfluence of yeast extract on the production of
Cholesterol oxidase

1010

1515th

2020th

2525th

3030th

3535

KonzentraConcentration Cholesterin-Oxidase-Cholesterol oxidase 2,72.7 tion vontion of Einheiten/LiterUnits / liter 0,50.5 Hefeextrakt
in%Yeast extract
in% extra-zellular Totalextra-cellular total 20,520.5 0,00.0 2,72.7 56,256.2 0,10.1 0,50.5 140,5140.5 0,50.5 0,30.3 68,168.1 1,01.0 2,52.5 2,02.0 2,72.7 3,03.0 0,20.2

Das zur Durchführung der Versuche verwendete Glyzerin-Medium enthielt 0,01% Trypton, 0,5% der oberflächenaktiven Verbindung S-3. Verschiedenen Anteilen des Mediums wurden dann die in der Tabelle 1 angegebenen Hefeextraktmengen zugesetzt.The glycerine medium used to carry out the experiments contained 0.01% tryptone, 0.5% of the surfactant compound S-3. Various proportions of the medium were then given in Table 1 specified amounts of yeast extract added.

Bei der verwendeten oberflächenaktiven Verbindung S-3 handelte es sich um ein technisches Produkt (Tween 40, Hersteller Atlas Chemicals, Wilmington, Delaware, USA).The surface-active compound S-3 used was a technical product (Tween 40, manufacturer Atlas Chemicals, Wilmington, Delaware, USA).

Example 2

Einfluß von Cholesterin (Versuche im kleinen Maßstab im Erlenmeyer-Kolben)Influence of cholesterol (tests on a small scale in Erlenmeyer flasks)

Es erfolgte keine Enzymsynthese in Abwesenheit von Cholesterin, wie sich aus der folgenden Tabelle 2 ergibt. In dem Medium, das 0,5% der oberflächenaktiven Verbindung S-3 enthielt, erfolgte ein äußerst starker Anstieg an produziertem Enzym bei Ergänzung des Mediums mit Cholesterin, wie die Ergebnisse der Tabelle 2 zeigen. Die Erzeugung von Cholesterin-Oxidase erreichte ein Maximum in dem Medium, das 0,1% Cholesterin enthielt.There was no enzyme synthesis in the absence of cholesterol, as can be seen from Table 2 below. An extremely strong occurred in the medium containing 0.5% of the surfactant compound S-3 Increase in enzyme produced when the medium is supplemented with cholesterol, as the results of Table 2 show. The production of cholesterol oxidase reached a maximum in the medium containing 0.1% Contained cholesterol.

Es erfolgte kein weiterer Anstieg in der Enzymausbeute bei weiterer Erhöhung der Konzentration an Cholesterin.There was no further increase in the enzyme yield with a further increase in the concentration of Cholesterol.

Das Cholesterin hatte einen weniger ausgeprägten Einfluß auf das Zellwachstum. Es trat eine höchstens 40%ige Zunahme des Gewichtes der trockenen Zellen durch Zusatz des Cholesterins zum Medium auf.Cholesterol had a less pronounced influence on cell growth. There was only one at most 40% increase in the weight of the dry cells by adding the cholesterol to the medium.

Im wesentlichen die gleichen oder ähnliche Beobachtungen wurden bezüglich des Einflusses des Cholesterins auf die Erzeugung des Enzyms in einem modifizierten Glyzerinmedium mit 0,3% der oberflächenaktiven Verbindung S-3 gemacht. Es erfolgte ein geringer Anstieg in der Ausbeute an Cholesterin-Oxidase, wenn die Konzentration an Cholesterin auf über 0,1% in dem Medium mit 0,3% der oberflächenaktiven Verbindung erhöht wurde.Essentially the same or similar observations were made regarding the influence of cholesterol on the production of the enzyme in a modified glycerol medium with 0.3% of the surfactant Connection S-3 made. There was a slight increase in the yield of cholesterol oxidase, when the concentration of cholesterol is above 0.1% in the medium with 0.3% of the surfactant Connection was increased.

4040

Table 2

Einfluß von Cholesterin auf die Erzeugung von Choleslerin-Oxidase in Gegenwart von 0,5% oberflächenaktiver VerbindungInfluence of cholesterol on the production of choleslerin oxidase in the presence of 0.5% surface-active compound

Konzentration von
Cholesterin in %Concentration of
Cholesterol in%

Cholesterin-Oxidase Cholesterol oxidase

Einheiten/LiterUnits / liter

Trockenzellengewicht Dry cell weight

g/Literg / liter

Freigesetztes Enzym, % der GesamtmengeEnzyme released,% of total

0,020.02

0,050.05

0,20.2

0,50.5

0,0
76,7
126,2
143,5
124,8
142,20.0
76.7
126.2
143.5
124.8
142.2

8,3 8,9 8,8 8,5 7,7 9,58.3 8.9 8.8 8.5 7.7 9.5

100
100
2
5
2
0 Das zur Durchführung der Versuche verwendete Medium enthielt 0,5% der oberflächenaktiven Verbindung S-3. Im übrigen hatte das Medium die Zusammensetzung des modifizierten Glyzerin-Mediums. Die Cholesterinkonzentration des Mediums wurde in der aus Tabelle 2 ersichtlichen Weise eingestellt.100
100
2
5
2
The medium used to carry out the experiments contained 0.5% of the surface-active compound S-3. Otherwise, the medium had the composition of the modified glycerine medium. The cholesterol concentration of the medium was adjusted as shown in Table 2.

33 2626th 5656 063063 1616 55 1515th Beispielexample Beispielexample

Einfluß der oberflächenaktiven VerbindungInfluence of the surface-active compound

Die Erzeugung des Enzyms wurde stark durch die oberflächenaktive Verbindung S-3 beeinflußt, wie sich aus den in Tabelle 3 zusammengestellten Daten ergibt So trat ein dreifacher Anstieg der Enzymausbeute dann auf, wenn das Medium durch Zusatz von 0,2% der oberflächenaktiven Verbindung ergänzt wurde. (Vergleiche Tabelle 3.) Eine maximale Enzymproduktion ergab sich bei einer Konzentration der oberflächenaktiven Verbindung von 0,2 bis 03%- Höhere Konzentrationen an oberflächenaktiver Verbindung (>0,3%) inhibierten die Produktion des Enzyms. Es wurden höchstens 0,6% Enzym in das Medium entlassen.The production of the enzyme was strongly influenced by the surface-active compound S-3, as is From the data compiled in Table 3, there was then a threefold increase in the enzyme yield when the medium was supplemented with the addition of 0.2% of the surfactant compound. (Compare Table 3.) A maximum enzyme production resulted at a concentration of the surface-active Compound from 0.2 to 03% - higher concentrations of surface-active compound (> 0.3%) inhibited the production of the enzyme. There were at most 0.6% enzyme released into the medium.

Table 3

Einfluß der oberflächenaktiven Verbindung auf die
Produktion von Cholesterin-OxidaseInfluence of the surface-active compound on the
Production of cholesterol oxidase

Konzentration der
oberflächenaktiven
VerbindungConcentration of
surface-active
link

Trockenzellengewicht Dry cell weight

g/Literg / liter

Cholesterin-Oxidase Cholesterol oxidase

Einheiten/LiterUnits / liter

6,0
6,9
4,7
6,6
6,06.0
6.9
4.7
6.6
6.0

39,639.6

85.485.4

129,1129.1

124,7124.7

72,472.4

Zur Durchführung der Versuche wurde ein modifiziertes Glyzerin-Medium mit verschiedenen Konzentrationen an oberflächenaktiver Verbindung verwendet.A modified glycerine medium with various concentrations was used to carry out the experiments used on surface-active compound.

Beispiel 4
Einfluß von GlyzerinExample 4
Influence of glycerine

Durch Weglassen des Glyzerins aus dem Medium wurde die Enzymproduktion um 28% vermindert, wie sich aus der folgenden Tabelle 4 ergibt. Die Enzymkonzentration wurde durch Zugabe von 0,25% Glyzerin praktisch wieder auf den Kontrollwert gebracht. Eine weitere Erhöhung der Glyzerinkonzentration veränderte die Enzymkonzentration nicht wesentlich.By removing the glycerine from the medium, enzyme production was reduced by 28%, such as can be seen from the following table 4. The enzyme concentration was increased by adding 0.25% glycerol practically brought back to the control value. A further increase in the glycerol concentration changed the enzyme concentration is not significant.

Auch das Wachstum der Kultur wurde durch das Glyzerin beeinflußt. Es wurde ein praktisch 50%iger Anstieg des Trockenzeilengewichtes in dem Glyzerin enthaltenden Medium gegenüber dem Medium ohne Glyzerin (vgl. Tabelle 4) verzeichnet.The growth of the culture was also influenced by the glycerine. It was practically 50% Increase in dry cell weight in the medium containing glycerol compared to the medium without Glycerine (see Table 4) recorded.

Table 4

Einfluß des Glyzerins fur die Erzeugung von
Cholesterin-OxidaseInfluence of glycerine for the production of
Cholesterol oxidase

Konzentration Trockenzellen- Cholesterin-Oxidase
an Glyzerin gewichtConcentration of dry cell cholesterol oxidase
in glycerine weight

g/Literg / liter

Einheiten/
LiterUnits/
liter

% der Ver-% of

gleichs-equal

probe^a)sample ^a )

5,8
8,2
8,35.8
8.2
8.3

108,9
142,3
150,5108.9
142.3
150.5

7272

9595

100100

^a) = Als Vergleichsprobe wurde ein modifiziertes Glyzerin-Medium mit 0,5% Glyzerin verwendet. ^a ) = A modified glycerine medium with 0.5% glycerine was used as a comparison sample.

Sterine und Cholesterinester als Auslöser für
Cholesterin-OxidaseSterols and cholesterol esters as triggers for
Cholesterol oxidase

In Beispiel 2 wurde der Einfluß von Cholesterin auf die Synthese von Cholesterin-Oxidase veranschaulicht Vier andere, von Cholesterin verschiedene Sterine sowie 12 Cholesterinester wurden auf ihre Aktivität als Auslöser oder Induktionsmittel für Cholesterin-Oxidase getestet Sämtliche Auslöser wurden in einer Konzentration von 0,1% verwendet Als wirksamster Auslöser von Cholesterin-Oxidase erwies sich /?-Sitosterin (/?-Sitosterol), wie sich aus Tabelle 5 ergibt Die gesamte ausgelöste Enzymaktivität lag bei 122% der durch Cholesterin ausgelösten Aktivität Zwei weitere Steroide, nämlich 5-a-Cholestan-3-j3-ol sowie Cholest-4-en-3-on erwiesen sich als mäßig effektiv bezüglich der Enzymbildung. Von den getesteten Cholesterinestern (Tabelle 6) führen Cholesteryloleat und Choiesteryilinoleat zu einer ungefähr 90%igen Bildung der Enzymmenge, die durch Cholesterin erzeugt wurde, während Cholesterylpropionat urd Cholesteryllinoleat zu einer 75%igen bzw.65%i_t,en Bildung führten.Example 2 illustrates the influence of cholesterol on the synthesis of cholesterol oxidase. Four other sterols other than cholesterol and 12 cholesterol esters were tested for their activity as triggers or inducers for cholesterol oxidase. All triggers were tested at a concentration of 0.1%. The most effective trigger of cholesterol oxidase proved to be /? - sitosterol (/? - sitosterol), as can be seen from Table 5. The total enzyme activity triggered was 122% of the activity triggered by cholesterol.Two other steroids, namely 5-α-cholestane -3-j3-ol and cholest-4-en-3-one were found to be moderately effective in terms of enzyme formation. Of the tested Cholesterinestern (Table 6) cholesteryl oleate and lead Choiesteryilinoleat to an approximately 90% forming the amount of enzyme that was generated by cholesterol, while Cholesterylpropionat Urd cholesteryl added to a 75% bzw.65% i _t, resulted s education.

Table 5

Wirksamkeit von Sterinen als AuslöserEffectiveness of sterols as triggers

Sterin")Sterol ") 3030th Cholesterincholesterol Gesamt-AklivitätTotal aclivity Enzym-AktiEnzyme acti j8-Sitosterinj8-sitosterol (Einheiten/Liter)(Units / liter) vität in % der
Vergleichsvity in% of
Comparison 35 5-ff-Cholestan-3-/j(-ol35 5-ff-Cholestan-3- / j (-ol probe¹¹)sample ¹¹ ) Cholest-4-en-3-onCholest-4-en-3-one 163,6163.6 100100 7-Dehydrocholesterin7-dehydrocholesterol 199,5199.5 122122 105,6105.6 6565 101,0101.0 6262 00 00

Zur Durchführung der Versuche wurde ein modifiziertes Glyzerin-Medium verwendet.A modified one was used to carry out the tests Glycerine medium used.

'') = Das Vcrglcichsmedium enthielt Cholesterin als Auslöser. ^b) = Die Konzentration an getestetem Sterin lag bei 0.17«,'') = The comparison medium contained cholesterol as a trigger. ^b ) = The concentration of tested sterol was 0.17 «,

Table 6

Wirksamkeit von Cholesterinestern als AuslöserEffectiveness of cholesterol esters as triggers

Cholesierinester")Cholesian nester ")

Konzentration concentration

(mMole)(mmoles)

Oxidase-Aktivität in "/o der Vergleichsprobe⁸) Oxidase activity in "/ o of the comparison sample ⁸ )

Cholesterincholesterol

CholesterylformiatCholesteryl formate

CholesterylpropionatCholesteryl propionate

Cholesterylbutyrat
CholesterylhexanoatCholesteryl butyrate
Cholesteryl hexanoate

CholesterylbenzoatCholesteryl benzoate

Cholesteryl-p-nitrobenzoatCholesteryl p-nitrobenzoate

CholesteryldecanoatCholesteryl decanoate

Cholesteryllaurat
CholesterylmyristatCholesteryl laurate
Cholesteryl myristate

CholesterylpalmitatCholesteryl palmitate

CholesteryloleatCholesteryl oleate

CholesteryllinoleatCholesteryl linoleate

b5 Verwendet wurde ein modifiziertes Glyzerin-Medium.
'') = Vergleichsmediuni enthielt als Ausloser Cholesterin. ^b) = Die Konzentration der getesteten Cholesterinester lag bei 0,1%.b5 A modified glycerine medium was used.
'') = Comparative mediuni contained cholesterol as the trigger. ^b ) = The concentration of the tested cholesterol esters was 0.1%.

2,62.6 100100 2,42.4 6464 2.32.3 7575 2,22.2 5454 2,12.1 5252 2,02.0 1313th 1,91.9 00 1,91.9 2626th 1,81.8 3636 1,71.7 2121 1,61.6 1414th 1,51.5 9191 1,51.5 8989 1,61.6 6565

Example 6

Verwendung anderer HefeextrakteUsing other yeast extracts

Aus Beispiel 1 ergibt sich die Bedeutung des Zusatzes vom Hefeextrakt zum Nährmedium.Example 1 shows the importance of adding yeast extract to the nutrient medium.

Es wurde die Wirksamkeit von mehreren verschiedenen Hefehydrolysaten untersucht Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 7 zusammengestelltThe effectiveness of several different yeast hydrolysates has been studied. The results are compiled in the following table 7

Aus den erhaltenen Ergebnissen ergibt sich, daß die Wirksamkeit von 2,0% eines handelsüblichen Hefehydrolysates (Amber BYF 100 sowie Amber BYF 50X)The results obtained show that the effectiveness of 2.0% of a commercially available yeast hydrolyzate (Amber BYF 100 and Amber BYF 50X)

vergleichbar war mit der Verwendung von 2,0% eines üblichen Hefeextraktes (Bacto).was comparable with the use of 2.0% of a conventional yeast extract (Bacto).

Das beste getestete handelsübliche Hefehydrolysat (Amberex 1003) stimulierte in einer Konzentration von 1,0% die Enzym-Produktion auf einen Wert von 112%, bezogen auf das Vergleichsmedium. Weitere Versuche zur Bestimmung der optimalen Konzentration an diesem Hydrolysat (Amerex 1003) zeigten eine maximale Aktivität, die mehr als zweimal so groß war a!s die des Vergleichsmediums.The best commercially available yeast hydrolyzate tested (Amberex 1003) stimulated at a concentration of 1.0% the enzyme production to a value of 112%, based on the comparison medium. More attempts to determine the optimal concentration of this hydrolyzate (Amerex 1003) showed a maximum Activity more than twice as large as that of the Comparison medium.

Hersteller der getesteten Hefehyrolysate war die Firma Amber Laboratories, Juneau, Wisconsin, USA.The manufacturer of the yeast hydrolyzates tested was Amber Laboratories, Juneau, Wisconsin, USA.

Table 7

Wirkung von Hefehydrolysaten auf die Erzeugung von Cholesterin-OxidaseEffect of yeast hydrolyzates on the production of cholesterol oxidase

HefehydrolysateYeast hydrolysates

Hefeextrakt (Difco [Bacto])
Hefehydrolysat (Amber BYF 100)Yeast extract (Difco [Bacto])
Yeast hydrolyzate (Amber BYF 100)

Hefehydrolysat (Amber BYT 50X)Yeast hydrolyzate (Amber BYT 50X)

Hefehydrolysat (Amber BYF 300)Yeast hydrolyzate (Amber BYF 300)

Hefehydrolysat (Amberex 1003)Yeast hydrolyzate (Amberex 1003)

Verwendet wurde ein modifiziertes Glyzerin-Medium. I = Das Vergleichsmedium enthielt einen handelsüblichen Hefeextrakt (Difco).A modified glycerine medium was used. I = The comparison medium contained a commercially available yeast extract (Difco).

Konzentrationconcentration Cholesterin-Cholesterol- Enzym-AktivitätEnzyme activity in%in% OxidaseOxidase in % des Verin% of ver (Einheiten/Liter)(Units / liter) gleichsmediums³)same medium ³ ) 2,02.0 141,2141.2 100100 0,50.5 51,751.7 3737 1,01.0 91,891.8 6565 2,02.0 152,4152.4 108108 5,05.0 44,244.2 3434 0,50.5 00 00 UOUO 00 00 2,02.0 127,3127.3 9090 5,05.0 00 00 0,50.5 53,653.6 3838 1,01.0 65,765.7 4747 2,02.0 95,095.0 6767 0,50.5 122,4122.4 8787 1,01.0 157,8157.8 112112 2,02.0 153,9153.9 109109 5,05.0 57,057.0 4040

Die Wirksamkeit eines Hefeextraktes oder eines Hefehydrolysates kann je nach seinem Ursprung etwas verschieden sein.The effectiveness of a yeast extract or a yeast hydrolyzate can vary depending on its origin to be different.

Im Einzelfalle läßt sich die Wirksamkeit eines Hefeextraktes oder eines Hefehydrolysates durch Vergleich mit einem wirksamen Hefeextrakt, beispielsweise vom Typ des verwendeten Difco-Hefeextraktes ermitteln. Als besonders vorteilhafte Hefeextrakte haben solche zu gelten, die Ausbeuten von mindestens 70% der Ausbeute liefern, die bei Verwendung von 2% Difco-Hefeextrakt (vgl. Tabelle 7) oder eines äquivalenten Hefeextraktes erhalten wird. Die Hefeextrakte können dabei in Konzentralionen von bis zu 5,0% in dem beschriebenen modifizierten Glyzerin-Medium getestet werden.In individual cases, the effectiveness of a yeast extract or a yeast hydrolyzate can be determined Comparison with an effective yeast extract, for example of the type of Difco yeast extract used determine. Particularly advantageous yeast extracts are those that have yields of at least Provide 70% of the yield when using 2% Difco yeast extract (see Table 7) or an equivalent Yeast extract is obtained. The yeast extracts can be used in concentrations of up to 5.0% in the modified glycerine medium described.

Example 7

Einfluß von Cholesterin auf die Erzeugung von
Cholesterin-Oxidase in größerem Maßstab bei
Verwendung eines größeren FermentiergerätesInfluence of cholesterol on the production of
Cholesterol oxidase on a larger scale
Use of a larger fermenter

Für die Durchfuhrung der Versuche wurde ein 150 Liter fassendes Fermentiergerät verwendet und mit 75 Litern des modifizierten Glyzerin-Mediums beschickt. Das Medium enthielt pro Liter 0,3 g eines eine übermäßig Schäumung unterdrückenden Mittels (PoIyglykol P-2000). Es wurden mehrere Versuche mit verschiedenen Cholesterin-Konzentrationen (vgl. Tabelle 8) durchgeführt. Nach der Sterilisation wurde das Medium in der beschriebenen Weise inoculiert, und zwar unter Verwendung eines in der beschriebenen Weise hergestellten Inoculums. Das Medium wurde belüftet (0,6 vvm) und unter Verwendung eines flachen 3-Blatt-Turbinenrührers, der mit einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen umlief, in Bewegung gehalten. Alle 2'/2 Stunden wurden Proben entnommen, bis die Produktion an Cholesterin-Oxidase einen optimalen Wert erreicht hatte.A fermentation device with a capacity of 150 liters was used to carry out the experiments and a 75 Liters of the modified glycerine medium charged. The medium contained 0.3 g of one per liter excessive foaming suppressive agent (polyglycol P-2000). Several experiments were carried out with different cholesterol concentrations (see table 8) carried out. After the sterilization, the medium was inoculated in the manner described, and using an inoculum prepared in the manner described. The medium became aerated (0.6 vvm) and using a flat 3-blade turbine stirrer running at a speed of 250 revolutions, kept in motion. Samples were taken every 2½ hours until the Production of cholesterol oxidase had reached an optimal level.

Table 8

Einfluß von Cholesterin auf die Erzeugung von
Cholesterin-Oxidase in größerem MaßstabInfluence of cholesterol on the production of
Cholesterol oxidase on a larger scale

Konzentration an
Cholesterin in g/LiterFocus on
Cholesterol in g / liter

Cholesterin-Oxidase
Einheiter./LiterCholesterol oxidase
Unit / liter

177
356
749177
356
749

Bei den >n Tabelle 8 angegebenen Cholesterin-Oxidase-Einheiten handelt es sich um Durchschnittswerte von 4 oder noch mehr Versuchen.For the> n Table 8 specified cholesterol oxidase units are the average values of 4 or more attempts.

Table 9

Vergleich des modifizierten Glyzerin-Mediums mit
Medien des Standes der TechnikComparison of the modified glycerine medium with
Prior art media

Example p

Vergleiche eines modifizierten Glyzerin-Mediums mit einem Medium des Standes der TechnikCompare a modified glycerol medium with a prior art medium

Es wurden mehrere verschiedene Mikroorganismen, von denen bekannt ist, daß sie Cholesterin-Oxidase zu erzeugen vermögen, getestet Verwendet wurden Stämme von dem Agricultural Collection Investigations Fermentation Laboratory Peoria, Illionois, USA, und der American Type Culture Collection (ATCC Culture Collection). Untersucht wurde die Wirksamkeit¹ ekies beim Verfahren der Erfindung verwendeten modifizierten Glyzerin-Mediums im Vergleich zu zwei bekannten Medien des Standes der Technik.Several different microorganisms known to be capable of producing cholesterol oxidase were tested. Strains from the Agricultural Collection Investigations Fermentation Laboratory Peoria, Illionois, USA, and the American Type Culture Collection (ATCC Culture Collection) were used. We investigated the efficacy ekies ¹ in the method of the invention used modified glycerol medium compared to two known media of the prior art.

Das eine Vergleichsmedium, als Vergleichsmedium A bezeichnet (NRDC-Medium), wurde in einem kleineren Maßstab gemäß den Angaben der GB-PS 13 85 319 hergestellt.One comparison medium, referred to as comparison medium A (NRDC medium), was used in a smaller Scale manufactured in accordance with the specifications of GB-PS 13 85 319.

Das zweite Vergleichsmedium — als Vergleichsmedium B bezeichnet (B-M-Medium) — wurde in kleinerem Maßstab gemäß den Angaben des Beispiels 2 der südafrikanischen Patentschrift 73/3259 hergestellt, mit der Ausnahme jedoch, daß Ammoniumacetat anstelle von Casein-Pepton verwendet wurde.The second comparison medium - referred to as comparison medium B (B-M medium) - was in a smaller Scale made according to the details of Example 2 of South African patent specification 73/3259, with except that ammonium acetate was used in place of casein peptone.

Die verschiedenen Bakterien wurden in den drei verschiedenen Medien gezüchtet, worauf ihre Cholesterin-Oxidase-Aktivität ermittelt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 9 zusammengestellt. Aus den Ergebnissen ergibt sich die Verbesserung, die bei Verwendung eines beim Verfahren der Erfindung verwendeten Mediums erzielt wird.The different bacteria were grown in the three different media, which indicated their cholesterol oxidase activity was determined. The results obtained are shown in Table 9 below. The results show the improvement obtained when using one in the method of Invention used medium is achieved.

Zur Erleichterung des Vergleiches der Daten wurden die Daten eines jeden Stammes gegenüber dem Vergleichsversuch angegeben.To facilitate comparison of the data, the data for each strain was compared to the Comparison test indicated.

Stamm Cholesterin-Oxidase-Aktivität (in % desStrain cholesterol oxidase activity (in% of

als Vergleichsmedium dienenden erfindungsgemäß verwendeten Mediums)medium used according to the invention serving as a comparison medium)

Medium Vergleichs- Vergleichsgemäß medium A medium BMedium comparative comparative according to medium A medium B

Erfindunginvention

ATCC 4277ATCC 4277 100100 5757 2727 NRRL 5636 NRRL 5636 100100 2222nd 2121 15 ATCC 1789515 ATCC 17895 100100 4444 -")- ") NRRL 5767NRRL 5767 100100 2020th

^b) = Unterhalb der Bestimmungsgrenze. ^b ) = Below the limit of quantification.

°) = Die Gesamtmenge an Cholesterin-Oxidase, die durch diesen Stamm erzeugt wurde, war sehr gering und lag bei ungefähr 20 Einheiten/Liter, d. h. der Wert lag an der unteren Grenze der Bestimmungsmöglichkeit. Den relativen Werten ist somit eine geringe Bedeutung beizumessen. °) = The total amount of cholesterol oxidase produced by this strain was produced was very small and lay at about 20 units / liter, i.e. H. the value was at the lower limit of the possible determination. The Relative values are therefore of little importance.

Example 9

Esterase- und Oxidase-Produktion in einem
modifizierten Glyzerin-MediumEsterase and oxidase production in one
modified glycerine medium

(a) Um ihre Wirksamkeit zu testen, wurden verschiedene Sterine an Stelle von Cholesterin in einer Konzentration von 0,1% verwendet. Die Konzentration an Cholesterin in dem modifizierten Glyzerin-Medium lag ebenfalls bei 0,1%.(a) To test its effectiveness, different sterols were used in place of cholesterol in one Concentration of 0.1% used. The concentration of cholesterol in the modified glycerol medium was also 0.1%.

Die höchste Enzymkonzentration wurde durch /?-Sitosterin und 5-<x-Cholestan-3-/?-ol ausgelöst, wie sich aus Tabelle 10 ergibt. Mittlere Enzymausbeuten wurden bei Verwendung von Cholesterin und Cholest-4-en-3-on erhalten. Kein Enzym fand sich in dem Medium mit 7-Dehydrocholesterin.The highest enzyme concentration was triggered by /? - sitosterol and 5- <x-cholestan-3 - /? - ol, like results from table 10. Average enzyme yields were obtained using cholesterol and cholest-4-en-3-one obtain. No enzyme was found in the medium containing 7-dehydrocholesterol.

Table 10

Einfluß von Sterinen auf die Produktion von Cholesterinesterase und Cholesterin-Oxidase in einem modifizierten Glyzerin-MediumInfluence of sterols on the production of cholesterol esterase and Cholesterol oxidase in a modified glycerol medium

SterinSterol

Cholesterincholesterol

jß-Sitosterinjß-sitosterol

5-ff-Cholestan-3-7?-ol5-ff-Cholestan-3-7? -Ol

Cholest-4-en-3-onCholest-4-en-3-one

7-Dehydrocholesterin7-dehydrocholesterol

Trockenzellengewicht Esterase OxidaseDry cell weight esterase oxidase

g/Liter Einheiten/Liter Einheiten/Literg / liter units / liter units / liter

6,3
7,7
6,8
7,9
7,66.3
7.7
6.8
7.9
7.6

37,937.9 121.6121.6 48,548.5 119,9119.9 49,249.2 72,372.3 21,521.5 44,044.0 0,00.0 0,00.0

(b) Zur Ermittlung des Effektes verschiedener Ester wurden 0,1% der Ester an Stelle des Cholesterins verwendet. Das zu Vergleichszwecken verwendete modifizierte Glyzerin-Medium enthielt 0,1% Cholesterin. (b) To determine the effect of various esters, 0.1% of the esters were used in place of the cholesterol used. The modified glycerine medium used for comparison purposes contained 0.1% cholesterol.

Sämtliche der sechs in einem modifizierten Glyzerin-Medium getesteten Cholesterinester erwiesen sich als Esterase-Auslöser, wie sich aus Tabelle 11 ergibt. Die maximale Ausbeute an Enzym wurde in Gegenwart von Cholesteryllinoleat erzielt. Die Esterasekonzentrationen, die von den anderen Estern erzeugt wurden, lagen bei etwa der Hälfte der Esterasekonzentration, die bei Verwendung des Linoleatesters erzielt wurde.All of the six cholesterol esters tested in a modified glycerol medium were found to be Esterase inducers, as shown in Table 11. the maximum yield of enzyme was achieved in the presence of cholesteryl linoleate. The esterase concentrations, those produced by the other esters were about half the esterase concentration that was around Use of the linoleate ester was achieved.

Table 11

Einfluß von Cholesterinestern auf die Produktion von Cholesterinesterase und Cholesterin-Oxidase in einem modifizierten Glyzerin-MediumInfluence of cholesterol esters on the production of cholesterol esterase and Cholesterol oxidase in a modified glycerol medium

Trockenzeilengewicht Esterase OxidaseDry Line Weight Esterase Oxidase

Einheiten/Liter Einheiten/LiterUnits / liter units / liter

CholesterineslerCholesterol eliminators Trc
g/LTrc
g / L Cholesterincholesterol 6,36.3 CholesterolpropionatCholesterol propionate 7,67.6 CholesterylbutyratCholesteryl butyrate 7,67.6 CholesterylhexanoatCholesteryl hexanoate 8,28.2 CholesteryloleatCholesteryl oleate 8,28.2 CholesteryllinoleatCholesteryl linoleate 6,86.8 CholesteryllinolenatCholesteryl linolenate 7,67.6

37,937.9 121,6121.6 14,914.9 45,345.3 19,619.6 38,638.6 14,914.9 59,559.5 16,016.0 87,287.2 49,749.7 95,995.9 23,023.0 71,671.6

Die Cholesterin-Oxidase-Erzeugung in Gegenwart 20 tionen wie sich aus Tabelle 11 ergibt. MäßigeThe cholesterol oxidase production in the presence of 20 ions as shown in Table 11. Moderate

von Cholesterin und jJ-Sitosterin war beträchtlich höher (40 bis 60%) als im Falle der anderen drei getesteten Sterine (Tabelle 10). Cholesteryloleat und Cholesteryllinoleat führten ebenfalls zu hohen Oxidase-Konzentra-Konzentrationen an Enzym wurden in dem Medium bei Verwendung der anderen vier Cholesterinester erzielt (Tabelle!!).of cholesterol and jJ-sitosterol was considerably higher (40 to 60%) than in the case of the other three sterols tested (Table 10). Cholesteryl oleate and cholesteryl linoleate also led to high concentrations of oxidase of enzyme were obtained in the medium using the other four cholesterol esters (Tabel!!).

Claims

Patent claims:

1. Process for the production of cholesterol oxidase by cultivating one of the following strains of microorganisms which produce cholesterol oxidase: NRRL 5636; NRRL 5767; NRRL 5768; ATCC 4277 and ATCC 17 895 in one one carbon supplier, a cholesterol oxidase inducer, a non-toxic nonionic, surface active agent Compound, yeast hydrolyzate and nutrient medium containing traces of metal salts and Separation of the generated cholesterol oxidase, characterized in that the microorganism cultured in a nutrient medium that (a) triggers the cholesterol oxidase in a known concentration of 1.0 to 10 g (b) the yeast hydrolyzate in a known concentration from 10 to 30 g and (c) the nonionic surface-active compound in one concentration contains from 1.0 to 5.0 g, each per liter of nutrient medium.

2. The method according to claim 1, characterized in that the nonionic surface-active Compound a compound with a hydrophilic Poiyoxyäthylen- or Polyglycidolrest and a lipophilic radical with at least nine carbon atoms is used

3. The method according to claim 2, characterized in that one is a nonionic surface-active Compound with a hydrophilic radical with at least 20 oxyethylene units and a lipophilic Remainder consisting of a fatty acid residue with at least 10 carbon atoms is used.

4. Process according to Claims 2 and 3, characterized in that there is a nonionic surface-active Compound with a hydrophilic group consisting of a sorbitan group and 20 oxyethylene units and a lipophilic residue with a palmitic acid moiety is used.