DE2647188A1 - METHOD FOR PRODUCING A PEPTIDE - Google Patents
METHOD FOR PRODUCING A PEPTIDEInfo
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Description
wobei A und B gleich oder verschieden sind und jeweils einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest "bedeuten und wobei X eine Aminoschutzgruppe bedeutet und wobei Y eine der folgenden Carboxylschutzgruppen bedeutet: tert-Alkoxygruppe, Benzyloxy-, Benzylamino- und Benzhydrylaminogruppe, welche gegebenenfalls mit einem inerten Substituenten substituiert ist, wird hergestellt indem man eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer N-terminalen Schutzgruppe oder ein Salz derselben der Formelwhere A and B are identical or different and each represent an amino acid residue or a peptide residue "and where X is an amino protecting group and where Y is one of the following carboxyl protecting groups: tert-alkoxy group, Benzyloxy, benzylamino and benzhydrylamino groups, which are optionally substituted with an inert substituent is prepared by adding an amino acid or a peptide with an N-terminal protecting group or a salt thereof of the formula
X-A-OHX-A-OH
mit einer Aminosäure oder einem Peptid einer C-terminalen Schutzgruppe oder einem Salz derselben der Formelwith an amino acid or a peptide of a C-terminal Protecting group or a salt thereof of the formula
H-B-YH-B-Y
umsetzt, und zwar in Gegenwart eines Thiolproteinaseenzyms oder eines Serinproteinaseenzyms in einer wässrigen Lösung mit einem pH-Wert, bei dem die Enzymaktivität der Thiolproteinase oder der Serinproteinase aufrechterhalten bleibt«converts, in the presence of a thiol proteinase enzyme or a serine proteinase enzyme in an aqueous solution with a pH at which the enzyme activity of thiol proteinase or the serine proteinase is maintained "
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids unter Verwendung eines spezifischen Enzyms als Katalysator.The invention relates to a method for producing a peptide. In particular, the invention relates to a method for the production of a peptide using a specific enzyme as a catalyst.
7 0 β 817711137 0 β 81771113
Herkömmlicherweise stellt man Peptide nach der Azidmethode her oder nach der gemischten Säureanhydridmethode, der Carbodiimidmethode, der aktiven Estermethode oder der Säurechloridmethode oder dgl. Bei diesen herkömmlichen Verfahren treten jedoch verschiedene industrielle Probleme auf. So kommt es zu einer Razemisierung der Carboxylkomponente des C-Terminal-Aminosäurerests. Weiter muß mit Nebenreaktionen, mit Problemen der Temperatursteuerung, mit Problemen der Auswahl des Lösungsmittels und mit Schwierigkeiten hinsichtlich der Eigenschaften der Aminoschutzgruppen und der Carboxylschutzgruppen gerechnet werden, sowie mit besonderen Effekten, welche durch die funktioneilen Gruppen der Seitenketten der Aminosäuren hervorgerufen werden.Conventionally, peptides are prepared by the azide method or by the mixed acid anhydride method, the carbodiimide method, the active ester method or the acid chloride method or the like. These conventional methods occur however, poses various industrial problems. This leads to a racemization of the carboxyl component of the C-terminal amino acid residue. Then there must be side reactions, problems of temperature control, problems of solvent choice and with difficulty in the properties of the amino protecting groups and the carboxyl protecting groups can be expected, as well as with special effects, which by the functional groups of the side chains of the amino acids be evoked.
Die Fragmentkondensationsmethode zur Herstellungen von Peptiden kann mit Vorteil bei Verbindungen angewandt werden, welche als Carboxylendgruppe Glycin aufweisen (die einzige Aminosäure, welche nicht razemisiert wird). Bei anderen Verbindungen mit anderen Aminosäuren als Carboxylendgruppen kann jedoch eine Razemisierung nicht verhindert werden. In der !Eat stellt bei allen bisherigen Peptidsynthesen die Razemisierung ein schwieriges Problem dar. Wenn Razemisierung eintritt, so ist die Reinheit des Produktes sehr gering und es ist erforderlich, das verunreinigende Isomere aus dem Produkt abzutrennen. Dies ist äußerst nachteilig für die industrielle Durchführung des Verfahrens.The fragment condensation method for the preparation of peptides can be used with advantage in compounds which have glycine as the carboxyl end group (the only amino acid that is not racemized). With other connections however, with amino acids other than carboxyl end groups, racemization cannot be prevented. In the ! Eat represents the racemization in all previous peptide syntheses poses a difficult problem. When racemization occurs, the purity of the product is very low and it is necessary to separate the contaminating isomer from the product. This is extremely detrimental to the industrial Implementation of the procedure.
Unter allen herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Peptidbindungen ist einzig und allein die Azidmethode weitgehend frei von Razemisierungsproblemen und diese Azidmethode ist somit die Methode der Wahl. Das Azidverfahren erfordert jedoch komplizierte Reaktionsschritte und es werden im Wege einer Nebenreaktion Harnstoffderivate gebildet. Aus diesen Gründen ist die Azidmethode vom Standpunkt der Ausbeute ungünstig.Of all the conventional methods of making peptide bonds, the azide method is unique largely free of racemization problems and this azide method is therefore the method of choice. The azide process however, requires complicated reaction steps and urea derivatives are formed by a side reaction. For these reasons, the azide method is unfavorable from the standpoint of the yield.
Es wurden ferner zusätzlich zu den verschiedenen organisch-In addition to the various organic
709817/1113709817/1113
chemischen Verfahren Peptidsyntheseverfahren unter Verwendung der Enzyme Papain und Chymotrypsin vorgeschlagen (J.S. Fruton "Advances in Protein Chemistry", 5, Academic Press Inc., New York, If.Y. 1949). Dabei treten die folgenden Reaktionen ein:chemical method using peptide synthesis method proposed the enzymes papain and chymotrypsin (J.S. Fruton "Advances in Protein Chemistry", 5, Academic Press Inc., New York, If.Y. 1949). The following reactions occur a:
Bz-Leu-OH + H-Leu-NH0 (D (ID Bz-Leu-OH + H-Leu-NH0 (D (ID
Bz-Leu-Leu-NH0 (III)Bz-Leu-Leu-NH0 (III)
Bz-Leu-OH + H-Gly-NH0 (D (II) Bz-Leu-OH + H-Gly-NH0 (D (II)
» Bz-Leu-Gly-NH0 “Bz-Leu-Gly-NH0
(III)(III)
Bz-Tyr-OH + H-Gly-NH0
(D (II)
^ Bz-Tyr-Gly-NH0Bz-Tyr-OH + H-Gly-NH0
(D (II)
^ Bz-Tyr-Gly-NH0
(III)(III)
Z-Phe-Gly-OH + H-TyT-NH2 (D (II) Z-Phe-Gly-OH + H-TyT-NH 2 (D (II)
f Z-Phe-Gly-Iyr-NH2 f Z-Phe-Gly-Iyr-NH 2
(III)(III)
Dabei muß die Phenylaminogruppe vom Peptid (III) unter recht drastischen Bedingungen entfernt werden, da die Phenylaminogruppe, welche an die C-terminale Gruppe der Aminkomponente (II) gebunden ist, nicht leicht vom Peptid abgespalten werden kann. So kommt es nachteiligerweise zu einer Spaltung der Peptidkette. Aus diesen Gründen wurde bisher dieses Peptidsyntheseverfahren praktisch nicht angewandt. Andererseits tritt bei der Reaktion (4) eine Traneamidierung und Transpeptidisierung ein, so daß auch diese Reaktion praktisch nicht verwendbar ist. (R.B. Johnston et alj J. Biol. Chem., 185, 629 (1950) und J. S. Fruton et al; J. Biol. Chem., 204, 891 (1953))The phenylamino group of peptide (III) must be right drastic conditions are removed because the phenylamino group attached to the C-terminal group of the amine component (II) bound cannot be easily cleaved from the peptide. This disadvantageously leads to a split the peptide chain. For these reasons, this peptide synthesis method has hitherto been used practically not applied. On the other hand, in reaction (4), traneamidation and transpeptidation occur one, so that this reaction is not practically usable either. (R.B. Johnston et alj J. Biol. Chem., 185, 629 (1950) and J.S. Fruton et al; J. Biol. Chem., 204, 891 (1953))
7 C 9 β 1 7 / i 11 37 C 9 β 1 7 / i 11 3
Bei der Reaktion (4) ist die primäre Aminogruppe des Säureamids, welche mit der terminalen Gruppe der Aminkomponente verbunden ist, ein Promotor für die durch Papain katalysierte Amidasereaktion. Daher nahen diese "bekannten Verfahren nur theoretisches Interesse, indem sie zeigen, daß Papain und Chymotrypsin als Katalysatoren für die Synthese von Peptid-Mndungen eingesetzt werden können, bei denen Phenylaminogruppen als Schutzgruppen der terminalen Carboxylgruppe der Aminkomponente dienen. Es besteht daher ein erhebliches Bedürfnis nach wirksamen Verfahren der Peptidsynthese.In reaction (4) the primary amino group of the acid amide is which is connected to the terminal group of the amine component, a promoter for the catalyzed by papain Amidase reaction. Therefore, these "known methods only approach theoretical interest in that they show that papain and Chymotrypsin as catalysts for the synthesis of peptide endings can be used in which phenylamino groups as protective groups of the terminal carboxyl group serve the amine component. There is therefore a significant need for efficient methods of peptide synthesis.
Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Synthese von Oligopeptiden oder Polypeptiden zu schaffen, welches bei einfacher Arbeitsweise zu hohen Ausbeuten führt.It is therefore the object of the present invention to provide a method for the synthesis of oligopeptides or polypeptides, which leads to high yields with a simple procedure.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Herstellung eines Peptide der FormelThis object is achieved according to the invention by a method for Preparation of a peptide of the formula
X-A-B-YX-A-B-Y
gelöst, wobei A und B gleich oder verschieden sind und einen Aminosäurerest oder ein Peptidrest bedeuten und wobei X eine Aminoschutzgruppe bedeutet und wobei Y eine Carboxylschutzgruppe, nämlich eine substituierte oder unsubstituierte tert-Alkoxy-, Benzyloxy-, Benzylamino- und Benzhydrylaminogruppe bedeutet, wobei eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer N-terminalen Schutzgruppe oder ein Salz derselben der Formeldissolved, where A and B are the same or different and mean an amino acid residue or a peptide residue and where X is a Amino protecting group and where Y is a carboxyl protecting group, namely a substituted or unsubstituted one tert-alkoxy, benzyloxy, benzylamino and benzhydrylamino groups means, wherein an amino acid or a peptide having an N-terminal protecting group or a salt thereof of formula
X-A-OHX-A-OH
mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit einer C-terminalen Schutzgruppe oder einem Salz derselben der Formelwith an amino acid or a peptide with a C-terminal Protecting group or a salt thereof of the formula
H-B-YH-B-Y
umgesetzt wird, und zwar in Gegenwart von Thiolproteinase oder Serinproteinase in einer wässrigen Lösung, deren pH-Wert derart gewählt ist, daß die Enzymaktivität der Thiolproteinase oder der Serinproteinase aufrechterhalten bleibt.is reacted, in the presence of thiol proteinase or serine proteinase in an aqueous solution, the pH of which is chosen so that the enzyme activity of the thiol proteinase or the serine proteinase is maintained.
Das Thiolproteinaseenzym umfaßt die Enzyme Papain, Stembromelein, Ficin, Cathepsin B, Chymopapain, Streptococcal protei-The thiol proteinase enzyme includes the enzymes papain, stembromelein, Ficin, cathepsin B, chymopapain, streptococcal protein
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nase, Asclepain, Clostridium histolyticum protenase B und Hefeprotenase B. Thiolproteinaee ist zur Hydrolyse einer Vielzahl verschiedenster Proteine geeignet, sowie zur Förderung der Spaltung einer Vielzahl von Peptidbindungen, Aminobindungen und Esterbindungen, sowie zur Förderung der Zersetzung von Benzoylalgininamid, Benzoylglycylleucylglycin und Benzoyltyrosylglycinamid. Die Thiolproteinase ist somit sowohl als Exopeptidase als auch als Endopeptidase wirksam (J.R. Kimmel und E.L. Smith, Advance Enzymology, 19, 267 (1957)). Serinproteinase umfaßt die Enzyme Substilisin, Aspergillus alkalische Proteinase, Elastase, a-Lytinproteinase, Chymotrypsin, Metridiumproteniase A, Trypsin, Thrombin, Tlasmin, Kininogenin, Enteropeptidase, Acrosin, Phaseolus protenase, Altemaria endopeptidase,Arthrobacter serinprotenase und Tenebrio a-protenase. Es wurde berichtet, daß Serinproteinase eine beträchtliche Hydrolyseaktivität gegenüber der leu (15) - Tyr (16)-Sequenz und gegenüber der Tyr (16) - Leu (17)-Sequenz der Insolin-B-Kette aufweist und ferner auch eine große Esteraseaktivität gegenüber Acylaminosäureestern. Das Subtilisin welches aus B. subtilis oder analogen Mikroorganismen gewonnen wird, umfaßt Typen von Carsbery, Novo, BPN1 und dgl. Alkalische Proteinase welche aus Strahlenpilzen isoliert werden kann, ist ein bekanntes Material.nase, Asclepain, Clostridium histolyticum protenase B and yeast protenase B. Thiolproteinaee is suitable for the hydrolysis of a large number of different proteins, as well as for promoting the cleavage of a large number of peptide bonds, amino bonds and ester bonds, as well as for promoting the decomposition of benzoylalginine amide, benzoylglycylleucylleucyl-amide, benzoylglycine. The thiol proteinase is thus effective both as an exopeptidase and as an endopeptidase (JR Kimmel and EL Smith, Advance Enzymology, 19, 267 (1957)). Serine proteinase includes the enzymes substilisin, Aspergillus alkaline proteinase, elastase, α-lytin proteinase, chymotrypsin, metridium proteinase A, trypsin, thrombin, tlasmin, kininogenin, enteropeptidase, acrosin, phaseolus protenacterase, and tenemaria endopeptidase a protenacterase, arthropeptidase, arthropeptidase. It has been reported that serine proteinase has considerable hydrolysis activity against the leu (15) - Tyr (16) sequence and against the Tyr (16) - Leu (17) sequence of the insolin B chain, and also has a large esterase activity against Acyl amino acid esters. The subtilisin obtained from B. subtilis or analogous microorganisms includes types from Carsbery, Novo, BPN 1 and the like. Alkaline proteinase which can be isolated from ray fungi is a known material.
Im folgenden wird mit dem Ausdruck Säurekomponente die Aminosäure oder das Peptidausgangsmaterial der FormelIn the following, the term acid component is used to denote the amino acid or the peptide starting material of the formula
X-A-OHX-A-OH
bezeichnet, wobei X eine Schutzgruppe der terminalen Aminogruppe bedeutet und wobei A einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest bedeutet. Die Gruppe A bezeichnet einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest, wobei als geeignete Aminosäuren vorzugsweise aliphatische Aminosäuren, wie Monoaminomonocarbonsäuren, z. B. Glycin (GIy), Alanin (AIa), Valin (VaI), Forvalin (nor-Val), Leucin (Leu, Isoleucin (iso-Leu), Norleucin (nor-Leu); Oxyaminosäuren, wie Serin (Ser),denotes, where X is a protecting group of the terminal amino group and where A is an amino acid residue or a peptide residue. Group A denotes an amino acid residue or a peptide residue, where suitable amino acids are preferably aliphatic amino acids, such as monoaminomonocarboxylic acids, z. B. Glycine (GIy), Alanine (AIa), Valine (VaI), Forvaline (nor-val), leucine (leu, isoleucine (iso-leu), Norleucine (nor-Leu); Oxyamino acids, such as serine (Ser),
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Threonin (Thr), Homoserin (homo-Ser); schwefelhaltige Aminosäuren, wie Methionin (Met) oder Cystin (CysS) und Cystein (CysH); Monoaminodiearbonsäuren, wie Asparaginsäure (Asp), Glutaminsäure (GIu), Asparagin (Asn) und Glutamin (GIn); Diaminomonocarbonsäure, wie Ornithin (Orn), Lysin (Lys), Arginin (Arg); aromatische Aminosäuren, wie Phenylalanin (Phe) und Tyrosin (Tyr); und heterocyclische Aminosäuren, wie Histidin (His), Tryptophan (Try). Diese Aminosäuren werden mit Symbolen "bezeichnet, welche auf dem Gebiet der Proteine allgemein üblich sind. Peptide werden durch Kombinationen dieser Symbole bezeichnet.Threonine (Thr), homoserine (homo-Ser); sulfur-containing amino acids, such as methionine (Met) or cystine (CysS) and Cysteine (CysH); Monoamino diarboxylic acids such as aspartic acid (Asp), glutamic acid (GIu), asparagine (Asn) and Glutamine (GIn); Diamino monocarboxylic acid, such as ornithine (Orn), Lysine (Lys), arginine (Arg); aromatic amino acids such as phenylalanine (Phe) and tyrosine (Tyr); and heterocyclic Amino acids such as histidine (His), tryptophan (Try). These amino acids are denoted by symbols "which appear on the Field of proteins are common. Peptides are identified by combinations of these symbols.
Geeignete Schutzgruppen für die freie terminale Aminogruppe (N-terminale Schutzgruppe) der Säurekomponente sind tert-Alkoxycarbonylgruppen, wie t-Butyloxycarbonyl (BOC-), t-Amyloxycarbonyl (t-Aoc-); Benzyloxycarbonyl (Z-), p-Methoxybenzyloxycarbonyl (PMZ), 3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl Jz(OMe)2-J , 2,4,6-Trimethylbenzyloxycarbonyl (TMZ-), p-Phenylazobenzyloxycarbonyl (PZ-); p-Toluolsulfonyl (Tos-); o-Nitrophenylsulfenyl (Nps-); oder dgl. Die andere Aminosäure oder das andere Peptidausgangsmaterial hat die FormelSuitable protective groups for the free terminal amino group (N-terminal protective group) of the acid component are tert-alkoxycarbonyl groups, such as t-butyloxycarbonyl (BOC-), t-amyloxycarbonyl (t-Aoc-); Benzyloxycarbonyl (Z-), p-methoxybenzyloxycarbonyl (PMZ), 3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl Jz (OMe) 2 -J, 2,4,6-trimethylbenzyloxycarbonyl (TMZ-), p-phenylazobenzyloxycarbonyl (PZ-); p-toluenesulfonyl (Tos-); o-nitrophenylsulfenyl (Nps-); or the like. The other amino acid or peptide starting material has the formula
H-B-Y.H-B-Y.
Diese Komponente wird im folgenden als Aminkomponente bezeichnet. In dieser Formel bezeichnet B einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest, welcher der Definition des Rests A folgt.This component is referred to below as the amine component. In this formula, B denotes an amino acid residue or a peptide residue which corresponds to the definition of Remainder A follows.
Als Schutzgruppen flir die Carboxylgruppe (C-terminale Schutzgruppen) der Aminokomponente kommen tert-Alkoxygruppen in Frage, wie t-Butoxy (-0Bu1*), Benzyloxy £OBzl), p-Nitrobenzyloxy i-OBzl (ρ-Ν02)| , Benzhydryloxy (-OBzh), Benzylamino (-NHBzI), 2,4-Dimethoxybenzylamino (-NHDMB) und Benzhydrylamino (-NHBzh). Diese Schutzgruppen flir die terminale Carboxylgruppe der Aminkomponente sind gegenüber Esterasereaktionen und Amidasereaktionen, welche durch die Thiolproteinaseenzyme und die Serinproteinaseenzyme verursache werden können, resistent.Suitable protective groups for the carboxyl group (C-terminal protective groups) of the amino component are tert-alkoxy groups, such as t-butoxy (-0Bu 1 *), benzyloxy £ OBzl), p-nitrobenzyloxy i-OBzl (ρ-Ν0 2 ) | , Benzhydryloxy (-OBzh), benzylamino (-NHBzI), 2,4-dimethoxybenzylamino (-NHDMB) and benzhydrylamino (-NHBzh). These protective groups for the terminal carboxyl group of the amine component are resistant to esterase reactions and amidase reactions which can be caused by the thiol proteinase enzymes and the serine proteinase enzymes.
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Als Säurekomponente und als Aminkomponente können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auch Aminosäurereste und Peptidreste mit funktioneilen Gruppen in den Seitenketten veru/endet u/erden. In diesen Fällen ist es bev/orzugt, auch diese funktioneilen Gruppen mit Schutzgruppen zu schützen. Geeignete Schutzgruppen für die a>-Aminogruppe (N ) sind N^-Benzyloxycarbonyl (N -Z), t-Butoxycarbonyl (N^-BOC) und Tosyl (N -Tos). Geeignete Schutzgruppen für die N-GuanidinogruppeAmino acid residues and peptide residues can also be used as the acid component and as the amine component in the method according to the invention veru / ends with functional groups in the side chains u / earth. In these cases it is preferable to use these functional ones as well Protect groups with protection groups. Suitable protecting groups for the a> -amino group (N) are N ^ -Benzyloxycarbonyl (N -Z), t-butoxycarbonyl (N ^ -BOC) and tosyl (N -Tos). Suitable protecting groups for the N-guanidino group
(NG) des Arg sind Nitro (NG-NO„), NG-Benzyloxycarbonyl (NG-Z)(N G ) of Arg are Nitro (N G -NO "), N G -Benzyloxycarbonyl (N G -Z)
GG GGG G
und N ,N -Dibenzyloxycarbonyl (N -Z-Z). Geeignete Schutzgruppen für die Imidazolringe (Nlm) des His sind Nlm-Benzyl (N -Bzl) und Tosyl (N -Tos). Geeignete Schutzgruppen für die ω-Carboxylgruppe sind ^-Benzyloxy (-OBzl). Geeignete Schutzgruppen für die Hydroxylgruppe der aliphatischen oder aromatischen Oxyaminosäuren sind Aralkylgruppen, wie Benzyl (Bzl). Geeignet S-Schutzgruppen für die Mercaptogruppe von CysH umfassen die Benzylgruppe (Bzl). Diese Schutzgruppen sollten unter den Bedingungen der Hauptreaktion stabil sein und andererseits vom Endprodukt leicht'abspaltbar sein, ohne zu Nebenreaktionen zu führen. Die als Ausgangsmaterialien eingesetzte Säurekomponente und die Aminkomponente können Schutzgruppen aufu/eisen oder die N -Aminogruppe der Aminkomponente kann frei sein oder in Form eines anorganischen oder organischen Salzes, z. B. eines Hydrochloride, eines Hydrobromids, Oxalats, p-Toluolsulfonats oder Acetats vorliegen. Bei dem erfindungsgemäßen l/erfahren kann die Kondensationsreaktion, u/elche zu der Peptidbildung führt, in einer wässrigen Lösung durchgeführt werden, welche einen pH-Wert hat, bei dem die Enzymaktivität erhalten bleibt. Im Falle der Thiolproteinase beträgt dieser pH-Wert etwa 4 bis 7,5 und im Falle der Serinproteinase etwa 6 bis 9 .and N, N -dibenzyloxycarbonyl (N -ZZ). Suitable protecting groups for the imidazole rings (N lm ) of His are N lm -benzyl (N -Bzl) and tosyl (N -Tos). Suitable protective groups for the ω- carboxyl group are ^ -Benzyloxy (-OBzl). Suitable protective groups for the hydroxyl group of the aliphatic or aromatic oxyamino acids are aralkyl groups, such as benzyl (Bzl). Suitable S-protecting groups for the mercapto group of CysH include the benzyl group (Bzl). These protective groups should be stable under the conditions of the main reaction and, on the other hand, should be easy to split off from the end product without leading to side reactions. The acid component used as starting materials and the amine component can have protective groups or the N -amino group of the amine component can be free or in the form of an inorganic or organic salt, e.g. B. a hydrochloride, a hydrobromide, oxalate, p-toluenesulfonate or acetate. In the inventive method, the condensation reaction, which leads to the formation of peptides, can be carried out in an aqueous solution which has a pH value at which the enzyme activity is retained. In the case of thiol proteinase, this pH is about 4 to 7.5, and in the case of serine proteinase, about 6 to 9.
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Es stehen zwei Verfahren zur Einhaltung des richtigen pH-Wertes für die Aufrechterhaltung der Enzymaktivität zur Verfügung. Das erste Verfahren besteht darin, die Kondensationsreaktion in einer Pufferlösung, z. B. einer Zitronensäurepufferlösung, einer Mcllvaine-Pufferlösung, einer Kolthoff-Pufferlösung, einer Tris-HCl-Pufferlösung oder einer Veronal-Pufferlösung durchzuführen, wobei die Säurekomponente und die Aminkomponente in der Pufferlösung aufgelöst werden und worauf das Enzym hinzugesetzt wird. Das andere Verfahren besteht darin, je nach dem gemessenen pH-Wert das Reaktionsgemisch während der Kondensationsreaktion mit der Säure oder der Base zu versetzen, um so den pH des Reaktionsgemisches in einem für die Aufrechterhaltung der Enzymaktivität erforderlichen Bereich zu halten.There are two methods of maintaining the correct pH to maintain enzyme activity. The first method is to carry out the condensation reaction in a buffer solution, e.g. B. a citric acid buffer solution, a Mcllvaine buffer solution, a Kolthoff buffer solution, a Tris-HCl buffer solution or a veronal buffer solution perform, with the acid component and the amine component are dissolved in the buffer solution and whereupon the enzyme is added. The other method is, depending to add the acid or base to the reaction mixture according to the measured pH value during the condensation reaction, so the pH of the reaction mixture in a range necessary for maintaining the enzyme activity to keep.
Die Ausgangsmaterialien können in einem Verhältnis von 0,8 bis 2 Molen und vorzugsweise 1 bis 1,5 Molen der Säurekomponente pro 1 Mol der Aminkomponente eingesetzt werden. Wenn die Ausgangsmaterialien in der wässrigen Lösung nicht allzu löslich sind, so kann man zur Verbesserung der Löslichkeit der Reaktanten ein Lösungsmittel zusetzen, z. B. einen Alkohol, wie Methanol oder Äthanol; Dimethylformamid; Dioxan; Tetrahydrofuran; Dimethylsulfoxid oder dgl. Die Menge des zugesetzten Lösungsmittels sollte beschränkt sein, so daß die Aktivität des Enzyms für die erfindungsgemäße Reaktion nicht beeinträchtigt oder inhibiert wird. Wenn ein Lösungsmittel eingesetzt wird, so sollte dieses in Mengen von weniger als 1 Gew.-Teil und vorzugsweise 0,2 bis 1,0 Gew.-Teilen pro 1 Gew.-Teil Wasser eingesetzt werden. Die erfindungsgemäße Reaktion wird in einem wässrigen Lösungsmittel durchgeführt. Es ist erforderlich, die relative Löslichkeit der Reaktionsprodukte zu senken, so daß diese vorzugsweise im System schwach löslich oder unlöslich sind.The starting materials can be used in a proportion of 0.8 to 2 moles and preferably 1 to 1.5 moles of the acid component can be used per 1 mole of the amine component. If the starting materials are not too soluble in the aqueous solution a solvent can be added to improve the solubility of the reactants, e.g. B. an alcohol like Methanol or ethanol; Dimethylformamide; Dioxane; Tetrahydrofuran; Dimethyl sulfoxide or the like. The amount of added Solvent should be limited so that the activity of the enzyme for the reaction of the invention is not impaired or is inhibited. If a solvent is used, it should be used in amounts of less than 1 part by weight and preferably 0.2 to 1.0 part by weight per 1 part by weight of water are used. The inventive reaction will carried out in an aqueous solvent. It is necessary, to lower the relative solubility of the reaction products, so that they are preferably sparingly soluble in the system or are insoluble.
Die Menge des Thiolproteinaseenzyms oder des Serinproteinaseenzyms liegt im Bereich von 10 bis 500 mg, vorzugsweise 10 bis 400 mg und speziell 50 bis 300 mg pro 1 mmol der Aminkomponente.The amount of the thiol proteinase enzyme or the serine proteinase enzyme is in the range from 10 to 500 mg, preferably 10 to 400 mg and especially 50 to 300 mg per 1 mmol of the amine component.
709017/1113709017/1113
Ferner kann der Lösung auch ein Enzymaktiwator, wie CysH oder ein Salz desselben oder 2-Mercaptoäthanol oder ein Salz desselben zugesetzt werden. Die Reaktionstemperatur liegt gewöhnlich im Bereich von 20 bis 55 C und insbesondere im Bereich won 30 bis 40 C. Unter diesen Bedingungen bleibt die Enzymaktiv/ität erhalten. Die Reaktion schreitet unter den genannten Bedingungen während 1 bis 24 h glatt voran. Das Reaktionsprodukt fällt aus dem Reaktionssystem aus und kann leicht isoliert werden.Furthermore, the solution can also contain an enzyme activator, such as CysH or a salt thereof or 2-mercaptoethanol or a salt thereof can be added. The reaction temperature is usually in the range from 20 to 55 ° C and in particular in the range from 30 to 40 C. Under these conditions, the enzyme activity is retained. The reaction proceeds smoothly for 1 to 24 hours under the conditions mentioned. The reaction product falls out of the Reaction system and can be isolated easily.
Nach dem erfindungsgemäßen l/erfahren kann man ein Dipeptid, ein Oligopeptid oder ein Polypeptid der folgenden FormelAccording to the invention, you can learn a dipeptide, an oligopeptide or a polypeptide of the following formula
X-A-B-YX-A-B-Y
auf einfache Weise erhalten, indem man die Gruppßη A und B der Ausgangsmaterialien der Formelnobtained in a simple manner by adding the groups A and B the starting materials of the formulas
X-A-OH und H-B-Y in geeigneter Weise auswählt.Appropriately selects X-A-OH and H-B-Y.
Das Dipeptidderiv/at LysyJrlysin kann gemäß folgender Reaktionsformel hergestellt werden.The dipeptide derivative LysyJrlysin can according to the following reaction formula getting produced.
Z-Lys(Z)-OH + H-Lys(Z)-0Bufc Z-Lys (Z) -OH + H-Lys (Z) -0Bu fc
Z-Lys(Z)-Lys(Z)-OBut Z-Lys (Z) -Lys (Z) -OBu t
Lysin, dessen co-Aminogruppe mit der Carbobenzoxylgruppe (Z-) geschützt ist (Z-Deriwat), dient als Säurekomponente und ein t-Butylester dient als Aminkomponente. Man erhält Lysyl-lysin dessen Aminogruppe in der Seitenkette geschützt ist.Lysine, whose co- amino group is protected with the carbobenzoxyl group (Z-) (Z-Deriwat), serves as the acid component and a t-butyl ester serves as the amine component. Lysyl-lysine is obtained, the amino group of which is protected in the side chain.
Das Arginin enthaltende Dipeptidderivat Arginyl-leucin wird durch folgende Reaktion erhalten Z-Arg(Z,Z)-OH + H-Leu-OBzhThe dipeptide derivative arginyl-leucine containing arginine is obtained by the following reaction Z-Arg (Z, Z) -OH + H-Leu-OBzh
^ Z-Arg(Z,Z)-Leu-OBzh.^ Z-Arg (Z, Z) -Leu-OBzh.
Das Tri-Z-arginin wird erhalten durch Schutz der Guanyl-The Tri-Z-arginine is obtained by protecting the guanyl
709817/1113709817/1113
gruppe und der Aminogruppe des Arginins mit Z. Es dient als Säurekomponente. Der Benzhydrylester des Leucins dient als Arninkomponente. Man erhält auf einfache Weise ein Dipeptidderivat durch Umsetzung in Gegenwart von Papain. Wenn man eine Aminosäure mit einer funktioneilen Gruppe in der Seitenkette verwendet, so kann die Aminosäure, deren funktioneile Gruppe geschützt oder ungeschützt ist, wie aus nachstehenden Beispielen hervorgeht, umgesetzt werden. Nachfolgend seien einige Reaktionen von Histidin erläutert.group and the amino group of arginine with Z. It serves as Acid component. The benzhydryl ester of leucine serves as the amine component. A dipeptide derivative is obtained in a simple manner by reaction in the presence of papain. If you have an amino acid with a functional group in the side chain is used, the amino acid whose functional group is protected or unprotected, as in the examples below to be implemented. Some reactions of histidine are explained below.
B0C-His(Bzl)-0H + H-Leu-OBzhB0C-His (Bzl) -0H + H-Leu-OBzh
f BOC-His(Bzl)-Leu-OBzh ...(a) f BOC-His (Bzl) -Leu-OBzh ... (a)
BOC-His-OH + H-Leu-OBzhBOC-His-OH + H-Leu-OBzh
$► BOC-His-Leu-OBzh ...(b)$ ► BOC-His-Leu-OBzh ... (b)
Reaktion (a) bezeichnet den Fall eines Schutzes der Seitenkette während bei der Reaktion (b) die Seitenkette ungeschützt ist.Reaction (a) denotes the case of protection of the side chain while in reaction (b) the side chain is unprotected.
Vorstehend wurden die Verhältnisse der Dipeptidherstellung erläutert.
Eine andere Situation besteht im Falle einer Säurekomponente mit einer Peptidbindung. In diesem Falle wird ein
Acyldipeptid mit einem Aminosäureamidderivat umgesetzt. Die Reaktion geht in Gegenwart von Papain glatt vonstatten, ohne
daß Nebenreaktionen eintreten. Sie kann durch die nachstehende Formel veranschaulicht werden:
Z-Pro-Gly-OH + H-Leu-NHBzhThe relations of dipeptide production have been explained above. Another situation exists in the case of an acid component with a peptide bond. In this case, an acyl dipeptide is reacted with an amino acid amide derivative. The reaction proceeds smoothly in the presence of papain without any side reactions occurring. It can be illustrated by the formula below:
Z-Pro-Gly-OH + H-Leu-NHBzh
Z-Pro-Gly-Leu-NHBzhZ-Pro-Gly-Leu-NHBzh
Man erhält Carbobenzoxy-prolyl-glycyl-leucin-benzhydrylamid.Carbobenzoxy-prolyl-glycyl-leucine-benzhydrylamide is obtained.
Beispiele der Synthese von Tripeptiden sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Im folgenden sollen die Verhältnisse erläutert werden, welche bestehen, wenn die Säurekomponente eine Dipeptid ist und wenn die Aminkomponente ebenfalls ein Dipeptid ist.Examples of the synthesis of tripeptides are shown in Table 3. The following explains the relationships which exist when the acid component is a dipeptide and when the amine component is also a dipeptide.
70Ö817/111370Ö817 / 1113
Die Folgende Reaktion kann zur Synthese des Fragment-(3-6)-Tetrapeptids von UaI -Angiotensin-II, welches als Polypeptidhormon bekannt ist, verwendet werden.The following reaction can lead to the synthesis of the fragment (3-6) tetrapeptide of UaI -angiotensin-II, which as a polypeptide hormone known to be used.
BOC-l/al-Tyr(Bzl)-OH + H-Val-His(BzI)-OBzIBOC-l / al-Tyr (Bzl) -OH + H-Val-His (BzI) -OBzI
■*BOC-l/al-Tyr(BzI )-l/al-His (BzI)-OH■ * BOC-l / al-Tyr (BzI) -l / al-His (BzI) -OH
Wenn als Aminkomponente der Reaktion der l/alylhistidinester verwendet wird, und wenn die Reaktion in Gegenu/art von Papain durchgeführt wird, so kann ein Tetrapeptid mit einer Benzylestergruppe nicht erhalten werden. Dies uiird auf eine Esterasewirkung zurückgeführt, welche eine der Charakteristika des Papains ist. Die obige Reaktion ist insbesondere vorteilhaft, u/enn das Tetrapeptid als Säurekomponente in der nächsten Stufe einer Polypeptidsynthese verwendet luird. Wenn die Carboxylgruppe der Aminkomponente das Benzhydrylamid ist, so kann man in hohen Ausbeuten ein Tetrapeptid-Benzhydrylamid-Derivat erhalten. Beispiele, bei denen ein Dipeptidderivat als Säurekomponente oder Aminkomponente eingesetzt uiird, sind in Tabelle 4 zusammengestellt. Die gleiche Reaktion kann unter Verwendung von Serinproteinase, z. B. Subtilisin BPN1, durchgeführt werden. Wie bereits erwähnt, gelingt die Synthese von Oligopeptiden und Polypeptiden durch Auswahl geeigneter Schutzgruppen für die Carboxylgruppe der Aminkomponente und durch Verwendung der Thiölproteinase oder der Serinproteinase, obwohl diese eine Esterasewirkung und eine Amidasetuirkung zeigen. Die katalytische Wirksamkeit dieser Enzyme für die Peptidsynthese ist völlig unerwartet.When the l / alylhistidine ester is used as the amine component of the reaction, and when the reaction is carried out in the manner of papain, a tetrapeptide having a benzyl ester group cannot be obtained. This is believed to be due to an esterase effect, which is one of the characteristics of papain. The above reaction is particularly advantageous when the tetrapeptide is used as the acid component in the next stage of polypeptide synthesis. When the carboxyl group of the amine component is the benzhydrylamide, a tetrapeptide benzhydrylamide derivative can be obtained in high yields. Examples in which a dipeptide derivative is used as an acid component or an amine component are listed in Table 4. The same reaction can be carried out using serine proteinase, e.g. B. Subtilisin BPN 1 can be performed. As already mentioned, oligopeptides and polypeptides can be synthesized by selecting suitable protective groups for the carboxyl group of the amine component and by using thiol proteinase or serine proteinase, although these show an esterase effect and an amidase effect. The catalytic effectiveness of these enzymes for peptide synthesis is completely unexpected.
Aus vorstehender Beschreibung geht heruor, daß das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Peptiden mit geuiünschter Aminosäuresequenz durch Ausnutzung der Endopeptidase-Charakteristika gelingt. Schon katalytische Mengen des Enzyms sind ausreichend und das Enzym kann u/iederholt eingesetzt werden. Die Reaktion schreitet unter milden Bedingungen in einer Pufferlösung oder in einer Lösung mit gewünschtem pH-Wert glatt voran. Die Ausbeute ist relativ hoch und das Produkt zeigt eine sehr hohe Reinheit. Das erfindungsgemäßeFrom the above description it is evident that the inventive Process for the production of peptides with desired Amino acid sequence succeeds by utilizing the endopeptidase characteristics. Even catalytic amounts of the enzyme are sufficient and the enzyme can be used repeatedly will. The reaction proceeds under mild conditions in a buffer solution or in a solution with the desired one pH smoothly. The yield is relatively high and the product shows a very high purity. The inventive
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Verfahren eignet sich sowohl zur stufenweise Verlängerung der Peptidketten als auch zur Kondensation wan Peptidfragmenten. Beide Reaktionen sind für industrielle Zwecke geeignet. Darüber hinaus tritt keinerlei Razemisierung der Peptide ein, ein Ergebnis, welches mit herkömmlichen Peptidsynthesen nicht erreicht werden kann.Procedure is suitable for both gradual extension the peptide chains as well as condensation wan peptide fragments. Both reactions are suitable for industrial purposes. In addition, there is no racemization of the peptides, a result that cannot be achieved with conventional peptide syntheses.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.In the following the invention is illustrated by means of embodiments explained in more detail.
Eine Mischung uon 20 ml Mcllvain-Pufferlösung von pH 6,2 undA mixture of 20 ml Mcllvain buffer solution of pH 6.2 and
3 ml Methanol wird zu 497 mg (1,20 mmol) Z-Lys(Z)-OH und 366 mg (1,09 mmol) H-Lys(z)-0Bu gegeben. Sodann gibt man 130 mg Papain (Titer 1200 CSU/g, hergestellt won Green-cross K.K.) und 0,05 ml 2-Mercaptoäthanol unter Rühren bei 38 C zu der Mischung, worauf die -Reaktion während 24 h durchgeführt wird. Das erhaltene ölige Produkt wird mit Äth'ylacetat extrahiert und die Extraktlösung wird der Reihe nach mit Wasser, 0,5n HCl, 7 % Ammoniakwasser und wiederum Wasser gewaschen. Die Äthylacetatlösung wird eingeengt, worauf Petroläther hinzugegeben wird. Man erhält 385 mg (48 %) rohe Kristalle won Z-Lys(Z)-Lys(Z)-OBut. Ein Teil der Kristalle wird aus Äthylacetat/Petroläther umkristallisiert. Man erhält ein reines Produkt mit einem Schmelzpunkt uon 62 bis 66 C und 5 = ~14'2 ° (c = °'5 Methanol).3 ml of methanol are added to 497 mg (1.20 mmol) of Z-Lys (Z) -OH and 366 mg (1.09 mmol) of H-Lys (z) -0Bu. 130 mg of papain (titer 1200 CSU / g, manufactured by Green-cross KK) and 0.05 ml of 2-mercaptoethanol are then added to the mixture with stirring at 38 ° C., whereupon the reaction is carried out for 24 hours. The oily product obtained is extracted with ethyl acetate and the extract solution is washed in sequence with water, 0.5N HCl, 7% ammonia water and again water. The ethyl acetate solution is concentrated and petroleum ether is added. 385 mg (48 %) of crude crystals of Z-Lys (Z) -Lys (Z) -OBu t are obtained . Some of the crystals are recrystallized from ethyl acetate / petroleum ether. A pure product is obtained with a melting point of 62 to 66 ° C. and 5 = ~ 14 ' 2 ° ( c = °' 5 methanol).
Elementar-AnalyseElemental analysis
C HNC HN
berechnet (%) 65,55 7,15 7,65 gefunden (%) 65,55 7,22 7,67calculated (%) 65.55 7.15 7.65 found (%) 65.55 7.22 7.67
Eine Mischung von 20 ml Mcllvaine-Pufferlösung mit pH 7,0 undA mixture of 20 ml Mcllvaine buffer solution with pH 7.0 and
4 ml Methanol wird zu 692 mg (1,20 mmol) Z-Arg(Z,Z)-OH und4 ml of methanol is added to 692 mg (1.20 mmol) of Z-Arg (Z, Z) -OH and
709817/1113709817/1113
470 mg (1,00 rnrnol) H-Leu-OBzh.TosOH gegeben. Sodann werden 150 mg Papain und 0,1 ml 2-Mercaptoäthanol unter Rühren bei 38 C zu der Mischung gegeben und die Reaktion wird während 10 h durchgeführt. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 7 % Ammoniakwasser und wiederum Wasser gewaschen, wobei man Z-Arg(Z,Z)-Leu-0Bzh470 mg (1.00 mmole) of H-Leu-OBzh.TosOH were given. 150 mg of papain and 0.1 ml of 2-mercaptoethanol are then added to the mixture with stirring at 38 ° C. and the reaction is carried out for 10 hours. The colorless precipitate obtained is filtered off and washed in sequence with water, 7% ammonia water and again water, Z-Arg (Z, Z) -Leu-0Bzh
erhält.receives.
Ausbeute 850 mg (99 %) Yield 850 mg (99 %)
Schmelzpunkt 161 bis 168 0CMelting point 161 to 168 ° C
[&>] p5 = -9,4 0C (C = 1,0 Ν,Ν-Dimethylformamid) [&>] p 5 = -9.4 0 C (C = 1.0 Ν, Ν-dimethylformamide)
Elementar-AnalyseElemental analysis
C HNC HN
berechnet {%) 68,76 6,24 8,18 gefunden (%) 68,43 6,18 8,38calculated {%) 68.76 6.24 8.18 found (%) 68.43 6.18 8.38
20 ml McI lv/aine-Puff erlösung won pH 6,6 werden zu 691 mg
(2,00 mmol) BOC-His (BzI)-G.-; und 599 mg (1,80 mmol) von
H-Leu-NHBzh.HCl gegeben. Sodann gibt man 2 50 mg Papain und 100 mg Cysteinhydrochlor^d zu der Mischung unter Rühren bei
38 C und die Reaktion wird während 24 h durchgeführt. Der
erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 7 % Ammoniakwasser und Wasser gewaschen,
Man erhält 750 mg rohe Kristalle. Das Produkt wird in 50 ml heißem Methanol aufgelöst und die heiße Lösung wird mit Aktivkohle
behandelt, um das Protein zu entfernen. Die Lösung wird dann eingeengt und Wasser wird zu dem Rückstand gegeben und
das Produkt wird umkristallisiert, wobei man ein kristallines Produkt, nämlich BOC-His(Bzl)-Leu-NHBzh erhält.
Ausbeute 686 mg (62 %)
Schmelzpunkt 113 bis 115 0C20 ml of McI IV / aine buffer solution at pH 6.6 become 691 mg (2.00 mmol) of BOC-His (BzI) -G.-; and added 599 mg (1.80 mmol) of H-Leu-NHBzh.HCl. Then 50 mg of papain and 100 mg of cysteine hydrochloride are added to the mixture with stirring at 38 ° C. and the reaction is carried out for 24 hours. The colorless precipitate obtained is filtered off and washed in sequence with water, 7% ammonia water and water. 750 mg of crude crystals are obtained. The product is dissolved in 50 ml of hot methanol and the hot solution is treated with activated charcoal to remove the protein. The solution is then concentrated and water is added to the residue and the product is recrystallized to give a crystalline product, namely BOC-His (Bzl) -Leu-NHBzh. Yield 686 mg (62 %)
Melting point 113 to 115 ° C
Ip = -8,1 ° (C = 1,0 Chloroform)Ip = -8.1 ° (C = 1.0 chloroform)
Elementar-Analyse C HNElemental analysis C HN
berechnet {%) 71,24 7,27 11,23 gefunden {%) 71,15 7,30 11,31calculated {%) 71.24 7.27 11.23 found {%) 71.15 7.30 11.31
709817/1113709817/1113
Beispiel 4 «*V jT * Example 4 «* V jT *
20 ml MeIlvaine-Pufferlösung von pH 6,6 werden zu 511 mg (2,00 mmol) BOC-His-OH und 599 mg (1,80 mmol) H-Leu-NHBzh.HCl gegeben. Sodann gibt man 250 mg Papain und 100 mg Cysteinhydrochlorid unter Rühren bei 38 0C zu der Mischung und die Reaktion wird u/ährend 24 h durchgeführt. Der erhaltene farblose Niederschlag uiird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 7 % Ammoniakwasser und Wasser gewaschen, wobei man ein kristallines Rohprodukt erhält. Dieses wird in Äthanol/Wasser aufgelöst und die heiße Lösung u/ird mit Aktivkohle behandelt, um das Protein zu entfernen. Sodann wird die Lösung eingeengt. Dabei erhält man das kristalline Produkt BOC-His-Leu-NHBzh.20 ml of MeIlvaine buffer solution of pH 6.6 are added to 511 mg (2.00 mmol) of BOC-His-OH and 599 mg (1.80 mmol) of H-Leu-NHBzh.HCl. Then gives 250 mg papain and 100 mg of cysteine hydrochloride with stirring at 38 0 C to the mixture and the reaction is carried out u / hile 24 h. The colorless precipitate obtained is filtered off and washed in sequence with water, 7% ammonia water and water, a crystalline crude product being obtained. This is dissolved in ethanol / water and the hot solution is treated with activated charcoal to remove the protein. The solution is then concentrated. This gives the crystalline product BOC-His-Leu-NHBzh.
Ausbeute 336 mg (35 %) Schmelzpunkt 221 bis 223 0CYield 336 mg (35 %) melting point 221 to 223 ° C
^5 = -23,6 ° (C = 0,5 Chloroform) Elementar-Analyse C H ti' ^ 5 = -23.6 ° (C = 0.5 chloroform) Elemental analysis CH ti '
berechnet {%) 67,52 7,37 13,12 gefunden {%) 67,39 7,38 13,21calculated {%) 67.52 7.37 13.12 found {%) 67.39 7.38 13.21
40 ml McIlvaine-Pufferlösung υοη pH 6,2 werden zu 531 mg (2,00 mmol) BOC-Phe-OH und 935 mg (2,00 mmol) H-His-(Bzl)-NHDMB.2HCl gegeben, worauf man 4 ml 1n NaOH zu der Lösung gibt. Sodann gibt man 480 mg Papain und 240 mg Cysteinhydrochlorid unter Rühren bei 38 C zu der Mischung. Sodann wird die Reaktion während 24 h durchgeführt. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 7 % Ammoniak und dann wiederum mit Wasser geiuaschen. Man erhält 960 mg eines kristallinen Rohprodukts. Diese wird in 100 ml heißem Methanol aufgelöst und die heiße Lösung wird mit Aktivkohle während 30 min behandelt, um das Protein zu entfernen. Die Lösung wird danach eingeengt und mit Wasser versetzt, wobei das kristalline Produkt BOC-Phe-His(BzI)-NHDMB.1/2H2 0 erscheint.40 ml McIlvaine buffer solution υοη pH 6.2 are added to 531 mg (2.00 mmol) BOC-Phe-OH and 935 mg (2.00 mmol) H-His- (Bzl) -NHDMB.2HCl, whereupon 4 ml of 1N NaOH are added to the solution. 480 mg of papain and 240 mg of cysteine hydrochloride are then added to the mixture at 38 ° C. with stirring. The reaction is then carried out for 24 hours. The colorless precipitate obtained is filtered off and washed in succession with water, 7% ammonia and then again with water. 960 mg of a crystalline crude product are obtained. This is dissolved in 100 ml of hot methanol and the hot solution is treated with activated charcoal for 30 minutes in order to remove the protein. The solution is then concentrated and water is added, the crystalline product BOC-Phe-His (BzI) -NHDMB.1 / 2H 2 O appearing.
709817/1113709817/1113
26A718826A7188
Ausbeute 650 mg (40 %) Schmelzpunkt 128 bis 132 0C : = +1,6 (C = 1,0 Chloroform)Yield 650 mg (40 %) melting point 128 to 132 0 C: = +1.6 (C = 1.0 chloroform)
Elementar-AnalyseElemental analysis
C HNC HN
berechnet {%) 66,44 6,82 10,76 gefunden {%) 66,34 6,66 10,78calculated {%) 66.44 6.82 10.76 found {%) 66.34 6.66 10.78
Das l/erfahren des Beispiels 1 u/ird wiederholt, uiobei jedoch als Säurekomponente die N* -Acylaminosäure und als Aminkomponente der Aminosäureester von H-l/al-0Bzh gemäß Tabelle verwendet luird. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Ferner uiird das Beispiel 1 wiederholt, uiobei jedoch als Säurekomponente die N -Acylaminosäure des Z-AIa-OH eingesetzt wird und u/obei als Aminkomponente der Aminosäureester oder das Amid gemäß Tabelle 2 eingesetzt werden. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 2'zusammengestellt.The experience of Example 1 is repeated, but here the N * -acylamino acid as the acid component and the amine component the amino acid ester of H-l / al-0Bzh according to the table is used. The results are shown in Table 1. Example 1 is also repeated, but with this the N-acylamino acid of Z-AIa-OH is used as the acid component and u / obei as the amine component of the amino acid ester or the amide according to Table 2 can be used. The results are also compiled in Table 2 '.
709817/1113709817/1113
komponenteacid
component
komponenteAmine
component
beu
te^)the end
beu
te ^)
7.22
7.12H
7.22
7.12
5.28
4.74NS
5.28
4.74
punkt
(0C)Enamel
Point
( 0 C)
6.346.71
6.34
4.804.66
4.80
Nr,E.g,
No,
(2) Φ
(2)
(1 ) berechnet (%)
(2) gefunden (%) Elemental analysis
(1) calculated (%)
(2) found (%)
6.446.39
6.44
4.665.55
4.66
72.43
72.54C.
72.43
72.54
6.596.61
6.59
5.265.40
5.26
71.2169.98
71.21
6.606.61
6.60
5.16 5.795.12 5.84
5.16 5.79
ΦΦ
71.1169.03
71.11
6.276.26
6.27
7.417.90
7.41
69.1969.48
69.19
6.316.27
6.31
4.845.12
4.84
ΦΦ
67.8367.86
67.83
6.396.47.
6.39
7.747.74
7.74
(2) Φ
(2)
68.1867.78
68.18
6.216.19
6.21
13.4013.58
13.40
68.2368.12
68.23
6.666.67
6.66
6.336.18
6.33
67.9468.24
67.94
62.9862.12
62.98
70.2870.67
70.28
- 17 -- 17 -
C3> CO OO C3> CO OO
Nr.E.g.
No.
komponenteacid
component
komponenteAmine
component
beute
{%) the end
prey
{%)
punkt
(0C)Enamel
Point
( 0 C)
(1) berechnet (#)
(2) gefunden {%) Elemental Analysis
(1) calculated (#)
(2) found {%)
6.60
6.54H
6.60
6.54
5. 73
5.82N
5. 73
5.82
(D(D
71.29
71.28C.
71.29
71.28
8.158.22
8.15
7.147.14
7.14
64.6564.26
64.65
6.016.01
6.01
5.115. 52
5.11
73.9773.86
73.97
6.836.82
6.83
5.445. 58
5.44
71.7271.69
71.72
6.106.36
6.10
9.249. 14
9.24
69.4870.57
69.48
6.116.02
6.11
10.9211.15
10.92
(D(D
66.7066.91
66.70
6.106.06
6.10
16.4216.38
16.42
NHB zhH-Arg (NO 2 ) -
NHB zh
NHBzh-1/2 H?OZ-Ala-Arg (NO 2 ) -
NHBzh-1/2 H ? O
60.0660.19
60.06
7.227.15
7.22
7.677.65
7.67
65. 5565.55
65. 55
Beispiel 24 V\4s Example 24 V \ 4 s
1,5 ml Ν,Ν-DimethylPormamid luerden zu 370 mg (1,20 mmol) Z-Pro-Gly-OH und 305 mg (1,00 mrnol) H-Leu-NHBzh.i/2H20 unter Rühren gegeben. Sodann gibt man 15 ml Zitronensäurepufferlösung mit einem pH von 5,5 zu der Mischung. Danach tuird das Gemisch mit 200 mg Papain und 0,2 ml 2-Mercaptoäthanol unter Rühren bei 38 C v/ersetzt und die Mischung u/ird mährend 24 h umgesetzt. Der erhaltene farblose Niederschlag ujird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, einer 5^-igen wässrigen Zitronensäurelösung, Wasser und 7 % Ammoniaklösung geuiaschen. Man erhält 310 mg (51 %) roher Kristalle mit einem Schmelzpunkt v/on 146 bis 149 0C. Das Produkt ujird in Methanol aufgelöst und eine geringe Menge eines unlöslichen Materials luird durch Filtrieren abgetrennt. Die Lösung u/ird eingeengt und Wasser wird zu dem Rückstand gegeben. Man erhält als Produkt Z-Pro-Gly-Leu-NHBzh.H^O mit einem Schmelzpunkt von 148 bis 150 0C und (cc/^ = -41,0 ° (C = 0,5 Methanol).1.5 ml of Ν, Ν-dimethylpormamide are added to 370 mg (1.20 mmol) of Z-Pro-Gly-OH and 305 mg (1.00 mmol) of H-Leu-NHBzh.i / 2H 2 O with stirring. 15 ml of citric acid buffer solution having a pH of 5.5 is then added to the mixture. The mixture is then replaced with 200 mg of papain and 0.2 ml of 2-mercaptoethanol with stirring at 38 ° C. and the mixture is reacted for 24 hours. The colorless precipitate obtained is filtered off and washed in succession with water, a 5% aqueous citric acid solution, water and 7 % ammonia solution. This gives 310 mg (51%) of crude crystals having a melting point v / on 146 to 149 0 C. The product ujird dissolved in methanol and a small amount of insoluble material by filtration luird separated. The solution is concentrated and water is added to the residue. The product obtained is Z-Pro-Gly-Leu-NHBzh.H ^ O having a melting point 148-150 0 C, and (cc / ^ = -41.0 ° (C = 0.5, methanol).
Elementar-Analyse berechnet {%) 6? ^75 ? ^2 ^30 Elemental analysis calculated {%) 6? ^ 75? ^ 2 ^ 30
gefunden {%) 68,05 6,96 9,24 Beispiele 25 bis 32 found {%) 68.05 6.96 9.24 Examples 25-32
Das l/erfahren des Beispiels 24 iuird wiederholt,möbel man jedoch als Säurekomponente das N -Acyldipeptid v/on Z-Phe-Ala-OH und als Aminkomponente die Aminosäure oder das Amid gemäß Tabelle 3 verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt. The experience of Example 24 is repeated if one is furniture however, the acid component is the N-acyl dipeptide from Z-Phe-Ala-OH and the amino acid or the amide according to Table 3 is used as the amine component. The results are shown in Table 3.
709817/1113709817/1113
- 19 -- 19 -
Bsp. Säure-Nr. komponsnteE.g. acid no. composed
Aminkomponente Amine component
Produkt Ausbeute Product yield
Schmel;:
punktSchmel ;:
Point
(0C)( 0 C)
Elementar-AnalyseElemental analysis
(1 ) berechnet (%) (2) gefunden (%) (1) calculated (%) (2) found (%)
2525th
Z-Phe-Ala-OHZ-Phe-Ala-OH
H-Gly-NHBzhH-Gly-NHBzh
Z-Phe-Ala-Gly-NHBzh 218-219Z-Phe-Ala-Gly-NHBzh 218-219
70.92 71.1770.92 71.17
6.12 6.156.12 6.15
9.45 9.469.45 9.46
2626th
Z-Phe-Ala-OHZ-Phe-Ala-OH
H-Ala-NHBzh Z-Phe-Alä-Ala-NHBzh·H-Ala-NHBzh Z-Phe-Alä-Ala-NHBzh
1/2H2O 219-2201 / 2H 2 O 219-220
70.22 70.3970.22 70.39
6.38 6.226.38 6.22
9.10 9.289.10 9.28
2727
Z-Phe-Ala-OHZ-Phe-Ala-OH
H-Val-NHBzh ] Z-Phe-Ala-Val-NHBzh 258-259H-Val-NHBzh ] Z-Phe-Ala-Val-NHBzh 258-259
φ 71.90 (Zj 71.97φ 71.90 (Zj 71.97
6.67 6.696.67 6.69
8.83 8.898.83 8.89
2828
Z-Pro-Gly-OHZ-Pro-Gly-OH
H-Ile-NHBzh ■ Z-Pro-Gle-NHBzhH-Ile-NHBzh ■ Z-Pro-Gle-NHBzh
211-213211-213
69.84 69.6369.84 69.63
6.90 6.866.90 6.86
9.58 9.419.58 9.41
2929
Z-Pro-Gly-OHZ-Pro-Gly-OH
H-Val-NHBzhH-Val-NHBzh
Z-Pro-Gly-VaI-NHB zh· 1/2H2OZ-Pro-Gly-VaI-NHB zh · 1 / 2H 2 O
197-199197-199
Φ 68.3 7 φ 68.77Φ 68.3 7 φ 68.77
6.78 6.616.78 6.61
9.67 9.659.67 9.65
3030th
Z-Pro-Gly-OHZ-Pro-Gly-OH
H-M et-NHB zhH-M et-NHB zh
Z -Pro-Gly-Met-NHBzhZ -Pro-Gly-Met-NHBzh
190190
φ 65.76 © 65.61 φ 65.76 © 65.61
6.35 6.386.35 6.38
9.30 9.469.30 am 9.46
3131
Z-Pro-Gly-OHZ-Pro-Gly-OH
H-Arg (NO2)-NHB zhH-Arg (NO 2 ) -NHB zh
Z-Pro-Gly-Arg(NO2)-NHB zh !120-125Z-Pro-Gly-Arg (NO 2 ) -NHB zh! 120-125
60.70 60.6560.70 60.65
5.99 6.235.99 6.23
16. 16.16. 16.
COCO
11.96 OO 12.0111.96 OO 12.01
3232
Z-Pro-Gly-OHZ-Pro-Gly-OH
H-A sn-NHB zhH-A sn-NHB zh
Z-Pro-Gly-Asn-NHBzhZ-Pro-Gly-Asn-NHBzh
239-240239-240
U) 65.62 (D 65.62U) 65.62 (D 65.62
6.02 6.006.02 6.00
Beispiel 33Example 33
Eine Mischung von 15 ml McIlvaine-Pufferlösung mit einem pH von 8,0 und 15 ml Methanol werden zu 564 mg (1,2 mmol) BOC-ual-Tyr-(Bzl)-OH und 516 mg (1,0 mmol) H-Val-His(Bzl)-OBzI.2HCl gegeben. Sodann gibt man 300 mg Papain und 150 mg Cysteinhydrochlorid zu der Mischung unter Rühren bei 38 C, worauf die Reaktion während 24 h durchgeführt wird. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man erhält 450 mg rohe Kristalle. Das Produkt wird in 40 ml Äthanol aufgelöst und die heiße Lösung wird mit Aktivkohle behandelt, um das Protein zu entfernen. Sodann wird die Lösung abgekühlt und der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat wird eingeengt. Der Rückstand wird durch Zugabe von Äther zu dem Rückstand umkristallisiert. Man erhält BOC-Wal-Tyr(Bzl)-\/al-His(Bzl)-OH.A mixture of 15 ml of McIlvaine buffer solution with a pH of 8.0 and 15 ml of methanol become 564 mg (1.2 mmol) of BOC-ual-Tyr- (Bzl) -OH and 516 mg (1.0 mmol) of H-Val-His (Bzl) -OBzI.2HCl given. 300 mg of papain and 150 mg of cysteine hydrochloride are then added to the mixture while stirring at 38 ° C. whereupon the reaction is carried out for 24 hours. The colorless precipitate obtained is filtered off and washed with Water washed. 450 mg of crude crystals are obtained. The product is dissolved in 40 ml of ethanol and the hot solution is treated with activated charcoal to remove the protein. The solution is then cooled and the precipitate obtained is filtered off and the filtrate is concentrated. The residue is added to the residue by adding ether recrystallized. BOC-Wal-Tyr (Bzl) - \ / al-His (Bzl) -OH is obtained.
Ausbeute 100 mg (12 %) Ninhydrintest: negativYield 100 mg (12 %) ninhydrin test: negative
Schmelzpunkt: 159 bis 165 0CMelting point: 159 to 165 ° C
Va\ D = -8,16 ° (C = 0,5 Ν,Ν-Dimethylformamid) Va \ D = -8.16 ° (C = 0.5 Ν, Ν-dimethylformamide)
Elementar-Analyse C HNElemental analysis C HN
berechnet (%) 63,44 7,26 10,00 gefunden {%) 63,67 7,04 10,24calculated (%) 63.44 7.26 10.00 found {%) 63.67 7.04 10.24
Eine Mischung von 20 ml Mcllvaine-Pufferlösung mit pH 6,1 und 10 ml Methanol werden zu 518 mg (1,1 mmol) BOC-Ual-Tyr(Bzl)-DH und 583 mg (1,0 mmol) H-\/al-His(Bzl)-NHBzh.2HCl gegeben, worauf man noch 2 ml 1n NaOH zu der Lösung gibt. Sodann versetzt man die Lösung mit 240 mg Papain und 120 mg Cysteinhydrochlorid unter Rühren bei 38 C. Sodann wird die Reaktion während 48 h durchgeführt. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit 0,5n HCl, 7 % Ammoniakwasser und Wasser gewaschen. Man erhält 950 mg rohe Kristalle. Das Produkt iuird in 300 ml Methanol aufgelöst und die heißeA mixture of 20 ml Mcllvaine buffer solution with pH 6.1 and 10 ml methanol become 518 mg (1.1 mmol) BOC-Ual-Tyr (Bzl) -DH and 583 mg (1.0 mmol) H - \ / al-His (Bzl) -NHBzh.2HCl, whereupon 2 ml of 1N NaOH are added to the solution. 240 mg of papain and 120 mg of cysteine hydrochloride are then added to the solution with stirring at 38 ° C. The reaction is then carried out for 48 hours. The colorless precipitate obtained is filtered off and washed in succession with 0.5N HCl, 7% ammonia water and water. 950 mg of crude crystals are obtained. The product iuird dissolved in 300 ml of methanol and the hot
709817/1113709817/1113
Lösung wird mit Aktivkohle behandelt, um das Protein zu entfernen. Die Lösung luird dann eingeengt und der Rückstand wird aus N,N-Dimethylformamid/Wassar umkristallisiert, ujobei man BOC-Val-Tyr(BzI)-Val-His(BzI)-NHBzh erhält.Solution is treated with activated charcoal to remove the protein. The solution is then concentrated and the residue becomes recrystallized from N, N-dimethylformamide / Wassar, ujobei man BOC-Val-Tyr (BzI) -Val-His (BzI) -NHBzh.
Ausbeute 410 mg {%2 %) Schmelzpunkt 237 bis 239 0C ^ = -6,1 ° (C = 1,0 N,N-Dimethylformamid)Yield 410 mg {% 2%) Melting point 237 to 239 0 C ^ = -6.1 ° (C = 1.0 N, N-dimethylformamide)
Elementar-Analyse berechnet {%) ^84 ^0 ^Q>[]n Elemental analysis calculated {%) ^ 84 ^ 0 ^ Q> [] n
gefunden (%) 70,18 7,01 9,94 Beispiele 35 bis 41 found (%) 70.18 7.01 9.94 Examples 35 to 41
Das Verfahren des Beispiels 34 u/ird uiiederholt, lüobei man als Säurekomponente das N ^ -Acyldipeptid gemäß Tabelle 4 und als Aminkomponente das jeu/eilige Dipeptidamid von H-Phe-Ser-NHBzh gemäß Tabelle 4 einsetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengestellt.The procedure of Example 34 is repeated, if one as the acid component the N ^ -acyldipeptide according to Table 4 and as the amine component the jeu / hasty dipeptide amide of H-Phe-Ser-NHBzh according to Table 4 is used. The results are compiled in Table 4.
709817/11 13709817/11 13
- 22 -- 22 -
O (O OOO (O OO
komponen-/Acid-
compose
•i-p beu-
• ip
Beispiel 42Example 42
Eine Mischung von 7,5 ml McIluaine-Pufferlösung mit pH 7,0 und 7,5 ml Methanol uierden zu 282 mg (0,6 mmol) BOC-l/al-Tyr-(Bzl)-OH und 345 mg (0,5 mmol) H-Val-His(Bzl)-Pro-Phe-0Et.2HCl gegeben und dann uiird das Gemisch noch mit 1 ml 1n NaOH v/ersetzt. Sodann gibt man 150 mg Papain und 70 mg Cysteinhydrochlorid hinzu, uiorauf die Mischung bei 38 °C während 24 h gerührt uiird. Die erhaltenen farblosen Ausfällungen werden abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 0,5n HCl, 7^-igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen. Man erhält 400 mg eines kristallinen Rohprodukts. Das Produkt wird in 50 ml Äthylacetat aufgelöst und die heiQe Lösung wird mit Aktiukohle behandelt, um das Protein zu entfernen. Sodann wird die Lösung eingeengt und der Rückstand wird aus Methanol/Wasser umkristallisiert. Man erhält BOC-Val-Tyr (BzI )-l/al-His (Bzl)-Pro-Phe-OE t.A mixture of 7.5 ml of McIluaine buffer solution at pH 7.0 and 7.5 ml of methanol lead to 282 mg (0.6 mmol) of BOC-l / al-Tyr- (Bzl) -OH and 345 mg (0.5 mmol) H-Val-His (Bzl) -Pro-Phe-0Et.2HCl and then the The mixture was replaced with 1 ml of 1N NaOH v /. 150 mg papain and 70 mg cysteine hydrochloride are then added the mixture is stirred at 38 ° C for 24 h. The received colorless precipitates are filtered off and sequentially with water, 0.5N HCl, 7 ^ ammonia water and again washed with water. 400 mg of a crystalline crude product are obtained. The product is dissolved in 50 ml of ethyl acetate and the hot solution is treated with charcoal to Remove protein. The solution is then concentrated and the residue is recrystallized from methanol / water. BOC-Val-Tyr (BzI) -l / al-His (Bzl) -Pro-Phe-OE t is obtained.
Ausbeute 226 mg (42 %) Yield 226 mg (42 %)
Ninhydrintest: negativ/ Schmelzpunkt 167 bis 173 0CNinhydrin test: negative / melting point 167 to 173 ° C
fpq2p = -34,0 (C = 1,0 Ν,Ν-Dimethylformamid) = -56,1 (C = 1,0 Methanol)fpq 2 p = -34.0 (C = 1.0 Ν, Ν-dimethylformamide) = -56.1 (C = 1.0 methanol)
Elerneηtar-AnaIyse C HNElementary analysis C HN
berechnet (%) 66,82 7,19 10,39calculated (%) 66.82 7.19 10.39
gefunden (%) 66,72 7,16 10,55found (%) 66.72 7.16 10.55
Das gleiche Produkt wird bei einem Lösungsv/erf ahren erhalten. Dieses Produkt hat die folgenden Eigenschaften:The same product is obtained from a solution experience. This product has the following characteristics:
Schmelzpunkt:164 bis 174 °C Mischschmelzpunkt:161 bis 167 0CMelting point: 164-174 ° C mixed melting point: 161-167 0 C.
&]2q = -35,3 (C = 1,0 N,N-Dimethylformamid) = -59,2 (C = 1,0 Methanol) &] 2 q = -35.3 (C = 1.0 N, N-dimethylformamide) = -59.2 (C = 1.0 methanol)
Im Gegensatz zur Lösungsmethode wird bei der Enzymmethode keine Razemisierung festgestellt.In contrast to the solution method, no racemization is found with the enzyme method.
709817/1113709817/1113
Beispiel 43Example 43
Ein Gemisch uon 15 ml Mcllvaine-Pufferlösung mit pH 8,0 und 15 ml Methanol uierden zu 943 mg (1,20 mrnol) B0C-Asn-Arg(N02)-Ual-Tyr(Bzl)-0H und 690 mg (1,00 mmol) H-Ual-His(Bzl)-Pra-Phe-0Et.2HCl gegeben. Sodann gibt man 300 mg Papain und 150 mg Cysteinhydrochlorid unter Rühren bei 3B C zu dem Gemisch und die Umsetzung wird dann während 4 h durchgeführt. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 0,5n HCl, 7^-igem Ammoniakwasser und dann wiederum mit Wasser gewaschen. Man erhält 1,20 g rohe Kristalle. Das Produkt wird in 200 ml Äthanol aufgelöst und die Lösung wird mit Aktiv/kohle behandelt, um das Protein zu entfernen. Die Lösung wird sodann eingeengt und der Rückstand wird durch Zugabe won Äther umkristallisiert. Man erhält das kristalline Produkt BOC-Asn-Arg(NO2)-Wal-Tyr-(BzI)-Ual-His(BzI)-Pro-Phe-OEt.A mixture of 15 ml Mcllvaine buffer solution with pH 8.0 and 15 ml methanol yielded 943 mg (1.20 mmol) BOC-Asn-Arg (NO 2 ) -Ual-Tyr (Bzl) -0H and 690 mg (1 , 00 mmol) H-Ual-His (Bzl) -Pra-Phe-0Et.2HCl given. 300 mg of papain and 150 mg of cysteine hydrochloride are then added to the mixture with stirring at 3B C, and the reaction is then carried out for 4 hours. The colorless precipitate obtained is filtered off and washed successively with water, 0.5N HCl, 7 ^ ammonia water and then again with water. 1.20 g of crude crystals are obtained. The product is dissolved in 200 ml of ethanol and the solution is treated with charcoal to remove the protein. The solution is then concentrated and the residue is recrystallized by adding ether. The crystalline product BOC-Asn-Arg (NO 2 ) -Wal-Tyr- (BzI) -Ual-His (BzI) -Pro-Phe-OEt is obtained.
Ausbeute: 530 mg (37 %) Schmelzpunkt; 185 bis 197 0C 2Q = -47,3 ° (C = 1,0 Methanl)Yield: 530 mg (37 %) melting point; 185 to 197 0 C 2 Q = -47.3 ° (C = 1.0 methane)
p = -25,3 ° (C = 1,0 N,N-Dimethylformamid) Elementar-Analyse CHNp = -25.3 ° (C = 1.0 N, N-dimethylformamide) Elemental analysis CHN
berechnet (Ji) 59,17 6,88 14,79 gefunden {%) 59,11 6,62 15,02calculated (Ji) 59.17 6.88 14.79 found {%) 59.11 6.62 15.02
Das gleiche Produkt uiird nach der Lösungsmethode hergestellt. Es hat die folgenden Eigenschaften:The same product is made by the solution method. It has the following characteristics:
Schmelzpunkt:.185 bis 198 0C Mischschmelzpunkt: 185 bis 190 0CMelting point: .185 to 198 0 C mixed melting point: 185-190 0 C.
M2Q = ~48»4 ° (C = 1,0 Methanol)M 2 Q = ~ 48 » 4 ° (C = 1.0 methanol)
= -26,5 ° (C = 1,0 N,N-Dimethylformamid)= -26.5 ° (C = 1.0 N, N-dimethylformamide)
Im Gegensatz zur Lösungsrnsthode findet bei der Enzymmethode keine Razemisierung statt.In contrast to the solution method, in the enzyme method no racemization took place.
709817/1113709817/1113
2 ml N,N-Dimethylformamid werden zu 420 mg (1,50 mmol) Z-GIn-OH und 480 mg (1,25 mmol) H-Leu-OBzh.(COOH)„ unter Rühren gegeben, worauf man noch 20 ml Zitronensäurepufferlösung mit einem pH von 5,5 zu der Mischung gibt. Sodann gibt man 300 mg Stembromelein und 0,2 ml 2-Mercaptoäthanol unter Rühren bei 38 C zu dem Gemisch, worauf die Reaktion während 24 h durchgeführt wird. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und dann der Reihe nach mit Wasser, 5^-iger Zitronensäure, Wasser, 7^-igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen. Man erhält 680 mg (97 %) des Produkts Z-Gln-Leu-OBzh mit einem Schmelzpunkt von 158 bis 163 0C. Nach dem Trocknen wird das Produkt in Methanol aufgelöst und die heiße Lösung wird mit Aktivkohle behandelt. Sodann wird die Lösung eingeengt und der Rückstand wird durch Zugabe von Wasser zu dem Konzentrat kristallisiert. Man erhält ein reines Produkt mit einem Schmelzpunkt von 160 bis 163 C2 ml of N, N-dimethylformamide are added to 420 mg (1.50 mmol) of Z-GIn-OH and 480 mg (1.25 mmol) of H-Leu-OBzh. (COOH) "while stirring, whereupon another 20 ml Citric acid buffer solution with a pH of 5.5 is added to the mixture. 300 mg of stembromelein and 0.2 ml of 2-mercaptoethanol are then added to the mixture with stirring at 38 ° C., whereupon the reaction is carried out for 24 hours. The colorless precipitate obtained is filtered off and then washed in sequence with water, 5% citric acid, water, 7% ammonia water and again with water. This gives 680 mg (97%) of product Z-Gln-Leu-OBzh having a melting point 158-163 0 C. After drying, the product is dissolved in methanol and the hot solution is treated with activated carbon. The solution is then concentrated and the residue is crystallized by adding water to the concentrate. A pure product with a melting point of 160 to 163 ° C. is obtained
und [K]2D = -38»1 ° (c = 1>° Methanol).and [K] 2 D = -38 » 1 ° ( c = 1 > ° methanol).
Elementar-Analyse C HNElemental analysis C HN
15 ml Zitronensäurepufferlösung mit pH 5,5 werden zu 403 mg15 ml of citric acid buffer solution with pH 5.5 becomes 403 mg
(1,20 mmol) Z-Leu-Ala-OH und 310 mg (1,00 mmol)(1.20 mmol) Z-Leu-Ala-OH and 310 mg (1.00 mmol)
H-Phe-OBu .(COOH)2 gegeben. Danach gibt man 200 mg Strembromelein und 0,2 ml 2-Mercaptoäthanol unter Rühren bei 38 C zu dem Gemisch, worauf die Reaktion während 24 h durchgeführtH-Phe-OBu. (COOH) 2 given. 200 mg of strembromelein and 0.2 ml of 2-mercaptoethanol are then added to the mixture at 38 ° C. with stirring, whereupon the reaction is carried out for 24 hours
wird. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 5^-iger Zitronensäure,will. The colorless precipitate obtained is filtered off and one after the other with water, 5% citric acid,
Wasser, 7^-igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen, Man erhält 310 mg rohe Kristalle. Nach dem Trocknen wird dasWater, 7 ^ ammonia water and washed again with water, 310 mg of crude crystals are obtained. After drying it will
Produkt mit Äthylacetat aufgelöst und die Lösung wird mit Aktivkohle behandelt. Sodann u/ird die Lösung eingeengt und der Rückstand wird aus Petroläther umkristallisiert.Product is dissolved with ethyl acetate and the solution is treated with activated charcoal. The solution is then concentrated and the residue is recrystallized from petroleum ether.
709817/1113709817/1113
Man erhält Z-Leu-AJa-Phe-OBu . Ausbeute: 250 mg (4,6 %) Schmelzpunkt: 73 bis 77 0C M2D = -40,0° (c = °»5 Methanol)Z-Leu-AJa-Phe-OBu is obtained. Yield: 250 mg (4.6 %) Melting point: 73 to 77 0 C M 2 D = -40.0 ° ( c = ° » 5 methanol)
E lernentar-AnalyseE learning tariff analysis
C HNC HN
berechnet {%) 66,77 7,66 7,79 gefunden (%) 66,76 7,71 7,90calculated {%) 66.77 7.66 7.79 found (%) 66.76 7.71 7.90
2 ml Ν,Ν-Dimethylformamid u/erden zu 470 mg (1,40 mmol) Z-Leu-Ala-OH und 585 mg (1,25 mmol) H-Ile-OBzh.TosOH unter Rühren gegeben, ujorauf man noch 20 ml Zitronensäurepufferlüsung von pH 5,5 zu dem Gemisch gibt. Danach u/ird das Gemisch mit 300 mg Stembromelein und 0,2 ml 2-Mercaptoäthanol gegeben u/orauf die Mischung noch bei 38 0C während 24 h gerührt u/ird. Der erhaltene farblose Niederschlag u/ird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 5^-iger Zitronensäure, Wasser, 7-^-igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen. Man erhält 610 mg (79 %) des Produkts Z-Leu-Ala-Ile-OBzh mit einem Schmelzpunkt von 167 bis 170 0C. Das Produkt wird in Äthylacetat aufgelöst und die Lösung wird Aktivkohle behandelt. Sodann wird die Lösung eingeengt und der Rückstand wird durch Zugabe von Äther zu dem Konzentrat umkristallisiert. Man erhält ein reines Produkt mit einem Schmelzpunkt von 170 bis 171 0C und mit M2Q = -60,2 ° (C = 1,0 Methanol)Add 2 ml of Ν, Ν-dimethylformamide to 470 mg (1.40 mmol) of Z-Leu-Ala-OH and 585 mg (1.25 mmol) of H-Ile-OBzh.TosOH with stirring, and then add 20 ml of citric acid buffer solution of pH 5.5 is added to the mixture. Thereafter u / ith the mixture with 300 mg Stembromelein and 0.2 ml 2-mercaptoethanol added u / orauf the mixture still at 38 0 C for 24 h stirred and / ird. The colorless precipitate obtained is filtered off and washed in succession with water, 5% citric acid, water, 7% ammonia water and again with water. This gives 610 mg (79%) of product Z-Leu-Ala-Ile-OBzh having a melting point 167-170 0 C. The product is dissolved in ethyl acetate and the solution is treated activated carbon. The solution is then concentrated and the residue is recrystallized by adding ether to the concentrate. Obtaining a pure product having a melting point of 170-171 0 C and treated with 2 M Q = -60.2 ° (C = 1.0 methanol)
Elernentar-Analyse C HNElementary analysis C HN
berechnet (%) 70,22 7,37 6,82 gefunden (%) 69,95 7,40 6,91calculated (%) 70.22 7.37 6.82 found (%) 69.95 7.40 6.91
Das Verfahren des Beispiels 46 u/ird wiederholt, wobei man jedoch jeweils als Säurekomponente das N^ -Acyldipeptid und als Aminkomponente den Aminosäureester oder das Aminosäureamid gemäß Tabelle 5 einsetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle zusammengestellt.The procedure of Example 46 is repeated using however, the N ^ -acyldipeptide and as the acid component as the amine component, the amino acid ester or the amino acid amide according to table 5. The results are summarized in the table.
709817/1113709817/1113
Nr.E.g.
No.
komponenteacid
component
komponenteAmine
component
beutethe end
prey
8364
83
6.85
6.90H
6.85
6.90
6.96
6.95N
6.96
6.95
punktEnamel
Point
Ii El
Ii
8073
80
6.186.25
6.18
11.6011.43
11.60
(D(D
1522nd
15th
7.377.37
7.37
6.886.82
6.88
NHBzn-l/2H2OPMZ-Ala-Ala-Asn-
NHBzn-1 / 2H 2 O
(D(D
) berechnet (%)
) gefunden {%) ementar analysis
) calculated (%)
) found {%)
2920th
29
6.816.84
6.81
8.638.64
8.63
67.
67.C.
67.
67.
1432
14th
6.726.71
6.72
11.3311.38
11.33
62.62.
62.
9790
97
6.696.67
6.69
8.898.83
8.89
φφ
70.70.
70.
.6877
.68
6.036.04
6.03
6.376. 15
6.37
72.72.
72.
.17.09
.17
7.006.85
7:00
7.457.33
7.45
6666
66
.88.13
.88
7.047.11
7.04
9.789.63
9.78
φφ
7171
71
.41.22
.41
7.427.37
7.42
6.926.82
6.92
NHB zh-1/2H7OZ-Ala-Leu-Ala-
NH zh-1 / 2H 7 O
7373
73
(D(D
6969
69
6768
67
7070
70
2 S /f 718 82 S / f 718 8
2 ml N,N-Dimethylformamid werden zu 380 mg (1,50 mmol)
Z-Thr-OH und 480 mg (1,25 mmol) H-Leu-OBzh.(COOH)2 unter
Rühren gegeben, worauf man noch 20 ml Zitronensäurepufferlösung von pH 5,5 zu der Mischung gibt. Sodann wird das Ganze
mit 300 mg Ficin und 0,3 ml 2-M8rcaptoäthanol v/ersetzt, uorauf
das Gemisch noch bei 38 °C mährend 24 h gerührt wird. Der erhaltene
farblose Niederschlag iuird abfiltriert und der Reihe
nach mit Wasser, 5%-iqeT Zitronensäure, Wasser, ?%-igem Ammoniakwasser
und wiederum mit Wasser gewaschen. Man erhält 330 mg (50 %) des Produkts Z-Thr-Leu-OBzh mit einem Schmelzpunkt von
114 bis 117 °C. Das Produkt wird in Äthylacetat aufgelöst und die Lösung wird eingeengt. Der Rückstand wird durch Zugabe
von Äther zu dem Konzentrat umkristallisiert. Man erhält dabei ein reines Produkt mit einem Schmelzpunkt von 120 bis 122 C2 ml of N, N-dimethylformamide become 380 mg (1.50 mmol)
Z-Thr-OH and 480 mg (1.25 mmol) H-Leu-OBzh. (COOH) 2 under
Stirring is added, whereupon 20 ml of citric acid buffer solution of pH 5.5 are added to the mixture. The whole thing is then replaced with 300 mg of ficine and 0.3 ml of 2-M8rcaptoethanol, and the mixture is stirred at 38 ° C. for 24 hours. The colorless precipitate obtained is filtered off and washed in sequence with water, 5% strength citric acid, water, 1% strength ammonia water and again with water. 330 mg (50 %) of the product Z-Thr-Leu-OBzh with a melting point of 114 to 117 ° C. are obtained. The product is dissolved in ethyl acetate and the solution is concentrated. The residue is made by adding
recrystallized from ether to the concentrate. A pure product with a melting point of 120 to 122 ° C. is obtained
und β*] ρ = -41,4 (C = 1,0 Methanol).and β *] ρ = -41.4 (C = 1.0 methanol).
Elementar-Analy seElemental analysis
C H NC H N
berechnet {%) 69,90 6,81 5,26 gefunden (%) 70,02 6,87 5,16calculated {%) 69.90 6.81 5.26 found (%) 70.02 6.87 5.16
1,5 ml Ν,Ν-Dimethylformamid werden zu 320 mg (1,20 mmol)
BOC-Met-OH und 254 mg (1,00 mmol) H-Ala-NHBzh unter Rühren
gegeben. Sodann gibt man 15 ml Zitronensäurepufferlösung won
pH 5,5 zu dem Gemisch. Danach gibt man noch 300 mg Ficin und
0,3 ml 2-Mercaptoäthanol unter Rühren bei 38 C zu der Mischung,
wobei das Ganze während 24 h bei 38 C zur Umsetzung gebracht wird. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert
und der Reihe nach mit Wasser, 5^-iger Zitronensäure, Wasser, 7/ζ-ig em Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen. Man
erhält 400 mg (82 %) des Produkts BOC-Met-Ala-NHBzh mit einem
Schmelzpunkt von 163.bis 164 C. Das Produkt wird mit Äthyläther
aufgelöst und die Lösung wird eingeengt. Sodann uiird
der Rückstand aus Äther/Petroläther umkristallisiert. Man
erhält ein reines Produkt mit einem Schmelzpunkt von 159 bis1.5 ml Ν, Ν-dimethylformamide become 320 mg (1.20 mmol)
BOC-Met-OH and 254 mg (1.00 mmol) H-Ala-NHBzh with stirring
given. 15 ml of citric acid buffer solution are then added
pH 5.5 to the mixture. Then you give another 300 mg of ficine and
Add 0.3 ml of 2-mercaptoethanol to the mixture with stirring at 38 ° C., the whole being reacted at 38 ° C. for 24 hours. The colorless precipitate obtained is filtered off
and washed in succession with water, 5% citric acid, water, 7 / ζ% ammonia water and again with water. 400 mg (82 %) of the product BOC-Met-Ala-NHBzh with a melting point of 163 ° to 164 ° C. are obtained. The product is dissolved with ethyl ether and the solution is concentrated. Then uiird
the residue recrystallized from ether / petroleum ether. Man
receives a pure product with a melting point of 159 to
709817/1113709817/1113
o„ . ., ι νΊ 25 or, ^ οo ". ., ι νΊ 25 or, ^ ο
161 C und JAl Q = -29,6 (C = 1,0 Methanol).161 C and JAl Q = -29.6 (C = 1.0 methanol).
Elementar-AnalyseElemental analysis
CHNCHN
berechnet {%) 64,30 7,26 8,65 gefunden {%) 64,13 7,20 8,77calculated {%) 64.30 7.26 8.65 found {%) 64.13 7.20 8.77
2 ml IM, N-Dimethylf ormamid werden in 516 mg (1,40 mmol) Z-Phe-Ala-OH und 480 mg (1,25 mmol) H-Leu-OBzh.(COOH)2 unter Rühren gegeben und dann wird das Ganze noch mit 20 ml Zitronensäurepufferlösung v/on pH 5,5 v/ersetzt. Danach gibt man 200 mg Ficin und 0,2 ml 2-Mercaptoäthanol unter Rühren bei 38 C zu dem Gemisch und das Ganze wird dann noch während 24 h zur Reaktion gebracht. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 5?o-iger Zitronensäure, Wasser, 7^-igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen. Man erhält 540 mg (67 %) rohe Kristalle mit einem Schmelzpunkt v/on 156 bis 158 C. Das Produkt wird in Methanol aufgelöst und eine kleine Menge eines unlöslichen Materials wird entfernt. Die Lösung wird eingeengt und der Rückstand wird umkristallisiert durch Zugabe v/on Wasser zu dem Produkt. Man erhält Z-Phe-Ala-Leu-OBzh mit einem Schmelzpunkt v/on 151 bis 152 0C und £θζ]2§ = -47,4 ° (C = 0,5 Methanol).2 ml of IM, N-dimethylformamide are added to 516 mg (1.40 mmol) of Z-Phe-Ala-OH and 480 mg (1.25 mmol) of H-Leu-OBzh. (COOH) 2 with stirring and then becomes the whole thing replaced with 20 ml citric acid buffer solution v / on pH 5.5 v /. Thereafter, 200 mg of ficin and 0.2 ml of 2-mercaptoethanol are added to the mixture with stirring at 38 ° C. and the whole is then reacted for a further 24 hours. The colorless precipitate obtained is filtered off and washed in sequence with water, 5% citric acid, water, 7% ammonia water and again with water. 540 mg (67 %) of crude crystals having a melting point of 156 to 158 ° C. are obtained. The product is dissolved in methanol and a small amount of an insoluble material is removed. The solution is concentrated and the residue is recrystallized by adding v / on water to the product. This gives Z-Phe-Ala-Leu-OBzh having a melting point v / on 151-152 0 C and £ θζ] 2 § = -47.4 ° (C = 0.5, methanol).
EIemeηtar-AnalyseEIemeηtar analysis
Eine Mischung v/on 20 ml McIlv/ainB-Puferlösung v/on pH 6,2 und 3 ml Methanol wird zu 370 mg (1,26 mmol) Z-Phe-OH und mg (1,07 mmol) H-Lys(Z)-0Bu gegeben. Sodann gibt man noch 130 mg Papain und 0,05 ml 2-Mercaptoäthanol unter Rühren bei 38 C während 20 h zu der Mischung. Der erhaltene farblose Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser,A mixture of 20 ml of McIlv / ainB buffer solution of pH 6.2 and 3 ml of methanol is added to 370 mg (1.26 mmol) of Z-Phe-OH and mg (1.07 mmol) of H-Lys (Z) -0Bu. Then you give Add 130 mg of papain and 0.05 ml of 2-mercaptoethanol to the mixture with stirring at 38 ° C. for 20 h. The obtained colorless Precipitate is filtered off and sequentially with water,
709817/1113709817/1113
0,5 M Zitronensäure, 7^-igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen. Die erhaltenen rohen Kristalle werden in Äthylacetat aufgelöst und die Lösung wird mit Aktiv/kohle behandelt. Sodann gibt man η-Hexan zu dem Fitrat. Man erhält Z-Phe-Lys(Z)-0But.0.5 M citric acid, 7 ^ ammonia water and washed again with water. The obtained crude crystals are dissolved in ethyl acetate and the solution is treated with activated charcoal. Then η-hexane is added to the fitrat. Z-Phe-Lys (Z) -0Bu t is obtained .
Ausbeute: 531 mg (80 %) Schmelzpunkt: 181 bis 121 °C jXl2p = -13,5° (C = 1,0 Methanol)Yield: 531 mg (80 %) Melting point: 181 to 121 ° C jXl 2 p = -13.5 ° (C = 1.0 methanol)
Elementar-Analyse C HNElemental analysis C HN
berechnet (%) 68,05 7,02 6,80 gefunden (%) 68,19 6,98 6,85calculated (%) 68.05 7.02 6.80 found (%) 68.19 6.98 6.85
Eine Mischung von 20 ml Mclluaine-Pufferlösung υοη pH 6,2 und 3 ml Methanol wird zu 359 mg (1,20 mmol) Z-Phe-OH und 173 mg (1,00 mmol) H-UaI-OBu gegeben. Sodann gibt man noch 130 mg Papain und 0,05 ml 2-Mercaptoäthanol bei 38 C zu dem Gemisch und das Ganze wird während 20 h zur Reaktion gebracht. Das erhaltene ölige Produkt wird in Äthylacetat aufgelöst und die Lösung wird der Reihe nach mit Wasser, 0,5n HCl, 7^-igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen. Die Lösung wird getrocknet und mit Aktivkohle zurEntfernung des Proteins behandelt. Sodann wird die Lösung eingeengt und mit Petrol-A mixture of 20 ml Mclluaine buffer solution υοη pH 6.2 and 3 ml of methanol becomes 359 mg (1.20 mmol) of Z-Phe-OH and 173 mg (1.00 mmol) H-UaI-OBu given. Then another 130 mg are given Papain and 0.05 ml of 2-mercaptoethanol at 38 ° C. to the mixture and the whole is reacted for 20 hours. The oily product obtained is dissolved in ethyl acetate and the solution is washed in sequence with water, 0.5N HCl, 7 ^ ammonia water and again with water. The solution is dried and treated with activated charcoal to remove the protein. The solution is then concentrated and washed with petroleum
er versetzt, wobei Z-Ph Ausbeute: 315 mg (69 %) he added, with Z-Ph yield: 315 mg (69 %)
1 = -19,0 0C (C = 1,0 Methanol)1 = -19.0 0 C (C = 1.0 methanol)
äther versetzt, wobei Z-Phe-Ual-OBu auskristallisiertether added, whereby Z-Phe-Ual-OBu crystallizes out
Schmelzpunkt: 104 bis 106 0CMelting point: 104 to 106 ° C
Der Schmelzpunkt und /jKJ D stimmen überein mit den Daten gemäß Chem. Ber. JK]O, 160 (1967).The melting point and / jKJ D agree with the data according to Chem. Ber. JK] O, 160 (1967).
Die folgenden Referenzbeispiele beziehen sich auf die Umwandlung der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Peptide in die freien Verbindungen.The following reference examples relate to the conversion that obtained with the process according to the invention Peptides into the free links.
709817/1113709817/1113
2,00 g (3,20 mmol) Z-Phe-Lys(Z)-OBu werden in 15 ml Äthylacetat aufgelöst und mit 20 ml 6,On HCl-Äthylacetat vermischt. Die Reaktion wird bei Zimmertemperatur während 2 h durchgeführt, worauf die Lösung eingeengt wird. Zu dem Rückstand gibt man trockenen Äther. Man erhält Z-Phe-Lys-(Z)-OH.2.00 g (3.20 mmol) of Z-Phe-Lys (Z) -OBu are dissolved in 15 ml of ethyl acetate dissolved and mixed with 20 ml of 6, On HCl-ethyl acetate. The reaction is carried out at room temperature for 2 hours, whereupon the solution is concentrated. Dry ether is added to the residue. Z-Phe-Lys- (Z) -OH is obtained.
Ausbeute: 1,69 g (94 %) Schmelzpunkt: 94 bis 96 0C •jj = -6,2 (C = 0,5 Methanol)Yield: 1.69 g (94 %) Melting point: 94 to 96 0 C • jj = -6.2 (C = 0.5 methanol)
Elernentar-AnalyseElementary analysis
C HNC HN
berechnet {%) 66,29 6,28 7,48 gefunden {%) 65,93 6,02 7,71calculated {%) 66.29 6.28 7.48 found {%) 65.93 6.02 7.71
909 mg (2,00 mmol) Z-Phe-Wal-OBu werden in einer Mischung von 8 ml Methanol und 0,12 ml Essigsäure aufgelöst und mit 100 mg 10/£ Pd-C vermischt. Die Reaktion wird während 2 h unter einer Wasserstoffatmosphäre durchgeführt und dann wird der Katalysator abfiltriert. Das Methanol wird durch Destillation entfernt und der Rückstand wird in Äthylacetat aufgelöst. Die Lösung wird sodann mit einer wässrigen Lösung von Natriumbicarbonat in Wasser und dann mit Wasser gewaschen. Die Äthylacetatlösung wird getrocknet und eingeengt und danach mit Petroläther versetzt, wobei H-Phe-\/al-0Bu auskristallisiert.909 mg (2.00 mmol) Z-Phe-Wal-OBu are in a mixture of 8 ml of methanol and 0.12 ml of acetic acid dissolved and mixed with 100 mg of 10 / £ Pd-C. The reaction is for 2 h under a Carried out hydrogen atmosphere and then the catalyst is filtered off. The methanol is removed by distillation and the residue is dissolved in ethyl acetate. The solution is then mixed with an aqueous solution of sodium bicarbonate washed in water and then with water. The ethyl acetate solution is dried and concentrated and then with Petroleum ether was added, with H-Phe - \ / al-0Bu crystallizing out.
Ausbeute: 612 mg (96 %) Schmelzpunkt: 65 bis 67 0C ^ = -30,0 (C s 1,0 Methanol)Yield: 612 mg (96 %) Melting point: 65 to 67 0 C ^ = -30.0 (C s 1.0 methanol)
r -τ25
Der Schmelzpunkt und L-SJ η stimmen überein mit den Daten gemäßr -τ25
The melting point and L-SJ η agree with the data in FIG
Chem. Ber. 100, 160 (1967).Chem. Ber. 100, 160 (1967).
Beispiel 62Example 62
20 ml Kolthoff-Pufferlösung von pH 8,5 werden zu 409 mg (1,10 mmol) B0C-Tyr(Bzl)-0H und 303 mg (1,00 mmol) H-t/al-NHDMB.HCl20 ml Kolthoff buffer solution of pH 8.5 become 409 mg (1.10 mmol) BOC-Tyr (Bzl) -0H and 303 mg (1.00 mmol) H-t / al-NHDMB.HCl
709817/1113709817/1113
gegeben und dann gibt man noch 1,0 ml 1n NaOH zu dem Gemisch. Danach gibt man 100 mg Serinproteinase (Titer 100 χ 10 PUN/g; vertrieben durch Nagase Sangyo K.K.) unter Rühren bei 3B C zu dem Gemisch, ujobei das Ganze während 2k h zur Reaktion gebracht ujird. Der Gelniederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 0,5n HCl, 7^-igem Ammoniakuiasser und wiederum mit Wasser gewaschen* Man erhält 361 mg eines kristallinen Rohprodukts. Dieses u/ird in Methanol aufgelöst und die heiße Lösung wird mit Aktivkohle behandelt, um das Protein zu entfernen. Die Lösung ujird eingeengt und durch Zugabe von Wasser umkristallisiert. Man erhält reines BOC-Tyr(BzI)-UaI-NHDMB.and then another 1.0 ml of 1N NaOH is added to the mixture. Then 100 mg of serine proteinase (titer 100 10 PUN / g; sold by Nagase Sangyo KK) are added to the mixture with stirring at 3B C, and the whole is reacted for 2k h. The gel precipitate is filtered off and washed in sequence with water, 0.5N HCl, 7 ^ ammonia water and again with water. 361 mg of a crystalline crude product are obtained. This is dissolved in methanol and the hot solution is treated with activated charcoal to remove the protein. The solution is concentrated and recrystallized by adding water. Pure BOC-Tyr (BzI) -UaI-NHDMB is obtained.
Ausbeute: 297 mg (48 %) Schmelzpunkt: 165 bis 168 0CYield: 297 mg (48 %) Melting point: 165 to 168 ° C
^ = -0,8 ° (C = 0,25 Chloroform) Elementar-Analyse C HN^ = -0.8 ° (C = 0.25 chloroform) elemental analysis C HN
berechnet (%) 67,83 7,32 6,78 gefunden (%) 67,71 7,35 6,60calculated (%) 67.83 7.32 6.78 found (%) 67.71 7.35 6.60
20 ml Zitronensäurepufferlösung won pH 7,5 u/erden zu 518 mg (1,10 mmol) BOC-Val-Tyr(BzI)-0H und 517 mg (1,0 mmol) H-Val-His(Bzl)-0Bzl.2HCl gegeben, worauf man noch 2,0 ml 1n NaOH zu der Lösung gibt. Sodann wird das Ganze mit 100 mg Serinproteinase des Beispiels 62 unter Rühren bei 38 0C versetzt und das Ganze iuird noch mährend 2M- h zur Reaktion gebracht. Der erhaltene farblose Niederschlag iuird abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man erhält 620 mg rohe Kristalle. Das Produkt uiird in 300 ml heißem Methanol aufgelöst und die heiße Lösung wird mit Aktivkohle während 1 h behandelt, um das Protein zu entfernen. Sodann wird die Lösung eingeengt und der Rückstand wird mit Wasser versetzt, wobei man kristallines BOC-Wal-Tyr(Bzl)-Val-His(Bzl)-0H.H20 erhält.20 ml citric acid buffer solution obtained pH 7.5 u / earth to 518 mg (1.10 mmol) BOC-Val-Tyr (BzI) -0H and 517 mg (1.0 mmol) H-Val-His (Bzl) -0Bzl. 2HCl added, whereupon 2.0 ml of 1N NaOH are added to the solution. Then, the whole with 100 mg of serine in Example 62 was added with stirring at 38 0 C and the whole iuird still mährend 2M h reacted. The colorless precipitate obtained is filtered off and washed with water. 620 mg of crude crystals are obtained. The product is dissolved in 300 ml of hot methanol and the hot solution is treated with activated charcoal for 1 hour to remove the protein. The solution is then concentrated and water is added to the residue, crystalline BOC-Wal-Tyr (Bzl) -Val-His (Bzl) -0H.H 2 O being obtained.
Ausbeute: 450 mg (56 %) Yield: 450 mg (56 %)
Schmelzpunkt: 176 bis 180 0CMelting point: 176 to 180 ° C
709817/1113709817/1113
l = -6,6 ° (C = 0,5 Methanol) l = -6.6 ° (C = 0.5 methanol)
Elementar-AnalyseElemental analysis
CHNCHN
berechnet {%) 64,84 7,17 10,31 gefunden {%) 64,84 7,16 10,90calculated {%) 64.84 7.17 10.31 found {%) 64.84 7.16 10.90
7,5 ml Mclluaine-Pufferlösung yon pH 8,97 u/erden zu 282 mg (0,60 mmol) BOC-Val-Tyr(BzI)-0H und 345 mg (0,50 mmol) H-Val-His(Bzl)-Pro-Phe-0Et.2HCl, worauf man 1,2 ml 1n NaOH zu der Lösung gibt. Sodann gibt man 40 mg Serinproteinase unter Rühren bei 38 C zu dem Gemisch und das Ganze tuird während 24 h unter Rühren zur Reaktion gebracht. Der erhaltene Geldniederschlag u/ird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 0,5n HCl und wiederum mit Wasser geu/aschen. Man erhält 400 mg rohe Kristalle. Das Produkt ujird in heießm Äthanol aufgelöst und die Lösung uiird mit Aktiv/kohle behandelt, um das Protein zu entfernen. Sodann iuird die Lösung eingeengt und der Rückstand u/ird aus Äthylacetat umkristallisiert, wobei man BOC-Ual-Tyr (BzI )-\/al-His (Bzl)-Pro-Phe-OH.2H2O erhält.7.5 ml Mclluaine buffer solution of pH 8.97 and ground to 282 mg (0.60 mmol) BOC-Val-Tyr (BzI) -0H and 345 mg (0.50 mmol) H-Val-His (Bzl ) -Pro-Phe-0Et.2HCl, whereupon 1.2 ml of 1N NaOH are added to the solution. 40 mg of serine proteinase are then added to the mixture with stirring at 38 ° C. and the whole is reacted for 24 hours with stirring. The money precipitate obtained is filtered off and washed in sequence with water, 0.5N HCl and again with water. 400 mg of crude crystals are obtained. The product is dissolved in hot ethanol and the solution is treated with activated charcoal to remove the protein. The solution is then concentrated and the residue is recrystallized from ethyl acetate, BOC-Ual-Tyr (BzI) - \ / al-His (Bzl) -Pro-Phe-OH.2H 2 O being obtained.
Ausbeute: 334 <ng (62 %) Schmelzpunkt: 163 bis 168 0C P = -26,9 (C = 1,0 Ν,Ν-Dimethylformamid)Yield: 334 <ng (62 %) Melting point: 163 to 168 0 C P = -26.9 (C = 1.0 Ν, Ν-dimethylformamide)
EIementar-AnalyseElementary analysis
C HNC HN
berechnet (%) 64,66 7,11 10,40 gefunden {%) 64,87 6,80 10,52calculated (%) 64.66 7.11 10.40 found {%) 64.87 6.80 10.52
Das Verfahren des Beispiels 64 u/ird wiederholt, wobei man als Säurekomponente die N ^ -Acylaminosäure oder das N -Acyldipeptid und als Aminkomponente den Dipeptid-t-Butylester gemäß Tabelle 6 einsetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 ebenfalls zusammengestellt.The procedure of Example 64 is repeated using as The acid component is the N ^ -acylamino acid or the N -acyldipeptide and the dipeptide t-butyl ester as the amine component according to table 6. The results are also summarized in Table 6.
709817/1113709817/1113
Beispiel 71Example 71
In einen Kolben gibt man 280,2 mg (1 mmal) Z-GIn-OH und 368,5 mg (1 mmol) H-Phe-Phe-QBu zur Suspension in 10 ml Wasser. Sodann wird eine Glaselektrode eines pH-Meters in die Suspension getaucht. 150 mg Papain und 0,1 ml 2-Mercaptoäthanol werden unter Rühren zu der Suspension gegeben, u/obei der pH des Gemisches durch Zugabe v/on i/i0n NaOH auf etwa 5,0 eingestellt wird, um die Feststoffkomponenten aufzulösen. Die Mischung wird bei 38 C während 20 h gerührt und dabei zur Reaktion gebracht. Während der Reaktion wird der pH-Wert des Reaktionsgemisches durch Zugabe v/on i/i0n NaOH auf 5 bis 6 gehalten, wozu der pH-Wert der Reaktionsmischung mit dem pH-Meter laufend gemessen wird. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 1n HCl, Wasser, 7^-igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen und dann getrocknet. Das Produkt u/ird aus Äthylacetat umkristallisiert. Man erhält 510 mg des Produktes Z-Gln-Phe-Phe-OBu mit einem Schmelzpunkt v/on 197 bis 200 0C.280.2 mg (1 mmal) of Z-GIn-OH and 368.5 mg (1 mmol) of H-Phe-Phe-QBu are added to the suspension in 10 ml of water in a flask. A glass electrode of a pH meter is then immersed in the suspension. 150 mg papain and 0.1 ml 2-mercaptoethanol are added to the suspension with stirring, and the pH of the mixture is adjusted to about 5.0 by adding 1 / 10N NaOH in order to dissolve the solid components. The mixture is stirred at 38 ° C. for 20 hours and reacted in the process. During the reaction, the pH of the reaction mixture is kept at 5 to 6 by adding 1 / 10N NaOH, for which purpose the pH of the reaction mixture is continuously measured with the pH meter. The precipitate obtained is filtered off and washed in sequence with water, 1N HCl, water, 7 ^ ammonia water and again with water and then dried. The product is recrystallized from ethyl acetate. This gives 510 mg of the product Z-Gln-Phe-Phe-OBu having a melting point v / on 197-200 0 C.
Ausbeute: 80,8 % Yield: 80.8 %
(uCj D = -18,3 ° (C = 1,0 Ν,Ν-Dimethylformamid)(uCj D = -18.3 ° (C = 1.0 Ν, Ν-dimethylformamide)
Elementar-Analyse (^35^λ2°7Ν4^Elemental analysis (^ 35 ^ λ2 ° 7 Ν 4 ^
C HNC HN
berechnet {%) 66,65 6,71 8,80 gefunden {%) 66,51 6,71 8,74calculated {%) 66.65 6.71 8.80 found {%) 66.51 6.71 8.74
In einen Kolben gibt man 398,5 mg Z-Phe-l/al-OH und 320,4 mg H-Phe-l/al-0Bu zur Suspension in 10 ml Wasser. Eine Glaselektrode eines pH-Meters wird in die Suspension getaucht. 150 mg Papain und 0,1 ml 2-Mercaptoäthanol werden unter Rühren zu der Suspesion gegeben, wobei der pH des Gemisches auf etwa 4,5 bis 5,0 durch Zugabe v/on verdünnter Salzsäurelösung eingestellt wird und wobei die Feststoffkomponenten aufgelöst werden. Die erhaltene Mischung wird bei 38 0C während 20 h gerührt. Während der Reaktion wird der pH der Reaktionsmischung398.5 mg of Z-Phe-1 / al-OH and 320.4 mg of H-Phe-1 / al-0Bu are placed in a flask for suspension in 10 ml of water. A glass electrode of a pH meter is immersed in the suspension. 150 mg papain and 0.1 ml 2-mercaptoethanol are added to the suspension with stirring, the pH of the mixture being adjusted to about 4.5 to 5.0 by adding dilute hydrochloric acid solution and the solid components being dissolved. The mixture obtained is stirred at 38 ° C. for 20 h. During the reaction, the pH of the reaction mixture becomes
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durch Zugabe von verdünnter HCl-lösung zum Reaktionsgemisch auf 4,5 bis 5,0 gehalten. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 1n HCl, Wasser, 7^-igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen, und dann getrocknet. Das Produkt wird aus Äthylacetat/PetroläthBr umkristallisiert. Man erhält 30 mg (4,3 % Ausbeute) Z-Phe-Ual-Phe-Wal-OBu mit einem Schmelzpunkt von 130 bis 145 0C.kept at 4.5 to 5.0 by adding dilute HCl solution to the reaction mixture. The precipitate obtained is filtered off and washed in sequence with water, 1N HCl, water, 7 ^ ammonia water and again with water, and then dried. The product is recrystallized from ethyl acetate / petroleum ether. This gives 30 mg (4.3% yield) of Z-Phe-Phe-Ual-Wal-OBu having a melting point of 130-145 0 C.
In einen Kolben gibt man 398,5 mg (1 mmol) Z-Phe-Val-OH und 320,4mg (1 mmol) H-Phe-Ual-OBu , zur Suspension in 10 ml Wasser. Die Glaselektrode eines pH-Meters wird in die Suspension getaucht. Sodann gibt man 150 mg Serinproteinase unter Rühren zu der Suspension während der pH-Wert des Gemisches auf 7,5 bis 8,0 gehalten, indem man i/i0n NaOH-Lösung tropfBnu/eise zu der Lösung gibt. Dabei werden die Feststoffkomponenten aufgelöst. Das Gemisch wird bei 38 0C während 20 h gerührt. Während der Reaktion u/ird der pH-Wert des Gemisches durch Zugabe won 1/Ιθη NaOH auf 7,5 bis 8 Gehalten. Hierzu wird der pH-Wert des Gemisches laufend mit dem pH-Meter verfolgt. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 1n HCl, Wasser, 7^-igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen und dann getrocknet. Das Produkt wird aus Äthylacetat/Petroläther umkristallisiert. Man erhält 190 mg (Ausbeute 27,1 % ) des Produktes Z-Phe-V/al-Phe-Val-OBu mit einem Schmelzpunkt υοη 130 bis 145 C.398.5 mg (1 mmol) of Z-Phe-Val-OH and 320.4 mg (1 mmol) of H-Phe-Ual-OBu are placed in a flask for suspension in 10 ml of water. The glass electrode of a pH meter is immersed in the suspension. 150 mg of serine proteinase are then added to the suspension with stirring while the pH of the mixture is maintained at 7.5 to 8.0 by adding dropwise i / 10N NaOH solution to the solution. The solid components are thereby dissolved. The mixture is stirred at 38 ° C. for 20 h. During the reaction, the pH of the mixture is kept at 7.5 to 8 by adding 1 / Ιθη NaOH. For this purpose, the pH value of the mixture is continuously monitored with the pH meter. The precipitate obtained is filtered off and washed in sequence with water, 1N HCl, water, 7 ^ ammonia water and again with water and then dried. The product is recrystallized from ethyl acetate / petroleum ether. 190 mg (yield 27.1 % ) of the product Z-Phe-V / al-Phe-Val-OBu with a melting point of 130 to 145 ° C. are obtained.
In einen Kolben gibt man 471,5 mg (1 mmol) Z-Phe-Tyr-OH und 320,4 mg H-Phe-Val-OBu zur Suspension in 10 ml Wasser. Eine Glaselektrode eines pH-Meters uiird in die Suspension getaucht. 150 mg Serinproteinase u/erden unter Rühren zu der Suspension gegeben, während der pH des Gemisches auf 7,5 bis471.5 mg (1 mmol) of Z-Phe-Tyr-OH and 320.4 mg of H-Phe-Val-OBu for suspension in 10 ml of water. A glass electrode of a pH meter is immersed in the suspension. 150 mg serine proteinase and ground with stirring to the Suspension given while the pH of the mixture to 7.5 to
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8,0 eingestellt wird, indem man i/i0n NaQH zu der Mischung gibt. Die Feststoff komponenten u/erden aufgelöst. Das Gemisch wird bei 38 C während 20 h gerührt. Während der Reaktion wird der pH des Reaktionsgemisches durch Zugabe von 1/1O n NaOH zu dem Gemisch auf 7,5 bis 8,0 gehalten. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und der Reihe nach mit Wasser, 1 η HCl, Wasser, 7^-igem Ammoniakwasser und wiederum mit Wasser gewaschen und dann getrocknet. Sodann wird das Produkt aus Äthylacetat/Petroläther umkristallisiert. Man erhält 230 mg (Ausbeute 30 %) des Produktes Z-Phe-Tyr-Phe-VaI-OBu mit einem Schmelzpunkt von 155 C.8.0 is adjusted by adding 1 / 10N NaQH to the mixture. The solid components are dissolved. The mixture is stirred at 38 ° C. for 20 h. During the reaction, the pH of the reaction mixture is maintained at 7.5 to 8.0 by adding 1/10 N NaOH to the mixture. The precipitate obtained is filtered off and washed in sequence with water, 1 η HCl, water, 7 ^ ammonia water and again with water and then dried. The product is then recrystallized from ethyl acetate / petroleum ether. 230 mg (yield 30 %) of the product Z-Phe-Tyr-Phe-VaI-OBu with a melting point of 155 ° C. are obtained.
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