DE2630043A1

DE2630043A1 - Fructose determn. in aq. soln. contg. glucose - comprising pre-treatment with glucose-oxidase, catalase and/or peroxidase to destroy glucose and peroxide

Info

Publication number: DE2630043A1
Application number: DE19762630043
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Ing Grad Flemming; Remigius Fresenius; Juergen Mondani
Original assignee: Institut Fresenius Chemische und Biologische Laboratorien GmbH
Current assignee: Institut Fresenius GmbH
Priority date: 1976-07-03
Filing date: 1976-07-03
Publication date: 1978-01-05

Abstract

Quantitative determn. of fructose in glucose-contg. aq. soln. takes place by reaction with adenosine triphosphate under enzyme catalysis with carrier-bonded hexokinase, phosphoglucose-isomerase and glucose-6-phosphate-dehydrogenase and with a reducible eoenzyme. The glucose-contg. aq. fructose soln. is pre-treated with a carrier-bonded glucose-oxidase as well as carrier bonded catalyase and/or peroxidase, until (i) all glucose in fructose soln. and (ii) H2O2 formed in enzyme-catalysed reaction are destroyed. Fructose can be determined accurately by a simple, direct method.

Description

Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Method for the quantitative determination of

Fructose in qlucosehaltiqer wässriger Lösung Aus H.U. Berqmever "Methoden der enzmatischen Analyse", 3. Auf lage 1974, Seiten 156-159, Verlaq Chemie Weinheim, Band Ijist es bekannt, Fructose in qlucosehaltiger wässriqer Lösung nach der Hexokinase-Methode durch Differenzhestimmunq quantitativ zu hestimmen. Hierbei sind zwei Bestimmungen erforderlich, da hei dieser Methode Fructose nicht direkt quantitativ bestimmt worden kann. vielmehr muß bei einer Bestimmung durch Umsetzung der zuckerhaltigen Lösung mit Adenosintrinhosnhat (ATP) unter Katalvse mit Hexokinase (HK), Phosphoglucose-Isomerase (PGI) und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G-6-P-DH) der Gesamtgehalt von Fructose und Glucose und in einer zweiten Bestimmunq durch Weglassung der Phosohoglucose-Isomerase der Gehalt an Glucose alleine hestimmt werden. Durch nifferenzhildunq ergibt sich dann der Fructoseqehalt der Bestimmungslosunq. Bei heiden Bestimmungen wird ein Coenzvm, vorzuqsweise Nikotinamid-adenin-dinucleotid (NADP) zugesetzt, wohei die Extinktion der bei den Reaktionen qebildeten reduzierten Form des Coenzvms (NADPII) als Meßgrößle dient. Die in diesen Bestimmungen auftretenden Reaktionen sind folgende: 1) Glucose + ATP Glucose-6-phosphat + ADP 2) Fructose + ATP Fructose-6-nhosphat + ADP 3) Fructose-6-nho-qphat clucose-6-phosphat 4) Glucose-6-nhosnhat + NADP 6-Phosphogluconolacton + NAPPH H+ Eine solche Differenzbestimmung nach der Hexokinaqe-Methode ergibt jedoch ungenaue Brgohnisse für die Fructose und ist relativ umständlich, da für jede Analvse zwei getrennte Bestimmungen und eine Differenz/rechnung erfordelich sind.Fructose in high-quality aqueous solution From HU Berqmever "Methods of Enzmatic Analysis", 3rd edition 1974, pages 156-159, Verlaq Chemie Weinheim, Volume Ij is known to quantitatively measure fructose in high-quality aqueous solution by the hexokinase method by differential immunity . Two determinations are necessary here, since fructose cannot be directly quantified with this method. rather, the total amount of fructose must be determined by reaction of the sugar-containing solution with adenosine trinhosphate (ATP) under catalysis with hexokinase (HK), phosphoglucose isomerase (PGI) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G-6-P-DH) and glucose and in a second determination by omitting the phosphoglucose isomerase the content of glucose alone can be determined. The fructose content of the determination solution then results from the difference. In both determinations, a coenzyme, preferably nicotinamide adenine dinucleotide (NADP), is added, whereby the extinction of the reduced form of the coenzyme (NADPII) formed in the reactions serves as the measured variable. The reactions occurring in these determinations are as follows: 1) Glucose + ATP Glucose-6-phosphate + ADP 2) fructose + ATP Fructose-6-nhosphate + ADP 3) Fructose-6-nho-qphat clucose-6-phosphate 4) glucose-6-nhosnhat + NADP 6-Phosphogluconolactone + NAPPH H + Such a difference determination according to the Hexokinaqe method, however, gives imprecise Brgohnisse for the fructose and is relatively cumbersome, since two separate determinations and a difference / calculation are required for each analysis.

Außerdem können ungenaue Ergebnisse durch eine unterschiedliche Glucose-6-phosphat-Dehvdrogenase-Reinheit in Bezug auf die Phosphoglucose-Isomerase-Aktivität, die von Charge zu Charge variieren kann, auftreten.In addition, inaccurate results can be caused by a different glucose-6-phosphate dehydrogenase purity in terms of phosphoglucose isomerase activity, which vary from batch to batch can occur.

Eine Direktbestimmung von Frucrose in glucosehaltigen wäserigen Lösungen ist ehenfalls hereits aus "Methode der enzvmatischen Analyse", Seite 601-606, mit Hilfe von Sorhit-Dehvdreogenase (TDH) bekannt. Diese Methode ist aber nur begrenzt verwendbar, da ihre Spezifität qering ist und die Sorbit-Dehydrogenase auch die Reaktion von NAD mit einer Reihe anderer Zucker katalysiert, so daß diese Methode beispielsweise in der Lebensmittelchemie nich einsetzbar ist. Außerdem ist Sorbit-Dehydrogenase ein relativ teures Enzym, was die Anwendbarkeit dieser Methode weiterhin begrenzt. Schließlich sind die nach der Sorbit-Dehydrogenase-Methode erhaltenen Werte nicht direkt vergleichbar mit den nach der ilexokinasemethode erhalten en Werten so daß in Fallen, wo die Fructose nach der ersteren methode und die Glucose nach der letzteren Methode bestimmut wird, das Mengenverhältnis der beiden Zucker zueinander nicht genau ermittelt werden kann.A direct determination of frucrose in glucose-containing aqueous solutions is also here from "Method of Enzvmatic Analysis", pages 601-606 Known help of Sorhit-Dehvdreogenase (TDH). However, this method is only limited usable there their specificity is qering and sorbitol dehydrogenase also catalyzes the reaction of NAD with a number of other sugars, making this one Method cannot be used, for example, in food chemistry. Also is Sorbitol dehydrogenase is a relatively expensive enzyme, making this method useful still limited. Finally, those obtained by the sorbitol dehydrogenase method Values not directly comparable with those obtained using the ilexokinase method Values so that in cases where the fructose according to the former method and the glucose the latter method determines the proportion of the two sugars cannot be precisely determined with respect to one another.

Die der Erfindung; zugrundeliegende Aufgabe bestand somit darin, eine möglichst genaue und einfache Direktbestimmung von Fructose zu bekomrien, die möglichst große Spezifität und damit breite Anwendbarkeit hat und deren Werte mit der weit verbreiteten Hexokinase-Methode zur Bestimmung von Glucose vergleichbar sind.That of the invention; The underlying task was therefore to create a as precise and simple direct determination of fructose as possible to get the most has great specificity and thus broad applicability and its values with the far common hexokinase method for the determination of glucose are comparable.

Das erfindungsgemaße Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Fructose in glucosehaltiger wässriger Lösung durch Umsetzung mit Adenosin-triphosphat unter Enzymkatalyse mit trägergebundener Hexokinase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und mit Hilfe eines reduzierharen Coenzvms ist dadurch gekennzeichnet, daß man die glucosehaltige wässrige Fructoselösung zuvor mit trägergebundener Glucoseoxidase sowie mit trägergebundener Katalase und/oder Peroxidase behandelt, bis die gesamte in der Fructoselösung enthaltene Glucose und das bei der enzymkatalvsiearten Reaktion gebildete fasserstoffperoxid zerstört sind.The method according to the invention for the quantitative determination of fructose in glucose-containing aqueous solution by reaction with adenosine triphosphate Enzyme catalysis with carrier-bound hexokinase, phosphoglucose isomerase and glucose-6-phosphate dehydrogenase and with the aid of a reducible coenzyme is characterized in that the Glucose-containing aqueous fructose solution beforehand with carrier-bound glucose oxidase as well as treated with carrier-bound catalase and / or peroxidase, until all of the glucose contained in the fructose solution and that in the case of the enzyme catalogs The hydrogen peroxide formed in the reaction is destroyed.

Die Peaktion der Glucose mit der trägergebundenen Glucoseoxidase (GOD) Läßt sich durch folgende Peaktionsgleichung wiedergeben: 5) Glucose + H2O + O2 D-Glucose-#-lacton + H2O2 Da das in dieser Reaktion gebildete Wasserstoffperoxid stören wird, wird dieses ehenfalls durch Enzfrzkatalyse zerstört.The reaction of glucose with the carrier-bound glucose oxidase (GOD) can be represented by the following reaction equation: 5) Glucose + H2O + O2 D-glucose - # - lactone + H2O2 Since the hydrogen peroxide formed in this reaction will interfere, it will inevitably be destroyed by enzyme catalysis.

13ei Verwendung des Enzyms Peroxidase (POD) für diesen Zweck ist ein Wasserstoffdonator mit zu verwenden, wie heispielsweise Ascorbinsäure, Resorcin, Hydrochinon oder vorzugsweise Harnsäure. Die Umsetzung verläuft dabei folgendermaßen: 6) Wasserstoffdonator + oxidierter Donator +2 1120 Verwendet man für die Wasserstoffperoxidzerstörung Katalase, so verläuft die Reaktion nach folgender Reaktionsgleichung: 7) 2H2O2 2 H2 + O2 Bei dieser Reaktion bildet sich also Sauerstoff, der das Gleichgewicht der Reaktionsgleichung 5) nach rechts verschiebt und so die Glucosezerstörung begünstigt.If the enzyme peroxidase (POD) is used for this purpose, a hydrogen donor such as ascorbic acid, resorcinol, hydroquinone or preferably uric acid must also be used. The reaction proceeds as follows: 6) Hydrogen donor + oxidized donor +2 1120 If catalase is used to destroy hydrogen peroxide, the reaction proceeds according to the following reaction equation: 7) 2H2O2 2 H2 + O2 In this reaction, oxygen is formed, which shifts the equilibrium of reaction equation 5) to the right and thus promotes the destruction of glucose.

Die trägergebundene Katalase und trägergebundens Peroxidase können auch in Kombination miteinander verwendet werden. Auch ist es möglich, der Säule mit tragergebundener Glucoseoxidase eine Säule mit trägergebundener Katalase vorzugschalten und eine waiserstoffperoxidhaltige Durchflußlösung zu verwenden, die bei dem Durchgang durch die vorgeschaltete Katalasesäule mit Sauerstoff angereichert wird, so daß im nachfolgenden Durchgang durch eine Säule mit trigergebundener Glucoseoxidase und Peroxidase das Gleichgewicht der Reaktionsgleichung 5) nach rechts verschoben und restliches, sowie gebildetes Wasserstoffperoxid zerstört wird.The carrier-bound catalase and the carrier-bound peroxidase can can also be used in combination with one another. It is also possible to use the pillar with carrier-bound glucose oxidase upstream a column with carrier-bound catalase and to use a flow-through solution containing hydrogen peroxide added to the passage is enriched with oxygen by the upstream catalase column, so that in the subsequent passage through a column with triger-bound glucose oxidase and peroxidase shifted the equilibrium of reaction equation 5) to the right and the remaining and formed hydrogen peroxide is destroyed.

Die wasserstoffperoxidzerstörenden trägergebundenen Enzyme, inshesondere die Peroxidase, können der trägergabundenen Glucoseoxidase nachgeschaltet werden, doch ist es aus verschiedenen Gründen, insbesondere auch aus apparativen Gründen zweckmäßig, Glucoseoxidase sowie Katalase und/oder Peroxidase in einer Spule int Gemisch miteinander zu binden. Dies trifft insbesondere fïr die Kombination Glucoseoxidase/Katalase zu, da dann, wenn die Katalase der Glucoseoxidase nachgeschaltet ist, der durch die Katalase gebildete Sauerstoff das Gleichgewicht der Reaktion 5) nicht mehr beeinflussen kann.The hydrogen peroxide-destroying carrier-bound enzymes, in particular the peroxidase can be followed by the glucose oxidase attached to the carrier, but it is for various reasons, in particular for reasons of apparatus expediently, glucose oxidase and catalase and / or peroxidase in one coil int To bind mixture together. This applies in particular to the combination of glucose oxidase / catalase to, because when the catalase is connected downstream of the glucose oxidase, the through the oxygen produced by the catalase no longer affects the equilibrium of reaction 5) can.

Da in vielen zu bestimmenden Lösungen die Glucose als α -Glucose vorliegt, deren Umsetzung zu D-Glucono--' -lacton von Glucoseoxidase nicht katalysiert wird, ist es in solchen Fällen erforderlich oder zweckmäßig, vor oder während der Behandlung mit Glucoseoxidase die glucosehaltige wässrige Fructoselösung mit trägergebundener Mutarotase zu behandeln, bis die gesamte Ck -Glucose in ß-Glucose überführt ist Die gebildete ß-Glucose kann dann nach der Reaktionsgleichung 5) unter Enzyrrikatalyse mit Glucoseoxidase zu D-Gluco-α-lacton umgesetzt werden.Since in many solutions to be determined the glucose is called α-glucose is present, the conversion of which to D-glucono-- '-lactone is not catalyzed by glucose oxidase it is necessary or appropriate in such cases, before or during the Treatment with glucose oxidase the glucose-containing aqueous fructose solution with carrier-bound Treat mutarotase until all of the Ck -glucose is converted into ß-glucose The ß-glucose formed can then according to reaction equation 5) with enzyme catalysis be converted with glucose oxidase to D-gluco-α-lactone.

Die trägergebundene Mutarotase kann der trägergebundenen Glucoseoxidase vorgeschaltet werden, doch ist es aus Gründen der apparativen Einfachheit wiederum heovrzugt, Glucoseoxidase mit Mutarotase in einer Säule im Gemisch miteinander unterzubringen. Am zweckmäßigsten ist es also, in einer Säule zusammen Glucoseoxidase, Mutarotase, sowie Peroxidase und/oder Katalase auf ein und demselben Träger zu fixieren. Dieser säule wird dann eine zweite Säule mit trägergebundenen Lnzymen nachgeschaltet, und in dieser zweiten Säule laufen dann die obigen Reaktionen 2)-4) ab. Die Enzvme Hexokinase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase können in dieser Reihenfolge in Einzelsäulen hintereinander geschaltet werden, doch ist es wiederum aus apparativen Gründen bevorzugt, diese drei Enzyme im Gemisch miteinander auf einem Träger zu fixieren und in einer Säule unterzubringen.The carrier-bound mutarotase can be the carrier-bound glucose oxidase are connected upstream, but it is again for reasons of simplicity of the apparatus It is preferable to mix glucose oxidase with mutarotase in a column. It is therefore most useful to put glucose oxidase, mutarotase, and to fix peroxidase and / or catalase on one and the same carrier. This column is then followed by a second column with carrier-bound enzymes, and The above reactions 2) -4) then take place in this second column. The enzyme hexokinase, Phosphoglucose isomerase and glucose-6-phosphate dehydrogenase can be used in this order can be connected in series in individual columns, but it is again made up of apparatus Reasons preferred to use these three enzymes in admixture with one another on a carrier fix and place in a column.

Die durch die oben geschilderten Säulen mit trägerfixierten Enzymen geschickte Reagenzlösung enthält Adenosintriphosphat (ATP), welches durch Katalyse mit Ilexokinase (HK) in Adenosindiphosphat (ADP)übrführt wird, Nikotinamid-adenin-dinucleotid (NADP) zur Bildung der Meßgröße T;ADPEI, sowie übliche Puffer zur Einstellung des optimalen pH-Wertes, wie Phosphatpuffer, (oder Triaethanolaminpuffer) und zweckmäßig ein Aktivierungsmittel für die Hexokinase, wie Magnesiumsulfat. Dies! Reagenzlösung wird vor der ersten Säule mit trägergebundenem Enzym die Lösung mit den zu bestimmenden Zuckern zugesetzt, und nach dem Durchgang durch die letzte Säule wird auf übliche Weise die Extinktion für NADPH in einer Küvette mit einem Spektralphotometer oder dergleichen gemessen.The by the columns described above with carrier-fixed enzymes clever reagent solution contains adenosine triphosphate (ATP), which by catalysis is converted into adenosine diphosphate (ADP) with ilexokinase (HK), nicotinamide adenine dinucleotide (NADP) for the formation of the measured variable T; ADPEI, as well as the usual buffers for setting the optimal pH, such as phosphate buffer, (or triethanolamine buffer) and appropriate an activating agent for the hexokinase such as magnesium sulfate. This! Reagent solution the solution with the to be determined is in front of the first column with the enzyme bound to the carrier Sugars are added, and after passing through the last column it is on usual Way the absorbance for NADPH in a cuvette with a spectrophotometer or like measured.

Die Zeichnung zeigt in schematischer Darstellung eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. In dem Vorratsbehälter 1 befindet sich die wässrige Reagenzlösung mit ADP, NADP, Magnesiumsulfat und Puffer.0ber die Leitung 2 wird die Reagenzlösung mit Hilfe der Pumpe 3 an dem Eingabekopf 4 vorheigefAhrt, huber welchen die glucosehaltige und fructosehaltige Bestimmungslösung in die Reagenzlösung einogefUhrt wird. Diese kombinierte wässrige Lösung geht dann durch die Säule 5, die auf einem Träger gebundeneGlucoseoxidase, Mutarotase sowie Peroxidase und/oder Katalase enthält.The drawing shows a device in a schematic representation for carrying out the method according to the invention. In the storage container 1 is located the aqueous reagent solution with ADP, NADP, magnesium sulfate and buffer In line 2, the reagent solution is fed to the input head 4 with the aid of the pump 3, over which the glucose-containing and fructose-containing determination solution into the reagent solution is introduced. This combined aqueous solution then goes through column 5, the glucose oxidase, mutarotase and peroxidase bound on a carrier and / or Contains catalase.

Nach dem Durchgang durch die Säule 5, in der die gesamte Glucose in D-lucono-& -lacton überführt und das dabei gebildete Wasserstoffperoxid zerstört wird, gelangt die Lösung durch die Säule 6, die auf einem Träger gebunden die Enzyme Hexokinase, Phospho-glucose-Isomerase und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase enthält. In dieser Säule laufen die Reaktionen 2)-4) ab. Nach dem Durchgang durch die Säule 6 gelangt die Lösung in die Küvette 7, wo die iJADPH-Extinktion bestimmt wird. Von der Küvette 7 aus verläßt die Lösung die Apparatur über die Leitung 8 und wird dann weggeworfen.After passing through column 5, in which all of the glucose is in D-lucono- & -lacton transferred and the thereby formed Hydrogen peroxide is destroyed, the solution passes through the column 6, which is bound on a support the enzymes hexokinase, phospho-glucose isomerase and glucose-6-phosphate dehydrogenase contains. The reactions 2) -4) take place in this column. After going through the column 6, the solution enters the cuvette 7, where the iJADPH absorbance is determined will. The solution leaves the apparatus from the cuvette 7 via the line 8 and then thrown away.

Eine geeignete Reagenzlösung in dem Vorratsbehälter 1 hat etwa folgende Zusammensetzung: auf 1000 ml 0,3 M TriNthanolamin 11 mM MgS04 0,16 mM NADP 0,29 mM ATP 1 g NaN3 LeerseiteA suitable reagent solution in the reservoir 1 is as follows Composition: on 1000 ml of 0.3 M triethanolamine 11 mM MgSO4 0.16 mM NADP 0.29 mM ATP 1 g NaN3 Blank page

Claims

P a t e n t a n s p r ii c h e 1. Method for quantitative determination of fructose in glucose-containing aqueous solution through conversion with adenosine triphosphate under enzyme catalogs with carrier-bound hexokinase, phosphoglucose isomarase and Glucose-6-phosphate-Drhydrogenase and with the help of a reducible to Coanzyms, thereby characterized in that the glucose-containing aqueous fructose solution previously with carrier-bound Glucose oxidase, as well as trigger-bound catalase and / or peroxidase, up to all of the glucose contained in the pructose solution and that in the enzyme catalyzed Hydrogen peroxide formed in the reaction are destroyed.

2. Varfahren according to claim 1, characterized in that one before or the glucose-containing aqueous fructose solution during the treatment with glucose oxidase Treated with carrier-bound mutarotase until the entire α-glucose is converted into ß-glucose is convicted.