DE2612725C3 - Method and reagent for the determination of cholesterol - Google Patents
Method and reagent for the determination of cholesterolInfo
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Description
p-Aminophenazonp-aminophenazone
Phenolphenol
Pufferbuffer
oberfiächenaktives Mittelsurface-active agent
gekennzeichnet durch einen Gehalt von wenigstens einem Alkanol mit 1 bis 4 C-Atomen.characterized by a content of at least one alkanol with 1 to 4 carbon atoms.
5. Reagenz nach Anspruch 4, bestehend aus5. Reagent according to claim 4, consisting of
0,05 bis 5 U Cholesterin-Oxidase0.05 to 5 U cholesterol oxidase
0,2 bis 2 U Cholesterinesterase0.2 to 2 U cholesterol esterase
0,03 bis 3 U Peroxidase0.03 to 3 U peroxidase
0,5 bis 3 mM p-Aminophenazon0.5 to 3 mM p-aminophenazone
2 bis 15 mM Phenol2 to 15 mM phenol
0,05 bis 1 % oberflächenaktives Mittel0.05 to 1% surfactant
0,2 bis 1,0 M Phosphatpuffer pH 7 bis 80.2 to 1.0 M phosphate buffer pH 7 to 8
gekennzeichnet durch 2 bis 10 Volumen-% Methanol. characterized by 2 to 10% by volume of methanol.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Cholesterin und ein Reagenz zur Durchführung dieses Verfahrens.The invention relates to a method for the enzymatic determination of cholesterol and a reagent for Implementation of this procedure.
Die enzymatische Bestimmung des Cholesterins mit Hilfe von Cholesterin-Oxidase ist bekannt. Hierbei wird das Cholesterin mit Sauerstoff in Gegenwart der Oxidase zu Cholestenon und H2O2 oxidiert. Die Reaktionsprodukte lassen sich dann nach verschiedenen Methoden bestimmen.The enzymatic determination of cholesterol with the aid of cholesterol oxidase is known. Here is the cholesterol is oxidized with oxygen in the presence of the oxidase to cholestenone and H2O2. the Reaction products can then be determined using various methods.
Eine bekannte Methode zur Bestimmung von H2O2 besteht in der oxidativen Kupplung mit p-Amino-phenazon und Phenol und in Gegenwart von Peroxidase (Ann. Clin. Biocliem. 6 (1969) 24). Bei dieser Reaktion wird ein Chromogen gebildet mit einem Absorptionsmaximum bei 500 nm, welches sich leicht mit einem Photometer quantitativ bestimmen läßtA well-known method for the determination of H2O2 consists in the oxidative coupling with p-aminophenazone and phenol and in the presence of peroxidase (Ann. Clin. Biocliem. 6 (1969) 24). This reaction becomes a Chromogen formed with an absorption maximum at 500 nm, which can be easily seen with a photometer can be determined quantitatively
Es ist bekannt, diese HjOj-Bestimmungsmethode auch im Rahmen der Cholesterin-Bestimmung mit Ch.olcsterin-Oxidase anzuwenden (Clin. Chem. 20, 470 bis 476 [1974]). Diese Methode erlaubt eine Bestimmung des Cholesterins mit einfachen Mitteln. Es wurde jedoch festgestellt, daß in vielen Fällen bei diesem Verfahren £'*.irka Abweichungen Suftrute?· di** °uf der Bi'd11"" einer Trübung beruhen. Es erwies sich zwar als möglich, in sehr vielen Fällen die durch die Trübung, die mit blcßem Auge zumeist nicht feststeilbar ist, hervorgerufenen Fehler zu beseitigen, indem gegen einen Probenleerwert gemessen wurde. Bei einem gewissen %-Satz der untersuchten Seren traten jedoch Trübungen auf, die auch durch einen Probenleerwert nicht eliminiert werden konnten, so daß das Verfahren hierbei völlig versagte. Der Grund hierfür lag in unterschiedlichen Trübungen in Probe und Probenleerwert, so daß stets zu hohe Cholesterinwerte erhalten werden.It is known that this HjOj determination method can also be used in the context of cholesterol determination with Cholcsterol oxidase (Clin. Chem. 20, 470 to 476 [1974]). This method allows a determination of the cholesterol with simple means. However, it was found that in many cases this method £ * .irk 'a deviation Suftrute? · Di ** ° n the Bi'd 11 "" based turbidity. It has been shown to be possible in many cases to eliminate the errors caused by the turbidity, which is usually not discernible with the naked eye, by measuring against a sample blank value. With a certain percentage of the sera examined, however, turbidity occurred which could not be eliminated even by a sample blank, so that the method here completely failed. The reason for this was the different turbidity in the sample and the sample blank, so that the cholesterol values obtained were always too high.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, diesen Mangel des oben beschriebenen Verfahrens zu beseitigen. The invention is based on the object of eliminating this deficiency of the method described above.
Die Lösung dieser Aufgbe gelingt erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin mit Cholesterin-Oxidase und Cholesterinesterase in Gegenwart von Peroxidase, p-Aminophenazon, einem oberflächenaktiven Mittel und Phenol, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß dem Bestimmungsansatz wenigstens ein Alkanol mit 1 bis 4 C-Atomen zugesetzt wird. Bevorzugt wird Methanol verwendet. Aber auch Äthanol, Propanol, Isopropanol und die Butanole können verwendet werden.This object is achieved according to the invention by a method for determining cholesterol with cholesterol oxidase and cholesterol esterase in the presence of peroxidase, p-aminophenazone, a surfactants and phenol, which is characterized in that the determination approach at least an alkanol with 1 to 4 carbon atoms is added. Methanol is preferably used. But also Ethanol, propanol, isopropanol, and the butanols can be used.
Die Höhe des Alkanoizusatzes variiert, je nach den zu berücksichtigenden Gegebenheiten. Stets zuverlässige Ergebnisse werden bei einem Zusatz von 2 bis 10 Volum-% Alkanol, bezogen auf das Gesamtvolumen des Testansatzes, erzielt. Besonders bevorzugt werden dabei 7 bis 8% Methanol bzw. 4 bis 6% der höheren Alkenole eingesetztThe amount of alkanoi added varies, depending on the factors to be taken into account. Always reliable results are achieved with an addition of 2 to 10 Volume% alkanol, based on the total volume of the test mixture, achieved. Are particularly preferred 7 to 8% methanol or 4 to 6% of the higher alkenols are used
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, bei der Cholesterin-Bestimmung in der Regel auf den Probenleerwert völlig zu verzichten. Bei denjenigen Fällen, in denen bisher die Trübungen so stark waren, daß die Bestimmung überhaupt nicht durchgeführt werden konnte, werden erfindungsgemäß zuverlässige Ergebnisse erhalten, wenn ein Probenleerwert mitgeführt wird.The method according to the invention makes it possible to generally use the To do without sample blank completely. In those cases in which the opacities have been so strong up to now, that the determination could not be carried out at all becomes reliable according to the invention Results obtained when a sample blank is included.
Das Verfahren der Erfindung ist sowohl zur Bestimmung von freiem als auch von gebundenem (verestertem) Cholesterin anwendbar.The method of the invention is for the determination of both free and bound (Esterified) cholesterol applicable.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zur Durchführung der Bestimmung von Cholesterin. Ein derartiges Reagenz enthält Cholesterin-Oxidase und Cholesterinesterase sowie Peroxidase, p-Aminophenazon, Phenol, Puffer, oberflächenaktives Mittel und ist erfindungsgemäß gekennzeichnet durch einen Gehalt von wenigstens einem Alkanol mit 1 bis 4 C-Atomen.Another object of the invention is a reagent for carrying out the determination of Cholesterol. Such a reagent contains cholesterol oxidase and cholesterol esterase as well as peroxidase, p-aminophenazone, phenol, buffer, surfactant and is characterized according to the invention by a content of at least one alkanol with 1 to 4 carbon atoms.
0,05 bis 5 U Cholesterin-Oxidase0.05 to 5 U cholesterol oxidase
0,2 bis 2 U Cholesterinesterase0.2 to 2 U cholesterol esterase
0,03 bis 3 U Peroxidase0.03 to 3 U peroxidase
0,5 bis 3 mM p-Aminophenazon0.5 to 3 mM p-aminophenazone
2 bis 15 mM Phenol2 to 15 mM phenol
0,05 bis 1% oberflächenaktives Mittel0.05 to 1% surfactant
und ist gekennzeichnet durch 2 bis 10 Volumen-% Methanol.and is characterized by 2 to 10% by volume of methanol.
2 bis 5 ml des obigen Reagenz reichen uus für eine Bestimmung inklusive Probenleerwert. Für größere Ansätze werden entsprechende Vielfache verwendet.2 to 5 ml of the above reagent may be enough for one Determination including sample blank. Corresponding multiples are used for larger batches.
Zur Durchführung des Verfahrens wird das erfindungsgemäße Reagenz mit Ausnahme der Chlolesterin-Oxidase mit der zu untersuchenden Probe versetzt, soWith the exception of cholesterol oxidase, the reagent according to the invention is used to carry out the method mixed with the sample to be examined, see above
daß sich ein Gesamtvolumen zwischen 2 und 3 ml ergibt und dann in einem Photometer die Extinktion in einem geeigneten Bereich, beispielsweise bei 546 nm bestimmt Danach wird die Cholesterin-Oxidase zugesetzt und nach einer bestimmten Zeit die Extinktionsdifferenz bestimmt, welche ein Maß für die im Serum vorhandene Cholesterinmenge istthat there is a total volume between 2 and 3 ml and then the absorbance in a photometer in one suitable range, for example determined at 546 nm. The cholesterol oxidase is then added and after a certain time the difference in absorbance is determined, which is a measure of that present in the serum Amount of cholesterol is
Zu 5 ml 0,5 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,5, der 0,2% Hydroxypolyäthoxy-dodecan als oberflächenaktives Mittel, 7,5% Methanol, 10 mM Phenol und 1 mM 4-Aminophenazon enthält, werden 0,05 ml eines lipaemischen Serums sowie 0,02 ml (= 1 U) Cholesterinesteraselösung und 0,02 ml (2 U) Peroxidase gegeben. Es wird nun die Probe geteilt, und zu der einen Hälfte der Lösung (24 ml) werden 0,02 ml Cholesterinoxidase-Lösung (- 2 U) hinzugefügtTo 5 ml of 0.5 M potassium phosphate buffer pH 7.5, the 0.2% hydroxypolyethoxy-dodecane as surface-active Medium, 7.5% methanol, 10mM phenol and 1mM Contains 4-aminophenazone, 0.05 ml of a lipemic Serum and 0.02 ml (= 1 U) cholesterol esterase solution and 0.02 ml (2 U) peroxidase were given. It the sample is now divided, and 0.02 ml of cholesterol oxidase solution is added to one half of the solution (24 ml) (- 2 U) added
Nach Inkubation der beiden Lösungen (mit und ohne Cholesterinoxidase) bei 37° C für 15 min bzw. bei Raumtemperatur für 30 min. wird die Lösung mit Cholesterinoxidase gegen die ohne Cholesterinoxidase bei 546 nm gemessen. Die dabei gemessene Extinktionsdifferenz ist ein Maß für die im Serum vorhandene Cholesterin-Konzentration, die durch Bezug auf einen mitgeführten Cholesterin-Standard berechnet wird.After incubation of the two solutions (with and without cholesterol oxidase) at 37 ° C for 15 min or at The solution with cholesterol oxidase is set against that without cholesterol oxidase at room temperature for 30 min measured at 546 nm. The absorbance difference measured is a measure of that present in the serum Cholesterol concentration calculated by reference to a cholesterol standard carried along.
Der Cholesteringehalt für eine typische Probe ergab 367 mg Cholesterin/100 ml, die Vergleichsbestimmung mit der Katalase-Methode (Z. f. Klin. Chem. Klin. Biochem. 12,403-407/1974)369 mgCholesterin/100 mLThe cholesterol content for a typical sample was 367 mg cholesterol / 100 ml, the comparative determination with the catalase method (Z. f. Klin. Chem. Klin. Biochem. 12.403-407 / 1974) 369 mg cholesterol / 100 mL
Wird dieser Versuch jedoch in Abwesenheit von Methanol durchgeführt, so entsteht eine Trübung, die die Messung der Extinktion bei 546 nm — und damit die Bestimmung der Cholesterin-Konzentration — unmöglich machtHowever, if this experiment is carried out in the absence of methanol, a turbidity occurs which the measurement of the extinction at 546 nm - and thus the determination of the cholesterol concentration - impossible power
ίο Zu 2 ml 0,5 M Kaliumphosphatpuffer pH 7A der 0,2% Hydroxypolyäthoxy-dodecan, 7,5% Methanol, 1OmM Phenol und 1 mM 4-Aminophenazon enthält, werden 0,02 ml Serum sowie 0,02 ml (= 1 U) Cholesterinesterase, 0,02 ml (2 U) Peroxidase sowie 0,02 ml (= 0,2 U) Cholesterinoxidase-Lösung gegeben. Nach Inkubation bei 37° C für 15 min. bzw. bei Raumtemperatur für 30 min. wird diese Lösung bei 546 nm gegen einen Reagentien-Leerwert (d.h, anstatt Probe wird Wasser in den Bestimmungsansatz eingesetz) gemessen. Der Cholesteringehalt der serumhaltigen Probe wird unter Bezug auf einen mitgeführten Cholesterin-Standard ermitteltίο To 2 ml of 0.5 M potassium phosphate buffer pH 7A of 0.2% Hydroxypolyethoxydodecane, 7.5% methanol, 10mM Contains phenol and 1 mM 4-aminophenazone, 0.02 ml of serum and 0.02 ml (= 1 U) of cholesterol esterase, 0.02 ml (2 U) peroxidase and 0.02 ml (= 0.2 U) cholesterol oxidase solution are given. After incubation at 37 ° C. for 15 min. or at room temperature for 30 min., this solution is at 546 nm against a Reagent blank value (i.e. water is used in the determination mixture instead of sample). Of the The cholesterol content of the serum-containing sample is determined with reference to a cholesterol standard carried along determined
Der Cholesteringehalt für eine typische Probe ergab 253 mg Cholesterin/100 ml, die Vergleichsbestimmung mit der Katalase-Methode 251 mg Cholesterin/100 ml. Wird dieser Versuch jedoch in Abwesenheit von Methanol durchgeführt, so werden um 15% höhere Cholesterinwerte gefunden.The cholesterol content for a typical sample was 253 mg cholesterol / 100 ml, the comparative determination with the catalase method 251 mg cholesterol / 100 ml. However, this experiment is carried out in the absence of If methanol is carried out, cholesterol levels are found to be 15% higher.
Claims (4)
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