DE2560547C2

DE2560547C2 - Method for isolating substances with insulin-like activity from blood or blood components of calves or pigs

Info

Publication number: DE2560547C2
Application number: DE2560547A
Authority: DE
Inventors: Hellmuth Dr. 8000 München Mittenzwei; Klaus Dr. 4000 Düsseldorf Pöhler; Adolf Prof. Dipl.-Chem. Dr. Wacker; Dörthe Dr. 6078 Neu-Isenburg Wacker
Original assignee: Solco Basel AG
Current assignee: ICN Switzerland AG
Priority date: 1975-12-24
Filing date: 1975-12-24
Publication date: 1986-03-13

Description

Es ist bekannt, daß bestimmte aus dem Blut warmblütiger Tiere gewonnene Substanzen neben anderen Wirkungen, wie einer atmungsstimulierenden Wirkung und einer wachstumsfördernden Wirkung, auch über eine gewisse insulinähnliche Wirksamkeit verfügen. Eine solche insulinähnliche Wirksamkeit, die durch Insulinantikörper nur geringfügig hemmbar ist, besitzt beispielsweise das in Arzneimittel Forschung 18, 1019 (1968) beschriebene Produkt, das gemäß DE-PS 10 76 888 aus dem Blut oder auch aus Blutbestandteilen vorbehandelter Kälber (oder gemäß DE-PS 10 17 744 auch Schweine) mit hoher RES-Aktivität hergestellt und in konfektionierter Form als Arzneimittel angewandt wird. Es ist ferner bekannt, daß sich durch wiederholte chromatographische Anreicherungsverfahren aus Kälberserum gereinigte wachstumsstimulierende Fraktionen gewinnen Lassen, die ebenfalls über eine durch Insulinantikörper praktisch nicht hemmbare insulinähnliche Wirksamkeit verfügen, und hierzu wird beispielsweise auf J. Cell. Physiol. 79,319 (1972) verwiesen. Gemäß Biochim. Biophys. Acta 121, 349 (1966) lassen sich aus der Proteinfraktion von Humanplasma durch Extraktion mit Alkohol undIt is known that certain substances obtained from the blood of warm-blooded animals, among others Effects, such as a breath-stimulating effect and a growth-promoting effect, also over have a certain insulin-like effectiveness. Such an insulin-like effectiveness brought about by insulin antibodies is only marginally inhibitable, has, for example, in Arzneimittelforschung 18, 1019 (1968) product described, which is pretreated according to DE-PS 10 76 888 from the blood or from blood components Calves (or pigs according to DE-PS 10 17 744) with high RES activity are produced and packaged Form is used as a medicinal product. It is also known that through repeated chromatographic Obtaining purified growth-stimulating fractions from calf serum enrichment process Lassen, which also has an insulin-like effectiveness which is practically uninhibited by insulin antibodies have, and in this regard, for example, J. Cell. Physiol. 79, 319 (1972) referenced. According to Biochim. Biophys. Acta 121, 349 (1966) can be obtained from the protein fraction of human plasma by extraction with alcohol and

Vj chrornatographische Anreicherungsverfahren ebenfalls höhermolekulare Substanzen mit insuünähnüchcr Wirksamkeit isolieren, die wiederum von Insulinantikörpern praktisch nicht gehemmt werden können. Weiter ist aus Acta Endochronologica 57, 330 bis 352. besonders Seite 330 unter Abstracts und Seite 343, letzter Absatz bis Seite 345. letzter Absatz, bekannt, daß sich Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit im Serum von Ratten aktivieren lassen, wenn man ein solches nicht behandeltes und deshalb neutrales Serum mindestens 3 Stunden bei Raumtemperatur beläßt. Vj chrornatographische enrichment process also isolate high molecular weight substances insuünähnüchcr effectiveness, which in turn can not be inhibited from virtually insulin antibodies. It is also known from Acta Endochronologica 57, 330 to 352, especially page 330 under abstracts and page 343, last paragraph to page 345, last paragraph, that substances with an insulin-like activity can be activated in the serum of rats if such an untreated one is not treated and therefore leave neutral serum for at least 3 hours at room temperature.

Die bekannten technischen Verfahren zur Herstellung von Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit gehen normalerweise alle von Blut oder Blutbestandteilen von Tieren, wie Schweinen oder Kälbern, insbesondere Kälbern, aus und erfordern zur Gewinnung der gewünschten Wirkstoffe verhältnismäßig aufwendige Melhoden. Selbst der Einsatz von Blut oder Blutbestandteilen entsprechend vorbehandelter Schlachttiere ergibt jedoch nur Lösungen mit einem verhältnismäßig geringen Anteil an insulinähnlicher Wirksamkeit, so daß solche Lösungen durch geeignete Methoden zur Erhöhung ihres Wirkstoffgehalts konzentriert werden müssen. Zudem müssen die bei solchen Verfahren nach Gewinnung der Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit anfallenden Produkte verworfen werden, da sie anscheinend an Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit erschöpft sind.The known technical processes for the production of substances with insulin-like effectiveness normally all go from blood or blood components from animals, such as pigs or calves, in particular Calves, and require relatively complex Melhoden to obtain the desired active ingredients. Even the use of blood or blood components from appropriately pretreated animals for slaughter results but only solutions with a relatively low proportion of insulin-like effectiveness, so that such Solutions must be concentrated by suitable methods to increase their active ingredient content. In addition must be the result of such processes after the extraction of the substances with insulin-like effectiveness Products are discarded as they appear to be depleted of substances with insulin-like effectiveness are.

Wegen der großen Bedeutung der Arzneimittel auf Basis ¹On Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit wird daher bereits seit einer Reihe von Jahren nach Möglichkeiten gesrcht, durch die sich die Ausbeute an Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit bei Verfahren der oben angegebenen Art verbessern läßt, ohne daß diesen Bemühungen bisher Erfolg beschieden war.Because of the great importance of drugs based on ^1- on substances with insulin-like activity, there has been a search for a number of years for ways by which the yield of substances with insulin-like activity can be improved in processes of the type indicated above, without these efforts being made so far Success was granted.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines neuen Verfahrens zur Isolierung von Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit aus Blut oder Blutbestandleilen, insbesondere von Kälbern oder Schweinen, durch das sich die aktiven Substanzen in erhöhter Konzentration und insgesamt günstigerer Ausbeute aus dem jeweiligen Ausgangsmaterial gewinnen lassen.The object of the invention is therefore to create a new method for isolating substances with insulin-like effectiveness from blood or blood components, especially from calves or pigs that the active substances in increased concentration and overall more favorable yield from the obtain the respective source material.

Diese Aufgabe wird nun erfindungsgemäß durch das in den Ansprüchen näher bezeichnete Verfahren gelöst.
Wie aus dem in der später folgenden Tabelle ziisammgefaßten Versuchsmaterial hervorgeht, läßt sich eineThis object is now achieved according to the invention by the method specified in more detail in the claims.
As can be seen from the test material summarized in the table below, a

bo Aktivierung der Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit bei Blut oder Blutbestandteilen nicht lediglich durch ein längeres Stehenlassen des Ausgangsmaterials bei Raumtemperatur oder gegebenenfalls auch bei etwas erhöhter Temperatur einfach im neutralen pH-Bereich erreichen. Die gewünschte Erhöhung der Ausbeute an Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit ergibt sich vielmehr eindeutig erst durch die erfinckingsgcmäßc Verschiebung des pH-Wertes in den alkalischen Bereich unter den im H;iuptanspruch sonst noch ;ingcge-bo activation of substances with insulin-like effectiveness in blood or blood components is not only by letting the starting material stand for a long time at room temperature or, if necessary, also at Simply reach a slightly higher temperature in the neutral pH range. The desired increase in the yield on substances with an activity similar to that of insulin arises rather clearly only through the success of the invention Shift of the pH value into the alkaline range below what is otherwise stated in the main claim; ingcge

bj bcnen weiteren Bedingungen.bj allow further conditions.

Während Blut oder Bhitbestandteilc Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit nur in einer Konzentration von 2.5 bis 8 μΕ/mg Trockensubstanz enthalten, wurde demgegenüber nun erfindungsgemäß gefunden, daß man durch diis in den Ansprüchen näher bezeichnete Aktivierungsverfahren ein Produkt erhalten kiinn, eins überWhile blood or components of insulin only have one concentration of substances with an effect similar to that of insulin Containing from 2.5 to 8 μΕ / mg dry substance, it has now been found according to the invention that one Through the activation process specified in more detail in the claims, a product is obtained, one over

$ einen hohen Anteil an Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit verfügt, nämlich einen Anteil von etwa 14 $ has a high proportion of substances with insulin-like effectiveness, namely around 14

ii bis 40 μ E/mg Feststoff.ii to 40 μU / mg solids.

y Vor der Einstellung des pH-Werts auf den erfindungsgemäß vorgeschriebenen Wert von 8 bis 10 soll man dasy Before the pH is adjusted to the value of 8 to 10 prescribed according to the invention, this should be done

ii Blut oder die Blutbestandteile — wie angegeben — mit 0,5 bis 4 Volumina eines hydrophilen Lösungsmittels ii blood or the blood components - as indicated - with 0.5 to 4 volumes of a hydrophilic solvent

£ verdünnen. Als Blut oder Blutbestandteile verwendet man beim vorliegenden Verfahren normalerweise Ge-Dilute £. In the present method, blood or blood components are normally used

fc samtblut. Plasma, Serum und Erythrozytensuspensionen oder Thrombozytensuspensionen. Weiter kann manfc velvet blood. Plasma, serum and erythrocyte suspensions or platelet suspensions. You can go further

i" erfindungsgemäß auch den nach Entfernen anorganischer oder organischer Substanzen mit einem MolekularTC-i "according to the invention, after removing inorganic or organic substances with a molecular TC-

'% wicht von weniger als 5000, nämlich den nach bereits erfolgter Gewinnung von Substanzen mit insulinähnlicher '% weight of less than 5000, namely after the extraction of substances with insulin-like substances

U Wirksamkeit, aus Blut oder Blutbestandteilen durch Dialyse erhaltenen Rückstand verwenden. Gleiches gilt U efficacy, use residue obtained from blood or blood components by dialysis. same for

fö auch für einen nach Entfernung anorganischer oder organischer Substanzen mit einem Molekulargewicht vonfö also for one after removal of inorganic or organic substances with a molecular weight of

S weniger als 1000 aus Blut oder Blutbestandteilen durch Ultrafiltration erhaltenen Rückstand.S less than 1000 residue obtained from blood or blood components by ultrafiltration.

'■/: Die Gewinnung der Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit aus dem in der erfindungsgemäßen Weise '■ /: The extraction of the substances with insulin-like effectiveness from the in the manner according to the invention

;λ behandelten Blut oder den Blutbestandteilen erfolgt am besien durch Dialysieren gegen eine für ein Molekular-; λ treated blood or the blood components are carried out on the best by dialyzing against a molecular weight

y I gewicht mit weniger als 6000 durchlässiger Membran als Außendialysat.y I weight with less than 6000 permeable membrane as external dialysate.

I; Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnen Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit werden I; The substances obtained by the method according to the invention have an insulin-like effectiveness

i; zweckmäßigerweise einem abschließenden Anreicherungsverfahren unterzogen, indem man aus den gewonne-i; expediently subjected to a final enrichment process by

% neu Substanzen anorganische Salze und niedermolekulare Substanzen entfernt und das Ganze auf ein Produkt % new substances Removed inorganic salts and low molecular weight substances and the whole thing on one product

%· mit einer insulinähnlichen Wirksamkeit von etwa 35 μΕ bis etwa 200 μΕ/mg Feststoff anreichert.% · Enriched with an insulin-like effectiveness of about 35 μΕ to about 200 μΕ / mg solid.

la Es empfiehh sich ferner, das gewonnene Produkt zur Bildung einer isotonischen Lösung einzuengen oder zula It is also advisable to concentrate or to constrict the product obtained to form an isotonic solution

verdünnen, wobei man vorzugsweise auf einen Feststoffgehait von etwa 2,5 bis 2ö mg/mi mit einer insulinähnlichen Wirksamkeit von etwa 500 μΕ/ml einstellt und die Isotonie gegebenenfalls durch Ergänzung mit Glucose oder Kochsalz herstellt.Dilute, preferably to a solids content of about 2.5 to 20 mg / ml with an insulin-like Effectiveness of about 500 μΕ / ml adjusts and the isotonicity, if necessary, by supplementing with glucose or table salt.

Die in obiger Weise gewonnen organopeptidhaltigen Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit haben ein Molekulargewicht von etwa 350 bis 5000, eine durch Antikörper nicht hemmbare insulinähnliche Wirksamkeit im Fettgewebetest von etwa 35 bis 200 μΕ/mg, eine Löslichkeit in Alkohol, eine Hitzestabilität bei neutralem pH, eine positive Reaktion gegenüber Ninhydrin und Amidoschwarz G, ein auf die Anwesenheit von Purinderivaten hinweisendes UV-Maximum bei 258 nm, einen durch eine Aminosäurebestimmung nach Hydrolyse ermittelten Peptidgehalt von 25 bis 30% des Trockengewichts der salzfreien Substanzen mit folgenden Aminosäuren: Glutaminsäure, Leucin, Glycerin, Serin, Asparaginsäure, Alanin. Isoleucin, Histidin, Valin, Threonin, Lysin, Methionin, Thyrosin, 'Volin und Arginin, und eine sich am Einbau von Glucose in Fettzellen, an der Erniedrigung von erhöhtem Blutzucker bei Mensch <"id Tier, an der Hemmung der Lipolyse und an der Förderung des Wachstums von Zcllkulturen, wie Fibroblasten, zeigende insulinähnliche Wirksamkeit.The organopeptide-containing substances with insulin-like effectiveness obtained in the above manner have a Molecular weight from about 350 to 5000, an activity similar to insulin which cannot be inhibited by antibodies in the adipose tissue test from about 35 to 200 μΕ / mg, a solubility in alcohol, a heat stability at neutral pH, a positive reaction to ninhydrin and amido black G, one to the presence of purine derivatives indicative UV maximum at 258 nm, one determined by an amino acid determination after hydrolysis Peptide content of 25 to 30% of the dry weight of the salt-free substances with the following amino acids: Glutamic acid, leucine, glycerine, serine, aspartic acid, alanine. Isoleucine, histidine, valine, threonine, lysine, methionine, Thyrosine, Voline and Arginine, and one in the incorporation of glucose in fat cells, in the lowering of increased blood sugar in humans <"id animals, the inhibition of lipolysis and the promotion of growth of cell cultures, such as fibroblasts, showing insulin-like activity.

Die insulinähnliche Wirksamkeit ^r'p.r nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Substanzen wird am epididymalen Fettanhang der Ratte in Anlehnung an die in J. Clin. Invest. 39,1487 bis 1498 (1960) beschriebene Methode bestimmt. Für jeden Fettgewebetest, der aus 24 Einzclbcstimmungen besteht, werden drei iiiäiinliehe Ratten mit einem Gewicht von etwa 180 bis 200 g verwendet. Nach Präparation der beiden Fettkörper der Nebenhoden wird das Fettgewebe zerschnitten und so verteilt, daß man am Schluß in jedem der 24 Reaktionsgefäße je ein Teilstück von einem Vorder-, Mittel- und Hinerlappen aus einem Fettgewebeatihang na; (insgesamt 80 bis 100 mg Fettgewebe). Jede Bestimmung wird dreifach durchgeführt, wozu jeweils 35 mp der auf eine insulinähnliche Wirksamkeit hin zu untersuchenden Präparationen abgewogen und in 7 ml Krebs-Ringer-Bicarbonat-Puffer, der 100 mg% Gelatine und 250 mg% Glucose enthält, gelöst werden. Die für die Untersuchungen verwendete Insulin-Eichkurve verfügt über einen Bereich von 63 bis 252 μΕ Insulin. Die kompletten Ansätze enthalten etwa 100 mg Fettgewebe, 9,5 mg auf ihre insulinähnliche Wirksamkeit zu untersuchende Substanz (oder auch Leerwerte oder verschiedene Insulinkonzentrationen), 1.9 ml Krebs-Ringer-Bicarbonat-Puffer und 0,1 ml l^u-C-Glucose mit 0,2 μθ. Sie werden 2 Stunden bei 37° C inkubiert.The insulin-like activity ^r 'pr substances obtained by the inventive process is the epididymal fat Annex the rat in accordance with the in J. Clin. Invest. 39, 1487 to 1498 (1960). For each adipose tissue test, which consists of 24 individual determinations, three similar rats weighing about 180 to 200 g are used. After the two fatty bodies of the epididymis have been prepared, the fatty tissue is cut up and distributed in such a way that, at the end, a section of a front, middle and back flap from a fatty tissue attachment is placed in each of the 24 reaction vessels; (a total of 80 to 100 mg adipose tissue). Each determination is carried out in triplicate, for which 35 mp of the preparations to be examined for an insulin-like activity are weighed and dissolved in 7 ml Krebs-Ringer bicarbonate buffer containing 100 mg% gelatin and 250 mg% glucose. The insulin calibration curve used for the investigations has a range from 63 to 252 μΕ insulin. The complete reaction mixtures contain about 100 mg of fat, 9.5 mg to their insulin-like activity to be examined substance (or blanks or different insulin concentrations), 1.9 ml Krebs-Ringer bicarbonate buffer and 0.1 ml l ^u -C-glucose with 0.2 µθ. They are incubated for 2 hours at 37 ° C.

Anschließend spritzt man in das Innengefäß des Reaktionskolbens zum Sammeln des '⁴CO: eine Menge von 0.4 ml Hyamin und dann in das Inkubationsmedium unter Wahrung des geschlossenen Systems mit einer Kanüle 0,25 ml einer 2n-Schwcfelsäure zur Freisetzung des ¹⁴COi ein. Nach 0.5stündiger Inkubation der einzelnen Reaktionsgefäße bei einer Temperatur von 37°C wird das Hyamin aus den als Absorptionsgefäße dienenden Kunststoffkappen in dazu passende Fläschchen aus Kusntstoff überführt, die als Zählgefäße dienen und mit 8 ml Toluol-Scintillationslösung gefüllt sind. Die verwendete Scintilidtionslösung besteht aus 4 g 2,5-Diphenyloxazol. 100 mg l,4-Bis-2-(4-methyI-5-phenyloxazolyl)benzol und 1 I Toluol. Die Radioaktivität wird in einem Flüssigkei ts-Sci η tillationsspektrometer gemessen.A quantity of 0.4 ml hyamin is then injected into the inner vessel of the reaction flask to collect the ' ⁴ CO: and then 0.25 ml of 2N sulfuric acid is injected into the incubation medium with a cannula to release the ¹⁴ COi while maintaining the closed system. After incubating the individual reaction vessels for 0.5 hours at a temperature of 37 ° C, the hyamin is transferred from the plastic caps used as absorption vessels into matching plastic bottles, which serve as counting vessels and are filled with 8 ml of toluene scintillation solution. The scintillation solution used consists of 4 g of 2,5-diphenyloxazole. 100 mg 1,4-bis-2- (4-methyl-5-phenyloxazolyl) benzene and 1 l toluene. The radioactivity is measured in a liquid scanning spectrometer.

Wird die gleiche Versuchsanordnung unter Zusatz von Insulinantikörpern durchgeführt, kommt es zu keiner oder nur einer geringfügigen Abnahme der Meßwerte.If the same experimental set-up is carried out with the addition of insulin antibodies, none of the results are obtained or only a slight decrease in the measured values.

Die Bestimmung einer Stimulation oder Hemmung der Lipolyse in Fettgewebe erfolgt unter Verwendung eines Fettgewebes, bei dem man mit 0,4 μg Adrenalin/ml oder mit 0,1 ug Glucagon/ml eine Lipolyse induziert. Anschließend werden im Medium die Konzentrationsänderungen der freien Fettsäuren und des Glycerins vor und nach Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen der zu untersuchenden insulinähnlichen Wirksubstanz bestimmt. Zum Vergleich wird eine Eichkurve mit Insulinlösungen verschiedener Konzentrationen zwischen 1 bo und 100 μΕ/ml erstellt. Die angewandte Bestimmungsmethode ist im einzelnen in Arzneim. Forsch. 18, 1019 bis 1021 (1968) beschrieben.The determination of stimulation or inhibition of lipolysis in adipose tissue is carried out using of adipose tissue in which lipolysis is induced with 0.4 ug adrenaline / ml or with 0.1 ug glucagon / ml. The changes in the concentration of free fatty acids and glycerine are then shown in the medium and after incubation with different concentrations of the insulin-like active substance to be examined certainly. For comparison, a calibration curve with insulin solutions of various concentrations between 1 bo and 100 μΕ / ml created. The method of determination used is in detail in Arzneimittel. Research 18, 1019 bis 1021 (1968).

Die Wirkung der erfindungsgemäß hergestellten Substanzen auf den Blutzuckerspiegel wird auch durch in-vivo Versuche ermittelt. Hierzu verabreicht man 250 g schweren Wistar-Ratten intravenös 3 g Glucose pro kg. Eine Vcrgleichsgruppe erhält gleichzeitig mit der Glucosegabe 2 mg der nach Beispiel 5 hergestellten tn erfindungsgemäßen Substanz (15 bis 20 μΕ/mg). Die Blutzuckerspiegel steigen bei den Kontrolltieren innerhalb von \^ri Minuten auf 400 mg°/o an und normalisieren sich nach 60 Minuten auf etwa 120 mg°/o. Bei den mit dem crfinclungsgemäß erhaltenen Wirkstoff behandelten Versuchstieren ergebet sich im gleichen Zeitraum um ctw;iThe effect of the substances produced according to the invention on the blood sugar level is also determined by in-vivo experiments. For this purpose, Wistar rats weighing 250 g are administered intravenously with 3 g glucose per kg. Simultaneously with the administration of glucose, a comparison group receives 2 mg of the substance according to the invention prepared according to Example 5 (15 to 20 μl / mg). The blood sugar levels in the control animals rise to 400 mg% within \ ^r i minutes and normalize to about 120 mg% after 60 minutes. In the case of the test animals treated with the active substance obtained according to the method, the result was around ctw; i

1515th

2020th

20% niedrigere Glucosespiegel.20% lower glucose levels.

Die Injektion des gleichen erfindungsgmäß hergestellten Wirkstoffes bei Alloxan-diabetischen Ratten führt zu einem statistisch signifikanten Blutzuckerabfall im Vergleich zu Alloxan-diabetischen Kontrolltieren, denen man intravenös nur die gleiche Menge physiologische Kochsalzlösung injiziert.The injection of the same active ingredient prepared according to the invention in alloxan-diabetic rats leads to a statistically significant drop in blood sugar compared to alloxan diabetic control animals given only the same amount of normal saline is injected intravenously.

Die in obigen biologischen Versuchen beschriebenen Eigenschaften zeigen, daß die erfindungsgemäß hergcstellen Substanzen interessante Heilmittel sind. Sie eignen sich vor allem als blutzuckererniedrigende Mittel bei hyperglykämischen Warmblütern. Zu einer entsprechenden Behandlung werden diese Heilmittel zweckmäßigerweise ;r. Tagesdosen von etwa 200 bis 500 μΕ/kg Körpergewicht eingesetzt, wobei man diese Wirkstoffmenge vorzugsweise in mehreren Teildosen zwei- bis dreimal täglich verabreicht. Die Verabfolgung erfolgt vorzugsweise durch intravenöse Infusion, und daher am besten in Form injizierbarer Lösungen.The properties described in the above biological tests show that they are produced according to the invention Substances are interesting remedies. They are particularly suitable as blood sugar-lowering agents hyperglycemic warm-blooded animals. These remedies are expediently used for appropriate treatment ; r. Daily doses of about 200 to 500 μΕ / kg body weight are used, this amount of active ingredient preferably administered in several divided doses two to three times a day. Administration is preferably carried out by intravenous infusion, and therefore preferably in the form of injectable solutions.

Ein besonderer Vorteil dieser insuiinähnlich wirkenden Substanzen ist darin zu sehen, daß sich mit ihnen auch die Spätfolgen einer nach langzeitiger Behandlung mit Insulin oder oralen Antidiabetika bei Diabetikern auftretenden Gewebsschädigungen behandeln lassen. Die Wirkstoffe werden daher zweckmäßigerweise am besten in Ergänzung zur üblichen Behandlung von Diabetikern verabfolgt. Diese besondere Wirkung wird zum einen Teil darauf zurückgeführt, daß in diesem Wirkstoff eine höhere Menge an insulinähnlichen Substanzen, die durch Insulinantikörper nicht hemmbar sind, vorhanden ist, und zum anderen Teil auch auf Jn diesem Wirkstoff vorhandene wachstumsfördernde Faktoren, die den Heilprozeß begünstigen.A particular advantage of these insuiin-like acting substances is to be seen in the fact that they also the long-term consequences of long-term treatment with insulin or oral antidiabetic drugs in diabetics have any tissue damage that occurs. The active ingredients are therefore expediently on best administered in addition to the usual treatment of diabetics. This special effect becomes the partly attributed to the fact that in this active ingredient a higher amount of insulin-like substances, the cannot be inhibited by insulin antibodies, and on the other hand also on this active ingredient existing growth-promoting factors that favor the healing process.

Aus der folgenden Tabelle geht der Einfluß des pH-Wertes auf die Gewinnung von Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit hervor. Wie ersichtlich, ergibt das erfindungsgemäße Arbeiten im pH-Boreich von 8 bis 10 gegenüber einer Behandlung in nur neutralem pH-Bereich eine besonders hohe GesamtausDe-jste an Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit.The following table shows the influence of the pH value on the production of substances with insulin-like substances Effectiveness. As can be seen, working according to the invention results in a pH range of 8 to 10 a particularly high total concentration of substances compared to a treatment in only a neutral pH range with insulin-like effectiveness.

Tabelle
Einfluß des pH-Werts auf die Gewinnung von Substanzen mit insulinähnlicher WirksamkeitTabel
Influence of the pH value on the production of substances with an insulin-like activity

30 35 40 45 50 55 bO 65 30 35 40 45 50 55 bO 65

Beispiel
Nr.example
No. Eingesetzies Ausgangsmaterial
und pH-Werte bei seiner BehandlungThe starting material used
and pH values in its treatment Ausbeutein g
Trocken
substanz/
IOC mlYield in g
Dry
substance/
IOC ml Insulinähnl.
Wirksamkeit
μΕ/mgInsulin-like
effectiveness
μΕ / mg Gesamte
insulinähnl.
Wirksamkeit
mE/100mlTotal
insulin-like
effectiveness
mU / 100ml 1
Vergleich1
comparison Kälberblut,
pH 9-10(9.5)
pH 7Calf blood,
pH 9-10 (9.5)
pH 7 1,3
1,21.3
1.2 18,6
11,018.6
11.0 24,1
13,224.1
13.2 2
3
Vergleich2
3
comparison Plasma von Kälberblut
pH 9-10(9,5)
pH 8
pH 7Calf blood plasma
pH 9-10 (9.5)
pH 8
pH 7 1,9
1,1
1,81.9
1.1
1.8 8,6
13,5
6,58.6
13.5
6.5 163
14,0*)
11,7163
14.0 *)
11.7 4
Vergleich4th
comparison Erythrozytensedimeit von Kälberblut
pH 9-10(9.5)
pH 7Erythrocyte sedimentation of calf blood
pH 9-10 (9.5)
pH 7 1,4
0,091.4
0.09 14,3
9,014.3
9.0 20,0
0,820.0
0.8 5
Vergleich5
comparison Vordialysieries Kälberblut,
pH 9,5
pH 7Vordialysieries calf blood,
pH 9.5
pH 7 1,05
0,31.05
0.3 3.5,0
16,03.5.0
16.0 36,0*)
5.036.0 *)
5.0 6
Vergleich6th
comparison Ultrafiltriertes Schweineblut
pH 9-10(9.5)
pH 7Ultra-filtered pig blood
pH 9-10 (9.5)
pH 7 03
0,203
0.2 30,0
10,030.0
10.0 9,0»)
2,0*)9.0 »)
2.0 *)

*) Nachgereichte Werte*) Subsequent values

Beispiel 1 Verwendung von Blut von Schlachtkälbernexample 1 Use of blood from slaughtered calves

3 1 frisch entnommenes Blut von Schlachtkälbern werden mit 300 ml einer 3,8%igen Natriumcitratlösung und mit 20 g Phenol mechanisch vermischt und auf 4°C gekühlt. Nach Verdünnen mit 1000 ml 50%igem wäßrigem Ethanol wird der pH-Wert durch Zugabe von etwa 80 ml 5n Ammoniaklösung auf 9 bis 10 (9,5) eingestellt und der gesamte Ansatz unter Rühren 24 Stunden auf 40⁰C erwärmt. Die Zunahme der Viskosität wird durch weitere Zugabe von 50%igem wäßrigem Ethanol in Grenzen gehalten. Sodann wird wieder auf 4°C abgekühlt, worauf man das Ganze in Dialysierschläuchen mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von etwa 5000 bis 6000 Dalton gegen destilliertes Wasser, das 0,2% Phenol enthält, dialysiert. Das Ve/hältnis von Innen- zu Außendiaiysat beträgt 1 : 5 bis 1 :10. Die Dialyseschläuche weroen zur Optimierung des Dialyseeffekts mechanisch bewegt. Nach 24 Stunden wird das Dialysat gewechselt, und nach weiteren 24 Stunden wird dieser Wechsel nochmals wiederholt. Die vereinigten Außendialysate werden in einem Vakuumplattenumlaufverdampfer bei maximal 35°C auf 2 1 eingeengt und mit 2n-Salzsäure auf pH 7,0 eingestellt. Anschließend wird weiter auf 200 ml3 liters of freshly drawn blood from slaughtered calves are mechanically mixed with 300 ml of a 3.8% sodium citrate solution and with 20 g of phenol and cooled to 4 ° C. After dilution with 1000 ml of 50% aqueous ethanol, the pH is adjusted to 9 to 10 (9.5) by adding about 80 ml of 5N ammonia solution and the entire batch is ^{heated to 40 °} C. for 24 hours while stirring. The increase in viscosity is kept within limits by adding more 50% strength aqueous ethanol. It is then cooled again to 4 ° C., whereupon the whole thing is dialyzed in dialysis tubes with a molecular weight exclusion limit of about 5000 to 6000 Dalton against distilled water containing 0.2% phenol. The ratio of inner to outer diaphragm is 1: 5 to 1:10. The dialysis tubes are moved mechanically to optimize the dialysis effect. The dialysate is changed after 24 hours, and this change is repeated again after a further 24 hours. The combined external dialysates are concentrated to 2 liters in a vacuum plate circulation evaporator at a maximum of 35 ° C. and adjusted to pH 7.0 with 2N hydrochloric acid. Then continue to 200 ml

eingeengt, ein eventuell entstandener Niederschlag abzcntrifugicrt und die klare Lösung gefriergetrocknet. Man erhält 39 g eines Substanzgemisches (Trockensubstanz) mit einer insulinähnlichen Wirksamkeit von I8.b uE/mg. entsprechend 1.3 g Trockensubstanz mit 24.1 mE/100 ml Ausgangsmaterial.concentrated, any precipitate formed was centrifuged off and the clear solution was freeze-dried. Man receives 39 g of a substance mixture (dry substance) with an insulin-like effectiveness of 18.b uU / mg. corresponding to 1.3 g dry matter with 24.1 mU / 100 ml starting material.

B e i s ρ i e I 2 ϊ B is ρ ie I 2 ϊ

Verwendung von Blutplasma von SchlachtkälbcrnUse of blood plasma from slaughtered calves

Das in Beispiel 1 beschriebene citrathaltige frische Kalberblut (3 I) wird in Zentriiugenflaschen zu 500 ml ■iibgefüllt und bei 4⁼C in einer Zentrifuge 30 Minuten bei 3400 U/min zentrifugiert. Aus 1 Liter Blut erhalt man O.b bis 0.75 I überstehendes Plasma, das man abpipeuiert und sammelt. Das Erythrozytensedimerit (0,30 bis 0.45 I) wird mit 0.5%igem Phenolwasser im Verhältnis I : I verdünnt und für die weitere Verarbeitung ebenfalls gesammelt (siehe Beispiel 4). Man verdünnt ! Liter des oben erhaltenen überstehenden Plasmas mit 200 ml destilliertem Wasser, das 0.5% Phenol enthält, und stellt den pH-Wert mit I On Natronlauge auf pH 9 bis 10 (9.5) ein. Die weitere Wärmebehandlung. Dialyse, Konzentration und Lyophilisierung werden wie in Beispiel I beschrieben durchgeführt. Hierdurch erhält man aus 1 Liter Plasma 19 g Trockensubstanz mit einer insiilinähnli· ι > chen Wirksamkeit von 8.6.uE/mg. entsprechend einer gesamten insulinähnlichen Wirksamkeit von IbJmE/ 100 ml.The citrate fresh Kalberblut (3 I) described in Example 1 / Zentriiugenflaschen centrifuged in 500 ml ■ iibgefüllt and 4 ⁼ C in a centrifuge for 30 minutes at 3400 rpm. Ob to 0.75 l of supernatant plasma is obtained from 1 liter of blood, which is piped off and collected. The erythrocyte sedimerite (0.30 to 0.45 l) is diluted with 0.5% phenol water in the ratio I: I and also collected for further processing (see example 4). You dilute! Liter of the supernatant plasma obtained above with 200 ml of distilled water containing 0.5% phenol and adjust the pH value to 9 to 10 (9.5) with I On sodium hydroxide solution. The further heat treatment. Dialysis, concentration and lyophilization are carried out as described in Example I. In this way, 19 g of dry substance are obtained from 1 liter of plasma with an insilin-like effectiveness of 8.6 uE / mg. corresponding to a total insulin-like effectiveness of IbJmE / 100 ml.

Beispiel 3
Verwendung von Blutplasma von Schlachtkälbern :oExample 3
Use of blood plasma from slaughtered calves: o

350 ml des nach Beispiel 2 durch Zentrifugieren von citrathaltigem Kälberblut erhaltenen Plasmas werden mit 50 ml entmineralisiertem Wasser verdünnt und mit 5n Natronlauge auf pH 8 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird unter Rühren 24 Stunden bei Raumtemperatur (20 bis 25 C) gehalten und dann nach Abkühlung auf etwa 4 bis 8 C einer zwei- bis dreimaligen Dialyse gegen 0.2%iges Phenolw:>sser unterworfen. Die vereinigten Diaiysa- 2 > te (etwa 3 I) werden mit verdünnter Salzsäure oder Essigsäure neutralisiert und unter Vakuum auf ein Volumen von 200 ml eingeengt. Das Dialysekonzentrat enthält 3.83 g Trockensubstanz, was 1.1 g/100 ml Ausgangsmaterial entspricht, und weist eine insulinähnliche Wirksamkeit von 1.3,5 μΕ/mg auf. was insgesamt 14,0 mE/100 ml entspricht.350 ml of the plasma obtained according to Example 2 by centrifuging citrate-containing calf blood are mixed with Diluted 50 ml of demineralized water and adjusted to pH 8 with 5N sodium hydroxide solution. The solution obtained is kept with stirring for 24 hours at room temperature (20 to 25 C) and then after cooling to about 4 up to 8 C to two or three dialysis against 0.2% phenolw:> sser. The united Diaiysa- 2 > te (about 3 l) are neutralized with dilute hydrochloric acid or acetic acid and reduced to volume under vacuum concentrated by 200 ml. The dialysis concentrate contains 3.83 g dry matter, which is 1.1 g / 100 ml starting material corresponds, and has an insulin-like effectiveness of 1.3.5 μΕ / mg. which is a total of 14.0 mU / 100 ml is equivalent to.

Beispiel 4
Verwendung von Erythrozytensediment von KälberblutExample 4
Use of erythrocyte sediment from calf blood

Man verdünnt 1.0 Liter eines nach Beispiel 2 gewonnenen Erythrozylensediments mit 0.5%iger wäßriger l'henoilosung im Verhältnis i : 1 und stellt den pH-Wert mit 5n Ammoniaklösung auf 9 bis 10 (9,5) ein. Zur J5 Verringerung der Viskosität setzt man gleichzeitig 2öö bis 3Ö0 mi Ethanol und die gleiche Menge eniminerali· siertes Wasser zu. Nach Hämolvse der Eryhirozytcn crha't man durch Zentrifugieren eine klare Lösung. Diese Lösung wird w ie in Beispiel I beschrieben 24 Stunden unter Rühren einer Wärmebehandlung bei 40' C unterzogen. Sodann wird auf etwa 4 C abgekühlt und das Ganze in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise gegen destilliertes Wasser, das 0.2% Phenol enthält, dialysiert. Das Dialysat wird dreimal gewechselt, und die vereinig- ad ten Außendial·.sate werden nach Konzentration und Neutralisation mit verdünnter Salzsäure lyophilisiert. Aus 2 I Ervthrozytensuspension 1 : 1 erhält man 28 g Trockensubstanz mit einer insulinähnlichen Wirksamkeit von !4.3 uE/mg. entsprechend 1.4 g Trockensubstanz mit 20.0 mE/100 ml Erythrozvtensuspension.1.0 liter of an erythrocyte sediment obtained according to Example 2 is diluted with 0.5% strength aqueous l'henoil solution in a ratio of i: 1 and the pH is adjusted to 9 to 10 (9.5) with 5N ammonia solution. To reduce the viscosity, 2 to 30 ml of ethanol and the same amount of enimineralized water are added at the same time. After hemolysis of the erythrocytes, a clear solution is obtained by centrifugation. As described in Example I, this solution is subjected to a heat treatment at 40 ° C. for 24 hours with stirring. It is then cooled to about 4 ° C. and the whole is dialyzed in the manner described in Example 1 against distilled water containing 0.2% phenol. The dialysate is changed three times, and the vereinig- ad th Außendial · .sate be lyophilized after concentration and neutralization with dilute hydrochloric acid. From 2 l of erythrocyte suspension 1: 1, 28 g of dry substance are obtained with an insulin-like effectiveness of 4.3 uU / mg. corresponding to 1.4 g dry matter with 20.0 mU / 100 ml erythrocyte suspension.

B e i s ρ i e I 5 -*5B e i s ρ i e I 5 - * 5

Verwendung von vordialysiertem KälberblutUse of pre-dialysed calf blood

Man dialysieri deformiertes Kälberblut bei neutralem pH-Wert unter Bildung eines praktisch salzfreien Innerei^K>ats. 100 I dieses neutralen Innendialysats von defibriniertem Kälberblut werden mit 1On Natronlaugr auf pH 9.5 gebracht und zur Viskositätserniedrigung mit 100 bis 150 1 50%igem Ethanol versetzt und dann unter Zusatz von 0.5% Phenol und Rühren während 24 bis 28 Stunden bei etwa 30^rC inkubiert. Nach Abkühlen auf 4 bis 10 C wird die Gesamtiösung erneut gegen 0.2%iges Phenolwasser dialysiert. Das Voiumenverhältnis von Innendiaiysat zu Außendialysat liegt bei 1 : 3 bis I : 5. Nach jeweils 24 Stunden wird das Außendialysat insgesamt viermal gewechselt und erneuert. Die gesammelten Außendialysate vom pH 9.0 werden unter Vakuum auf 25 I eingeengt und mit 6n Salzsäure oder Essigsäure neutralisiert, von Trübungen abfiltriert und auf 3 ! weiter konzentriert. Nach einwöchigem Stehenlassen bei 4^CC wird der gebildete Niederschlag abfiltriert und die Restlösung nach Korrektur des pH-Werts auf 7.0 lyophilisiert. Aus 1 Liter des Konzentrats (Vj des Ansatzes) erhält man 350 g lyophilisierte Trockensubstanz mit einer insulinähnlichen Wirksamkeit von 35 μΕ/mg. Dies entspricht 1.05 g Trockensubstanz/100 ml Ansatz mit einer gesamten insulinähnlichen Wirksamkeit von etwa 36 m E /!0OmI.Deformed calf blood is dialyzed at neutral pH to form a practically salt-free innards. 100 l of this neutral internal dialysate of defibrinated calf blood are brought to pH 9.5 with 10n sodium hydroxide and mixed with 100 to 150 l of 50% ethanol to reduce the viscosity and then incubated ^{for 24 to 28 hours at about 30 ° C. with the addition of 0.5% phenol and stirring} . After cooling to 4 to 10 ° C., the total solution is dialyzed again against 0.2% strength phenol water. The volume ratio of internal dialysate to external dialysate is 1: 3 to 1: 5. After every 24 hours, the external dialysate is changed and renewed a total of four times. The collected external dialysates of pH 9.0 are concentrated in vacuo to 25 l and neutralized with 6N hydrochloric acid or acetic acid, filtered to remove cloudiness and reduce to 3! further focused. After standing for one week at 4 ^° C., the precipitate formed is filtered off and the remaining solution is lyophilized after the pH value has been corrected to 7.0. From 1 liter of the concentrate (Vj of the batch) one receives 350 g of lyophilized dry substance with an insulin-like effectiveness of 35 μΕ / mg. This corresponds to 1.05 g dry matter / 100 ml mixture with a total insulin-like effectiveness of about 36 mU /! 0OmI.

Beispiel 6
Verw endung von ultrafiltriertem SchweineblutExample 6
Use of ultrafiltered pig blood

10 Liter frisch entnommenes Schweineblut werden mit 1000 ml 3.8%iger Natriumcitratlösung und 60 g Phenol fc5 mechanisch vermischt, auf 4"'C gekühlt und mit zusätzlichen 2 1 demineralisiertem Wasser verdünnt. Die erhaltene Lösung wird mittels einer Zentrifuge geklärt und dann durch Ultrafiltrationsmembranen (z. B. PSAC-PeIIicon-Membranen aus Acetylceliulsoe) mit einer Ausschlußgrenze von 1000 Dalton unter einem Überdruck von 610 liters of freshly drawn pig blood are mixed with 1000 ml of 3.8% sodium citrate solution and 60 g of phenol fc5 mechanically mixed, cooled to 4 "C and diluted with an additional 2 liters of demineralized water. The obtained Solution is clarified using a centrifuge and then through ultrafiltration membranes (e.g. PSAC-PeIIicon membranes from Acetylceliulsoe) with an exclusion limit of 1000 Dalton under an overpressure of 6

bar (at) filtriert. Hierbei werden anorganische und organische Bestandteile mit einem Molekulargewicht unter etwa 800 bis 1200 Dalton eliminiert, und es bleibt ein dickflüssiger Brei zurück, den man in 2 I destilliertem Wasser aufnimmt und mit 1On Natronlauge auf pH 9 bis 10(9.5) bringt. Unter Rühren wird auf etwa 50"C erhitzt und mindestens 4 Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Das dickflüssige Produkt wird noch weitere 24 bis 4H Stunden bei Raumtemperatur gerührt und nach Abkühlen auf 10⁰C gegen destilliertes Wasser, das 0,2% Phenol enthält, insgesamt zweimal dialysiert. Die so gewonnenen neutralisierten, eingeengten und lyophilisieitcn Aufiendialysate enthalten 30 g Trockensubstanz mit einer durchschnittlichen insulinähnlichen Wirksamkeit von 30 μΕ/mg. Auf je 100 ml ultrafiltriertes Blut erhält man 9,0 mE insulinähnliche Wirksamkeit.bar (at) filtered. Inorganic and organic components with a molecular weight below about 800 to 1200 Dalton are eliminated, and a thick paste remains, which is taken up in 2 l of distilled water and brought to pH 9 to 10 (9.5) with 10N sodium hydroxide solution. The mixture is heated to about 50 ° C. with stirring and kept at this temperature for at least 4 hours. The viscous product is stirred for a further 24 to 4 hours at room temperature and, after cooling to 10 ^° C., against distilled water containing 0.2% phenol, The neutralized, concentrated and lyophilized external dialysates obtained in this way contain 30 g of dry substance with an average insulin-like effectiveness of 30 μl / mg. 9.0 mU of insulin-like effectiveness is obtained for every 100 ml of ultrafiltered blood.

Example 7

Kationenaustauscherbehandlung eines nach Beispiel 4 erhaltenen Produkts
mit insulinähnlicher WirksamkeitCation exchange treatment of a product obtained according to Example 4
with insulin-like effectiveness

4 g des nach Beispiel 4 erhaltenen Produkts mit 14,3 μΕ/mg insulinähnlicher Wirksamkeit werden in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und auf eine mit einem Kationenaustauscher auf Basis von Polystyrolmatrix (z. B. AG50W - X8). der in der NH₄-Form vorliegt und eine Korngröße von 75 bis 150 μΐη hat, gefüllte Säule (26 χ 40) aufgetragen. Nach dem Einsickern der Probelösung wird die Säule so lange mit destilliertem Wasser gewaschen, bis im Eluat UV-spektralphotometrisch (Wellenlänge 254 nm) keine Substanz mehr nachzuweisen ist (etwa 2 i). Dieses Eluat wird verworfen. Die Säule wird nacheinander mit 200 ml 10%iger Ammoniaklösung und 3 1 destilliertem Wasser eluiert. Die gesammelten Eluate werden in einem Vakuumrotationsverdampfer auf ein Fünftel des ursprünglichen Volumens eingeengt und schließlich gefriergetrocknet. Hierbei erhält man etwa 550 mg salzfreies Lyophilisat mit einer insulinähnlichen Wirksamkeit von 32 μΕ/mg.4 g of the product obtained according to Example 4 with 14.3 μl / mg of insulin-like activity are dissolved in 100 ml of distilled water and transferred to a cation exchanger based on a polystyrene matrix (e.g. AG50W-X8). which is in the NH ₄ form and has a grain size of 75 to 150 μΐη, filled column (26 χ 40) applied. After the sample solution has seeped in, the column is washed with distilled water until no substance can be detected in the eluate by UV spectrophotometry (wavelength 254 nm) (approx. 2 liters). This eluate is discarded. The column is eluted successively with 200 ml of 10% ammonia solution and 3 liters of distilled water. The collected eluates are concentrated in a vacuum rotary evaporator to one fifth of the original volume and finally freeze-dried. This gives about 550 mg of salt-free lyophilizate with an insulin-like effectiveness of 32 μΕ / mg.

Claims

Patent claims:

1. A method for isolating substances with insulin-like effectiveness from blood or blood components of calves or pigs by dialysis against a membrane of depleted blood or blood components permeable to a molecular weight of 5000 to 6000 and then concentrating and drying the dialysate, characterized in that blood or blood components of calves or pigs in the presence of preservatives after dilution with 0.5 to 5 volumes of a hydrophilic solvent adjusts to a pH value of 8 to 10 and ^{holds for a period of at least 4 hours at a temperature of 15 to 40 0} C, the material incubated in this way

ίο temperatures below 10 ⁰ C cools, dialyzed repeatedly against distilled water and isolated from the combined external dialysates by neutralization, concentration under vacuum and lyophilization, a substance mixture with a molecular weight of 350 to 5000, which has an insulin-like activity of 14 to 40 μΕ / mg solid .

2. The method according to claim 1, characterized in that afs blood or blood components by the Dialysis against a membrane of blood that is permeable to a molecular weight of 5000 to 6000 or Internal dialysate obtained from blood components at neutral pH.

3. The method according to claim 1, characterized in that the blood or blood components through Ultrafiltration against a membrane with an exclusion limit of 1000 Daltons obtained residue begins.