DE2551742A1 - PROTEASE, METHOD OF PRODUCING IT AND DETERGENT - Google Patents
PROTEASE, METHOD OF PRODUCING IT AND DETERGENTInfo
- Publication number
- DE2551742A1 DE2551742A1 DE19752551742 DE2551742A DE2551742A1 DE 2551742 A1 DE2551742 A1 DE 2551742A1 DE 19752551742 DE19752551742 DE 19752551742 DE 2551742 A DE2551742 A DE 2551742A DE 2551742 A1 DE2551742 A1 DE 2551742A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- enzyme
- protease
- solution
- culture broth
- alkali metal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
Description
" Protease, Verfahren zu ihrer Herstellung und Waschmittel " Priorität: 19. November 1974, Großbritannien, Nr. 50 044/74"Protease, process for its preparation and detergent" Priority: November 19, 1974, Great Britain, No. 50 044/74
Proteolytisch v/irkende Enzyme mit hoher proteolytischer Aktivität im alkalischen Bereich sind bekannt. Von Vetter (vgl. Antonie van Leeuwenhoek, Bd. 1 (1934), Seiten 141 bis 147) wurde ein Mikroorganismus beschrieben, der als Bacillus alcalophilus bezeichnet wurde. Dieser Mikroorganismus kann Gelatine und Hämoglobin in stark alkalischem Medium abbauen. Diese Eigenschaft des Mikroorganismus wird, wie spätere Untersuchungen ergaben (vgl. GB-PS 1 205 403), der Wirkung eines Enzyms zugeschrieben. Enzyme mit hoher Aktivität in alkalischen Medien sind auch aus der GB-PS 1 243 784 und der NL-OS 72.07050 bekannt. Darin werden mehrere proteolytisch v/irkende Enzyme beschrieben, die von Mikroorganismen der Gattung Bacillus gebildet werden und in Waschmittein verwendet werden können, die normalerweise alkalisch sind, wenn sie in der Yfaschflüssigkeit aufgelöst werden.Proteolytic enzymes with high proteolytic activity in the alkaline range are known. Von Vetter (cf. Antonie van Leeuwenhoek, Vol. 1 (1934), pages 141 to 147) was described a microorganism named Bacillus alcalophilus. This microorganism can gelatin as well Break down hemoglobin in a strongly alkaline medium. This property of the microorganism becomes, as later studies have shown (cf. GB-PS 1 205 403), attributed to the action of an enzyme. Are enzymes with high activity in alkaline media also known from GB-PS 1 243 784 and NL-OS 72.07050. Several proteolytic enzymes are described therein, which are produced by microorganisms of the genus Bacillus and which can be used in detergents which are normally used are alkaline when dissolved in the detergent liquid will.
609822/0929609822/0929
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein proteolytisch wirkendes Enzym (nachstehend kurz als Protease bezeichnet) mit hoher proteolytischer Aktivität in alkalischen Medien zu schaffen, das sich als Zusatz für Waschmittel eignet. Diese Aufgaben werden durch die Erfindung gelöst.The invention is based on the object of a proteolytic To create enzyme (hereinafter referred to as protease for short) with high proteolytic activity in alkaline media, which is suitable as an additive for detergents. These objects are achieved by the invention.
Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.The invention thus relates to that characterized in the claims Object.
Das Enzym kann in überraschend hohen Ausbeuten aus dem Mikroorganismus Bacillus nov. spec, mit der Bezeichnung PB 92, seinen nach üblichen Methoden hergestellten Mutanten oder Varianten erhalten werden. Die Ausbeuten sind höher als die, die beispielsweise mit dem in der NL-OS 72.07050 beschriebenen Stamm von Bacillus firmus erhalten werden. Ein weiterer unerwarteter Vorteil der Erfindung ist die überraschend gute Waschwirkung des Enzyms in perborathaltigen Waschmitteln. Eine Kultur des Mikroorganismenstammes Bacillus PB 92 ist im Laboratorium für Mikrobiologie der Technischen Universität DeIft, Niederlande, hinterlegt und hat dort die Bezeichnung OR-60 erhalten.The enzyme can be obtained from the microorganism in surprisingly high yields Bacillus nov. spec, with the designation PB 92, obtained its mutants or variants prepared by customary methods will. The yields are higher than those obtained, for example, with the strain of described in NL-OS 72.07050 Bacillus firmus can be obtained. Another unexpected advantage of the invention is the surprisingly good detergency of the enzyme in detergents containing perborate. A culture of the microorganism strain Bacillus PB 92 is in the laboratory for Microbiology from the Technical University of DeIft, the Netherlands, and has received the designation OR-60 there.
Die Protease der Erfindung wird durch Züchten von Bacillus PB 92 oder seiner Mutanten oder Varianten in einem Nährmedium, das übliche Kohlenstoff-, Stickstoff- und Spurenelementquellen enthält, unter aeroben Bedingungen und anschließendes Isolieren des erhaltenen, proteolytisch v/irkenden Enzyms aus der Kulturbrühe hergestellt.The protease of the invention is produced by growing Bacillus PB 92 or its mutants or variants in a nutrient medium, the usual sources of carbon, nitrogen and trace elements, under aerobic conditions and subsequent isolation of the proteolytically active enzyme obtained from the culture broth manufactured.
609822/0929609822/0929
Γ -3- 7551742"1 Γ -3- 7551742 " 1
Eigenschaften des Enzyms
(a) Beziehung pH-Wert/Aktivität Properties of the enzyme
(a) pH / activity relationship
Zur Bestimmung der Beziehung pH-Wert/Aktivität wird die Hämoglobinmethode nach Anson (vgl. J. Gen. Physiology, Bd. 22 (1939)» Seiten 79 bis 89) so genau wie möglich angewandt. Anweisungen, die nicht in dem Artikel von Anson angegeben sind, sind nachstehend aufgeführt:To determine the pH / activity relationship, the hemoglobin method according to Anson (cf. J. Gen. Physiology, Vol. 22 (1939) »pages 79 to 89) applied as precisely as possible. Instructions not provided in Anson's article are listed below:
Substrat:Substrate:
Rinderhämoglobulin, Proteasesubstrat gemäß Anson, rein lyophilisiert. Bovine hemoglobulin, protease substrate according to Anson, pure lyophilized.
Subs tratlö suns·:Subs step solutions:
Das Hämoglobin wird unter Rühren mit V/asser zu einer 22prozentigen Lösung (Gewicht/Volumen) vermischt. 10 ml dieser frisch angesetzten, konzentrierten Lösung v/erden mit 8 ml 1 η Natronlauge, 72 ml Wasser und 36 g Harnstoff versetzt und verdünnt. Die alkalische Lösung wird 60 Minuten auf 25°C erwärmt, um das Hämoglobulin zu denaturieren.The hemoglobin becomes 22 percent while stirring with water Solution (weight / volume) mixed. 10 ml of this freshly prepared, concentrated solution v / ground with 8 ml of 1 η sodium hydroxide solution, 72 ml of water and 36 g of urea are added and diluted. The alkaline solution is warmed to 25 ° C for 60 minutes to denature the hemoglobulin.
Es werden die nachstehenden Pufferlösungen, Harnstoff und Natriumäthylmercurithiosalicylat (Thiomersal) zugegeben. Der pH-Wert wird mit einer Elektrode (Ingold HA) eingestellt. Das Volumen wird so eingestellt, daß eine 2,2prozentige Hämoglobinlösung erhalten wird.The following buffer solutions, urea and sodium ethyl mercurithio salicylate (thiomersal) are added. Of the The pH value is adjusted with an electrode (Ingold HA). The volume is adjusted so that a 2.2 percent hemoglobin solution is obtained.
Als pH-Vergleichslösungen v/erden Pufferlösungen mit einem pH-Wert von 8,00, 9,00, 10,00, 11,00 und 12,00 eingesetzt. Es wird ein digitales pH-Meter verwendet.Buffer solutions with a pH value are used as pH comparison solutions of 8.00, 9.00, 10.00, 11.00 and 12.00 are used. It will used a digital pH meter.
L 6098?2/0929 ^ L 6098? 2/0929 ^
Γ - 4 - 2 B 51 7 A 2 π Γ - 4 - 2 B 51 7 A 2 π
Die Zusammensetzung des Puffers für die Substratlösung mit einem pH-Wert von 8 folgt nach der Beschreibung für die Trypsinbestimmung. Die Zusammensetzung der übrigen Pufferlösungen sind aus Dawson et al., "Date for Biochemical Research", 2. Ausgabe (1969), Oxford, S. 475 ff. entnommen.The composition of the buffer for the substrate solution with a pH value of 8 follows the description for the trypsin determination. The composition of the remaining buffer solutions are Taken from Dawson et al., "Date for Biochemical Research", 2nd Edition (1969), Oxford, pp. 475 ff.
Die Komponenten werden zur Substratlösung gegeben, bis die nachstehenden Endkonzentrationen erhalten werden: pH-Bereich 8,3.- 10,3: Puffersystem Glycin - NaOH (0,05 M) pH-Bereich 10,8- 11,3: Puffersystem Ka2HPO4 - NaOH (0,025 M) pH-Bereich 11,7- 12,5: Puffersystem KCl - NaOH (0,05 M).The components are added to the substrate solution until the following final concentrations are obtained: pH range 8.3-10.3: buffer system glycine - NaOH (0.05 M) pH range 10.8-11.3: buffer system Ka 2 HPO 4 - NaOH (0.025 M) pH range 11.7-12.5: Buffer system KCl - NaOH (0.05 M).
E_nzymlösung E_nzymlös un g
Es v/erden frische Lösungen in Wasser hergestellt. Eine verdünnte Lösung hat eine Enzymkonzentration von 200 DE/ml. LIe Bezeichnung DE bezieht sich auf Delft-Einheiten, die sich wiederum auf eine Methode zur .Bestimmung der Enzymaktivität beziehen, die in der GB-PS 1 353 317 beschrieben ist.Fresh solutions in water are prepared. A diluted one Solution has an enzyme concentration of 200 DE / ml. LIe designation DE refers to Delft units, which in turn refer to a method for determining enzyme activity, which is described in GB-PS 1,353,317.
Inkubation:Incubation:
Jede Analyse besteht aus zv/ei Bestimmungen und einer Blindbestimmung. Die Substrat- und Enzymlösimgen v/erden in einem Wasserbad auf 250C eingestellt. Der pH-Wert der Substratlösungen wird mit einer Elektrode (Ingold HA) bestimmt, wobei für pH-Werte unter 11,0 auch eine Elektrode (Ingold LOT) verwendet wird. Als pH-Vergleichslösungen werden Puffer-Vergleichslösungen verwendet. 2,5 ml der Substratlösung werden in einem Zentrifugenröhrchen mit 0,5 ml Enzymlösung versetzt und unmittelbar danach mit einem. Glasstab, der mit einem Griff versehen ist, durch Rühren _jEach analysis consists of two / one determinations and one blind determination. The substrate and Enzymlösimgen v / ground set in a water bath at 25 0 C. The pH value of the substrate solutions is determined with an electrode (Ingold HA), an electrode (Ingold LOT) also being used for pH values below 11.0. Buffer comparison solutions are used as pH comparison solutions. 2.5 ml of the substrate solution are mixed with 0.5 ml of enzyme solution in a centrifuge tube and immediately thereafter with a. Glass rod, which is provided with a handle, by stirring _j
6 0 9 8 2 2/09296 0 9 8 2 2/0929
■ - - 5 - 75M742"1 ■ - - 5 - 75M742 " 1
vermischt. Die Blindlösung, die kein Enzym enthält, wird ebenfalls inkubiert.mixed. The blank solution, which does not contain enzyme, is also used incubated.
Die Inkubation wird nach 10 Minuten durch Zugabe von 5 ml 0,3 η Trichloressigsäure beendet. Zur Blindlösung v/erden 5 ml der Trichloressigsäurelosung und 0,5 ml Enzymlösung zugegeben. Die Trichloressigsäurelosung wird mit einer ZIPPETTE zugegeben. Das Gemisch wird anschließend mit dem Glasstab, der mit einem Griff versehen ist, noch in dem Zentrifugenröhrchen stark gerührt. Anschließend werden die Zentrifugenröhrchen in ein Wasserbad von 2°C eingebracht.The incubation is ended after 10 minutes by adding 5 ml of 0.3 η trichloroacetic acid. Add 5 ml to the blank solution the trichloroacetic acid solution and 0.5 ml of enzyme solution were added. The trichloroacetic acid solution is added with a ZIPPETTE. The mixture is then with the glass rod that comes with is provided with a handle, still in the centrifuge tube strongly stirred. The centrifuge tubes are then placed in a 2 ° C water bath.
Die Drift des pH-Wertes während der Inkubation wird zu Beginn und am Ende der Inkubation mit einer Elektrode (LOT-Elektrode für pH-Werte unterhalb 11,0 und HA-Elektrode für pH-Werte oberhalb 11,0) gemessen. Die Drift des pH-Wertes beträgt weniger als 0,1 pH-Einheiten bei der Inkubation von Enzymlösungen, die 50 oder weniger DE/ml enthalten und weniger als 0,15 pH-Einheiten bei der Inkubation von Enzymlösungen, die 200 bis 500 DE/ml enthalten. Als Grundlage dienen Mittelwerte, die mit der HA-Elektrode erhalten wurden.The drift of the pH value during the incubation is measured at the beginning and at the end of the incubation with an electrode (LOT electrode for pH values below 11.0 and HA electrode for pH values above 11.0) measured. The drift of the pH value is less than 0.1 pH units when incubating enzyme solutions that are 50 or less DE / ml and less than 0.15 pH units when incubating enzyme solutions containing 200 to 500 DE / ml. Average values obtained with the HA electrode serve as the basis were obtained.
Nachdem die Inkubationslösungen mindestens 30 Minuten bei 20C gehalten wurden, werden die Zentrifugenröhrchen bei 6000 g zentrifugiert. After the incubation solutions have been kept at 2 ° C. for at least 30 minutes, the centrifuge tubes are centrifuged at 6000 g.
809822/0929809822/0929
-ο,-ο,
Die Farbentwicklung wird in einem Wasserbad bei 25WC durchgeführt. 5 ml des Überstandes werden mit 10 ml 0,5 η Natronlauge versetzt. Das Gemisch wird anschließend sofort mit einer Vortex-Genie- Vorrichtung gerührt. Nach genau 2 Minuten wird das Gemisch mit 3 ml eines Phenolreagenzes mit einer ZIPPETTE unter fortwährendem Rühren versetzt. Als Phenolreagenz wird das Folin-Ciocalteus-Phenolreagenz verwendet, das mit 2 Volumenteilen Wasser verdünnt wird.The color development is carried out in a water bath at 25 W C. 10 ml of 0.5 μm sodium hydroxide solution are added to 5 ml of the supernatant. The mixture is then immediately stirred with a Vortex Genie device. After exactly 2 minutes, 3 ml of a phenol reagent with a ZIPPETTE is added to the mixture while stirring continuously. The Folin-Ciocalteus phenol reagent, which is diluted with 2 parts by volume of water, is used as the phenol reagent.
Die Farbentwicklung wird mit einem Spektrometer mit automatischem Spalt bei 750 nm genau 6 Minuten nach der Phenol-Reagenz-Zugabe gemessen. Als Vergleichslösung zur Bestimmung der Farbentwicklung wird eine Tyrosinlösung verwendet, die 8 χ 10 Tyrosinäquivalente in 5 ml 0,2 η Salzsäure mit 0,5 Volumenprozent Formaldehyd enthält. Die Farbentwicklung der Vergleichslösung wird in gleichmäßigen Abständen überprüft. Die Abweichungen vom Mittelwert liegen dabei unter 1 % bei einem Ansatz eines verdünnten Phenolreagenzes,The color development is measured with an automatic slit spectrometer at 750 nm exactly 6 minutes after the phenol reagent has been added. As a comparison solution for determining the color development, a tyrosine solution is used which contains 8 × 10 tyrosine equivalents in 5 ml of 0.2 η hydrochloric acid with 0.5 percent by volume of formaldehyde. The color development of the comparison solution is checked at regular intervals. The deviations from the mean value are below 1 % when using a dilute phenol reagent,
Das Enzym weist folgende proteolytische Aktivität auf:The enzyme has the following proteolytic activity:
8710.3
87
9410 y 8
94
Aktivität.relative.
activity
609822/0929609822/0929
- 7 - ? S B1 7 4 2 π - 7 -? S B1 7 4 2 π
(b) Elektrophoreseuntersuchung (b) Electrophoresis study
Das Verhalten des Enzyms kann weiterhin durch die Zyciogramm-Methode gekennzeichnet werden, die auf einer Kombination der Discelektrophorose in Polyacrylamidgel und einer visuellen Beobachtung der Aktivität beruht. Die Methode ist von Zuidweg et al. in Biotech, and Bioeng., Bd. 14 (1972) Seiten 685 bis beschrieben und gestattet einen direkten Vergleich der Enzympräparate. Der Vergleich wirdThe behavior of the enzyme can be further determined by the zyciogram method marked on a combination of disk electrophorosis in polyacrylamide gel and visual observation the activity is based. The method is from Zuidweg et al. in Biotech, and Bioeng., Vol. 14 (1972) pp. 685 bis and allows a direct comparison of the enzyme preparations. The comparison will
(a) mit dem Enzym der Erfindung(a) with the enzyme of the invention
(b) einer Protease, die von einem Stamm der Gattung Bacillus erhalten wurde, der bei der National Collection of Type Cultures in London unter der Bezeichnung NCTC 4553 hinterlegt wurde (vgl. GB-PS 1 205 403),(b) a protease obtained from a strain belonging to the genus Bacillus registered in the National Collection of Type Cultures was deposited in London under the designation NCTC 4553 (see GB-PS 1 205 403),
(c) einem im Handel erhältlichen, proteolytisch wirkendem Enzym MAXATASE und(c) a commercially available, proteolytic enzyme MAXATASE and
(d) einem im Handel erhältlichen Enzym ESPERASE durchgeführt und ist in der Figur gezeigt. Die Figur weist nur die Hauptkomponenten der Präparate auf (als Puffersystem wird in der elektrophoreti sehen Trennung das System E verwendet, das 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol und Borsäure enthält ).(d) a commercially available enzyme ESPERASE and is shown in the figure. The figure has only the main components of the preparations (system E is used as the buffer system in the electrophoretic separation, the Contains 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol and boric acid ).
Die visuelle Beobachtung der Aktivität wird nach der Immersion-Kontakt-Technik (vgl. die Beschreibung von Zuidweg et al., a.a.O.) durchgeführt.The visual observation of the activity is carried out according to the immersion contact technique (cf. the description of Zuidweg et al., Op. Cit.).
Die Figur zeigt, daß das Enzym der Erfindung aus mehreren Verbindungen besteht, wobei sich die Zusammensetzung des Enzyms von den Zusammensetzungen der übrigen Enzym-Präparate unterscheidet. The figure shows that the enzyme of the invention is composed of several compounds exists, whereby the composition of the enzyme differs from the compositions of the other enzyme preparations.
6098??/09296098 ?? / 0929
- 8 - 75517-42- 8 - 75517-42
Amj.nosäure2usammeiisetzung des Enzyms der Erfindung
Die Aminosäurezusammensetzung der zwei Hauptkoraponenten A und B
(vgl. Figur) wird "bestimmt und ist in Tabelle I im Vergleich zu den Aminosäurezusammensetzungen mehrerer bekannter EnzymeDung Amj.nosäu re2 Usam meiisetzung the enzyme of the OF INVENTION
The amino acid composition of the two main coraponents A and B (see figure) is "determined and is in Table I in comparison with the amino acid compositions of several known enzymes
1. Subtilisin Carlsberg (vgl. Delange und Smith, J. Biol# Chem.1. Subtilisin Carlsberg (see Delange and Smith, J. Biol # Chem.
Bd. 243 (1968) S. 2134)Vol. 243 (1968) p. 2134)
2. Enzym von Bacillus Sacchariticus (vgl. US-PS 3 622 458)2. Bacillus sacchariticus enzyme (see US Pat. No. 3,622,458)
3. Enzym von Bacillus firraus (vgl. I1JL-OS 72.07050) und3. Bacillus firraus enzyme (cf. I 1 JL-OS 72.07050) and
4. Enzym von B 221 (vgl. K. Horikoshi, Agr. Biol. Chera., Bd. 35 (1971), S. 1407) gezeigt.4. Enzyme from B 221 (cf. K. Horikoshi, Agr. Biol. Chera., Vol. 35 (1971), p. 1407).
Der Fehler dieser Bestimmungen liegt bei +, 10 %. The error of these determinations is +. 10 %.
Die Tabelle zeigt weiterhin die Molekulargev/ichte der Enzyme
und ihre isoelektrischen Punkte.The table also shows the molecular weights of the enzymes
and their isoelectric points.
B09822/0929B09822 / 0929
„ a _"A _
? .S R1 7 A? .S R1 7 A
dun,? !Enzyme of Erf in-Ί
dun,? !
GewichtHoI.-
weight
trischer
PunktIsoelek-
tricer
Point
Taxonomi eTaxonomi e
Die taxonome Bestimmung wurde gemäß Smith, Gordon und Clark, "Aerobic Sporeforming Bacteria", U.S. Dept. of Agr., Monographie Nr. 16 (1952), durchgeführt. Die Sporulierung des Mikroorganismus Bacillus PB 92 kann durch KultivierenTaxonomic determination was made according to Smith, Gordon and Clark, "Aerobic Sporeforming Bacteria", U.S. Dept. of Agr., Monograph No. 16 (1952). The sporulation of the microorganism Bacillus PB 92 can be obtained by culturing
609822/0929609822/0929
lyophilisierter Kulturen von 65 Tage alten TSB-Agarkulturen (TSB : Trypton-Soya-Brühe aus Oxoid) auf TSB-Agar induziert werden.lyophilized cultures from 65 day old TSB agar cultures (TSB: tryptone soy broth from Oxoid) induced on TSB agar will.
(a) Vegetative Zellen: (bewegliche) Stäbchen, abgerundete Enden, im allgemeinen vereinzelt, aber auch in kurzen Ketten von 2 bis 8 Stäbchen; manchmal sehr lange Ketten mit einer Länge von mindestens 100Ou.(a) Vegetative cells: (mobile) rods, rounded ends, generally isolated, but also in short chains of 2 to 8 double crochets; sometimes very long chains with a length of at least 100Ou.
(b) Sporangien: Manchmal etwas verdickt(b) Sporangia: Sometimes a little thickened
(c) Sporen: 0,6 - 0,8 sowie 1,0 - 1,3 u; ellipsoid, dickwandig;subterminal bis parazentral.(c) spores: 0.6-0.8 and 1.0-1.3 u; ellipsoidal, thick-walled; subterminal to paracentral.
(d) Schattenformen: ziemlich viele; auch in der Mitte einer Kette von normalen Zellen.(d) shadow shapes: quite a few; also in the middle of a chain of normal cells.
Weitere Eigenschaften Other properties
Maximale Wachstumstemperatur: 5O0CMaximum growth temperature: 5O 0 C
Gram-positiv; nur aerobGram positive; aerobic only
Wachstum auf Nähragar bei pH-Viert von 7,2: etwas langsamerer Wachstumsbeginn als bei einem pH-Wert von 9,k. Die Kanten der Kolonien sind bei dem pH-Wert von 7,2 glattrandig, bei einem pH-Wert von 9,4 aber gewellt bis faserförmig.Growth on nutrient agar at pH four of 7.2: onset of growth is somewhat slower than at pH 9, k. The edges of the colonies are smooth-edged at pH 7.2, but wavy to fibrous at pH 9.4.
Keine Pigmentbildung auf Tyrosinagar bei einem pH-Wert von 9,5· Schwache Stärkehydrolyse auf Kartoffelstärke/Nähragar bei einemNo pigment formation on tyrosine agar at a pH value of 9.5 · Weak starch hydrolysis on potato starch / nutrient agar at one
pH-Wert von 9,5, . .pH value of 9.5,. .
Starke Verflüssigung von Gelatine auf Gelatine/Nähragar bei einem pH-Wert von 9,5.Strong liquefaction of gelatin on gelatin / nutrient agar a pH of 9.5.
Deutlicher Caseinabbau auf Milchagar bei einem -pH-Wert von 8,4·.Significant degradation of casein on milk agar with a pH value of 8.4.
609822/0929609822/0929
- ·Μ - ?551742- · Μ -? 551742
Kein oder kein wesentliches Wachstum auf Glucose- oder Monn.itagar mit Nitrat als einziger Stickstoffquelle. Positive Nitratreduktion in einer Nitrat/Nährbrühe bei einem pH-Wert von 9,5· No or no significant growth on glucose or Monn.itagar with nitrate as the sole nitrogen source. Positive nitrate reduction in a nitrate / nutrient broth at a pH value of 9.5
Der Mikroorganismus, der das Enzym der Erfindung produziert, wurde aus einer Bodenprobe in Sambia mit einer spezifischen Isolationsmethode bei einem pH-¥ert von 8,0 bis 9,5 isoliert.The microorganism which produces the enzyme of the invention was isolated from a soil sample in Zambia with a specific isolation method at a pH from 8.0 to 9 ¥ ert, 5 isolated.
Züchtungbreeding
Das von dem Mikroorganismus Bacillus PB 92 produzierte Enzym wird durch Züchten des Mikroorganismus und anschließendes Abtrennen des produzierten Enzyms in üblicher Weise erhalten. Zur Erzielung hoher Ausbeuten des Enzyms ist ein Medium nötig, das gut assimilierbare Kohlenstoff- und Energiequellen, wie Glucose, Sucrose, Dextrine oder Stärke, und Stickstoffquellen organischen Ursprungs enthält, wie Casein, Hefe oder Sojamehl. Weiterhin werden vorzugsweise bestimmte Mengen von Calcium- und Magnesiumsalzen sowie mehrere Spurenelemente zugegeben.The enzyme produced by the microorganism Bacillus PB 92 is obtained by culturing the microorganism and then separating the produced enzyme in a conventional manner. In order to achieve high yields of the enzyme, a medium is necessary that has readily assimilable carbon and energy sources, such as Contains glucose, sucrose, dextrins or starch, and nitrogen sources of organic origin, such as casein, yeast or soy flour. Furthermore, certain amounts of calcium and magnesium salts and several trace elements are preferably added.
Während der Züchtung ist eine gute Belüftung notwendig. Der pH-Wert des Mediums wird bei 6,5 bis 10, vorzugsweise bei 7 bis 9, gehalten. Die Züchtungstemperatur liegt bei 570C.Good ventilation is necessary during cultivation. The pH of the medium is kept at 6.5-10, preferably 7-9. The cultivation temperature is 57 0 C.
Bei Beachtung dieser Maßnahmen können sehr hohe Ausbeuten (Proteaseaktivität pro g umgesetzte Glucose) erhalten werden. Die Ausbeute ist hinreichend hoch für eine wirtschaftliche Herstel-If these measures are observed, very high yields (protease activity per g of converted glucose) can be obtained. the Yield is sufficiently high for economical manufacture
lung des Enzyms. _jdevelopment of the enzyme. _j
609822/0929609822/0929
Abtrennung des Enzyms Separation of the enzyme
Das Enzym wird aus der Kulturbrühe in üblicher Weise abgetrennt. Die Brühe wird filtriert, um die Mikroorganismen und unlösliches Material abzutrennen. Zur Herstellung wasserfreier Waschmittel wird das Enzym im allgemeinen durch Zugabe wassermischbarer organischer Lösungsmittel oder anorganischer Salze, wie Natriumsulfat oder Ammoniumsulfat, zum Filtrat ausgefällt. Für eine wirtschaftliche Herstellung wird das Filtratvolumen zuerst durch Verdampfen eingeengt, bevor die Lösungsmittel oder die Salze zugegeben werden. Für flüssige Waschmittel können die filtrierte Brühe oder das wieder aufgelöste Enzym verwendet . werden.The enzyme is separated off from the culture broth in the usual way. The broth is filtered to remove the microorganisms and separate insoluble material. For the production of anhydrous detergents, the enzyme is generally made water-miscible by adding it organic solvents or inorganic salts such as sodium sulfate or ammonium sulfate, precipitated to the filtrate. For economical production, the volume of the filtrate is concentrated by evaporation first before the solvents or salts are added. For liquid detergents, the filtered broth or the redissolved enzyme used. will.
Nach dem Ausfällen wird das Enzym durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt. Anschließend wird der erhaltene Filterrückstand getrocknet.After precipitation, the enzyme is removed by filtration or centrifugation severed. The filter residue obtained is then dried.
Das Enzym kann in üblicher Weise Waschmitteln einverleibt werden. Die Menge des verwendeten Enzyms entspricht im allgemeinen der Menge, bei der das gesamte Waschmittel eine proteolytische Aktivität von ungefähr 100 bis 5000 DE/g, vorzugsweise 500 bis 1000 DE/g#besitzt. Die Bestimmung der proteolytischen Aktivität ist in der GB-PS 1 553 317 beschrieben.The enzyme can be incorporated into detergents in the usual way. The amount of enzyme used generally corresponds to the amount in which the total detergent has a proteolytic activity of approximately 100 to 5000 DE / g, preferably 500 to 1000 DE / g # . The determination of the proteolytic activity is described in GB-PS 1,553,317.
Die Waschmittel mit dem Enzym der Erfindung· enthalten weiterhin mindestens ein Tensid. Als Tenside in Waschmittein werden diejenigen Tenside eingesetzt, die allgemein in Waschmitteln mit en-The detergents with the enzyme of the invention also contain at least one surfactant. As surfactants in detergents are those Surfactants are used, which are generally used in detergents with
L 609822/0929 L 609822/0929
R .S 1 7 4 2 Π R .S 1 7 4 2 Π
zyma"bischer Aktivität verwendet v/erden. Im allgemeinen können nicht-ionische und anionische oberflächenaktive Verbindungen, wie wasserlösliche Seifen, anionische, nicht-ionische, ampholytische oder zwitterionische Tenside, verwendet werden. Ein Beispiel eines allgemein verwendeten Tensids ist Dodecylbenzolsulfonat. Üblicherweise liegen die Tenside, die allein oder im Gemisoh verwendet werden können, in einer Menge von ungefähr 4 bis 20 % des Waschmittels vor.In general, nonionic and anionic surface active compounds such as water soluble soaps, anionic, nonionic, ampholytic or zwitterionic surfactants can be used. An example of a commonly used surfactant is dodecylbenzenesulfonate Surfactants, which can be used alone or in the Gemisoh, in an amount of approximately 4 to 20 % of the detergent.
Die Waschmittel der Erfindung können weitere zusätzliche Verbindungen enthalten, die allgemein in Waschmitteln mit proteolytischer Aktivität verwendet werden. Sie enthalten üblicherweise komplexe Phosphate, beispielsweise ein Alkalimetalltripolyphosphat oder ein Alkalimetallpyrophosphst, vorzugsweise in Mengen von etwa 40 bis 50 Gewichtsprozent, bezogen auf das Waschmittel. Weiterhin oder alternativ können Verbindungen, wie ein Alkalimetallcyanotriacetat oder ein Alkalimetallcitrat, verv/endet werden. Ihre Wirkung in Waschmitteln ist komplex, wobei • aber ihre Wirkung als Wasserweichmacher die größte Bedeutung hat. Weitere Verbindungen, die üblicherweise zur Herstellung von Waschmitteln verwendet werden, sind beispielsweise Alkalimetallsilikate, im allgemeinen in Mengen von 1 bis 10 Gewichtsprozent, schwach alkalische Verbindungen, wie Alkalimetallbicarbonate, im allgemeinen in Mengen von höchstens 20 Gewichtsprozent, Füllstoffe, 'beispielsweise Alkalimetallsulfate, und v/eitere Verbindungen, wie Carboxymethylcellulose, Duftstoffe und optische Aufheller. Eine weitere üblich verwendete Verbindung ist ein Alkalimetallperborat, insbesondere Natriumperborat. InThe detergents of the invention can contain other additional compounds which are commonly used in detergents with proteolytic activity. They usually contain complex phosphates such as an alkali metal tripolyphosphate or an alkali metal pyrophosphate, preferably in amounts from about 40 to 50 percent by weight, based on the detergent. Furthermore or alternatively, compounds such as an alkali metal cyanotriacetate or an alkali metal citrate can be used will. Their effect in detergents is complex, but • their effect as a water softener is of the greatest importance Has. Other compounds that are commonly used for the production of detergents are, for example, alkali metal silicates, generally in amounts of 1 to 10 percent by weight, weakly alkaline compounds such as alkali metal bicarbonates, generally in amounts of at most 20 percent by weight, fillers, for example alkali metal sulfates, and other substances Compounds such as carboxymethyl cellulose, fragrances and optical brighteners. Another commonly used compound is an alkali metal perborate, especially sodium perborate. In
L -JL -J
609822/0929609822/0929
Verbindung mit den Perboraten zeigt das Enzym der Erfindung eine unerwartet hohe Stabilität.In conjunction with the perborates, the enzyme of the invention exhibits an unexpectedly high stability.
Die Waschmittel können in üblicher Weise hergestellt werden, beispielsweise durch Vermischen der Komponenten oder durch Her stellen eines Teilgemisches, das anschließend mit den üblichen Komponenten vermischt wird. Vorzugsweise wird das Enzym mit einem oder mehreren der üblichen Verbindungen, beispielsweise dem Füllstoff, vermischt, um ein Konzentrat mit einer zuvor bestimmten enzymatisehen Aktivität herzustellen, das wiederum mit den anderen Komponenten vermischt v/erden kann.The detergents can be prepared in the usual way, for example by mixing the components or by Her provide a partial mixture, which is then mixed with the usual components. Preferably the enzyme is with one or more of the usual compounds, for example the filler, mixed to make a concentrate with a previously to produce certain enzymatic activity, which in turn mixed with the other components / can be grounded.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.The examples illustrate the invention.
Züchtung des Mikroorganismus Bacillus P3 92. Es wird folgendes Medium verwendet: e/h't rCultivation of the microorganism Bacillus P3 92. The following medium is used: e / h't r
Hefe (bezogen auf das Trockengewicht) 22 K2HPO4.3H2O 5Yeast (based on dry weight) 22 K 2 HPO 4 .3H 2 O 5
MgSO4.7H2O 0,05MgSO 4 .7H 2 O 0.05
CaCl2 0,05CaCl 2 0.05
FeSO4.7H2O 0,005FeSO 4 .7H 2 O 0.005
MnSO4.4H2O 0,005MnSO 4 .4H 2 O 0.005
Die Komponenten des Mediums v/erden in 90 % des Endvolumens gelöst. Anschließend wird die Lösung 1 Stunde bei einem pH-Wert von 7,0 und einer Temperatur von 12O0C sterilisiert.The components of the medium are dissolved in 90% of the final volume. Then the solution is sterilized for 1 hour at a pH of 7.0 and a temperature of 12O 0 C.
L 609822/0929 L 609822/0929
7 427 42
Die Impfkultür wird durch Impfen von 100 ml Trypticase—Soja-Brühe (0xoid)f zu der nach 20minütigem Sterilisieren bei 1200C 4 ml 1 M Natriumcarbonatlösung aus einem Schrägröhrchen zugegeben wurde, mit dem Mikroorganismus Bacillus PB 92 erhalten. Die Impfkultur wird 24 Stunden bei 300C auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert.The Impfkultür is by inoculating 100 ml trypticase soy broth (0xoid) f after 20 minutes of sterilization at 120 0 C 4 ml of 1 M sodium carbonate solution was added from a slant tube to that obtained with the microorganism Bacillus PB 92nd The seed culture is incubated for 24 hours at 30 0 C on a shaker.
Das Medium wird bei 370C und einem pH-Wert von 8,0 mit 1 Volumenteil der Impfkultur pro 100 Volumenteile Medium beimpft. Die Hauptzüchtung wird bei 370C in Rührfermentern durchgeführt, die mit einer pH-Regelvorrichtung, einer Temperaturregelvorrichtung, einer Antischaumvorrichtung und einer Vorrichtung für das kontinuierliche Messen der Konzentration des gelösten Sauerstoffs und der Sauerstoffaufnahmegeschwindigkeit ausgerüstet ist. 17 Stunden nach dem Impfen wird eine 30prozentige Glucoselösung, die 1 Stunde bei 1200C sterilisiert wurde, bis zu einer Endkonzentration von 30 g Glucose pro Liter Medium zugegeben. The medium is inoculated at 37 0 C and a pH of 8.0 with 1 volume of the inoculum culture per 100 parts by volume of medium. The main culture is carried out at 37 0 C in stirred fermenters, which is equipped with a pH control device, a temperature control device, an anti-foam device and a device for continuously measuring the concentration of dissolved oxygen and the oxygen uptake rate. 17 hours after inoculation, a 30 percent glucose solution, which has been sterilized at 120 ° C. for 1 hour, is added up to a final concentration of 30 g glucose per liter of medium.
Die erhaltenen Ergebnisse v/eisen auf eine Ausbeute des proteolytisch wirkenden Enzyms von etv/a 8 χ 10 DE/g verbrauchte Glucose hin.The results obtained indicate a yield of the proteolytic active enzyme of about 8-10 DE / g consumed Glucose.
In Beispiel 1 der NL-OS 72.07050 ist ein Züchtungsversuch beschrieben, bei dem eine Endausbeute von 11 χ-10 DE/Liter Kulturbrühe erhalten wird (50 Anson-Einheiten entsprechen etv/a 11 χ 10 DE). Die Menge der verwendeten Kohlenhydrate entspricht etwa 75 g Glucose/Liter Kulturbrühe. Die Ausbeute anIn example 1 of NL-OS 72.07050 a breeding experiment is described, with a final yield of 11 χ-10 DE / liter of culture broth is obtained (50 Anson units correspond to etv / a 11 χ 10 DE). Corresponds to the amount of carbohydrates used about 75 g glucose / liter of culture broth. The yield at
6098?/ /09 2S6098? / / 09 2 p
- ie .-■■ 7 5 51 7 Λ 2- ie .- ■■ 7 5 51 7 Λ 2
Protease/g verbrauchte Glucose im Beispiel der NL-OS 72.07050 entspricht 1,5 x 10 DE. Das bedeutet, daß die Ausbeute des Enzyms der Erfindung etwa 5 mal größer ist.Protease / g glucose consumed in the example of NL-OS 72.07050 corresponds to 1.5 × 10 DE. This means that the yield of the Enzyme of the invention is about 5 times larger.
Beispiel 2
Waschwirkunfi
Die Waschuntersuchungen werden auf folgende Weise ausgeführt:Example 2
Washing effect
The washing tests are carried out in the following way:
(a) zu untersuchende Kleidungstückproben: EMPA-116 (verschmutzt mit Blut, Milch und chinesischer Tinte) von der Eidgenössischen Materialprüfungs- und Versuchsanstalt für Industrie, Bauwesen und Gewerbe, St. Gallen, Schweiz. Die zu untersuchenden Kleidungsstückproben werden im Dunkeln und luftdicht aufbewahrt. Zur Waschuntersuchung werden Stücke von 5 x 5 cm aus einem visuell homogenen Teil des Kleidungsstücks ausgeschnitten.(a) Clothing samples to be tested: EMPA-116 (soiled with blood, milk and Chinese ink) from the Federal Materials Testing and Research Institute for Industry, Construction and Commerce, St. Gallen, Switzerland. The garment samples to be tested become dark and airtight kept. Pieces of Cut 5 x 5 cm from a visually homogeneous part of the garment.
(b) Waschlaugen: 4 g eines perborathaltigen, handelsüblichen Waschmittels ohne Enzym pro Liter synthetisches Leitungswasser mit einer Härte von 15°d (deutscher Härtegrad). Das synthetische Wasser wird auf folgende Weise hergestellt: 10 ml einer Lösung von 0,656 % MgCIg in destilliertem Wasser werden mit 10 ml einer Lösung von 2 % CaCl2 (pA) in destilliertem Wasser in einem 1000 ml Meßkolben versetzt und kräftig vermischt. Die erhaltene Lösung wird anschließend unter Rühren mit 10 ml einer Lösung von 2', 1 % NaHCO, vermischt und mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.(b) Lye: 4 g of a commercially available laundry detergent containing perborate without enzyme per liter of synthetic tap water with a hardness of 15 ° d (German degree of hardness). The synthetic water is prepared as follows: 10 ml of a solution of 0.656 % MgClg in distilled water are mixed with 10 ml of a solution of 2 % CaCl 2 (pA) in distilled water in a 1000 ml volumetric flask and mixed vigorously. The solution obtained is then mixed with 10 ml of a solution of 2 ', 1 % NaHCO 3, while stirring, and made up to 1000 ml with distilled water.
609822/0929609822/0929
— 1 / —- 1 / -
? 5 5 1 7 4 2 π ? 5 5 1 7 4 2 π
(c) Waschuntersuchung: 250 ml Waschlauge werden jeweils in einer ausreichenden Zahl von 300 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben. Das Enzym wird anschließend in einer Menge von 0, 250, 500 und 1000 DE/g Waschmittel jeweils in einem doppelten Ansatz zugegeben. Die Erlenmeyerkolben werden in einem Schüttelthermostaten bei 450C gehalten, in dem sie unter Schütteln aufgewärmt werden. Anschließend wird jeweils eine Kleidungsstückprobe in den Erlenmeyerkolben zugegeben, die genau 1 Stunde bei A-5°C geschüttelt v/erden. Nach dem Waschen wird die Waschlauge dekantiert. Es werden 250 ml synthetisches Leitungswasser zu den Erlenmeyer-Kolben zugegeben. Die Kolben v/erden mit Gummistopfen verschlossen und genau 1 Minute kräftig geschüttelt. Die Kleidungstückprobsn werden in einem Becherglas gesammelt, in dem sie mit langsam fließenden Leitungswasser gespült werden. Nach Zugabe der letzten Kleidungsstückprobeil wird das Spülen etwa 10 Minuten fortgesetzt. Anschließend läßt man die Kleidungstückproben, die in einem weißen sauberen Handtuch zusammengefaltet sind, an der Luft im Dunkeln trocknen.(c) Washing test: 250 ml of washing liquor are added to a sufficient number of 300 ml Erlenmeyer flasks. The enzyme is then added in an amount of 0, 250, 500 and 1000 DE / g detergent in duplicate. The Erlenmeyer flasks are kept in a shaking thermostat at 45 ° C., in which they are warmed up while shaking. Then a garment sample is added to each Erlenmeyer flask, which is shaken for exactly 1 hour at A-5 ° C. After washing, the washing liquor is decanted. 250 ml of synthetic tap water are added to the Erlenmeyer flasks. The flasks are closed with rubber stoppers and shaken vigorously for exactly 1 minute. The clothing samples are collected in a beaker in which they are rinsed with slowly flowing tap water. After the final garment samples have been added, rinsing continues for about 10 minutes. The clothing samples, which are folded up in a white clean towel, are then allowed to air dry in the dark.
Nach dem Trocknen wird die Remission in einem Rernissionsmeßgerät beidseitig bestimmt, v/obei MgO als Referenz substanz verwendet wird. Die Mittelwerte werden hinsichtlich einer vollständig rein gewaschen Kleidungsstückprobe berechnet, die eine Remission von 65,8 % bezogen auf MgO besitzt.After drying, the remission is determined on both sides in a remission measuring device, v / whether MgO is used as a reference substance. The mean values are calculated for a completely washed garment sample which has a remission of 65.8 % based on MgO.
609822/0929609822/0929
- -18 -- -18 -
75517427551742
Vergleich des Enzyms der Erfindung mit MAXATASE und ESPBRASE Die Waschuntersuchungen werden gemäß der vorstehenden Weise bei einem pH-Viert von 9>7 durchgeführt. In Tabelle II sind die Ergebnisse zusammengefaßt. Comparison of the enzyme of the invention with MAXATASE and ESPBRASE The washing tests are carried out according to the above manner at a pH-fourth of 9> 7. The results are summarized in Table II.
Die Tabelle zeigt, daß unter den Untersuchungsbedingungen das Enzym der Erfindung eine bessere Waschwirkung als die handelsüblichen Enzyme Maxatase und Esperase auf v/eist.The table shows that under the test conditions, the enzyme of the invention has a better washing effect than the commercially available ones Enzymes Maxatase and Esperase on v / eist.
609822/0929609822/0929
Claims (4)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB50044/74A GB1519148A (en) | 1974-11-19 | 1974-11-19 | Compositions of matter |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2551742A1 true DE2551742A1 (en) | 1976-05-26 |
| DE2551742B2 DE2551742B2 (en) | 1980-07-17 |
| DE2551742C3 DE2551742C3 (en) | 1981-05-07 |
Family
ID=10454444
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE2551742A Expired DE2551742C3 (en) | 1974-11-19 | 1975-11-18 | Protease preparation and its use in detergents |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4002572A (en) |
| JP (3) | JPS5624512B2 (en) |
| BE (1) | BE835693A (en) |
| CH (1) | CH626916A5 (en) |
| DE (1) | DE2551742C3 (en) |
| DK (1) | DK146964C (en) |
| FI (1) | FI55848C (en) |
| FR (1) | FR2292042B1 (en) |
| GB (1) | GB1519148A (en) |
| IE (1) | IE42844B1 (en) |
| IT (1) | IT1050910B (en) |
| LU (1) | LU73826A1 (en) |
| NL (1) | NL167995C (en) |
| NO (1) | NO147311C (en) |
| SE (2) | SE435396B (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5453200A (en) * | 1990-11-26 | 1995-09-26 | Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien | Precifitation process for exocellular proteins |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4243582A (en) * | 1979-04-26 | 1981-01-06 | Monsanto Company | Novel glycoproteins from bovine cartilage |
| JPS6055118B2 (en) * | 1982-02-08 | 1985-12-03 | 昭和電工株式会社 | Novel bacterial alkaline protease and its production method |
| JPS58181409U (en) * | 1982-05-27 | 1983-12-03 | 藤沢 秀丸 | An auxiliary device that attaches to a portable electric drill device to drill vertically. |
| US5801038A (en) * | 1984-05-29 | 1998-09-01 | Genencor International Inc. | Modified subtilisins having amino acid alterations |
| US5972682A (en) * | 1984-05-29 | 1999-10-26 | Genencor International, Inc. | Enzymatically active modified subtilisins |
| US4797362A (en) * | 1985-06-06 | 1989-01-10 | Lion Corporation | Alkaline proteases and microorganisms producing same |
| US4764470A (en) * | 1986-02-05 | 1988-08-16 | Genex Corporation | Alkaline protease produced by a bacillus |
| DK386586D0 (en) * | 1986-08-14 | 1986-08-14 | Novo Industri As | PROTEASE, PROCEDURE FOR PREPARING IT AND USING THEREOF |
| JP3026567B2 (en) * | 1987-02-27 | 2000-03-27 | ジェネンコー インターナショナル インコーポレイテッド | Molecular cloning and expression of genes encoding proteolytic enzymes |
| EP0479396B1 (en) * | 1987-02-27 | 1999-06-09 | Genencor International, Inc. | Transformation of alkalophilic bacillus strains |
| JP2637532B2 (en) * | 1987-02-27 | 1997-08-06 | ギスト ブロカデス ナームローゼ フェンノートチャップ | Stable gene amplification in chromosomal DNA of prokaryotic microorganisms |
| JPS6455179A (en) * | 1987-08-27 | 1989-03-02 | Kao Corp | Production of isocitric dehydrogenase |
| US4865983A (en) * | 1987-12-04 | 1989-09-12 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Cleaning compositions containing protease produced by vibrio and method of use |
| US6287841B1 (en) | 1988-02-11 | 2001-09-11 | Genencor International, Inc. | High alkaline serine protease |
| PT89702B (en) * | 1988-02-11 | 1994-04-29 | Gist Brocades Nv | PROCESS FOR PREPARING NEW PROTEOLITIC ENZYMES AND DETERGENTS THAT CONTAINS THEM |
| US5324653A (en) * | 1988-02-11 | 1994-06-28 | Gist-Brocades N.V. | Recombinant genetic means for the production of serine protease muteins |
| US5352603A (en) * | 1989-08-31 | 1994-10-04 | Kali-Chemie Ag | Highly alkaline proteases |
| JPH06506597A (en) * | 1991-03-29 | 1994-07-28 | ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド | Alkaline protease 3733, its production and use in cleaning contact lenses |
| DK58391D0 (en) * | 1991-04-03 | 1991-04-03 | Novo Nordisk As | HIS UNKNOWN PROTEAS |
| CA2066556A1 (en) * | 1991-04-26 | 1992-10-27 | Toyoji Sawayanagi | Alkaline protease, method for producing the same, use thereof and microorganism producing the same |
| DE69333463D1 (en) * | 1992-05-18 | 2004-05-06 | Genencor Int | Bacteria producing alkaline proteases, and process for producing these alkaline proteases |
| AU7524994A (en) * | 1993-08-12 | 1995-03-14 | University Of Maryland | Thermostable alkaline metalloprotease produced by a hyphomonas, and preparation thereof |
| US6777218B1 (en) * | 2000-03-14 | 2004-08-17 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes having an improved wash performance on egg stains |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1234445A (en) * | 1967-10-03 | 1971-06-03 | ||
| GB1205403A (en) * | 1967-11-10 | 1970-09-16 | Novo Terapeutisk Labor As | Preparation of proteolytic enzyme preparations |
| US3622458A (en) * | 1968-10-02 | 1971-11-23 | Sanraku Ocean Co | Production of a new protease |
| US3838009A (en) * | 1968-10-25 | 1974-09-24 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Process for producing detergent resisting alkaline protease |
| FI47779C (en) * | 1969-04-10 | 1974-03-11 | Astra Laekemedel Ab | Method for preparing a hydrolytic enzyme mixture. |
| US3652399A (en) * | 1969-04-30 | 1972-03-28 | Takeda Chemical Industries Ltd | Alkali protease |
| GB1395895A (en) * | 1971-05-28 | 1975-05-29 | Novo Terapeutisk Labor As | Enzyme products |
| JPS5345395B2 (en) * | 1972-03-18 | 1978-12-06 | ||
| JPS5039151B2 (en) * | 1972-09-02 | 1975-12-15 | ||
| JPS564236B2 (en) * | 1972-11-11 | 1981-01-29 |
-
1974
- 1974-11-19 GB GB50044/74A patent/GB1519148A/en not_active Expired
-
1975
- 1975-11-13 NO NO753801A patent/NO147311C/en unknown
- 1975-11-18 FI FI753247A patent/FI55848C/en not_active IP Right Cessation
- 1975-11-18 DK DK518575A patent/DK146964C/en not_active IP Right Cessation
- 1975-11-18 DE DE2551742A patent/DE2551742C3/en not_active Expired
- 1975-11-18 FR FR7535216A patent/FR2292042B1/en not_active Expired
- 1975-11-18 BE BE161972A patent/BE835693A/en not_active IP Right Cessation
- 1975-11-18 NL NL7513433A patent/NL167995C/en not_active IP Right Cessation
- 1975-11-18 IT IT69844/75A patent/IT1050910B/en active
- 1975-11-18 LU LU73826A patent/LU73826A1/xx unknown
- 1975-11-18 CH CH1492475A patent/CH626916A5/de not_active IP Right Cessation
- 1975-11-18 IE IE2517/75A patent/IE42844B1/en unknown
- 1975-11-18 US US05/633,026 patent/US4002572A/en not_active Expired - Lifetime
- 1975-11-18 SE SE7512938A patent/SE435396B/en not_active IP Right Cessation
- 1975-11-18 JP JP13864975A patent/JPS5624512B2/ja not_active Expired
-
1976
- 1976-02-26 JP JP51020538A patent/JPS51125407A/en active Granted
-
1977
- 1977-12-30 US US05/866,179 patent/USRE30602E/en not_active Expired - Lifetime
-
1980
- 1980-04-09 JP JP4669580A patent/JPS55148086A/en active Granted
-
1981
- 1981-07-06 SE SE8104191A patent/SE442749B/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NICHTS ERMITTELT * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5453200A (en) * | 1990-11-26 | 1995-09-26 | Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien | Precifitation process for exocellular proteins |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS51125407A (en) | 1976-11-01 |
| DE2551742B2 (en) | 1980-07-17 |
| DK518575A (en) | 1976-05-20 |
| SE8104191L (en) | 1981-07-06 |
| GB1519148A (en) | 1978-07-26 |
| USRE30602E (en) | 1981-05-05 |
| JPS5742310B2 (en) | 1982-09-08 |
| FI55848C (en) | 1979-10-10 |
| FR2292042B1 (en) | 1985-07-05 |
| FI55848B (en) | 1979-06-29 |
| SE7512938L (en) | 1976-05-20 |
| NO147311C (en) | 1983-03-16 |
| CH626916A5 (en) | 1981-12-15 |
| DE2551742C3 (en) | 1981-05-07 |
| NO147311B (en) | 1982-12-06 |
| NL167995B (en) | 1981-09-16 |
| JPS5624512B2 (en) | 1981-06-06 |
| BE835693A (en) | 1976-05-18 |
| SE435396B (en) | 1984-09-24 |
| SE442749B (en) | 1986-01-27 |
| JPS5616200B2 (en) | 1981-04-15 |
| JPS55148086A (en) | 1980-11-18 |
| LU73826A1 (en) | 1976-06-11 |
| NO753801L (en) | 1976-05-20 |
| DK146964C (en) | 1984-08-06 |
| JPS5182783A (en) | 1976-07-20 |
| NL7513433A (en) | 1976-05-21 |
| DK146964B (en) | 1984-02-27 |
| FR2292042A1 (en) | 1976-06-18 |
| IE42844B1 (en) | 1980-11-05 |
| IT1050910B (en) | 1981-03-20 |
| FI753247A (en) | 1976-05-20 |
| US4002572A (en) | 1977-01-11 |
| NL167995C (en) | 1982-02-16 |
| IE42844L (en) | 1976-05-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE2551742A1 (en) | PROTEASE, METHOD OF PRODUCING IT AND DETERGENT | |
| DE1800508C3 (en) | Process for the production of proteolytic enzyme preparations and their use | |
| DE69433032T2 (en) | LIQUIDIFYING - [alpha] -AMYLASE, METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF, AND DETERGENT COMPOSITION CONTAINING THE SAME | |
| DE2926808A1 (en) | PROTEASE PRODUCT WITH REDUCED ALLERGENIC EFFECT, PRODUCTION PROCESS AND DETERGENT | |
| DE2026092C3 (en) | Process for the production of an alkaline protease | |
| DE1807185C3 (en) | Process for the production of preparations containing proteolytic enzymes and their use | |
| DE2453111A1 (en) | PROCESS FOR PRODUCING NEW ENZYMES | |
| DE2224777A1 (en) | NEW ALKALINE PROTEOLYTIC ENZYME, ITS PRODUCTION AND USE | |
| CH620471A5 (en) | ||
| DE2334463A1 (en) | METHOD OF OBTAINING PROTEOLYTIC ENZYMES, THE PROTEOLYTIC ENZYMS SO MANUFACTURED AND THEIR USES | |
| DE1906001C3 (en) | Alkali proteases and detergents containing them | |
| DE2167078C2 (en) | Amylase prepn - for prodn of maltose from starch | |
| AT394730B (en) | METHOD FOR PRODUCING EXO- AND ENDOCELLULASE-FREE XYLANASE | |
| EP0145798B1 (en) | Bacillus subtilis dsm 2704 and process for the preparation of alpha-amylase | |
| DE3834550A1 (en) | PROTEOLYTIC ENZYME, ITS MANUFACTURE AND USE | |
| DE2925427C2 (en) | Process for the production of protease | |
| DE2164018B2 (en) | PROCESS FOR THE BIOTECHNICAL PRODUCTION OF URICASE | |
| DE3328619A1 (en) | Alkaline protease and process for the preparation thereof | |
| DE2435247C2 (en) | β-Amylase, its manufacture and use | |
| DE2107461A1 (en) | Process for the production of alkaline dextranase enzyme | |
| DE2033822A1 (en) | Hydrolytic enzyme mixture and processes for its production | |
| DE1936437A1 (en) | Process for the production of proteases and the proteases produced thereby | |
| AT394574B (en) | Main wash detergent | |
| DE2063988A1 (en) | Protease of high enzymatic activity - prepd by culture of bacillus licheniformis, used in industrial cleaning | |
| DE4017522A1 (en) | New cellulase-free xylanase enzyme - produced by culturing thermomyces lanuginosus on lignocellulose |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |