DE2547696A1 - Antiviral ionic complex of linear polyarginine - and natural double-chain ribonucleic acid or its derivative - Google Patents

Antiviral ionic complex of linear polyarginine - and natural double-chain ribonucleic acid or its derivative

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Abstract

Antiviral substance comprises a mainly ionic complex in which the cationic part is a linear polyarginine having at least 5 arginine units and the anionic part is (a) a double chain ribonucleic acid polyanion, the double chain ribonucleic acid being of natural origin or (b) a polyanion of a double chain deriv. of a natural double chain ribonucleic acid. The complexes are antivirals with a broad spectrum of activity against both RNA and DNA viruses e.g. encephalomyocarditis (EMC) virus, Semlike Forest virus, foot and mouth disease virus and Herpes Simplex. At least part of their activity is due to induction of interferons in the cells of the host. The LD50 in mice of these complexes is less than the LD50 of the RNA alone.

Description

"Antivirale Substanz, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese"Antiviral substance, process for its preparation and these

Substanz enthaltende Arzneipräparate" Es ist an sich bekannt, daß doppelstrangige Ribonucleinsäuren, die nachstehend RNS abgekürzt werden, hochwirksame Interfer-or.-Induktoren und daher von großer Bedeutung ur die Breitspektrum-Prophylaxe von Virusinfektionen sind und in einem geringeren Ausmaß auch zur Behandlung derartiger Infektionen eingesetzt werden können. Sowonl die synthetischen als auch die Ribonucleinsäuren natürlichen Ursprungs weisen Interferon-Induktoren-Aktivität sowie antivirale Aktivität in Gewebekulturen und bei Tieren auf. Doppelstrangige Ribonucleinsäuren mit antiviraler Aktivität können z.B.Medicinal preparations containing substance "It is known per se that double-stranded ribonucleic acids, which are abbreviated to RNA below, are highly effective Interfer-or-inducers and therefore of great importance for broad-spectrum prophylaxis of viral infections and, to a lesser extent, are used to treat such Infections can be used. Both the synthetic and the ribonucleic acids of natural origin show interferon inducer activity as well as antiviral activity in tissue cultures and in animals. Double-stranded ribonucleic acids with antiviral Activity can e.g.

aus Viruspartikeln extrahiert werden, die u.a. in bestimmten infizierten Pilzen vorkommen, wie in einigen Stämmen von Penicillium chrysogenum, Penicillium funiculosum, Penicillium stoloniferum, Aspergillus niger und Aspergillus roetidus. Außerdem kommen der tige Ribonucleinsäuren in cytoplasmatischen Polyhedrosisviren, in Reovirus-3-Virion sowie in der replikativen Phagenform MS2 aus E.coli und in der replikativen Phagenform von MU9 eines mutanten E. coli vor.can be extracted from virus particles that are found in certain infected Fungi occur, as in some strains of Penicillium chrysogenum, Penicillium funiculosum, Penicillium stoloniferum, Aspergillus niger and Aspergillus roetidus. In addition, the term ribonucleic acids occur in cytoplasmic polyhedrosis viruses, in Reovirus-3 virion and in the replicative phage form MS2 from E. coli and in the replicative phage form of MU9 of a mutant E. coli.

Es bestehen Jedoch Anzeichen dafür, daß doppelstrangige Ribonucleinsäuren natürlichen Ursprungs beim Menschen und bei Tieren eine zu hohe toxische Nebenwirkung haben. Ihre Anwendung in der Human- und der Veterinärmedizin ist daher beschränkt.However, there is evidence that double-stranded ribonucleic acids of natural origin in humans and animals too high a toxic side effect to have. Their use in human and veterinary medicine is therefore limited.

Es besteht daher ein Bedarf für ein antivirales Mittel, das weniger toxisch als doppelstrangige Ribonucleinsäure allein ist, und dessen antivirale Aktivität vergleichbar oder besser ist.There is therefore a need for an antiviral agent that is less is toxic than double stranded ribonucleic acid alone, and its antiviral activity is comparable or better.

Es ist an sich bekannt, daß Nucleinsäuren mit vielen basischen Polypeptiden, wie Protaminen und Polylysin, ionische Komplexe bilden. Die meisten dieser Arbeiten jedoch belassen sich mit den Komplexen von Polybasen und Desoxyribonucleinsäure und einstrangiger Ribonucleinsäure. Diese Polybase-Nucleinsäure-Komplexe sind gegen Nuclease-Abbau und thermische Denaturierung stabiler als die Stamm-Nucleinsäure. Als man entdeckte, daß synthetische doppelstrangige Ribonucleinsäuren Interferon-Induktoren sind, glaubte man, daß die Behandlung der doppelstrangigen Ribonucleinsäure mit Polybasen zu einer Stabilisierung gegen den Abbau durch nbenuclcase führt und somit zu einer verbesserten oder verlängerten antiviralen Aktivität in vivo. Die Ergebnisse dieser Arbeiten waren Jedoch nicht sehr ermutigend. Billiau und Mitarbeiter (siehe Ann. N.Y. Acad. Sci., 173 (1), 5. 657 (1970)) berichteten, daß die Stimulierung durch doppelstrangige Ribonucleinsäure 4eç Interferon-Mechanismus in Gewebekulturen bis zu 100fach erhöht werden kann durch Zugabe von polybasischen Substanzen, wie Neomycin, Streptomycin, Diäthyla.minoäthyldextran, methyliertem Albumin, Protamin, Histon und Colistin. Diese Verbindungen waren dafür bekannt, daß sie die Wirkung der Ribonuclease hemmen oder die Aufnahme von Ribonucleinsäure in die Zelle erhöhen. Billiau und Mitarbeiter vermuten, daß "einige dieser basischen Substanzen für die Therapie von Virus-Infektionen durch Interferon-Induktoren geeignet sein könnten", schränken Jedoch ein, daß "die Interferon-Induktion durch Poly-I : Poly-C in vivo durch Diäthylaminoäthyldextran, jedoch nicht durch Neomycin oder Protamin erhöht würde".It is known per se that nucleic acids with many basic polypeptides, like protamines and polylysine, form ionic complexes. Most of this work however, left with the complexes of polybases and deoxyribonucleic acid and single stranded ribonucleic acid. These polybase-nucleic acid complexes are against Nuclease degradation and thermal denaturation more stable than the parent nucleic acid. When it was discovered that synthetic double-stranded ribonucleic acids were interferon inducers it was believed that treating double-stranded ribonucleic acid with Polybases lead to a stabilization against the degradation by nbenuclcase and thus to improved or prolonged antiviral activity in vivo. The results however, this work has not been very encouraging. Billiau and coworkers (see Ann. N.Y. Acad. Sci., 173 (1), pp. 657 (1970)) reported that the stimulation by double-stranded ribonucleic acid 4eç interferon mechanism in tissue cultures increased up to 100 times can be made by adding polybasic Substances such as neomycin, streptomycin, diethyla.minoäthyldextran, methylated Albumin, protamine, histone and colistin. These compounds were known to that they inhibit the action of the ribonuclease or the uptake of ribonucleic acid increase in the cell. Billiau et al suggest that "some of these are basic Substances suitable for the therapy of virus infections by interferon inducers could be "but that" limit the induction of interferon by poly-I : Poly-C in vivo by diethylaminoethyldextran, but not by neomycin or Protamine would increase ".

Hochmolekulares Poly-D-Lysin erhöht die Interferon-Induktion durch Poly-I : Poly-C in Mäusen und ist diesbezüglich dem Diäthylaminoäthyldextran überlegen (siehe Rice und Mitarbeiter in 1,?ppl.High molecular weight poly-D-lysine increases the induction of interferon Poly-I: Poly-C in mice and is superior to diethylaminoethyldextran in this regard (see Rice and co-workers in 1,? ppl.

Microbiol. 19 (5), S. 867 (1970)). Die mit einer Kombination von Poly-I : Poly-C und Poly-D-Lysin behandelten Tiere zeigten keine unmittelbaren Zeichen von Toxizität, die Dosis des Materials lag jedoch deutlich unter der Dosis, bei der die toxischen Wirkungen von Poly-I : Poly-C allein auftreten.Microbiol. 19 (5), p. 867 (1970)). Those with a combination of Poly-I : Poly-C and poly-D-lysine treated animals showed no immediate signs of toxicity, but the dose of the material was well below the dose that the toxic effects of Poly-I: Poly-C occur alone.

Die FR-PS 178 953 offenbart ein Präparat, das 1 mg doppelstrangige Ribonucleinsäure, 200 µg Polyornithin und 50 mg Vitamin B6 enthält. Das Polyornithin soll die Aufnahme der Ribonucleinsäure in die Zellen erhöhen.The FR-PS 178 953 discloses a preparation that 1 mg double-stranded Contains ribonucleic acid, 200 µg polyornithine and 50 mg vitamin B6. The polyornithine is said to increase the uptake of ribonucleic acid in the cells.

Die Literatur ließ vermuten, daß Komplexe von gewissen Polybasen mit doppelstrangiger Ribonucleinsäure die Interferon-Spiee1 in vitro und in vivo erhöhen und/oder verlängern Wurden. Es ist Jedoch bekannt, daß der Interferon-Spiegel nicht unbedingt mit der antiviralen Aktivität parallel geht. Eine Verbindung, die nur eine geringe Interferon-induzierende Wirkung hat, kann jedoch ein sehr gutes antivirales Mittel sein und umgekehrt. Außerdem besteht in der Literatur keine Übereinstimmung darüber, welche Art von Polybase notwendig ist, um in vivo erhöhte Interferon-Spiegel zu erreichen. Kombinationen von Protamin und doppelstrangiger Ribonucleinsäure scheinen weniger zufriedenstellend zu sein als doppelstrangige Ribonucleinsäuren allein, wogegen Kombinationen von doppelstrangiger Ribonucleinsäure und Diäthylaminoäthyldextran ihr überlegen sind. Diese widersprechenden Ergebnisse machen es unmöglich, zu sagen, ob und welche einen ionischen Komplex bildende Kombination von doppelstrangiger Ribonucleinsaure mit einer Polybase bezüglich der Interferon-induzierenden Aktivität, xeniger der antiviralen Aktivität, der doppelstrangignn Ribonueleinsäure allein überlegen ist.The literature suggested that complexes of certain polybases with double-stranded ribonucleic acid increase the levels of interferon in vitro and in vivo and / or have been extended. It is However known that the interferon level does not necessarily parallel antiviral activity. A connection that has only a slight interferon-inducing effect, but it can be a very good one be antiviral and vice versa. In addition, there is no consensus in the literature about what kind of polybase is necessary to raise interferon levels in vivo to reach. Combinations of protamine and double stranded ribonucleic acid appear to be less satisfactory than double-stranded ribonucleic acids alone, whereas combinations of double-stranded ribonucleic acid and diethylaminoethyldextran are superior to her. These contradicting results make it impossible to say whether and which combination of double-stranded ones forming an ionic complex Ribonucleic acid with a polybase for interferon-inducing activity, x less antiviral activity, double-stranded ribonueleic acid alone is superior.

Die Brauchbarkeit eines antiviralen Mittels hängt im wesentlichen von zwei Faktoren ab: Von der Dauer der durch eine bestimmte Dosis des Mittels erreichten Schutzwirkung und der Toxizität des Mittels.The usefulness of an antiviral agent essentially depends depends on two factors: On the duration of the achieved by a certain dose of the agent Protective effect and toxicity of the agent.

Die Dauer der Schutzwirkung hängt nicht unbedingt von der Fak;igkeit, die Interferon-Produktion zu induzieren, ab, und wird daher auch nicht, gemäß der Literatur, von der Zugabe einer Polybase beeinflußt. Was die Toxizität eines antiviralen Mittels betrifft, ist in der Literatur nichts zu finden.The duration of the protective effect does not necessarily depend on the ability induce interferon production, and therefore will not, according to the Literature influenced by the addition of a polybase. As for the toxicity of an antiviral Concerning means, nothing can be found in the literature.

Es wurde nun festgestellt, daß Komplexe von doppelstrangiger Ribonucleinsäure natürlichen Ursprungs mit Polyarginin weniger tcx-c' sind, zumindest bei kleinen Säugetieren, als die doppelstrangige Stamm-Ribonucleinsäure,und daß diese Komplexe eine längere antivirale Schutzwirkung haben als die entsprechende Ribonucleinsäure.It has now been found that complexes of double-stranded ribonucleic acid of natural origin with polyarginine are less tcx-c ', at least for small ones Mammals, than the double-stranded Parent ribonucleic acid, and that these complexes have a longer antiviral protective effect than the corresponding one Ribonucleic acid.

Gegenstand der Erfindung ist somit eine antivirale Substanz, die im wesentlichen ein ionischer Komplex ist, der dadurch gekennzeichnet ist, daß die Kationen Polykationen eines linearen Polyargininmoleküls mit mindestens 5 Arginin-Einheiten und die Anionen entweder a) Polyanionen einer doppelstrangigen Ribonucleinsäure natürlichen Ursprungs oder b) Polyanionen eines doppelstrangigen Derivats einer natürlichen doppelstrangigen Ribonucleinsäure sind.The invention thus provides an antiviral substance that is in the is essentially an ionic complex, which is characterized in that the Cations Polycations of a linear polyarginine molecule with at least 5 arginine units and the anions either a) polyanions of a double-stranded ribonucleic acid of natural origin or b) polyanions of a double-stranded derivative of a are natural double stranded ribonucleic acid.

Der Ausdruck "doppelstrangig" bezeht sich auf die Tatsache, daß zwei getrennte Ribonucleinsäure-Noleküle durch Wasserstoff-Brükkenbindung zwischen den komplementären Basen längs des Molekals assoziiert sind. Die Ribonucleinsäuren können verschieden stark "doppelstrangig" sein.The term "double stranded" refers to the fact that two separated ribonucleic acid molecules by hydrogen bonding between the complementary bases are associated along the molecule. The ribonucleic acids can be "double-stranded" to different degrees.

Der Ausdruck "doppelstrangige Ribonucleinsäure natürlichen Ursprungs" betrifft jede doppelstrangige Ribonucleinsäure, die aus den oben angegebenen Pilzen extrahiert werden kann, und schließt synthetische doppelstrangige Ribonucleinsäuren, wie Polyinosinyl-: Polycytidylsäure (Poly-I : Poly-C), Polyadenyl-: Polyuridylsäure (Poly-A : Poly-U) und Polyguanidyl-: Polycytidylsäure (Poly-G : Poly-C) aus.The term "double-stranded ribonucleic acid of natural origin" refers to any double-stranded ribonucleic acid obtained from the mushrooms listed above can be extracted, and includes synthetic double-stranded ribonucleic acids, such as polyinosinyl: polycytidylic acid (poly-I: poly-C), polyadenyl: polyuridylic acid (Poly-A: Poly-U) and polyguanidyl-: polycytidylic acid (Poly-G: Poly-C).

Der Ausdruck "doppelstrangiges Derivat einer natürlichen doppelstrangigen Ribonucleinsäure" betrifft Jede natürliche doppelstrangige Ribonucleinsaure, die einer chemischen oder biochemischen (z.B. enzymatischen) Reaktion unterworfen wurde, welche die primäre und/oder sekundäre und/oder tertiäre Struktur verändert (z.B. die N-Oxide gemäß der GB-PS 1 284 150 oder die alkali-modifizierten doppelstrangigen Ribonucleinsäuren gemäß DT-OS 2 201 513). Voraussetzung ist, daß das entstandene Derivat noch einen wesentlichen Teil der Basenpaare der komplementären Stränge besitzt.The term "double-stranded derivative of a natural double-stranded Ribonucleic Acid "refers to any natural double-stranded Ribonucleic acid, which are subjected to a chemical or biochemical (e.g. enzymatic) reaction which changes the primary and / or secondary and / or tertiary structure (e.g. the N-oxides according to GB-PS 1 284 150 or the alkali-modified double-stranded Ribonucleic acids according to DT-OS 2 201 513). The prerequisite is that the Derivative still has a substantial part of the base pairs of the complementary strands.

Die Doppelstrangigkeit einer doppelstrangigen Ribonucleinsäure oder deren Derivat kann durch zwei Parameter, die Hyperchromizität und den Tm-Wert, charakterisiert werden. Diese Parameter werden durch Aufzeichnen der UV-Absorption des Materials bei 260 nm erhalten, während die Temperatur allmählich gesteigert wird. Die UV-Absorption einer doppelstrangigen Ribonueleinsäure bei dieser Wellenlange steigt mit steigender Temperatur, bis ein konstanter Wert erreicht ist, der der Absorption der thermisch denaturierten (z.3 einstrangigen) Ribonucleinsäure entspricht. Die Differenz zwischen den beiden Grenzwerten der Absorption, ausgedrückt als Prozentsatz der Absorption des doppelstrangigen Materials, wird als die "Hyperchromizität" dieses Materials bezeichnet.The double-stranded nature of a double-stranded ribonucleic acid or its derivative can be characterized by two parameters, the hyperchromicity and the Tm value will. These parameters are determined by recording the UV absorption of the material obtained at 260 nm while gradually increasing the temperature. The UV absorption a double-stranded ribonueleic acid at this wavelength increases with increasing Temperature until a constant value is reached, that of the absorption of the thermal denatured (e.g. 3 single-stranded) ribonucleic acid corresponds. The difference between the two limit values of the absorption expressed as a percentage of the absorption of double stranded material, is called the "hyperchromicity" of that material designated.

Wird die UV-Absorption bei 260 nm eines doppelstrangigen Materials gegen die Temperatur aufgetragen, so stellt man fest, daß die Absorption bei hohen Temperaturen größer als bei niedrigen Temperaturen ist. Die Temperatur, bei der die Absorption in der Mitte zwischen der Absorption des doppelstrangigen Materials und der des thermisch denaturierten (z.B. einstrangigen) Materials liegt, wird als Tm-Wert dieses Materials bezeichnet.The UV absorption at 260 nm of a double-stranded material Plotted against the temperature, it is found that the absorption at high Temperatures is greater than at low temperatures. The temperature at which the absorption in the middle between the absorption of the double stranded material and that of the thermally denatured (e.g. single-stranded) material is called Denotes the Tm value of this material.

Das im erfindungsgemäßen Komplex als Kation verwendete Polyarginin-Molekül hat ein Molekulargewicht von 1500 bis 1 000 000, vorzugsweise etwa 6500. "Linear" heißt, daß in dem Polyarginin-Molekl keine Vernetzungen zwischen den basischen Aminogruppen der Arginin-Einheiten bestehen.The polyarginine molecule used as a cation in the complex according to the invention has a molecular weight of 1,500 to 1,000,000, preferably about 6,500. "Linear" means that there are no crosslinks between the basic amino groups in the polyarginine molecule of arginine units.

Als Polyarginin-Molekül geeignet ist ein Poly-D-, Poly-L- oder Poly-D,L-Arginin-Molekül. Bevorzugt ist ein Poly-L-Arginin-Molekül.A poly-D, poly-L or poly-D, L-arginine molecule is suitable as a polyarginine molecule. A poly-L-arginine molecule is preferred.

Vorzugsweise stammen die als Polyanionen verwendeten doppelstrangigen Ribonucleinsäuren aus Virus teilchen, die in bestimmten infizierten Pilzen vorhanden sind, z.B. in bestimmten Pilzen der Gattung Penicillia, z.B. ?.chrysogenu:ri ( GB-PS 1 170 929), P.stolontperum (Banks und Mitarbeiter, Nature, Bd. 223, S. 155 (1968)) und Aspergilli, z.B. A.niger und A.foetidus (G3-PS l 300 259). Vorzugsweise sorten die Polyanionen(4 und(b) die Interferon-Produktion in lebenden Säugetieren induzieren (das kann durch die Methode von G.P. Lampson, A.A. Tytell, A.K. Field, M.M. Nemes und M.R. Hilleman in "Proc.Nat.Acad.Sci.", Bd. 58, S. 782 (1967) besttigt werden).The double-stranded polyanions used as polyanions are preferably derived Ribonucleic acids from virus particles that are present in certain infected fungi are, e.g. in certain fungi of the genus Penicillia, e.g.? .chrysogenu: ri (GB-PS 1 170 929), P. stolontperum (Banks and co-workers, Nature, Vol. 223, p. 155 (1968)) and Aspergilli, e.g., A. niger and A. foetidus (G3-PS 1,300,259). Preferably varieties the polyanions (4 and (b)) induce interferon production in living mammals (this can be done by the method of G.P. Lampson, A.A. Tytell, A.K. Field, M.M. Nemes and M.R. Hilleman in "Proc.Nat.Acad.Sci.", Vol. 58, p. 782 (1967)).

Die erfindungsgemäße antivirale Substanz ist im wesentlichen ein ionischer Komplex der durch eine starke elektrostatische liechselwirkung zwischen dem kationischen Polyarginin-Anteil und dem anionischen Anteil der Ribonucleinsäure charakterisiert ist. Es sind Jedoch auch andere Arten von Wechselwirkungen möglich; Genaues über diese Art von Bindungen weiß man jedoch nicht.The antiviral substance of the present invention is essentially ionic Complex of the by a strong electrostatic interaction between the cationic Characterized polyarginine content and the anionic content of ribonucleic acid is. However, other types of interactions are also possible; Exactly about however, these types of ties are not known.

In den erfindungsgemäßen Komplexen sind praktisch alle anionischen Stellen der doppelstrangigen Ribonucleinsäure durch entsprechende kationische Stellen des Polyarginins neutralisiert, wobei die kationischen Stellen die basischen Aminogruppen der Argininmonomere sind. Um diese Neutralisation der kationischen und anionischen Stellen zu erreichen, verwendet man das Polyarginin entweder als einzelnes Molekül mit einer den anionischen Stellen der doppelstrangigen Ribonucleinsäure entsprechenden Anzahl an kationischen Stellen oder als kleinere Polyarginin-Moleküle, wobei die Summe der kationischen Stellen den anionischen Stellen der doppelstrangigen Ribonucleinsäure entspricht. Mit diesen "1 : Komplexe erhält man eine lange antivirale Schutzdauer und eine niedrige Toxizität.In the complexes according to the invention, practically all are anionic Place the double-stranded ribonucleic acid through corresponding cationic places of the polyarginine neutralized, the cationic sites being the basic amino groups of arginine monomers. To this neutralization of the cationic and anionic To reach places, one uses the polyarginine either as a single molecule with one corresponding to the anionic sites of double-stranded ribonucleic acid Number of cationic sites or as smaller polyarginine molecules, with the Sum of the cationic sites and the anionic sites of the double-stranded ribonucleic acid is equivalent to. With these "1: complexes one obtains a long antiviral protection period and low toxicity.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur IIerstellung der antiviralen Substanz, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in Lösung linear es Polyarginin oder dessen Salz entweder mit a) Polyanionen einer doppelstrangigen Ribonucleinsäure natürlochen Ursprungs oder b) Polyanionen eines doppelstrangigen Derivats einer natürlichen doppelstrangigen Ribonucleinsäure umsetzt.The invention also relates to a method for producing the antiviral Substance which is characterized in that in solution there is linear polyarginine or its salt either with a) polyanions of a double-stranded ribonucleic acid of natural origin or b) polyanions of a double-stranded derivative of a converts natural double-stranded ribonucleic acid.

Man kann die Polyarginin-Polykationen in wässriger Lösung mit den Ribonucleinsäure-Polyanionen umsetzen. So kann man Polarginlnhydrochlorid in der wässrigen Lösung eines anorganischen Salzes, z.B. Natriumchlorid, lösen und mit einer entsprechenden Lösung der Ribonucleinsäure vermischen. Wenn die Molarität der entstandenen Salzlösung nicht zu hoch ist, fallt der komplex sofort aus.You can use the polyarginine polycations in aqueous solution with the Implement ribonucleic acid polyanions. So you can polar gine hydrochloride in the aqueous solution of an inorganic salt, e.g. sodium chloride, and dissolve with mix with an appropriate solution of ribonucleic acid. When the molarity the resulting saline solution is not too high, the complex fails immediately.

Ist das nicht der Fall, so kann man die Lösung zur Verminderung der Molarität verdünnen, der Komplex fällt dann aus.If this is not the case, the solution can be to reduce it the Dilute the molarity, the complex then precipitates.

Man kann aber auch ein Gemisch des neutralen Polyarginins und der Ribonucleinsäure oder deren Derivat zu einer Salzlösung zugeben und die entstandene Lösung gegebenenfalls verdünnen, um den Komplex auszufällen.But you can also use a mixture of the neutral polyarginine and the Add ribonucleic acid or its derivative to a salt solution and the resulting If necessary, dilute the solution to precipitate the complex.

Vorzugsweise verwendet man einen geringen Uberschuß an Polyarginin-Polykationen, wobei der Überschuß anhand der basischen Aminogruppen, die mit den Phosphorsäuregruppen der Ribonucleinsäure-Polyanionen reagieren können, berechnet wird.A small excess of polyarginine polycations is preferably used, the excess based on the basic amino groups with the phosphoric acid groups the ribonucleic acid polyanions can react is calculated.

Die erfindungsgemäßen Komplexe besitzen antivirale Aktivität mit einem breIten Spektrum gegen eine Anzahl von Desoxyribonucleinsäure- und Ribonucleinsäure-Viren, z.B. Encephalomyocarditls-Virus, Semliki-Forest-Virus, gegen den Maul- und Klauenseuche hervorrufenden Virus und gegen den Herpes-Simplex-Virus. Vermutlich induzieren die erfindungsgemäßen Komplexe die Interferon-Produktion in den Wirtzellen und schützen somit gegen den Angriff der Viren.The complexes of the invention have antiviral activity with a broad spectrum against a number of deoxyribonucleic acid and ribonucleic acid viruses, e.g. Encephalomyocarditls virus, Semliki Forest virus, against foot and mouth disease causing virus and against the herpes simplex virus. Presumably they induce Complexes according to the invention protect the interferon production in the host cells and thus against the attack of viruses.

berraschenderweise ist die Toxizität dieser Komplexe (gemessen als ID bei Mäusen) niedriger als die von Ribonucleinsäure allein.Surprisingly, the toxicity of these complexes (measured as ID in mice) lower than that of ribonucleic acid alone.

Die Erfindung betrifft somit Arzneipräparate, die durch einen Gehalt an erfindungsgemäßer antiviraler Substanz als Wirkstoff, gegebenenfalls in Kombination mit pharmakologisch verträglichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln gekennzeichnet sind.The invention thus relates to medicinal preparations which, by means of a content of the antiviral substance according to the invention as an active ingredient, optionally in combination labeled with pharmacologically acceptable carriers and / or diluents are.

Die Wahl des Trägerstoffes richtet sich nach der bevorzugten Art der Verabreichung. Man kann die erfindungsgemäßen Arzneipräparate z+,B. subcutan oder intramuskulär injizieren. Die erfindungsgemäße antivirale Substanz ist dann im Verdünnungsmittel entweder gelöst oder als feine Dispersion suspendiert. Bei lokaler Anwendung, z.B. an der Schleimhaut der Nase oder des Rachens, ist der Trägerstoff ein Verdünnungsmittel.The choice of carrier depends on the preferred type of Administration. You can use the pharmaceutical preparations according to the invention z +, B. subcutaneous or inject intramuscularly. The antiviral substance according to the invention is then in the diluent either dissolved or suspended as a fine dispersion. For local use, e.g. on the mucous membrane of the nose or throat, the carrier is a diluent.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Die Abkürzung "d.s.-RNS" bedeutet doppelstrangige Ribonucleinsäure.The examples illustrate the invention. The abbreviation "d.s.-RNS" means double stranded ribonucleic acid.

Beispiel 1 Herstellung eines Komplexes aus ds-RNS, die aus P.chrysogenum, ATCC 10002 virusähnlichen Partikeln isoliert wurde, und Polyarginin Eine gerührte Lösung von 100 mg ds-iNS-Natriumsalz in 200 ml 0,15 m Natriumchlorid wird bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 200 mg Poly-L-Arginin mit einem Molekulargewicht von 6500 in 200 ml 0,15 m Natriumchlorid versetzt. Es fällt sofort ein Niederschlag aus. Das Reaktionsgemisch wird 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann zentrifugiert. Gemäß dem W-Spektrum enthält die überstehende Lösung keine Nucleinsäure . Der Niederschlag wird mit 200 ml wasser, dann mit 200 ml Methanol gewaschen und bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck getrocknet. ;4an erhalt 162 mg des Komplexes als weißen Feststoff. Das Produkt ist in 3 m Natriumchlorid unlöslich. Zur die biologischen Versuche wird der erfindungsgemäße Komplex als Suspension eingesetzt. Example 1 Preparation of a complex from ds-RNA obtained from P.chrysogenum, ATCC 10002 virus-like particles was isolated, and polyarginine was stirred Solution of 100 mg of ds-iNS sodium salt in 200 ml of 0.15 M sodium chloride is made at room temperature with a solution of 200 mg poly-L-arginine with a molecular weight of 6500 in 200 ml of 0.15 M sodium chloride are added. A precipitate forms immediately. That The reaction mixture is stirred for 16 hours at room temperature and then centrifuged. According to the W spectrum, the supernatant solution does not contain any nucleic acid. The precipitation is washed with 200 ml of water, then with 200 ml of methanol and at room temperature dried under reduced pressure. ; 4an receives 162 mg of the complex as a white Solid. The product is insoluble in 3M sodium chloride. To the biological The complex according to the invention is used as a suspension for experiments.

Biologische Daten (a) Toxizität bei Mäusen Die Toxizität der als Ausgangsmaterial eingesetzten doppelstrangigen Ribonucleinsäure und der nach Beispiel 1 hergestellten Komplexe wird in 16 bis 20 g schweren Mäusen, Stamm CD1, verglichen.Biological data (a) Toxicity in mice The toxicity of the starting material used double-stranded ribonucleic acid and that prepared according to Example 1 Complex is compared in 16 to 20 g mice, strain CD1.

Die Verbindungen werden intraperitoneal injiziert, die Tiere werden 10 Tage lang beobachtet. Tabelle I faßt die Ergebnisse zusammen.The compounds are injected intraperitoneally, the animals become Observed for 10 days. Table I summarizes the results.

Tabelle 1 Toxizität des erfindungsgemäßen antiviralen Komplexes. Die Dosis bezieht sich auf die Menge an jeweils vorhandener doppelstrangiger Ribonucleinsäure. Die Sterblickeit ist in Anzahl toter Tiere/Anzahl von Tieren in einer Gruppe angegeben Dosis Sterblich- LD50 Verbindung (mg/kg) keit (mg/kg) ds-RMS-Polyarginin- Komplex in 1,5 m NaCl (Suspension) 25 0/5 7100 50 o/5 100 0/5 ds-RNS in 0,15 m NaCl 12,5 1/10 25 25 5/10 50 9/10 (b) Antivirale A: Die Verbindungen werden 16 bis 20 g schweren Mäusen, Stamm CD1, intraperitoneal injiziert. 24 oder 72 Stunden später werden diesen Müssen eine oder zwei Verdünnungen von Encephalomyocarditis-Virus intraperitoneal inJiziert. Die Tiere werden 12 Tage lang beobachtet, die Sterblichkeit wird mit der unbehandelter Kontrollmäuse verglichen. Tabelle II faßt die Ergebnisse zusammen. T a b e l l e II Antivirale Kurzzeitaktivität des erfindungsgemäßen ds-RNS-Polyarginin-Komplexes. Anzahl toter Tiere von 10 in jeder Gruppe Antivirale Daten (Encephalomyocarditis-Virus) Verbindung 3 Tage vor der Verbindung 1 Tag vor der Virusinfketion verabreicht Virusinfketion verabreicht Verbindung Virus-Dosis Virus-Dosis Virus-Dosis Virus-Dosis 10-4 10-5 10-4 10-5 Verbindung-Dosis (mg/kg) 5 0,5 0,05 5 0,5 0,05 5 0,5 0,05 5 0,5 0,05 ds-RNS in 0,15 m NaCl 9 9 7 3 4 7 4 3 6 0 2 2 ds-RNS/Poly-L-Arginin- Komplex, Suspension in 1,5 m NaCl 10 10 10 8 7 6 10 10 9 5 10 9 unbehandelte Kontrollen Virale Dosis Virale Dosis Sterblichkeit 10-4 20/20 10-5 18/20 B e i s p i e l 2 Herstellung eines Komplexes aus ds-RNS, die aus P.chrysogenum ATCC 10002 Virusähnlichen Partikeln isoliert wurde, und Polyarginin Eine gerührte Lösung von 500 mg ds-RNS-Natriumsalz in 500 ml 0,15 m Natriumchlorid wird bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 318 mg Poly-L-Arginin-Hydrochlorid (Miles-Code-Nr. 71-103A) in 100 ml 0,15 m Natriumchlorid versetzt. Es fällt ein Niederschlag aus. Das Gemisch wird 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann über Nacht bei 4 0C stehengelassen. Der Niederschlag wird zentrifugiert. Gemäß dem UV-Spektrum enthält die überstehende Lösung keine Nucleinsäure. Der Niederschlag wird in Ö ml 0,15 m Natriumchlorid suspendiert und noch einmal zentrifugiert.Table 1 Toxicity of the antiviral complex according to the invention. The dose relates to the amount of double-stranded ribonucleic acid present in each case. The dying time is given in the number of dead animals / number of animals in a group Dose Mortal LD50 Compound (mg / kg) ability (mg / kg) ds-RMS-polyarginine- Complex in 1.5 M NaCl (Suspension) 25 0/5 7 100 50 o / 5 100 0/5 ds-RNA in 0.15 M NaCl 12.5 1/10 25 25 5/10 50 9/10 (b) Antiviral A: The compounds are injected intraperitoneally into mice weighing 16 to 20 g, strain CD1. Twenty-four or 72 hours later, they must be injected intraperitoneally with one or two dilutions of encephalomyocarditis virus. The animals are observed for 12 days and the mortality is compared with that of untreated control mice. Table II summarizes the results. Table II Short-term antiviral activity of the ds-RNA-polyarginine complex according to the invention. Number of dead animals out of 10 in each group Antiviral data (encephalomyocarditis virus) Connection 3 days before connection 1 day before Viral Infection Administered Viral Infection Administered Compound virus dose virus dose virus dose virus dose 10-4 10-5 10-4 10-5 Compound Dose (mg / kg) 5 0.5 0.05 5 0.5 0.05 5 0.5 0.05 5 0.5 0.05 ds-RNA in 0.15 M NaCl 9 9 7 3 4 7 4 3 6 0 2 2 ds-RNA / poly-L-arginine Complex, suspension in 1.5 m NaCl 10 10 10 8 7 6 10 10 9 5 10 9 untreated controls Viral Dose Viral Dose Mortality 10-4 20/20 10-5 18/20 EXAMPLE 2 Preparation of a complex of ds-RNA, which was isolated from P.chrysogenum ATCC 10002 virus-like particles, and polyarginine A stirred solution of 500 mg of ds-RNA sodium salt in 500 ml of 0.15 M sodium chloride is mixed with a solution at room temperature of 318 mg of poly-L-arginine hydrochloride (Miles code no. 71-103A) in 100 ml of 0.15 M sodium chloride. A precipitate separates out. The mixture is stirred for 3 hours at room temperature, then left to stand at 4 ° C. overnight. The precipitate is centrifuged. According to the UV spectrum, the supernatant solution does not contain any nucleic acid. The precipitate is suspended in 0.15 ml of sodium chloride and centrifuged again.

Der Niederschlag wird in 0,15 m Natriumchlorid suspendiert und zerkleinert. Man erhält eine feine Suspension des Komplexes mit einem ds-RNS-Gehalt von 20 mg/ml. Das Produkt ist in 3 m Natriumchlorid unlöslich. Pür die biologischen Versuche wird es als Suspension verwendet.The precipitate is suspended in 0.15 M sodium chloride and comminuted. A fine suspension of the complex is obtained with a ds-RNA content of 20 mg / ml. The product is insoluble in 3M sodium chloride. Pür the biological experiments will it used as a suspension.

Wirkungsdauer Der Schutz, den die erfindungsgemäßen Komplexe gegen niedrige (8 x LDso) zu ) und hohe (80 x LD50) Infektionswerte des Encephalomyocarditis-Virus gewährleisten, wird in einzelnen Zeitintervallen bis zu 5 Wochen bewertet. 16 bis 20 g schweren Mäusen, Stamm CD1, wird die erfindungsgemäße antivirale Substanz subcutan injiziert. 0, 1, 7, 21 oder 35 Tage danachwerdendiesen Mäusen eine oder zwei Verdünnungen von rncephalornyocarditis-Virus intraparitoneal injiziert. Die Tiere werden 12 Tage beobachtet, die Sterblichkeitsrate von mit Komplex behandelten Tieren wird mit der von Kontrollmäusen verglichen, die eine entsprechende Dosis von ds-RNS entweder intraperitoneal oder subcutan und entsprechende Mengen Encephalomyocarditis-Virus erhalten hatten. Die Zeitintervalle, die Dosismengen und die Verabreichungsart sind in Tabelle III und IV zusammengefaßt. Da die Tiere am Ende der Vorbehandlungszeit ungewöhnlich groß waren, wurde am siebten Tag die für diesen Versuch notwendige Virus-Dosis bestimmt, die 50 % der Testtiere tötet. Dementsprechend konnten dann die Virus-Dosen gewählt werden.Duration of action The protection that the complexes according to the invention against low (8 x LDso) to) and high (80 x LD50) infection values of the encephalomyocarditis virus guarantee is assessed in individual time intervals of up to 5 weeks. 16 to In mice weighing 20 g, strain CD1, the antiviral substance according to the invention is applied subcutaneously injected. 0, 1, 7, 21 or 35 days after these mice are given one or two dilutions of rncephalornyocarditis virus injected intraparitoneally. The animals are 12 days observed the death rate of treated with complex Animals are compared with that of control mice given an appropriate dose of ds-RNA either intraperitoneally or subcutaneously and appropriate amounts of encephalomyocarditis virus had received. The time intervals, the dose amounts and the mode of administration are summarized in Tables III and IV. Because the animals at the end of the pretreatment period were unusually large, became necessary for this experiment on the seventh day Virus dose determined that kills 50% of the test animals. Accordingly, could then the virus doses are chosen.

EMC LD50 im Versuch : 10-6,9 am Ende : 10-6,6 wobei LD50 die Dosis an Virus ist, die 50 ffi der Tiere tötet. EMC LD50 in the test: 10-6.9 at the end: 10-6.6 where LD50 is the dose of virus that kills 50 ffi of the animals.

T a b e l l e III Dauer der Schutzwirkung des erfindungsgemäßen Komplexes bei Mäusen, denen Encephalomyocarditis-Virus in einer 8 x LD50-Menge injiziert wurde. Angegeben ist die Anzahl toter Tiere/Tiere einer Gruppe Vorbehandlungszeit (Tage) erbindung Dosis Verab- 1 7 21 35 (mg/kg) reichung ds-RNS 5 i.p. 0/10 3/10 - - ds-RNS 5 s.c. 0/10 7/10 - - Komplex 100 s.c. 6/10 3/10 1/9 2/10 Kontrollen - - 10/10 - - - T a b e l l e IV Sehutzwirkung bei Mäusen, denen Encephalomyocarditis-Virus in einer 80 x LD50-Menge injikziert wurde. Angegeben ist die Anzahl toter Tiere/Tiere einer Gruppe. Harbehandlungszeit (Tage) Verbindung Dosis Verab 1 7 21 35 (mg/kg) reichung s-RNS 5 i.p. 0/10 10/10 - - s-RNS 5 s.c. 2/10 10/10 - - Komplex 100 s.c. 10/10 5/10 5/10 9/10 ontrollen - - 10/10 Table III Duration of the protective effect of the complex according to the invention in mice which have been injected with encephalomyocarditis virus in an 8 × LD50 amount. The number of dead animals / animals in a group is given Pretreatment time (days) binding dose administration 1 7 21 35 (mg / kg) range ds-RNS 5 ip 0/10 3/10 - - ds-RNS 5 sc 0/10 7/10 - - Complex 100 sc 6/10 3/10 1/9 2/10 Controls - - 10/10 - - - Table IV Protective effect in mice injected with encephalomyocarditis virus in an amount of 80 x LD50. The number of dead animals / animals in a group is given. Hardening time (days) Compound Dose Ad 1 7 21 35 (mg / kg) range s-RNS 5 ip 0/10 10/10 - - s-RNS 5 sc 2/10 10/10 - - Complex 100 sc 10/10 5/10 5/10 9/10 roll up - - 10/10

Claims (12)

Patentansprü che 1. Antivirale Substanz, die im wesentlichen ein ionischer Komlex ist, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, daß die Kationen Polykationen eines linearen Polyarginin-Moleküls mit mindestens 5 Arginin-Einheiten und die Anionen entweder a) Polyanionen einer doppelstrangigen Ribonucleinsäure naturlichen Ursprungs oder b) Polyanionen eines doppelstrangigen Derivats einer natürlichen doppelstrangigen Ribonucleinsäure sind. Claims che 1. Antiviral substance, which is essentially a Ionic complex is, as indicated by the fact that the cations are polycations a linear polyarginine molecule with at least 5 arginine units and the anions either a) polyanions of a double-stranded ribonucleic acid of natural origin or b) polyanions of a double-stranded derivative of a natural double-stranded one Are ribonucleic acid. 2. Antivirale Substanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kationen Poly-L-Arginin-Kationen sind.2. Antiviral substance according to claim 1, characterized in that the cations are poly-L-arginine cations. 3. Antivirale- Substanz nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die doppelstrangige Ribonucleinsäure aus Virusteilchen von infizierten Stämmen von Penicillium chrysogenum, Penicillium stoloniferum, Aspergillus nieger oder Aspergillus foetidus stammt.3. Antiviral substance according to claim 1 and 2, characterized in that that the double-stranded ribonucleic acid from virus particles from infected strains from Penicillium chrysogenum, Penicillium stoloniferum, Aspergillus nieger or Aspergillus foetidus originates. 4. Antivirale Substanz nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die doppelstrangige Ribonucleinsäure die replikative Form eines Phagen ist.4. Antiviral substance according to claim 1 and 2, characterized in that that the double-stranded ribonucleic acid is the replicative form of a phage. 5. Antivirale Substanz nach Anspruch 1, 2 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß die doppelstrangige Ribonucleinsäure die replikative Form einer Phagen-Mutante MU9 eines MS2-Escherichia coli-Phagen ist.5. Antiviral substance according to claim 1, 2 and 4, characterized in that that the double-stranded ribonucleic acid is the replicative form of a phage mutant MU9 of an MS2 Escherichia coli phage. 6. Antivirale Substanz nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß im wesentlichen alle Anionen der doppelstrangigen Ribonucleinsäure oder deren Derivat an einer ionischen Bindung mit den Polyarginin-Kationen beteiligt sind.6. Antiviral substance according to claim 1 to 5, characterized in that that essentially all anions of double-stranded ribonucleic acid or their Derivative involved in an ionic bond with the polyarginine cations. 7. Verfahren zur Herstellung der antiviralen Substanz nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man in Lösung lineares Polyarginin oder dessen Salz mit entweder a) Polyanionen einer doppelstrangigen Ribonucleinsäure natürlichen Ursprungs oder b) Polyanionen eines doppelstrangigen Derivats einer natürlichen doppelstrangigen Ribonucleinsäure umsetzt.7. A method for producing the antiviral substance according to claim 1 to 6, characterized in that linear polyarginine or its Salt with either a) polyanions of a double-stranded ribonucleic acid natural Origin or b) polyanions of a double-stranded derivative of a natural one converts double-stranded ribonucleic acid. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wässrige Elektrolytlösung eines Polyarginins mit einer xinSsrigen Elektrolytlösung einer doppelstrangigen Ribonucleinsaure oder deren doppelstrangigem Derivat vermischt.8. The method according to claim 7, characterized in that one aqueous electrolyte solution of a polyarginine with an xinS aqueous electrolyte solution a double-stranded ribonucleic acid or its double-stranded derivative mixed. 9. Arzneipräparat, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer antiviralen Substanz nach Anspruch 1 bis 6 als Wirkstoff, gegebenenfalls in Kombination mit üblichen pharmakologisch verträglichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln.9. Medicinal preparation, characterized by a content of an antiviral Substance according to claim 1 to 6 as an active ingredient, optionally in combination with customary pharmacologically acceptable carriers and / or diluents. 10. Arzneipräparat nach Pnspruch 9, gekennzeichnet durch errQn zusätzlichen Gehalt an einem lebenden oder abgetöten Virus 10. Medicinal preparation according to claim 9, characterized by additional errQn Content of a live or killed virus 11. Arzneipräparat nach Anspruch 9 und 10 in einer für Injektionen geeigneten Form.11. Medicinal preparation according to claim 9 and 10 in a form suitable for injections. 12. Arzneipräparat nach Anspruch 9 und 10 in einer für die Anwendung an der Schleimhaut der Nase oder des Rachens geeigneten Form.12. Medicinal preparation according to claim 9 and 10 in one for the application suitable shape on the mucous membrane of the nose or throat.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001015704A1 (en) * 1999-08-27 2001-03-08 Hugo Seinfeld Medicaments that contain xenogenic oligo- or/and polyribonucleotides

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