DE2545977A1

DE2545977A1 - Enzymatic ethanol assay in body fluids - by using amino-propane-1,3-diol as buffer and trapping agent

Info

Publication number: DE2545977A1
Application number: DE19752545977
Authority: DE
Inventors: Giovanni Dr Bucolo
Original assignee: Calbiochem Corp
Current assignee: CNA Holdings LLC
Priority date: 1975-10-14
Filing date: 1975-10-14
Publication date: 1977-05-05

Abstract

A compsn. for determining the ethanol content of body fluids consists of (i) the enzyme alcohol dehydrogenase, (ii) the coenzyme nicotinamide adenine di-nucleotide (iii) a buffer/acetaldehyde trapping agent selected from 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol (I), 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (II) and their mits, and (iv)an acid in sufficient amt. to lower the p H of an aqueous soln. of the mixt. to within the range 8.8-9.2, the mixt. being free of any other acetaldehyde trapping agent. The compsn. is useful for enzymatic assay of ethanol partic, in body fluids such as saliva, serum, and urine, the advantage being that a single chemical compound acts simultaneously as a buffer and as a trapping agent for one of the products of the enzymatic reaction.

Description

" Laboratoriumsreagenz zur Bestimmung von ethanol in Flüssig-"Laboratory reagent for the determination of ethanol in liquid

keiten " Eine brauchbare Methode zur Bestimmung des Äthanolgehaltes von Flüssigkeiten, insbesondere von Körperflüssigkeiten kurz nach der Einnahme von Athanol ist eine enzymatische Reaktion, bei der das Äthanol durch die Alkoholdehydrogenase, in der das Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) als Coenzym dient und das wiederum zu seiner reduzierten Form, dem NADH reduziert wird, zu Acetaldehyd oxidiert wird. Reaktionsablauf und -ausmaß werden UV-spektrometrisch bei 340 nm bestimmt. Bei dieser Wellenlänge absorbiert nur das MALE, nicht aber das NAD. keiten "A useful method for determining the ethanol content of fluids, especially body fluids shortly after ingesting Ethanol is an enzymatic reaction in which the ethanol is produced by the alcohol dehydrogenase, in which the nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) serves as a coenzyme and that in turn to its reduced form, which NADH is reduced to, is oxidized to acetaldehyde. The course and extent of the reaction are determined by UV spectrometry at 340 nm. At this Wavelength only absorbs the MALE, but not the NAD.

Zur praktischen Anwendung in einem Test muß die Umsetzung vollständig ablaufen. Dies ist natürlich nicht durch die Anwesenheit des Enzyms und des Coenzyms allein gewährleistet. Vielmehr muß eines der Umsetzungsprodwt;te in irgendeiner Art abgefangen werden. Bevorzugt wird dabei der Acetaldehyd abgefangen. Wie bei den meisten enzymatischen Umsetzungen ist ein Puffer nötig, um den pH-Wert im Optimalbereich für die enzymatische Umsetzung zu halten.For practical use in a test, the implementation must be complete expire. This is of course not due to the presence of the enzyme and the coenzyme guaranteed alone. Rather, one of the implementation products must be in some Kind of intercepted. The acetaldehyde is preferably captured. As with most enzymatic conversions, a buffer is needed to maintain the pH to be kept in the optimum range for the enzymatic conversion.

Als brauchbares Abfangreagenz ist die Aminooxyessigsäure bekannt, die in einem Äthanoltest in der US-PS 3 493 467 und in Clinical Chemistry, Bd. 16 (1970), S. 402 - 407 beschrieben ist.Aminooxyacetic acid is known as a useful trapping reagent, those in an ethanol test in U.S. Patent 3,493,467 and Clinical Chemistry, Vol. 16 (1970), pp. 402-407.

Nach dem Erscheinen dieser Veröffentlichungen wurde gefunden, daß die Aminooxyessigsäure offenbar mit NAD umgesetzt wird.After the appearance of these publications, it was found that the aminooxyacetic acid is apparently reacted with NAD.

Dies führt zu einer Referenzabsorption, die zufälligen Scllwankungen unterworfen ist (vgl. Clinical Chemistry Bd. 17 (1971), S. 458 - 460). Es tJurde nun gefunden, daß zwei eng verwandte Verbindungen und ihre in jedem Verhältnis verwendbaren Gemische nicht nur die benötigte Pufferkapazität für -das Testgemisch aufgrund der vorstehend genannten enzymatischen Umsetzung liefern, sondern auch die Aminooxyessigsäure vollständig ersetzen können. Diese Verbindungen oder ihre Gemische können überraschenderweise als Abfangreagens für den bei der Umsetzung gebildeten Acetaldehyd dienen. Der Ersatz der Aminooxyessigsäure führt zu einem stabilen Testgemisch. Dabei bleibt die Referenzabsorption im wesentlichen konstant und voraussagbar. Gleichzeitig wird das Testgemisch erheblich vereinfacht, da eine einzige Substanz zwei getrennte Funlctionen erfüllt.This leads to a reference absorption, the random fluctuations is subject (cf. Clinical Chemistry Vol. 17 (1971), pp. 458-460). It was now found that two closely related compounds and theirs can be used in every proportion Mixtures not only have the required buffer capacity for the test mixture due to the provide the enzymatic conversion mentioned above, but also the aminooxyacetic acid can replace completely. These compounds or their mixtures can surprisingly serve as a scavenging reagent for the acetaldehyde formed in the reaction. The replacement the aminooxyacetic acid leads to a stable test mixture. The reference absorption remains essentially constant and predictable. At the same time, the test mix becomes significant simplified, since a single substance fulfills two separate functions.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Laborreagens zur Bestirarrung von Äthanol in Flüssigkeiten zu schaffen, das Alkoholdehydrogenase, Nicotinamid-adenin-dinucleotid, eine Puffersubstanz und ein Aldehydabfangreagens enthält. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.The invention is therefore based on the object of an improved laboratory reagent to create the solidification of ethanol in liquids, the alcohol dehydrogenase, Nicotinamide adenine dinucleotide, a buffer and an aldehyde scavenger contains. This object is achieved by the invention.

Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.The invention thus relates to that characterized in the claims Object.

2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol ist als "Tris bekannt und wird auch als Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan bezeichnet.2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol is known and will be known as "Tris" also known as tris (hydroxymethyl) aminomethane.

Sie ist im Merck Index, 8. Ausgabe 1968 auf Seite 1083 unter dem Trivialnamen Tromethamin angeführt. 2-Amino--2-methyl-1,5-propandiol ist im Merck Index auf Seite 57 nach der Genfer Nomerlatur angegeben. Beide Verbindungen unterscheiden sich nur durch eine Hydro5;lfunk-ti.on und ergeben in verdünnter wäßriger Lösung einen pH-iert von etwas oberhalb 10. Werden diese Verbindungen teilweise mit einer Säure, wie Salzsäure, auf einen po erst von 8,8 bis 9,2 neutralisiert, so verhalten sie sich wie ein Puffer mit einer guten Pufferkapazität und wirken als Aldehydabfangreagenz.It is in the Merck Index, 8th Edition 1968 on page 1083 under the common name Tromethamine listed. 2-Amino-2-methyl-1,5-propanediol is in the Merck Index on page 57 given according to the Geneva nomenclature. Both connections are just different by a hydro-oil function and result in a pH-iert in dilute aqueous solution from slightly above 10. Are these compounds partially with an acid such as Hydrochloric acid, neutralized to a po of 8.8 to 9.2, is how they behave like a buffer with a good buffering capacity and act as an aldehyde scavenging reagent.

Die Zusammenstellung des Laboratoriumsreagenzes kann nach Ublichen Methoden erfolgen. Beispielsweise können alle Komponenten in einer einzigen Lösung, vorzugsweise in Wasser, eingebracht werden. Diese Lösung kann anschließend gefriergetrocknet werden.The composition of the laboratory reagent can be customary Methods are done. For example, all components can be in a single solution, preferably in water. This solution can then be freeze-dried will.

Nach dem Mahlen oder Sieben des Rückstandes wird ein wasserfreies Präparat in gepulvertem Zustand erhalten. Andererseits können die Komponenten auch in trockenem Zustand innig vermischt werden, wobei das Mahlen mit einer Kugelmühle bevorzugt ist. Es wird ein homogenes Präparat in fein pulverisierter Form erhalten. Weiterhin kann eine gesteigerte Stabilität durch Teilen des Präparats in zwei Teile erhalten werden. Der eine Teil enthält üblicherweise das NAD, während der andere Teil die Restkomponenten enthält. Zum Test werden vorher bestimmte Mengen eines jeden Teils in Wasser aufgelöst und miteinander vermischt. Die auf ihren Äthanolgehalt zu testende Flüssigkeit wird anschließend in einem vorher bestimmten Volumen zugegeben. Danach wird die Absorption der Lösung vor und nach der Imiubation unter bestimmten Bedingungen, im allgemeinen 8 bis 10 Minuten bei 300C, bestimmt. Die Referenz wird in üblicher Weise angesetzt, so daß die geeignete Korrektur automatisch dutchgeführt werden kann. Die Absorpti.onsmessung wird in üblicher Weise durchgefullrt; vgl. Clinical Chemistry Bd. 16 (1970), S. 402 - 407 und US-PS 3 493 467. Liegt das Mittel als ein Gemisch vor, so kann eine vorher gewählte Menge dieses Gemisches in Wasser gelöst werden. Der Test wird wie vorstehend beschrieben ausgeführt.After grinding or sieving the residue becomes anhydrous Preparation received in powdered state. on the other hand can they Components are intimately mixed even in the dry state, with grinding with a ball mill is preferred. It becomes a homogeneous preparation in finely powdered form Maintain shape. Furthermore, increased stability can be achieved by dividing the preparation can be obtained in two parts. One part usually contains the NAD, while the other part contains the remaining components. Certain amounts are used for the test of each part dissolved in water and mixed together. The on their ethanol content The liquid to be tested is then added in a predetermined volume. After that, the absorption of the solution before and after the imiubation is under certain Conditions, generally 8 to 10 minutes at 30 ° C., determined. The reference will applied in the usual way, so that the appropriate correction is automatically carried out by Dutch can be. The absorption measurement is carried out in the usual way; see. Clinical Chemistry Vol. 16, pp. 402-407 (1970) and U.S. Patent 3,493,467. Is the agent as a mixture, then a previously selected amount of this mixture in water be solved. The test is carried out as described above.

Vorzugsweise werden folgende Mengen wasserfreier Komponenten für einen Fünf-Test-Ansa-tz verwendet: 1. Puffer-Abfangreagenz 6,99 ivIol 2. Säure zur Einstellung eines pH-Wertes von 8,8 bis 9,2 3. Alkoholdehydrogenase 200 bis 220 I.E.The following amounts of anhydrous components are preferably used for one Five test approach used: 1. Buffer capture reagent 6.99 ivIol 2. Acid for adjustment a pH of 8.8 to 9.2 3. Alcohol dehydrogenase 200 to 220 I.U.

4. NAD 16 bis 18 mg 5. Schwermetallkomplexbildner 10 bis 50 mg.4. NAD 16 to 18 mg. 5. Heavy metal complexing agents 10 to 50 mg.

Wenn das Laborreagenz innerhalb dieser Grenzen geändert wird, soll die Testlösung mit einer bekannten Menge verdünnten Athanols eingestellt werden.If the laboratory reagent is changed within these limits, should the test solution can be adjusted with a known amount of dilute ethanol.

In jedem Fall soll die Konzentration des Puffer-Abfangreagenzes in der Testlösung mindestens 0,3 Mol betragen, um den während der enzymatischen Umsetzung entstandenen Acetaldehyd wirksam abfangen zu können. Ein Überschuß schadet zwar nicht, ist aber natürlich unwirtschaftlich. Die obere Grenze beträgt dabei 3 Mol; sie kann aber ohne schädliche Auswirkung überschritten werden.In any case, the concentration of the buffer capture reagent in of the test solution must be at least 0.3 mol, by the amount during the enzymatic conversion to be able to effectively intercept the resulting acetaldehyde. An excess does harm not, but of course it is uneconomical. The upper limit is 3 mol; however, it can be exceeded without any harmful effects.

Beide erfindungsgemäß vervrendeten Puffer-Abfangreagenzien reagieren in wäßriger Lösung alkalisch. Der pH-T.Mert liegt dabei etwas über dem optimalen pH-Wert der enzymatischen Umsetzung, so daß eine Säure in das erfindungsgemäße Laborreagenz aufgenommen wird. Wenn zur Herstellung des Laborreagenzes wasserfreie Substanzen miteinander vermischt werden, wird eine feste Säure, vorzugsweise eine Säure ohne Kristallwasser, wie Weinsäure, Fumarsäure, Gluconsäure, Citronensäure oder Äpfelsäure, insbesondere Bernsteinsäure verwendet. Wenn das Laborreagenz durch vorheriges Auflösen und anschließendes Gefriertrocknen hergestellt wird, können auch Mineralsäuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure, verwendet werden. Das Mengenverhaltnis von Säure zu Puffer-Abfangreagenz wird so gewählt, daß ein pH-Wert von 8,8 bis 9,2 erreicht wird, wenn das feste Gemisch des Laborreagenzes in :wasser aufgelöst wird. Dabei soll die Konzentration des Puffer-Abfangreagenzes mindestens 0,3 Mol betragen.Both buffer capture reagents used in the present invention react alkaline in aqueous solution. The pH T.Mert is slightly above the optimal pH value of the enzymatic conversion, so that an acid in the laboratory reagent according to the invention is recorded. If anhydrous substances are used for the manufacture of the laboratory reagent are mixed together, a solid acid, preferably an acid without Water of crystallization, such as tartaric acid, fumaric acid, gluconic acid, citric acid or malic acid, especially succinic acid is used. If the laboratory reagent by prior dissolution and subsequent freeze-drying is produced, mineral acids, such as hydrochloric acid, sulfuric acid or phosphoric acid can be used. The quantity ratio from acid to buffer-trapping reagent is chosen so that a pH of 8.8 to 9.2 is achieved when the solid mixture of the laboratory reagent is dissolved in: water. The concentration of the buffer capture reagent should be at least 0.3 mol.

Vorzugsweise werden Ko,nponenten verwendet, die völlig frei von Schwermetallionen sind. Da die Puffer-Abfangreagenzien in einem genügend hohen Reillheitsgrad kommerziell nur schwer zu erhalten sind, können sie zur erfindungsgemaßen Verwendung gereinigt werden. Vorzugsweise werden dem erfindungs gemaßen Laborrea genz Schwermetallkomplexbildner zugesetzt, auch wenn die einzelnen Komponenten genügend rein scheinen. Dadurch werden Nickel-, Chrom- oder Eisenionen komplexiert, die unbeabsichtigt durch den Gebrauch von Wasser, das in Kontakt mit Edelstahl war, eingeschleppt werden. Vorzugsweise werden als Schwermetallkomplexbildner athylendiamintet-aessigsaure oder ihre Natriumsalze verwendet. Die verwendete Menge bleibt in jedem Fall gering und ist gleichgültig von der zugesetzten Form nicht besonders bedeutungsvoll, da jeder Säurezusatz automatisch kompensiert wird, wenn die zur Erzielung eines bestimmten pH-Bereich benötigte Säuremenge bestimmt amrde. Es können auch andere Schwermetallkomplexbildner, wie Diäthylentriaminpentaessigsäure, 8-Hydroxychinolin, o-Phenanthrolin oder Bipyridyl, verwendet werden. Im allgemeinen werden ungefähr 1 bis 5 Teile des Komplexbildners, bezogen auf 100 Teile des Puffer-Abfangreagenzes, verwendet.It is preferred to use components that are completely free of heavy metal ions are. Since the buffer trapping reagents are commercially available in a sufficiently high degree of purity are difficult to obtain, they can be purified for use in accordance with the invention will. Heavy metal complexing agents are preferably used for the laboratory reagent according to the invention added, even if the individual components seem sufficiently pure. This will be Nickel, chromium or iron ions are complexed inadvertently through use be brought in by water that has been in contact with stainless steel. Preferably Ethylenediamine-acetic acid or its sodium salts are used as heavy metal complexing agents used. The amount used remains small in any case and does not matter of the added form is not particularly meaningful, since every addition of acid is automatic it is compensated when the amount of acid required to achieve a certain pH range definitely amrde. Other heavy metal complexing agents such as diethylenetriaminepentaacetic acid, 8-hydroxyquinoline, o-phenanthroline or bipyridyl can be used. In general approximately 1 to 5 parts of the complexing agent, based on 100 parts of the buffer capture reagent, used.

Die Testmethode und das Laborreagenz können auch auf anderen Gebieten, wie zur Bestimmung des Äthanolgehaltes von zahlreichen Verfahrensflüssigkeiten, wie Destillationsablaugen, zur Aufbereitung und Behandlung von mit bestimmten Industrieabfällen beladenem Wasser in Flüssen und Meeresbuchten, das möglichenreise fermentativ verschniutzt werden kann, eingesetzt werden.The test method and the laboratory reagent can also be used in other areas, how to determine the ethanol content of numerous process fluids, such as distillation waste liquors, for the preparation and treatment of certain industrial wastes laden water in rivers and bays that pollutes possible journeys by fermentation can be used.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.The examples illustrate the invention.

Beispiel 1 Folgende Substanzen werden in den nachstehend genannten Menge trocken vermischt: 2-Amino-2-hydroxymethylS -propandiol 842 mg Bernsteinsäure 104 mg Tetranatriumsalz der Äthylendiamintet;ra- 26 mg essigsäure Alkoholdehydrogenase 216 I.E. Example 1 The following substances are used in those mentioned below Amount dry mixed: 2-Amino-2-hydroxymethylS-propanediol 842 mg succinic acid 104 mg of tetrasodium salt of ethylenediamine; ra- 26 mg of acetic acid alcohol dehydrogenase 216 I.U.

NAD 17,2 mg Die vorstehend genannten Substanzen werden zuerst getrennt bei Raumtemperatur vorzugsweise über Phosphorpentorid durch Entwässerung getrocknet und anschließend trocken zur Herstellunb des Laborreagenzes vermischt. Zum Gebrauch werden 13,5 ml Wasser zugegeben, um das Laborreagenz aufzulösen. Zu r Durchführung eines Testes werden eine geeignete Menge einer Körperflüssigkeit, wie 0,1 ml Serum oder Speichel, mit 4,9 ml Wasser oder vorzugsweise isotonischer Kochsalzlösung verdünnt, 0,1 ml dieser verdünnten Lösung werden anschließend mit 2,6 ml Testlösung vermischt. Die Referenzlösung wird üblicherweise parallel durch Vermischen von 0,1 ml Kochsalzlösung und 2,6 ml Testlösung angesetzt. Die Lösungen werden in Küvetten gegeben, die zur photometrischen Messung geeignet sind. Die zwei Küvetten werden 8 bis 10 Minuten auf 300C erwärmt. Danach wird die UV-Absorption bei 340 nm bestimmt und daraus der hthanolgehalt der Körperflüssigkeit berechnet. Die Meßapparatur wird üblicherweise durch eine Äthanolverdünnungsreihe kalisrlert. NAD 17.2 mg The above substances are first separated preferably dried over phosphorus pentoride by dehydration at room temperature and then mixed dry to produce the laboratory reagent. For use 13.5 ml of water are added to dissolve the laboratory reagent. To r implementation a suitable amount of a body fluid, such as 0.1 ml of serum or saliva, diluted with 4.9 ml of water or preferably isotonic saline solution, 0.1 ml of this diluted solution is then mixed with 2.6 ml of test solution. The reference solution is usually prepared in parallel by mixing 0.1 ml of saline solution and 2.6 ml test solution made up. The solutions are placed in cuvettes designed for photometric measurement are suitable. The two cuvettes are 8 to 10 minutes heated to 300C. The UV absorption at 340 nm is then determined and the Calculates the ethanol content of the body fluid. The measuring apparatus is usually calibrated by an ethanol dilution series.

Beispiel 2 Beispiel 1 wird wiederholt, wobei anstatt 842 mg 2-Amino-2-hydroxymethyl-1 , 3-propandiol 733 mg 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol im Laborreagenz verwendet werden. Example 2 Example 1 is repeated, but instead of 842 mg of 2-amino-2-hydroxymethyl-1 , 3-propanediol 733 mg of 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol used in the laboratory reagent will.

Beispiel 3 Beispiel 1 wird wiederholt, wobei anstatt 842 mg 2-Amino-2-hydrorymethyl-1,3-propandiol 421 mg 2-Amino-2-hydroxymethyl-1 , 3-propandiol zusammen mit 369 mg 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol im Laborreagenz verwendet werden. Example 3 Example 1 is repeated, but instead of 842 mg of 2-amino-2-hydrorymethyl-1,3-propanediol 421 mg of 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol together with 369 mg of 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol can be used in the laboratory reagent.

Beispiel 4 Beispiel 1 wird ohne das Tetranatriumsalz der Äthylendiamintetraessigsäure wiederholt. Example 4 Example 1 is without the tetrasodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid repeated.

Beispiel 5 Beispiel 2 wird ohne das Tetranatriumsalz der .S.thylendiamintetraessigzaure wiederholt. Example 5 Example 2 is without the tetrasodium salt of .S.thylenediamine tetraacetic acid repeated.

Beispiel 6 Beispiel 3 wird ohne das Tetranatriumsalz der Äthylendiamin tetraessigsäure wiederholt. Example 6 Example 3 is ethylenediamine without the tetrasodium salt tetraacetic acid repeated.

Beispiel 7 Das Laborreagenz gemäß Beispiel 1 wird in 13,5 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die Lösung wird anschließend gefriergetrocknet, wobei ein wasserfreies, homogenes Gemisch erhalten wird. Example 7 The laboratory reagent according to Example 1 is distilled in 13.5 ml Dissolved in water. The solution is then freeze-dried using an anhydrous, homogeneous mixture is obtained.

Anschließend wird der Test gemäß Beispiel 1 wiederholt. Beispiel 8 Beispiel 7 wird wiederholt, wobei anstatt des Laborreagenzes gemäß Beispiel 1 das Laborreagenz gemäß Beispiel 4 verwendet wird.The test according to Example 1 is then repeated. example 8 Example 7 is repeated, but instead of the laboratory reagent according to Example 1 the laboratory reagent according to Example 4 is used.

Claims

Claims laboratory reagent for the determination of ethanol in liquids, consisting of a) the enzyme alcohol dehydrogenase, b) the coenzyme nicotinamide adenine dinucleotide, c) a powder, d) an aldehyde scavenger and e) an acid to adjust the pH an aqueous solution of the buffer aldehyde scavenging reagent in a range of approximately 8.8 to 9.2 to keep that the buffer, which also serves as an aldehyde scavenger, 2-amino - 2-hydroxymethyl-1,3-propanediol and / or 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol.

2. Laboratory reagent according to claim 1, characterized by the coenzyme containing part and a part containing the remaining components.

3. Laboratory reagent according to claim 1, characterized by an additive a heavy metal complexing agent.

4. Laboratory reagent according to claim 3, characterized in that it is as Contains heavy metal complexing agent ethylenediaminetetraacetic acid or its sodium salt.

5. Laboratory reagent according to claim 1, characterized by a content from 6.99 moles of the buffer aldehyde depletion reagent, 16 to 18 mg of NAD and 200 to 220 U.E. alcohol dehydrogenase.