DE2532065A1 - Rapid enzymatic hydrolysis of triglycerides - using Candida lipase, pancreatic lipase and an alkali metal salt of a bile acid - Google Patents

Rapid enzymatic hydrolysis of triglycerides - using Candida lipase, pancreatic lipase and an alkali metal salt of a bile acid

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DE2532065A1 DE19752532065 DE2532065A DE2532065A1 DE 2532065 A1 DE2532065 A1 DE 2532065A1 DE 19752532065 DE19752532065 DE 19752532065 DE 2532065 A DE2532065 A DE 2532065A DE 2532065 A1 DE2532065 A1 DE 2532065A1
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Abstract

An enzymatic process for rapidly liberating glycerol from its esterified from as a fatty acid ester in an aq. fluid, comprises mixing the fluid with a combination of Candida lipase, pancreatic lipase and bile salt selected from the alkali metal salts of taurodeoxycholic, taurocholic, taurochenodeoxycholic and taurodehydrocholic acid. 100% hydrolysis can be achieved in 3-5 mins. without using a proteolytic enzyme such as chymotrypsin. Used in the enzymatic test for the determination of serum triglycerides.

Description

Verfahren zur raschen, enzymatischen Hydrolyse von Triglyzeriden und Reagens zur Durchführung des Verfahrens Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur raschen, enzymatischen Hydrolyse von Triglyzeriden und ein Reagens zur Durchführung dieses Verfahrens, um Glyzerin aus seiner veresterten Form als Fettsäureester freizusetzen, z. B. wenn es in einem wäßrigen Medium wie einem Serum, vorliegt.Process for the rapid, enzymatic hydrolysis of triglycerides and Reagent for carrying out the method The invention relates to a method for rapid enzymatic hydrolysis of triglycerides and a reagent to perform this process to release glycerine from its esterified form as a fatty acid ester, z. When in an aqueous medium such as a serum.

Ein wirksamer, enzymatischer Test zur Bestimmung von Serumtriglyzeriden hängt hauptsächlich von der Entwicklung eines raschen und vollständigen Verfahrens für die Hydrolyse der Triglyzeride ab, da verschiedene Arbeitsweisen zur Messung des bei einer solchen Reaktion gebildeten Glyzerins an sich bekannt sind. So kann, wie von F. H. Kreutz in Klin. Wochschr.An effective, enzymatic test for the determination of serum triglycerides depends mainly on the development of a rapid and complete procedure for the hydrolysis of the triglycerides, as there are different ways of measuring of the glycerol formed in such a reaction are known per se. So can, as by F. H. Kreutz in Klin. Wochschr.

40 (1962) , S. 362 beschrieben, Glyzerin rasch durch Kombination der folgenden Reaktionen bestimmt werden: (1) Glyzerin + ATP Glycerokinase Glyzerinphosphat + ADP (2) ADP + Phosphoenolpyruvat Pyruvatkinase ATP + F;yruvat (3) Fyruvat + NADS Nilchsäure Lactat + NAD Dehydrogenase Bei dieser Kombination von Reaktionen wird 1 Mol NADH für jedes ol an phosphorylisiertem Glyzerin oxidiert; daher ist die Veränderung in der optischen Dichte bei 340 nm ein direktes Maß der Glyzerinmenge bei dieser Untersuchung.40 (1962), p. 362, glycerol can be determined rapidly by combining the following reactions: (1) Glycerin + ATP glycerokinase glycerin phosphate + ADP (2) ADP + phosphoenolpyruvate pyruvate kinase ATP + F; yruvate (3) Fyruvate + NADS lactic acid lactate + NAD Dehydrogenase In this combination of reactions, 1 mole of NADH is oxidized for every ol of phosphorylated glycerol; therefore the change in optical density at 340 nm is a direct measure of the amount of glycerol in this study.

In der US-Patentschrift 3 703 591 ist angegeben, daß die vorangehende Stufe, nämlich diejenige der Hydrolyse der Triglyzeride unter Bildung von Glyzerin, enzymatisch unter Verwendung eines Gemisches aus einer Lipase und einer Protease durchgeführt werden kann. Obwohl es seit langem bekannt ist, daß bestimmte Lipasen für sich alleine zur Hydrolyse von Triglyzeriden angewandt werden können, und daß die enzymatische Aktivität möglicherweise durch die Anwesenheit eines Gallensäuresalzes gesteigert werden könnte, sind bislang bekannte Arbeitsweisen, die lediglich Lipasen (mit oder ohne Gallensäuresalze) verwendeten, wegen der langen Dauer der Hydrolysestufe und auch wegen der als übliches Ergebnis auftretenden, unvollständigen Hydrolyse nicht zufriedenstellend gewesen.U.S. Patent 3,703,591 indicates that the foregoing Stage, namely that of hydrolysis of the triglycerides with the formation of glycerine, enzymatically using a mixture of a lipase and a protease can be carried out. Although it has long been known that certain lipases can be used by themselves for the hydrolysis of triglycerides, and that the enzymatic activity possibly due to the presence of a bile acid salt could be increased are previously known working methods that only use lipases (with or without bile acid salts) because of the long duration of the hydrolysis stage and also because of the incomplete hydrolysis that occurs as a usual result not been satisfactory.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine vollständige und rasche Hydrolyse von Triglyzeriden herbeizuführen.The object of the invention is to achieve complete and rapid hydrolysis of triglycerides.

Uberraschenderweise wurde nun gefunden, daß eine solche vollständige und rasche Hydrolyse von Triglyzeriden unter Verwendung einer Kombination herbeigeführt werden kann, welche lediglich aus bestimmten Lipasen zusammen mit einem Gallensäuresalz besteht, wodurch die Notwendigkeit der Zugabe eines proteolytischen Enzyms wie Chymotrypsin als einer der Reaktionsteilnehmer nicht mehr erforderlich ist. Die Erfindung betrifft daher ein enzymatisches Verfahren zum raschen Freisetzen von Glyzerin aus seiner veresterten Form als Fettsäureester in einem wäßrigen Fluid, wobei sich das Verfahren durch die Stufe des Vermischens dieses Fluides mit einer Kombination von Candida-lipase, pankreatischer Lipase und einem Gallensäuresalz in Form eines Alkalimetallsalzes von Taurodeoxycholsäure, Taurocholsäure, Taurochenodeoxycholsäure oder Taurodehydrocholsäure auszeichnet.Surprisingly, it has now been found that such a complete and brought about rapid hydrolysis of triglycerides using a combination which can only be made up of certain lipases together with a bile acid salt consists, eliminating the need to add a proteolytic Enzyme like chymotrypsin as one of the reactants is no longer required is. The invention therefore relates to an enzymatic method for rapid release of glycerine from its esterified form as a fatty acid ester in an aqueous fluid, the method comprising the step of mixing this fluid with a Combination of candida lipase, pancreatic lipase and a bile acid salt in the form of an alkali metal salt of taurodeoxycholic acid, taurocholic acid, taurochenodeoxycholic acid or taurodehydrocholic acid.

Die erfindungsgemäße Reagenskombination zur Lösung dieser Aufgabe, nämlich der raschen Hydrolyse von Fettsäureestern zur Freisetzung von Glyzerin hieraus, zeichnet sich aus durch ein Gemisch von Candida-lipase, pankreatischer Lipase und einem Gallensäuresalz in Form eines Alkalimetallsalzes von Taurodeoxycholsäure, Taurocholsäure, Taurochenodeoxycholsäure oder Taurodehydrocholsäure.The reagent combination according to the invention for solving this problem, namely the rapid hydrolysis of fatty acid esters to release glycerine from them, is characterized by a mixture of Candida lipase, and pancreatic lipase a bile acid salt in the form of an alkali metal salt of taurodeoxycholic acid, Taurocholic acid, taurochenodeoxycholic acid or taurodehydrocholic acid.

Es wurde gefunden, daß eine 100 %ige Hydrolyse in drei bis fünf Minuten unter Verwendung einer Kombination von Candida-lipase und pankreatischer Lipase mit einem Gallensäuresalz wie Natriumtaurodeoxycholat herbeigeführt werden kann. Das so gebildete Glyzerin kann dann nach einer beliebigen Methode aus einer Anzahl von bekannten Methoden bestimmt werden, wobei eine solche Methode bereits zuvor erläutert wurde.It has been found that 100% hydrolysis occurs in three to five minutes using a combination of Candida lipase and pancreatic lipase can be brought about with a bile acid salt such as sodium taurodeoxycholate. The glycerine formed in this way can then by any of a number of methods can be determined by known methods, with such a method previously was explained.

In diesem Zusammenhang wird noch auf folgende Literaturstellen hingewiesen: R. G. H. Morgan und N. E. Hoffman, Biochim. Biophys.In this context, reference is made to the following literature: R. G. H. Morgan and N. E. Hoffman, Biochim. Biophys.

Acta, 248 (1971), 5. 143; R. L. Ory, J. Kiser und P. A. Pradel, Lipids, 4 (1968), S. 261; H. Brockerhoff, J. Bio. Chem. 246 (1971), S. 5828; P. Desnuelle, Enzymes, 7 (1972), S. 575 und US-Patent 2 527 305.Acta, 248: pp. 143 (1971); R. L. Ory, J. Kiser and P. A. Pradel, Lipids, 4 (1968), p. 261; H. Brockerhoff, J. Bio. Chem. 246: 5828 (1971); P. Desnuelle, Enzymes, 7: 575 (1972) and U.S. Patent 2,527,305.

Es wird bevorzugt, daß die enzymatische Hydrolyse von Triglyzeriden mittels der coaktiven Lipasen in Anwesenheit der Komponenten für die drei zusätzlichen Reaktionssysteme, welche in den zuvor angegebenen Gleichungen dargestellt wurden, durchgeführt wird, so daß alle diese Reaktionen gleichzeitig in einem einzigen Arbeitsvorgang unternommen werden können, oder -gegebenenfalls - in einer Zweistufentechnik, bei welcher eine der für die Umwandlung von Glyzerin erforderlichen Komponenten, z. B. die Glyzerokinase, zu allen anderen Komponenten zugesetzt wird, nachdem die Hydrolyse aufgetreten ist und eine Anfangsbestimmung der optischen Dichte durchgeführt wurde. Da die verschiedenen zur enzymatischen Umwandlung von Glyzerin erforderlichen Komponenten bzw. Bestandteile bereits angegeben worden sind und an sich aus dem Stand der Technik bekannt sind, und da die Anteile dieser Komponenten ebenfalls an sich bekannt sind, ist eine ins Einzelne gehende Diskussion hiervon nicht erforderlich. Es erscheint ausreichend festzustellen, daß die Kombination von Lipasen und Gallensäuresalz ein Teil eines Testgemisches sein kann, welches eine oder mehrere der Komponenten, die zur Verwendung bei der enzymatischen Umwandlung von Glyzerin und die nebeneinander ablaufende Oxidation von NADH in einem colorimetrischen oder spektrofotometrischen Test bekannt sind, einschließen.It is preferred that the enzymatic hydrolysis of triglycerides by means of the coactive lipases in the presence of the components for the three additional reaction systems represented in the equations given above so that all of these reactions occur simultaneously can be undertaken in a single operation, or optionally - in a two-stage technique, in which one of the for the conversion of glycerine required components, e.g. B. glycerokinase, to all other components is added after hydrolysis has occurred and an initial determination the optical density was performed. Since the different to the enzymatic Conversion of glycerine required components or constituents already indicated have been and are known per se from the prior art, and since the proportions These components are also known per se, is a detailed one Discussion of this is not necessary. It seems sufficient to state that the combination of lipases and bile acid salt can be part of a test mixture may, which one or more of the components for use in the enzymatic Conversion of glycerine and the side-by-side oxidation of NADH in one colorimetric or spectrophotometric tests are known.

Das für die enzymtische Hydrolyse von Triglyzeriden verantwortliche System umfaßt ein coaktives Gemisch von pankreatischer Lipase, einer mikrobiellen Lipase und ein Gallensäuresalz. Alle diese drei Komponenten sind für eine wirksame Hydrolyse unbedingt erforderlich. Eine Vielzahl von pankreatischen Lipasen mit einer Aktivität innerhalb des Bereiches von etwa 10 bis 100 Lipaseeinheiten pro mg und vorzugsweise innerhalb des Bereiches von 20 bis 80 Einheiten/mg werden als geeignet angesehen, und solche Lipasen sind im Handel erhältlich, z. B. die pankreatische Lipase mit der Bezeichnung PL3 von Worthington Chemical Company, Freehold, New Jersey, USA. Die mikrobielle Lipase ist genauer bezeichnet eine Candida-lipase, die z. B. aus einer Kulturbrühe von Candida-cylindracea erhalten worden sein kann. Solche Candida-lipase sollte eine Aktivität innerhalb des Bereiches von 30 bis 800 Lipaseeinheiten/mg und vorzugsweise innerhalb des Bereiches von 200 bis 800 Lipaseeinheiten/mg besitzen.The one responsible for the enzymatic hydrolysis of triglycerides System comprises a coactive mixture of pancreatic lipase, a microbial one Lipase and a bile acid salt. All of these three components are effective Hydrolysis absolutely necessary. A variety of pancreatic lipases with a Activity within the range of about 10 to 100 lipase units per mg and preferably within the range of 20 to 80 units / mg are considered suitable and such lipases are commercially available, e.g. B. the pancreatic Lipase designated PL3 from Worthington Chemical Company, Freehold, New Jersey, UNITED STATES. The microbial lipase is more precisely called a Candida lipase, which z. B. may have been obtained from a culture broth of Candida cylindracea. Such Candida lipase should have an activity within the range of 30 to 800 lipase units / mg and preferably within the range of 200 to 800 lipase units / mg.

Es wird angenommen, daß andere Candida-lipasen in gleicher Weise wirksam sind, wenn sie in Kombination mit der pankreatischen Lipase und dem Gallensäuresalz des Systems zur Triglyzeridhydrolyse verwendet werden.It is believed that other Candida lipases are equally effective when in combination with the pancreatic lipase and the bile acid salt of the triglyceride hydrolysis system.

Obwohl sowohl pankreatische Lipase als auch Candida-lipase vorhanden sein müssen, wurde gefunden, daß die anteiligen Mengen dieser Bestandteile, gemessen in Werten der Lipaseeinheit, in Übereinstimmung mit den gegebenen Erfordernissen der Zeit zum Abschluß der Hydrolyse beträchtlich variiert werden können.Although both pancreatic lipase and candida lipase are present It has been found that the proportional amounts of these ingredients are measured in values of the lipase unit, in accordance with the given requirements the time to complete hydrolysis can be varied considerably.

Eine Aktivitäts-Lipaseeinheit ist die Menge, die zur Freisetzung von 1 Mikromol von Säure pro Minute bei 25 °C aus einer Olivenölemulsion, welche Gum acacia und 15 mg pro ml an Natriumtaurocholat enthält, bei einem pH-Wert von etwa 8,0 ausreicht. Diese Definition einer Lipaseeinheit und die Arbeitsweise, worauf sie beruht, sind allgemein anerkannt und in Worthington Enzyme Manual (1972), 5. 6 ausführlicher beschrieben.A unit of activity lipase is the amount required to release 1 micromole of acid per minute at 25 ° C from an olive oil emulsion, which gum acacia and 15 mg per ml of sodium taurocholate, at a pH of about 8.0 is sufficient. This definition of a lipase unit and how it works on what it is generally accepted and in Worthington Enzyme Manual (1972), 5. 6 described in more detail.

Insbesondere sollte die Menge an pankreatischer Lipase in dem Reaktionsgemisch wenigstens 0,14 Lipaseeinheiten für jeweils 1,ul an Körperflüssigkeit (Blutserum oder Plasma) mit einem Triglyzeridwert innerhalb des Bereiches von 0 bis 500 mg pro 100 ml (mg %) betragen, um eine vollständige Hydrolyse innerhalb von 12 Minuten zu erreichen. Unter Zugrundelegung derselben Grundwerte sollte die Menge an Candida-lipase in dem Gemisch wenigstens 0,28 Einheiten betragen, und die Menge an Gallensäuresalz sollte wenigstens 0,002mg für jeden/ul an Körperflüssigkeit betragen. Wenn kiirzere Reaktionszeiten erforderlich oder erwünscht sind, müssen die Mengen dieser Bestandteile erhöht werden. So sind für eine vollständige Hydrolyse innerhalb von 3 bis 5 Minuten wenigstens 1,2 Einheiten an pankreatischer Lipase, 0,54 Einheiten an Candida-lipase und 0,02 mg Gallensäuresalz für jeweils 1/ul an Körperflüssigkeit erforderlich.In particular, the amount of pancreatic lipase in the reaction mixture should be at least 0.14 lipase units for every 1. µl of body fluid (blood serum or plasma) with a triglyceride value within the range of 0 to 500 mg per 100 ml (mg%) amount to complete hydrolysis within 12 minutes to reach. Using the same basic values as a basis, the amount of candida lipase in the mixture be at least 0.28 units, and the amount of bile acid salt should be at least 0.002mg for each / ul of body fluid. If shorter Reaction times are required or desired, the amounts of these ingredients must increase. So are for complete hydrolysis within 3 to 5 minutes at least 1.2 units of pancreatic lipase, 0.54 units of candida lipase and 0.02 mg of bile acid salt required for every 1 / µl of body fluid.

Anders ausgedrückt bedeutet dies, daß bei einer Reagenskombination mit einem Volumen von 1 ml die Werte zur Hydrolyse von 50 1 an Serum oder Plasma mit einem Triglyzeridwert von 0 -500 mg °> innerhalb von 12 Minuten wenigstens 7 Einheiten an pankreatischer Lipase, 14 Einheiten an Candida-lipase und 0,1 mg Gallensäuresalz betragen sollten, oder zur Hydrolyse von 50/ul dieses Serums oder Plasmas innerhalb von 3 bis 5 Minuten wenigstens 60 Einheiten an pankreatischer Lipase, 27 Einheiten an Candida-lipase und 1,0 mg Gallensäuresalz.In other words, this means that in the case of a reagent combination with a volume of 1 ml, the values for hydrolysis of 50 liters of serum or plasma with a triglyceride value of 0-500 mg °> within 12 minutes at least 7 units of pancreatic lipase, 14 units of candida lipase and 0.1 mg Bile acid salt should be, or to hydrolyze 50 / ul of this serum or Plasmas at least 60 units of pancreatic within 3 to 5 minutes Lipase, 27 units of Candida lipase and 1.0 mg bile acid salt.

Da die Geschwindigkeit beim Abschluß eines Testes wesentlich sein kann, insbesondere in Verbindung mit Testszur klinischen Diagnose wurde eine maximale Zeitspanne zum Abschluß der Hydrolyse in einem klinischen Test willkürlich auf annähernd 12 Minuten festgelegt. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß geringe Konzentrationen oder Mengen der entsprechenden Lipasen und des Gallensäuresalzes bei anderen Tests, wo längere Zeitspannen eher annehmbar sind, verwendet werden können.Because the speed at the conclusion of a test will be essential can, especially in connection with tests for clinical diagnosis, was a maximum Time to complete hydrolysis in a clinical test is arbitrary to approximately 12 minutes set. It should be noted, however, that low concentrations or amounts of the corresponding lipases and the bile acid salt in other tests, where longer periods of time are more acceptable.

Wie zuvor beschrieben, ist ein Gallensäuresalz eine unbedingt erforderliche Komponente des Systems. Obwohl Alkalimetallsalze von Taurocholinsäure, Taurochenodeoxycholinsäure oder Taurodehydrocholinsäure verwendet werden können, wurden besonders gute Ergebnisse mit Alkalimetallsalzen von Taurodeoxycholsäure erreicht. Es wurde gefunden, daß das Salz von Taurodeoxycholsäure in Mischung mit Candida-lipase und pankreatischer Lipase unter optimalen Bedingungen schnellere Ergebnisse bei niedrigeren Konzentrationen als die anderen Gallensäuresalze ergibt.As previously described, a bile acid salt is an essential one Component of the system. Although alkali metal salts of taurocholic acid, taurochenodeoxycholic acid or taurodehydrocholic acid can be used have particularly good results achieved with alkali metal salts of taurodeoxycholic acid. It was found that the salt of taurodeoxycholic acid mixed with candida lipase and pancreatic Lipase under optimal conditions gives faster results at lower concentrations than the other bile acid salts.

Wie zuvor beschrieben, und im folgenden noch näher in den folgenden Beispielen erläutert, reagiert die Kombination von pankreatischer Lipase und Candida-lipase in Mischung mit einem Gallensäuresalz, vorzugsweise dem Salz von Taurodeoxycholsäure, mit den Triglyzeriden in Körperflüssigkeiten unter herbeiführung einer vollständigen Hydrolyse in so kurzen Zeitspannen wie 3 Minuten. Eine solche Kombination von Reaktionsteilnehmern kann bei einem beliebigen Test eingesetzt werden, welcher die rasche und vollständige Hydrolyse von Triglyzeriden erfordert.As previously described, and in more detail below in the following Illustrated in the examples, the combination of pancreatic lipase and Candida lipase reacts in a mixture with a bile acid salt, preferably the salt of taurodeoxycholic acid, with the triglycerides in body fluids causing a complete Hydrolysis in times as short as 3 minutes. Such a combination of respondents can be used in any test that provides the quick and complete Requires hydrolysis of triglycerides.

Das Verfahren und das Reagens gemäß der Erfindung können z. B.The method and the reagent according to the invention can e.g. B.

in Verbindung mit einer Untersuchung auf vollständigen Triglyzeridgehalt unter Einschluß der drei Reaktionen zur Glyzerinbestimmung, wie sie zuvor beschrieben wurden und an sich auf dem Fachgebiet bekannt sind, eingesetzt werden. Alle für die vollständige colorimetrische Bestimmung von Triglyzeriden in Körperflüssigkeiten erforderlichen Komponenten können vorgemischt und lycphilisiert werden, um eine stabile Reagenskombination für die klinische Anwendung zu liefern.in conjunction with a full triglyceride test including the three reactions for glycerol determination as described above and are known per se in the art. All for the complete colorimetric determination of triglycerides in body fluids required components can be premixed and lycphilized to form a to provide stable reagent combination for clinical use.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.The invention is illustrated in more detail by means of the following examples.

Beispiel 1 Ein zur Durchführung der Erfindung geeignetes Reagens kann hergestellt werden, indem das folgende 3-ml-Reaktionsgemicch angesetzt wird: pankreatische Lipase (Worthington Po3), 180 Lipaseeinheiten Candida-lipase (Worthington), 80 Lipaseeinheiten Natriumtaurodeoxycholsäure 3 mg LDH, (internationale Einheiten) 10 IU Pyruvatkinase 10 IU NADH O,75juflol Phosphoenolpyruvat 1,5 /uMOl Dinatrium-ATP 0,5 /uMol Magnesiumchlorid 0,0067 M Kaliumphosphatpuffer 0,1 M, pH 7,0.Example 1 A reagent suitable for practicing the invention can can be prepared by preparing the following 3 ml reaction mixture: pancreatic Lipase (Worthington Po3), 180 lipase units. Candida lipase (Worthington), 80 lipase units Sodium taurodeoxycholic acid 3 mg LDH, (international units) 10 IU pyruvate kinase 10 IU NADHO 0.75 juflol phosphoenolpyruvate 1.5 / µmol disodium ATP 0.5 / µmol magnesium chloride 0.0067 M potassium phosphate buffer 0.1 M, pH 7.0.

Der Test wird so durchgeführt, daß eine Teilmenge der auf Triglyzerid zu untersuchenden Flüssigkeit, z. B. 50/ul Serum oder Plasma mit Triglyzeridwerten von 0 bis 500 mg %, zu dem oben angegebenen Reaktionsgemisch zugesetzt werden. Im Anschluß an die Inkubation für etwa 5 Minuten bei einer Temperatur zwischen 25 °C und 37 oC wird die optische Dichte bei 340 nm gemessen. Danach werden 10 Einheiten Glyzero-kinase zugegeben und das Gemisch wird wiederum bei 25 0 bis 37 °C für weitere 5 Minuten inkubiert. Die optische Dichte bei 340 nm wird erneut bestimmt und die Differenz der Werte der optischen Dichten ist proportional zu dem Triglyzeridgehalt nach entsprechender Eichung unter Anwendung der konventionellen Arbeitsweisen in klinischen Laboratorien, welche Blindreaktion auch immer erhalten wurde.The test is done so that a subset of the triglyceride liquid to be examined, e.g. B. 50 / µl serum or plasma with Triglyceride levels from 0 to 500 mg%, added to the reaction mixture given above will. Following incubation for about 5 minutes at a temperature between 25 ° C and 37 oC, the optical density is measured at 340 nm. After that there will be 10 units Glycerokinase is added and the mixture is again at 25 0 to 37 ° C for further Incubated for 5 minutes. The optical density at 340 nm is determined again and the The difference in the values of the optical densities is proportional to the triglyceride content after appropriate calibration using the conventional working methods in clinical laboratories whatever blind reaction was obtained.

Beispiel 2 Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde unter Anwendung der gleichen Reaktionsteilnehmer, Anteile und Bedingungen mit der Ausnahme wiederholt, daß eine gereinigte Lipase, die aus der Kulturbrühe von Candida-cylindracea nov. sp. erhalten worden war, anstelle der Candida-lipase des ersten Beispiels verwendet wurde. Eine vollständige Hydrolyse der Triglyzeride der Probe wurde innerhalb von 5 Minuten in der gleichen Weise, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurde, erreicht.Example 2 The procedure of Example 1 was followed using the the same reactants, proportions and conditions repeated with the exception, that a purified lipase obtained from the culture broth of Candida cylindracea nov. sp. was used in place of the Candida lipase of the first example became. Complete hydrolysis of the sample's triglycerides was achieved within 5 minutes in the same manner as described in Example 1 was achieved.

Beispiel 3 Es wurden verschiedene Reagenskotnbinationen in tbereinstimmung mit Beispiel 1 hergestellt mit der Ausnahme, daß eine Vielzahl von Gallensäuresalzen verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt. Jede Reagenskombination enthielt 0,1 mg Candida-lipase (Aktivität æ 80 Einheiten), 3,0 mg pankreatische Lipase (Aktivität = 180 Einheiten) und die Menge an angegebenem Gallensäuresalz. Die Zeiten sind in Minuten für eine vollständige (100 *ige) Hydrolyse für Serumproben mit Triglyzeridwerten von 100 mg *,(d. h. 100 mg pro 100 ml Wasser) und 280 mg * angegeben.Example 3 Various reagent combinations were made in accordance made with Example 1 except that a variety of bile acid salts was used. The results are compiled in the following table. Each reagent combination contained 0.1 mg Candida lipase (activity æ 80 units), 3.0 mg of pancreatic lipase (activity = 180 units) and the amount of indicated Bile acid salt. The times are in minutes for a complete (100%) hydrolysis for serum samples with triglyceride values of 100 mg *, (i.e. 100 mg per 100 ml of water) and 280 mg * indicated.

Tabelle Erforderliche Zeit zum Abschluß der Hydrolyse mit unterschiedlichen Gallensäuresalze enthaltenden Enzymkombinationen Gallensäure (Na-Salz) Menge Zeit (Min.) Zeit (Min., (mg) für 100 mg % für 280 mg Probe °/0 Probe (1) Taurocholsäure 6,0 20 12,0 14 18,0 10 24,0 5 12 30,0 5 10 (2) Taurodeoxycholsäure 0,3 12 1,0 7 7 1,5 5 6 3,0 4 5 (3) Taurochenodeoxycholsäure 1,5 - 14 3,0 - 12 6,0 3 10 (4) Taurodehydrocholsäure 6,0 13 24,0 13 30,0 10 Table Time required to complete the hydrolysis with different Bile acid salts containing enzyme combinations bile acid (Na salt) amount time (Min.) Time (min., (Mg) for 100 mg% for 280 mg sample ° / 0 sample (1) taurocholic acid 6.0 20 12.0 14 18.0 10 24.0 5 12 30.0 5 10 (2) taurodeoxycholic acid 0.3 12 1.0 7 7 1.5 5 6 3.0 4 5 (3) taurochenodeoxycholic acid 1.5-14 3.0-12 6.0 3 10 (4) taurodehydrocholic acid 6.0 13 24.0 13 30.0 10

Claims (30)

Patentansprüche (1.JEnzymatisches Verfahren zum raschen Freisetzen von Glyzerin aus aus seiner veresterten Form als Fettsäureester in einem wäßrigen Fluid, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, daß es die Stufe des Vermischens dieses Fluides mit einer Kombination von Candida-lipase, pankreatischer Lipase und einem Gallensäuresalz in Form eines Alkalimetallsalzes von Taurodeoxycholsäure, Taurocholsäure, Taurochenodeoxycholsäure oder Taurodehydrocholsäure umfaßt. Claims (1. Enzymatic process for rapid release of glycerine from its esterified form as a fatty acid ester in an aqueous one Fluid, it is noted that it has the stage of mixing this Fluids with a combination of candida lipase, pancreatic lipase and one Bile acid salt in the form of an alkali metal salt of taurodeoxycholic acid, taurocholic acid, Taurochenodeoxycholic acid or taurodehydrocholic acid. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Salz der Taurocholsäure verwendet wird.2. The method according to claim 1, characterized in that a salt the taurocholic acid is used. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Salz der Taurodeoxycholsäure verwendet wird.3. The method according to claim 1, characterized in that a salt the taurodeoxycholic acid is used. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Salz von Taurochenodeoxycholsäure verwendet wird.4. The method according to claim 1, characterized in that a salt used by taurochenodeoxycholic acid. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Salz von Taurodehydrocholsäure verwendet wird.5. The method according to claim 1, characterized in that a salt of taurodehydrocholic acid is used. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Gallensäuresalz ein Natriumsalz verwendet wird.6. The method according to claim 1, characterized in that the bile acid salt a sodium salt is used. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Candida-lipase verwendet wird, die aus einer Kultur von Candida-cylindracea erhalten worden ist.7. The method according to claim 1, characterized in that a Candida lipase obtained from a culture of Candida cylindracea is used. 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Candida-lipase in der Kombination wenigstens 0,28 Einheiten an Lipase-Aktivität für jeweils 1 Xl an wäßrigem Fluid mit einem Triglyzeridwert von 0 bis 500 mg * liefert.8. The method according to claim 1, characterized in that the Candida lipase in the combination at least 0.28 units of lipase activity for every 1 xl of aqueous fluid with a triglyceride value of 0 to 500 mg *. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Candida-lipase wenigstens 0,54 Einheiten an Lipase-Aktivität für jeweils 1/11 an wäßrigem Fluid mit einem Triglyzeridwert von 0 bis 500 mg > liefert. 9. The method according to claim 8, characterized in that the Candida lipase at least 0.54 units of lipase activity for every 1/11 of aqueous fluid with a triglyceride value of 0 to 500 mg> delivers. 10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die pankreatische Lipase in der Kombination wenigstens 0,14 Einheiten an Lipase-Aktivität für jeweils 1/ul an wäßrigem Fluid mit einem Triglyzeridwert von 0 bis 500 mg % liefert.10. The method according to claim 1, characterized in that the pancreatic Lipase in the combination at least 0.14 units of lipase activity for each Provides 1 / µl of aqueous fluid with a triglyceride value of 0 to 500 mg%. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die pankreatische Lipase wenigstens 1,2 Einheiten an Lipase-Aktivität für jeweils 1 pol an wäßrigem Fluid mit einem Triglyzeridwert von 0 bis 500 mg % liefert.11. The method according to claim 10, characterized in that the pancreatic Lipase at least 1.2 units of lipase activity for every 1 pol of aqueous Provides fluid with a triglyceride value of 0 to 500 mg%. 12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kombination wenigstens 0,002 mg des Gallensäuresalzes für jeweils 1/ul an wäßrigem Fluid mit einem Triglyzeridwert von 0 bis 500 mg % enthält.12. The method according to claim 1, characterized in that the combination at least 0.002 mg of the bile acid salt for every 1 / µl of aqueous fluid contains a triglyceride value of 0 to 500 mg%. 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Kombination wenigstens 0,02 mg des Gallensäuresalzes für jeweils 1/ul an wäßrigem Fluid mit einem Triglyzeridwert von 0 bis 500 mg % enthält.13. The method according to claim 12, characterized in that the combination at least 0.02 mg of the bile acid salt for every 1 / µl of aqueous fluid contains a triglyceride value of 0 to 500 mg%. 14. Reagenskombination zur raschen Hydrolyse von Fettsäureestern zur Freisetzung des Glyzerins hieraus, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Mischung von Candida-lipase, pankreatischer Lipase und einem Gallensäuresalz in Form eines Alkalimetallsalzes von Taurodeoxycholsäure, Taurocholsäure, Taurochenodeoxycholsäure oder Taurodehydrocholsäure umfaßt.14. Reagent combination for the rapid hydrolysis of fatty acid esters Release of the glycerine therefrom, characterized in that it is a mixture of candida lipase, pancreatic lipase and a bile acid salt in the form of a Alkali metal salt of taurodeoxycholic acid, taurocholic acid, taurochenodeoxycholic acid or taurodehydrocholic acid. 15. Kombination nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Salz von Taurocholsäure enthält.15. Combination according to claim 14, characterized in that it contains a salt of taurocholic acid. 16. Kombination nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Salz von Taurodeoxycholsäure enthält.16. Combination according to claim 14, characterized in that it contains a salt of taurodeoxycholic acid. 17. Kombination nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Salz von Taurochenodeoxycholsäure enthält.17. Combination according to claim 14, characterized in that it contains a salt of taurochenodeoxycholic acid. 18. Kombination nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Salz von Taurodehydrocholsäure enthält.18. Combination according to claim 14, characterized in that it contains a salt of taurodehydrocholic acid. 19. Kombination nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Gallensäuresalz ein Natriumsalz ist.19. Combination according to claim 14, characterized in that the Bile acid salt is a sodium salt. 20. Kombination nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Candida-lipase enthält, die aus einer Kultur von Candida-cylindracea erhalten worden ist.20. Combination according to claim 14, characterized in that it contains a Candida lipase obtained from a culture of Candida cylindracea has been. 21. Kombination nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Candida-lipase wenigstens 14 Lipase-Einheiten für jeweils 1 ml der Reagenskombination aufweist.21. Combination according to claim 14, characterized in that the Candida lipase at least 14 lipase units for every 1 ml of the reagent combination having. 22. Kombination nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Candida-lipase wenigstens 27 Lipase-Einheiten für jeweils 1 ml der Reagenskombination aufweist.22. Combination according to claim 21, characterized in that the Candida lipase at least 27 lipase units for every 1 ml of the reagent combination having. 23. Kombination nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die pankreatische Lipase wenigstens 7 Lipase-Einheiten für jeweils 1 ml der Reagenskombination aufweist.23. Combination according to claim 14, characterized in that the pancreatic lipase at least 7 lipase units for every 1 ml of the reagent combination having. 24. Kombination nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die pankreatische Lipase wenigstens 60 Lipase-Einheiten für jeweils 1 ml der Reagenskombination aufweist.24. Combination according to claim 23, characterized in that the pancreatic lipase at least 60 lipase units for every 1 ml of the reagent combination having. 25. Kombination nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 0,1 mg Gallensäuresalz in jeweils 1 ml der Reagenskombination vorliegen.25. Combination according to claim 14, characterized in that at least 0.1 mg bile acid salt are present in each 1 ml of the reagent combination. 26. Kombination nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 1,0 mg Gallensäuresalz für jeweils 1 ml der Reagenskombination vorliegen.26. Combination according to claim 25, characterized in that at least 1.0 mg of bile acid salt is present for every 1 ml of the reagent combination. 27. Reagenskombination nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die pankreatische Lipase eine Aktivität von etwa 10 bis 100 Lipase-Einheiten pro mg aufweist.27. reagent combination according to claim 14, characterized in that the pancreatic lipase has an activity of about 10 to 100 lipase units each mg. 28. Kombination nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet5 daß die pankreatische Lipase eine Aktivität von annähernd 20 bis 80 Lipase-Einheiten pro mg aufweist.28. Combination according to claim 27, characterized5 that the pancreatic lipase have an activity of approximately 20 to 80 lipase units each mg. 29. Reagenskombination nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Candida-lipase eine Aktivität von annähernd 30 bis 800 Lipase-Einheiten pro mg aufweist.29. reagent combination according to claim 14, characterized in that the Candida lipase has an activity of approximately 30 to 800 lipase units per mg. 30. Reagenskombination nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Candida-lipase eine Aktivität von annähernd 200 bis 800 Lipase-Einheiten pro mg aufweist.30. reagent combination according to claim 29, characterized in that the candida lipase has an activity of approximately 200 to 800 lipase units per mg.
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