DE2519936A1 - ESCHERICHIA COLI EXTRACTS, THE PROCESS FOR THEIR MANUFACTURING AND THEIR USE IN MEDICINAL PREPARATIONS - Google Patents

ESCHERICHIA COLI EXTRACTS, THE PROCESS FOR THEIR MANUFACTURING AND THEIR USE IN MEDICINAL PREPARATIONS

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DE2519936A1
DE2519936A1 DE19752519936 DE2519936A DE2519936A1 DE 2519936 A1 DE2519936 A1 DE 2519936A1 DE 19752519936 DE19752519936 DE 19752519936 DE 2519936 A DE2519936 A DE 2519936A DE 2519936 A1 DE2519936 A1 DE 2519936A1
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Description

VON KREiSLER SCHuNWAlD MEYtrt EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTINGFROM KREiSLER SCHUNWALD MEYtrt EISHOLD FUES FROM KREISLER KELLER SELTING

PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler f 1973PATENT LAWYERS Dr.-Ing. by Kreisler f 1973

Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. Ale1: von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selting, KölnDr.-Ing. K. Schönwald, Cologne Dr.-Ing. Th. Meyer, Cologne Dr.-Ing. KW Eishold, Bad Soden Dr. JF Fues, Cologne Dipl.-Chem. Ale 1 : from Kreisler, Cologne Dipl.-Chem. Carola Keller, Cologne Dipl.-Ing. G. Selting, Cologne

AvK/Ax 5 Köln ι J). Mai 1975AvK / Ax 5 Cologne ι J). May 1975

DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOFDEICHMANNHAUS AT THE MAIN RAILWAY STATION

Agenoe Nationale de Valorisation de la Recherche (A IT V A R), 13, Rue Madeleine Michelis, Neuilly sur Seine (Haute-de-Seine) (Frankreich).Agenoe Nationale de Valorisation de la Recherche (A IT V A R), 13, Rue Madeleine Michelis, Neuilly sur Seine (Haute-de-Seine) (France).

Escherichia coli-Extrakte, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in ArzneimittelzubereitungenEscherichia coli extracts, process for their production and their use in pharmaceutical preparations

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichen niedrigmolekularen Extrakten von Zellen von Escherichia coli, die hierbei erhaltenen- wasserlöslichen Extrakte und sie enthaltende Arzneimittelzubereitungen, die als immunologische Adjuvantia wertvoll sind.The invention relates to a method for the production of water-soluble, low molecular weight extracts from cells from Escherichia coli, the water-soluble ones obtained in this way Extracts and pharmaceutical preparations containing them which are valuable as immunological adjuvants are.

Die wasserlöslichen Extrakte gemäß der Erfindung enthalten Diaminopimelinsäure (DAP) und haben ein Molekulargewicht zwischen 1000 + 200 und 8000 + 200.The water-soluble extracts according to the invention contain diaminopimelic acid (DAP) and have a molecular weight between 1000 + 200 and 8000 + 200.

Ein Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichen Extrakten aus Escherichia coli wurde bereits beschrieben. Als Beispiel ist die Veröffentlichung von Adam und Mitarbeitern in Biochem. Biophy. Res. Com. 56, Nr.3, 1974, zu nennen. Diese Arbeit beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichen Produkten durch Behandlung der Zellwände mit einem Lysozym.A process for the production of water-soluble extracts from Escherichia coli has already been described. As an example, the publication by Adam and co-workers in Biochem. Biophy. Res. Com. 56, no.3, 1974, to call. This thesis describes a process for the production of water-soluble products by treatment the cell walls with a lysozyme.

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Telefon: (0221) 234541-4 · Telex: 8882307 dopa d · Telegramm: Dompatent Köln Telephone: (0221) 234541-4 Telex: 8882307 dopa d Telegram: Dompatent Cologne

Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung der wasserlöslichen Extrakte nach einem neuen Verfahren, bei dem die Verwendung eines Enzyms nicht erforderlich ist.The invention relates to the preparation of the water-soluble extracts by a new process in which the use of an enzyme is not required.

Das Verfahren gemäß der Erfindung besteht darin, daß man die von Lipiden befreiten Bakterienreste der Zellen von Escherichia coli einer milden Extraktion unterwirft und die hierbei erhaltenen wasserlöslichen Extrakte isoliert.The method according to the invention consists in that the bacterial residues of the cells of Escherichia coli, which have been freed from lipids, are subjected to a mild extraction and the water-soluble extracts obtained in this way are isolated.

Die wasserlöslichen Extrakte werden anschließend vorzugsweise nach bekannten Reinigungsverfahren gereinigt. Die wasserlöslichen Extrakte gemäß der Erfindung werden vorteilhaft in Pulverform gehandhabt und aufbewahrt. Der hier gebrauchte Ausdruck "milde Extraktion" bedeutetThe water-soluble extracts are then preferably cleaned using known cleaning methods. the Water-soluble extracts according to the invention are advantageously handled and stored in powder form. As used herein, "mild extraction" means

eine Homogenisierung in einem wäßrigen Medium unter ; Anwendung der Autolyse der Bakterienzellen und nicht die . Durchführung chemischer Modifikationen oder Extraktionen.a homogenization in an aqueous medium under ; Application of autolysis of the bacterial cells and not the. Performing chemical modifications or extractions.

Die milde Extraktion der Zellen erfolgt durch Mahlen und Homogenisieren in einem wäßrigen Medium gegebenen- ' falls in Gegenwart eines nichtionogenen oberflächen- \ aktiven Mittels, z.B. des Produkts- der Handelsbezeichnung "NP-40".The mild extraction of the cells is carried out by grinding and homogenizing, in an aqueous medium gegebenen- 'appropriate in the presence of a nonionic surface-\ active agent, for example of the Produkts- the trade name "NP-40".

Gemäß der Erfindung wird die Extraktion vorteilhaft bei I einer Temperatur von etwa J57°C, einer physiologischen " ; Temperatur, durchgeführt. Die Extraktionsdauer im Rahmen: des Verfahrens gemäß der Erfindung ist nicht entscheidend wichtig, muß jedoch ausreichend sein, um die wasser- j löslichen Substanzen maximal zu extrahieren und auf ! diese Weise wasserlösliche Extrakte mit guten Ausbeuten . zu erhalten. Die Extraktion kann in einer einzigen Stufe oder in mehreren aufeinanderfolgenden Stufen durchge- ' führt werden.According to the invention, the extraction is advantageously carried out at a temperature of about 57 ° C., a physiological temperature will extract soluble substances and maximum! to obtain in this manner water-soluble extracts with good yields.. The extraction can be in a single step or in several successive stages carried 'leads.

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Den in das Verfahren gemäß der Erfindung eingesetzten Zellen von Esoherichia coil werden vorher die Lipide entzogen. Dies geschieht beispielsweise nach dem Verfahren, das von A. Aebi und Mitarbeitern in Bull. Soc. Chim. Biol. 35 (1953) 661 beschrieben wird. Für das Verfahren können alle Varietäten von Escherlchia coli verwendet werden, jedoch werden die Zellen von Escherichia coil B (nicht-virulente Varietät) bevorzugt.The cells of Esoherichia coil used in the method according to the invention previously become the lipids withdrawn. This is done, for example, according to the method described by A. Aebi and coworkers in Bull. Soc. Chim. Biol. 35 (1953) 661 is described. For the procedure all varieties of Escherlchia coli can be used however, Escherichia coil B (non-virulent variety) cells are preferred.

Die nichtionogene oberflächenaktive Verbindung, die beim Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden kann, ermöglicht die Dissoziation der Lipidsubstanzen, die an Zellen gebunden sind, die durch den Lipidentzug nicht extrahiert worden sind. Die Verwendung der oberflächenaktiven Verbindung ermöglicht somit eine Verbesserung der Ausbeute der Extraktion.The nonionic surface-active compound used in Method according to the invention can be used, allows the dissociation of the lipid substances that are bound to cells that have not been extracted by lipid extraction. The use of the surface-active Compound thus enables the extraction yield to be improved.

Nach der milden Extraktion werden die wasserlöslichen Extrakte durch Zentrifugieren, Aussalzen, Dialyse und Gefriertrocknung isoliert.After the mild extraction, the water-soluble extracts are made by centrifugation, salting out, and dialysis Freeze drying isolated.

Das Aussalzen erfolgt an der überstehenden Schicht, die nach dem Zentrifugieren des bei der milden Extraktion erhaltenen Gemisches erhalten wird, mit Jiilfe von Lösungen eines Mineralsalzes, z.B. Ammoniumsulfat, mit verschiedenen Konzentrationen. Zur Durchführung der Aussalzungen wird vorzugsweise die Temperatur des Reaktionsgemisches auf eine genügende Höhe gebracht, um schnelle Auflösung des verwendeten Mineralsalzes und die gewünschte Sättigung zu erreichen. Anschließend wird das Gemisch 6 bis 24 Stunden bei einer verhältnismäßig niedrigen Temperatur, vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen etwa 0° und 6°C gehalten. Die unlöslichen Teile werden bei der bevorzugten Arbeitsweise durch Zentrifugieren bei einer ebenfalls zwischen etwa 0° und 60C liegenden-Temperatur entfernt.Salting out takes place on the supernatant layer, which is obtained after centrifuging the mixture obtained in the mild extraction, with the aid of solutions of a mineral salt, for example ammonium sulfate, at various concentrations. To carry out the salting out, the temperature of the reaction mixture is preferably brought to a level sufficient to achieve rapid dissolution of the mineral salt used and the desired saturation. The mixture is then held at a relatively low temperature, preferably at a temperature between about 0 ° and 6 ° C., for 6 to 24 hours. The insoluble components are removed in the preferred method by centrifugation at a temperature-temperature is also between about 0 ° and 6 0 C.

Die wasserlöslichen Extrakte gemäß der Erfindung werden The water-soluble extracts according to the invention are

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anschließend beispielsweise durch Gefriertrocknen, aus den aus den vorstehend beschriebenen Stufen erhaltenen Lösungen, die bei der Dialyse nicht durch eine Membran hindurchtreten, die die Substanzen mit einem Molekulargewicht oberhalb von 1000 zurückhält, in den trockenen Zustand überführt. Beispielsweise wird eine Membran des Typs "Diaflo UM 2" (Amicon) verwendet.then, for example, by freeze-drying the solutions obtained from the steps described above which do not pass through a membrane during dialysis pass through, which retains the substances with a molecular weight above 1000, in the dry Transferred state. For example, a membrane of the type "Diaflo UM 2" (Amicon) is used.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die wasserlöslichen Extrakte außerdem nach geeigneten physikalisch-chemischen Verfahren, insbesondere durch Chromatographie an Adsorptionsmitteln, z.B. DEAE-Cellulose, dem unter der Bezeichnung "DEAE Biogel A" bekannten Produkt, oder durch Filtration beispielsweise durch Polyacrylamidgel,insbesondere 'unter Verwendung der unter den Handelsbezeichnungen "Biogel PlO","Biogel P6" oder "Biogel PV bekannten Produkte, gereinigt und in ihre Bestandteile getrennt werden.According to a particularly preferred embodiment of the The invention can also use the water-soluble extracts by suitable physico-chemical processes, in particular by chromatography on adsorbents, e.g. DEAE cellulose, known as "DEAE Biogel A "known product, or by filtration, for example through polyacrylamide gel, in particular 'Using those known under the trade names "Biogel PlO", "Biogel P6" or "Biogel PV" Products, cleaned and separated into their components.

Die in dieser Weise erhaltenen wasserlöslichen Extrakte,' die einen weiteren Gegenstand der Erfindung darstellen, j bestehen im wesentlichen aus einem Gemisch von wasserlöslichen Zellwandtrümmern in unterschiedlichen Mengen- ! anteilen gegebenenfalls zusammen mit nicht-aminierten : The water-soluble extracts obtained in this way, which represent a further object of the invention, consist essentially of a mixture of water-soluble cell wall debris in different amounts! share if necessary together with non-aminated :

j reduzierenden Zuckern. Die Menge der in den Extrakten ' gemäß der Erfindung enthaltenen wasserlöslichen Fragmente der Zellwand ist verschieden in Abhängigkeit von den | jeweiligen Bedingungen der Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung, insbesondere der Extraktionszeitj reducing sugars. The amount of in the extracts' according to the invention contained water-soluble fragments of the cell wall is different depending on the | respective conditions for carrying out the method according to the invention, in particular the extraction time

und der Zahl der Aussalzungen bei der Reinigung.and the number of times it was salted out during cleaning.

Die wasserlöslichen Fragmente der Zellwand bestehen im wesentlichen aus einem Disaccharid-Tetrapeptid, einem Tetrasaccharid-Heptapeptid und aus dem Dimeren, Trimeren und Tetrameren des letzteren. JThe water-soluble fragments of the cell wall consist essentially of a disaccharide tetrapeptide, a Tetrasaccharide heptapeptide and from the dimer, trimer and tetramer of the latter. J

Das Disaccharid-Tetrapeptid hat die folgende molekulareThe disaccharide tetrapeptide has the following molecular

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Zusammensetzung: N-Acetylgluoosamin (1), N-Acetylmuraminsäure (1), Alanin (2), Glutaminsäure (1), Diaminopimelinsäure (1), und sein Gerüst kann durch das folgende Schema dargestellt werden: ■Composition: N-acetylgluoosamine (1), N-acetylmuramic acid (1), alanine (2), glutamic acid (1), diaminopimelic acid (1), and its skeleton can be represented by the following Scheme can be represented: ■

NAG-NAM " · ;NAG-NAM "·;

Ala-Glu-DAP-Ala ■ 'Ala-Glu-DAP-Ala ■ '

Hierin bedeuten:Herein mean:

NAG = N-Acetylglucosamin ; NAG = N-acetylglucosamine ;

NAM = N-Acetylmurarninsäure (acide N-acetylmuramique)NAM = N-acetylmurarnic acid (acidic N-acetylmuramique)

AIa = Alanin jAIa = alanine j

GIu = Glutaminsäure ' jGIu = glutamic acid 'j

DAP = Diaminopimelinsäure '. DAP = diaminopimelic acid '.

•Das Tetrasaccharid-Heptapeptid hat die folgende -moleku-r lare Zusammensetzung: N-Acetylglucosamin (2), N-Acetylmuraminsäure (2), Alanin (J>), Glutaminsäure (2), Diaminopimelinsäure (2), und sein Gerüst kann durch das folgende Schema dargestellt werden:• The tetrasaccharide heptapeptide has the following molecular composition: N-acetylglucosamine (2), N-acetylmuramic acid (2), alanine (J>), glutamic acid (2), diaminopimelic acid (2), and its structure can be through the following scheme can be represented:

NAG - NAM - NAG - NAMNAG - NAM - NAG - NAM

A-Ia AIa ·A-Ia AIa

• I• I

GIu GIuGIu GIu

1 I 1 I.

DAP ^ DAPDAP ^ DAP

AIa-AIa-

Die nicht-aminierten reduzierenden Zucker bestehen im wesentlichen aus Glucose und gegebenenfalls Mannose und Galactose.The non-aminated reducing sugars consist essentially of glucose and optionally mannose and Galactose.

Die Konstitution der in der beschriebenen Weise erhaltenen wasserlöslichen Extrakte kann nach üblichen MethodenThe constitution of the water-soluble extracts obtained in the manner described can be determined by customary methods

zur Bestimmung des Gehalts an Aminosäuren., aminierten : JZuckern und nicht-aminierten reduzierenden Zuckern nachgewiesen werden. !to determine the content of amino acids., aminated: J sugars and non-aminated reducing sugars can be detected. !

Mit Hilfe der vorstehend beschriebenen Reinigungsstufe können erfindungsgemäß wasserlösliche Extrakte erhalten werden, die hauptsächlich das Tetrasaccharid-Hepta-With the help of the cleaning stage described above water-soluble extracts can be obtained according to the invention, which mainly contain the tetrasaccharide hepta-

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peptid gegebenenfalls in Verbindung mit nicht aminierten \ reduzierenden Zuckern enthalten. Beispielsweise ergibtpeptide possibly in connection with non-aminated \ reducing sugars. For example, results in

der nach der milden Extraktion und nach der Isolierung erhaltene rohe wasserlösliche Extrakt nach Chromatographie an DEAE-Cellulose mit Hilfe geeigneter Elutionsmittel eine Gruppe von Substanzen, die das Disaccharid-Tetrapeptid, das Tetrasaccharid-Heptapeptid sowie sein Dimeres, Trimeres und Tetrameres gegebenenfalls in Verbindung mit nicht aminierten reduzierenden Zuckern umfaßt. Im Verlauf der Chromatographie werden die wasserlöslichen Substanzen in der Reihenfolge des abnehmenden Molekulargewichts isoliert.the crude water-soluble extract obtained after the mild extraction and isolation after chromatography on DEAE cellulose with the help of suitable eluents a group of substances that contain the disaccharide tetrapeptide, the tetrasaccharide heptapeptide and its dimer, Trimers and tetrameres optionally in connection with non-aminated reducing sugars. In the course Chromatography lists the water-soluble substances in the order of decreasing molecular weight isolated.

Da die Aktivität der wasserlöslichen Extrakte gemäß der Erfindung an die Anwesenheit der Diaminopimelinsäure gebunden ist, ist es besonders zweckmäßig, aus dem rohen Gemisch die Substanzen zu isolieren, die in genügend großen Mengen vorhanden sind und einen hohen Gehalt an Diaminopimelinsäure haben.Since the activity of the water-soluble extracts according to the invention is due to the presence of diaminopimelic acid is bound, it is particularly useful to isolate the substances from the raw mixture that are in sufficient are present in large quantities and are high in diaminopimelic acid.

Gemäß einer Variante der Erfindung führt man die Chroma-· tographie vorteilhaft durch, inäem man die DEAE-Cellulose '■ mit einer Pufferlösung, die einen pH-Wert von etwa 7 hat, ; ins Gleichgewicht bringt und mit einem sauren Puffer, | ; der beispielsweise einen pH-Wert von etwa 3 hat, eluiert. ; Auf diese Weise können durch Chromatographie wasserlös- : liehe Extrakte isoliert werden, die hauptsächlich das . : Tetrasaccharid-Heptapeptid gegebenenfalls in Verbindung mit nicht-aminierten reduzierenden Zuckern enthalten. ;According to a variant of the invention performs the chroma · chromatography advantageously, inäem to the DEAE-cellulose '■ with a buffer solution having a pH of about 7; balances and with an acidic buffer, | ; which has a pH of about 3, for example, elutes. ; In this way, water-soluble extracts can be isolated by chromatography, which mainly contain the. : Contains tetrasaccharide heptapeptide possibly in connection with non-aminated reducing sugars. ;

Die gemäß der Erfindung hergestellten wasserlöslichen Extrakte weisen eine interessante Aktivität,als immunologische Adjuvantia auf, ohne arthrogene Aktivität zu zeigen.The water-soluble extracts prepared according to the invention have an interesting activity as an immunological one Adjuvantia without showing arthrogenic activity.

Die Wirksamkeit als Adjuvans wird am Meerschweinchen, Hart ley-Stamm, nach der Methode von R.G. White und Mit-The effectiveness as an adjuvant is determined on the guinea pig, Hartley strain, according to the method of R.G. White and Mit-

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arbeitern, Immunology 7 (1964) I58 bestimmt. Die arthrogene Wirkung und die Schutzwirkung werden nach den Methoden bestimmt, die von P. Bonhomme in CR. Acad. Sei., Serie D, 265 (1966) 1422 und CR. Acad. Sei. Serie D, 265 (1967) 2115 beschrieben werden.workers, Immunology 7 (1964) I58. The arthrogenic Effect and protection are determined according to the methods described by P. Bonhomme in CR. Acad. Sci., Series D, 265 (1966) 1422 and CR. Acad. May be. Series D, 265 (1967) 2115.

Beim Meerschweinchen bewirken die wasserlöslichen .Extrakte gemäß der Erfindung eine Verstärkung der Antikörperbildung bei intrakutaner Verabreichung von Dosen von 0,1 mg oder höheren Dosen.In guinea pigs, the water-soluble extracts according to the invention increase the formation of antibodies with intracutaneous administration of doses of 0.1 mg or higher.

Die Produkte gemäß der Erfindung können iiv der Humanoder Veterinärmedizin verwendet werden, um die Widerstandskraft gegen Infektionen durch Viren oder Bakterien zu steigern. Sie bewirken eine Verstärkung der Bildung von Antikörpern, die gegen pathogene Mikroorganismen wirksam sind, und können in Verbindung mit Impfstoffen verabreicht werden, um eine maximale Antikörperreaktion sicherzustellen.The products according to the invention can iiv the human or Veterinary medicine used to increase resistance to infection by viruses or bacteria to increase. They cause an increase in the formation of antibodies against pathogenic microorganisms are effective and can be administered in conjunction with vaccines to maximize antibody response to ensure.

Die Erfindung umfasst ferner Arzneimittelzubereitungen, die die wasserlöslichen Extrakte gemäß der Erfindung in Verbindung mit einem oder mehreren verträglichen und pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmitteln oder "Hilfsstoffen und gegebenenfalls mit anderen Arzneimitteln, z.B. Antibiotika, Mitteln gegen Hyperämie und Impfstoffen, enthalten. In diesen Zubereitungen sind die wasserlöslichen Extrakte gemäß der Erfindung im allgemeinen in Mengen von mehr als 0,1 Gew.-^ enthalten.The invention further comprises pharmaceutical preparations which contain the water-soluble extracts according to the invention in conjunction with one or more compatible and pharmaceutically acceptable diluents or "Auxiliary materials and, if necessary, with other drugs, e.g. antibiotics, agents against hyperemia and Vaccines. In these preparations the water-soluble extracts according to the invention are generally contained in amounts of more than 0.1 wt .- ^.

Die Zubereitungen können oral, rektal, parenteral oder in Form von Aerosolen verabreicht werden. In der Humantherapie hängen die Dosen von der gewünschten Wirkung ab. Sie können beim Erwachsenen zwischen 10 und 50 mg pro Tag liegen.The preparations can be administered orally, rectally, parenterally or in the form of aerosols. In human therapy the doses depend on the desired effect. You can take between 10 and 50 mg in adults per day lie.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.The invention is further illustrated by the following examples.

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50 g Bakterienreste, die von Lipiden befreit und aus · Zellen von Escherichia Coll B nach der Methode von ' A. Aebi und Mitarbeitern, Bull. Soc. Chem. Biol. 35 ' (1953) 661, erhalten worden sind, werden in 250 ml Wasser, das 0,1 ml des Tensids "NP-4o" enthält, in einer Mühle des Typs "Ultra-Turrax" gemahlen und homogenisiert. 'Das Gemisch wird 48 Stunden bei 4θ C gerührt und ; 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert (4000 U/Min.). Der ; Überstand wird auf 8o C erhitzt. Dann wird Ammonium-.s.ulfat in einer solchen Menge zugesetzt, daß eine zu : 40^ gesättigte Lösung erhalten wird. Nach 12 Stunden bei 40C und Zentrifugierung für 30 Minuten wird eine Fällung P1I0 erhalten. Dem Überstand wird Ammoniumsulfat in einer solchen Menge zugesetzt, daß eine Lösung mit 70$ Sättigung erhalten wird. Nach 12 Stunden bei 4°C und Zentrifugation für 30 Minuten wird eine Fällung P„Q erhalten.50 g of bacterial residues which have been freed from lipids and removed from cells of Escherichia Coll B according to the method of A. Aebi and coworkers, Bull. Soc. Chem. Biol. 35 '(1953) 661, are ground and homogenized in 250 ml of water containing 0.1 ml of the surfactant "NP-40" in an "Ultra-Turrax" type mill. 'The mixture is stirred for 48 hours at 4θ C and; Centrifuged for 30 minutes at 4 ° C (4000 rpm). Of the ; The supernatant is heated to 8oC. Ammonium sulphate is then added in such an amount that a solution saturated to: 40 ^ is obtained. After 12 hours at 4 ° C. and centrifugation for 30 minutes, a precipitate P 1 I 0 is obtained. Ammonium sulfate is added to the supernatant in such an amount that a solution with 70% saturation is obtained. After 12 hours at 4 ° C. and centrifugation for 30 minutes, a P " Q precipitate is obtained.

Die Fällungen P2^0 und P70 und der Überstand S70 werden anschließend getrennt gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die verschiedenen Lösungen, die nicht durch die Membran hindurchtreten, werden gefriergetrocknet. Hierbei werden 9 g der Fraktion P^0, O,l8o g der Fraktion P70 und 2,200 g der Fraktion S70, die den rohen wasserlöslichen Extrakt enthält, erhalten.The precipitates P 2 ^ 0 and P 70 and the supernatant S 70 are then dialyzed separately against distilled water. The various solutions that do not pass through the membrane are freeze-dried. This gives 9 g of fraction P 0 , 0, 18o g of fraction P 70 and 2,200 g of fraction S 70 , which contains the crude water-soluble extract.

Beispiel 2Example 2

Reinigung zur Gewinnung eines Tetrasaccharid-Heptapeptids in Verbindung mit nicht aminierten reduzierenden Zuckern Purification to obtain a tetrasaccharide heptapeptide in connection with non-aminated reducing sugars

Die gemäß Beispiel 1 erhaltene Fraktion S70 wird durch Säulenchromatographie an DEAE-Cellulose (Höhe 92 cm, Durchmesser 2,5 cm), die mit einem 0,05-molaren Veronalpuffer von pH 7 ins Gleichgewicht gebracht worden ist, gereinigt, wobei mit einem 0,05-molaren Natriumcitratpuffer von pH 3 eluiert wird und Fraktionen von je 2 cm^ aufgefangen werden, die mit 1 bis 500 numeriert The fraction S 70 obtained according to Example 1 is purified by column chromatography on DEAE cellulose (height 92 cm, diameter 2.5 cm) which has been equilibrated with a 0.05 molar veronal buffer of pH 7, with a 0.05 molar sodium citrate buffer of pH 3 is eluted and fractions of 2 cm ^ each are collected, which are numbered 1 to 500

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werden. Die Elution wird durch optische Ablesung der Eluate am Spektrophotometer bei 280 und 220 nut verfolgt.will. The elution is followed by optical reading of the eluates on the spectrophotometer at 280 and 220 times.

Die Fraktionen Nr.180 bis 220 enthalten den aktiven Extrakt. Nach der Dialyse gegen destilliertes Wasser zur Entfernung der Salze und anschließender Gefriertrocknung werden 37 mg eines wasserlöslichen Extrakts mit folgenden Eigenschaften erhalten:Fractions 180 to 220 contain the active extract. After dialysis against distilled water 37 mg of a water-soluble extract are used to remove the salts and subsequent freeze-drying obtained with the following properties:

Aussehen: weißes Pulver
Zusammensetzung:Appearance: white powder
Composition:

a) Aminosäuren : (Molverhältnis): Alanin (3), Glutaminsäure (2), Diaminopimelinsäure (2).a) Amino acids : (molar ratio): alanine (3), glutamic acid (2), diaminopimelic acid (2).

b) Aminozucker b) amino sugar

(Molverhältnis): N-Acetylglucosamin (2), N-Acetylmuraminsäure (2). j(Molar ratio): N-acetylglucosamine (2), N-acetylmuramic acid (2). j

Molekulargewicht (berechnet auf Basis von 3 Alaninresten im Molekül): 5600 + 200.Molecular weight (calculated on the basis of 3 alanine residues in the molecule): 5600 + 200.

Der Gehalt an Aminosäuren beträgt 15 + 2$ und der Gehalt an Aminozuckern 1795 + 2fo. Der Rest besteht aus nicht-aminierten reduzierenden Zuckern (im wesentlichen Glucose).The content of amino acids is 15 + 2 $ and the content of amino sugars is 17 9 5 + 2fo. The remainder consists of non-aminated reducing sugars (essentially glucose).

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Claims (12)

- ίο - Patenta nsprüche- ίο - Patent claims 1) Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichen, Diaminopimelinsäure enthaltenden Extrakten von niedrigem Molekulargewicht aus Zellen von Escherichia coli, dadurch gekennzeichnet, daß man die von Lipiden befreiten Bakterienreste der Zellen von Escherichia coli einer milden Extraktion unterwirft und die wasserlöslichen Extrakte auf physikalisch-chemischem Wege isoliert.1) Process for the preparation of water-soluble, diaminopimelic acid-containing extracts of low Molecular weight from cells of Escherichia coli, characterized in that that of lipids freed bacterial residues of the cells from Escherichia coli subjected to a mild extraction and the water-soluble extracts are isolated by a physico-chemical route. 2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die wasserlöslichen Extrakte einer Reinigung unterwirft.2) Method according to claim 1, characterized in that the water-soluble extracts of a cleaning subject. 3) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die milde Extraktion durch Mahlen und Homogenisieren der von Lipiden befreiten Bakterienreste in einem wässrigen Medium durchführt.3) Method according to claim 1 and 2, characterized in that the mild extraction is carried out by grinding and homogenizing the lipid-freed bacterial residues in an aqueous medium. 4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion in Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels 'durchführt.4) Process according to claim 1 to 3, characterized in that the extraction is carried out in the presence of a surfactant 'performs. 5) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extrakte durch mehrmaliges Zentrifugieren, Aussalzen, Dialysieren und durch Gefriertrocknen aus der durch milde Extraktion erhaltenen Lösung isoliert.5) Method according to claim 1 to 4, characterized in that the extracts are repeated several times Centrifugation, salting out, dialysis and through Freeze-drying isolated from the solution obtained by mild extraction. 6) Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reinigung der wasserlöslichen Extrakte durch Chromatographie an Adsorptionsmittel^ oder durch Filtration durchführt.6) Method according to claim 1 to 5, characterized in that the purification of the water-soluble Carries out extracts by chromatography on adsorbents ^ or by filtration. 7) Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekenn-7) Method according to claim 1 to 6, characterized in that zeichnet, daß man die Chromatographie an DEAE-Cellu-j lose oder an dem Produkt der Handelsbezeichnung | "DEAE-Biogel A" vornimmt.draws that the chromatography on DEAE-Cellu-j loose or on the product of the trade name | "DEAE-Biogel A". 509848/1066509848/1066 25Ί9936
- 11 - :25Ί9936
- 11 -: 8) Verfahren nach Anspruch 1 "bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Filtration mit einem PoIyacrylamidgel durchführt. I8) Method according to claim 1 "to 6, characterized in that that the filtration is carried out with a polyacrylamide gel. I. 9) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man nach der Homogenisierung in einem wässrigen
Medium und nach dem Zentrifugieren zweimal mit
Ammoniumsulfat aussalzt, nach jedem Aussalzen zentrifugiert, den erhaltenen Überstand gegen destilliertes Wasser dialysiert, an einer Säule chromatographiert und den aktiven wasserlöslichen Extrakt
isoliert. ;9) Method according to claim 1, characterized in that
that after homogenization in an aqueous
Medium and after centrifugation twice with
Ammonium sulfate salted out, centrifuged after each salting out, the supernatant obtained dialyzed against distilled water, chromatographed on a column and the active water-soluble extract
isolated. ; 10) Wasserlösliche, Diaminopimelinsäure enthaltende
Extrakte mit niedrigem Molekulargewicht, dadurch
gekennzeichnet, daß sie ein Molekulargewicht zwischen 1000 + 200 und 8000 + 200 haben und im wesentlichen aus wasserlöslichen Fragmenten der Zellwände
von Escherichia coli gegebenenfalls in Verbindung ; mit nicht-aminierten reduzierenden Zuckern bestehen.10) Water-soluble diaminopimelic acid containing
Low molecular weight extracts, thereby
characterized in that they have a molecular weight between 1000 + 200 and 8000 + 200 and consist essentially of water-soluble fragments of the cell walls
from Escherichia coli, where appropriate, in conjunction; consist with non-aminated reducing sugars. 11) Wasserlösliche Extrakte nach Anspruch 10, dadurch .11) water-soluble extracts according to claim 10, characterized. gekennzeichnet, daß die wasserlöslichen Fragmente
aus einem Gemisch eines Disaccharid-Tetrapeptids, ' eines Tetrasaccharid-Heptapeptids, des Dimeren,
Trimeren und Tetrameren des letzteren gegebenen- falls in Verbindung mit nicht-aminierten
reduzierenden Zuckern bestehen.characterized in that the water-soluble fragments
from a mixture of a disaccharide tetrapeptide, ' a tetrasaccharide heptapeptide, the dimer,
Trimers and tetramers of the latter, optionally in connection with non-aminated ones
reducing sugars. 12) Arzneimittelzubereitungen, enthaltend eine wirksame
Menge wenigstens eines wasserlöslichen Extrakts
nach Anspruch 10 und 11 und einen verträglichen und j pharmazeutisch unbedenklichen Träger oder Hilfsstoff. 12) Medicinal preparations containing an effective
Amount of at least one water-soluble extract
according to claims 10 and 11 and an acceptable and pharmaceutically acceptable carrier or excipient. 509848/1066509848/1066
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