DE2516919C3

DE2516919C3 - Method for staining and identifying haematological examination material

Info

Publication number: DE2516919C3
Application number: DE19752516919
Authority: DE
Inventors: Dietrich Dr 7812 Bad Krozingen; Löhr Walter Dr 7801 Heuweiler; Kretschmer Vera; Sohmer Inge; 7800 Freiburg Wittekind
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Filing date: 1975-04-17
Publication date: 1977-09-29

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Anfärben und Kenntlichmachen von hämatologischem Untersuchungsmaterial. The invention relates to a method for staining and identifying haematological examination material.

Die Anfärbung von hämatologischem Untersuchungsmaterial, wie Blutausstriche und Knochenmarksausstriche, geschieht weltweit nach einem relativ einheitlichen Verfahren, bei dem Färbungen angewendet werden, die unter den Bezeichnungen 1) Wright's Stain, 2) Leishman's Stain, 2) May-Grünwald-Färbung,4) Giemsa-Färbung bekannt sind. Die Färbemelhoden nach 3) und 4) werden vor allem in der deutschsprachigen Literatur unter der Bezeichnung »panoptische Färbung nach Pappenheim«, abgekürzt »Pappenheim-Färbung«, zusammengefaßt.The staining of haematological test material, such as blood smears and bone marrow smears, happens worldwide according to a relatively uniform process in which coloring is used under the names 1) Wright's Stain, 2) Leishman's Stain, 2) May-Grünwald stain, 4) Giemsa staining are known. The staining testicles according to 3) and 4) are mainly found in German-speaking Literature under the designation "panoptic coloring according to Pappenheim", abbreviated as "Pappenheim coloring", summarized.

Die unter 1) bis 4) genannten Färbeverfahren werden nicht mit Farblösungen vorgenommen, die durch Einwiegen reiner Farbstoffsubstanz in die Lösungsmittel, meist Methanol oder Wasser, hergestellt sind. Vielmehr werden bekanntermaßen Gemische von Farbstoffen in der Hämatologie angewendet; vgl. hierzu Roe.Wilcox und Li 11 ie in US-Public Health Reports 56, 1906-1909 (1941); Taylor in Journ. Histochem. Cytochem. 8, 248 (1960); Toepfer in Progression Histochem. and Cytochem, Vol. 1/5, 6 (1970); u.a.The dyeing processes mentioned under 1) to 4) are not carried out with dye solutions that are through Weighing of pure dye substance into which solvents, mostly methanol or water, are produced. Rather, it is known that mixtures of dyes are used in hematology; see Roe.Wilcox and Li 11 ie in US Public Health Reports 56: 1906-1909 (1941); Taylor in Journ. Histochem. Cytochem. 8: 248 (1960); Potter in Progression Histochem. and Cytochem, Vol. 1/5, 6 (1970); i.a.

Diese Farbstoffgemische bestehen grundsätzlich aus a) kationischen Farbstoffen und b) aus anionischen Farbstoffen.These dye mixtures basically consist of a) cationic dyes and b) anionic ones Dyes.

a) Bei den kationischen Farbstoffen handelt es sich um Farbstoffe mit dem Grundgerüst des Thiazins (Thiodiphenylamin). Der in diesen Gemischen wesentliche Farbstoff ist das Methylenblau (Tetramethylphenazthioniumchlorid). Methylenblau ist extrem instabil, da durch oxydative Dirnethylierung die weniger methylierten Homologen, die Azur-Farbstoffe (Azur B, A, C) und das entmethylierte Thionin entstehen. Diese Farbstoffe lassen sich nicht durch die herkömmlichen Trennverfahren der organischen Chemie gewinnen, sondern in den benötigten großen Mengen und mit vertretbarem Material- und Personalaufwand nur auf chromatographischem Wege.a) The cationic dyes are dyes with the basic structure of the thiazine (Thiodiphenylamine). The essential dye in these mixtures is methylene blue (tetramethylphenazthionium chloride). Methylene blue is extremely unstable because the less methylated ones due to oxidative dimethylation Homologues, the azure dyes (azure B, A, C) and the demethylated thionine are formed. These dyes can not be obtained by the conventional separation processes of organic chemistry, but in the required large quantities and with justifiable material and personnel costs only on chromatographic Ways.

Aufgrund ihrer Färbeeigenschaften kommt den Azur-Farbstoffen zentrale Bedeutung in der Blutfärbung zu. Nur diese Thiazin-Untergruppe ergibt gemeinsam mit Eosin den sogenannten Romanowsky-Giemsa-Effekt, d. h. eine starke und brilliante Anfärbung von Zellkernen und Parasitenkernen in Purpurfarbe. Reines Methyienbiau und Thionin sind an diesem wichtigen Phänomen nicht beteiligt.Due to their coloring properties, the azure dyes are of central importance in blood staining to. Only this thiazine subgroup, together with eosin, results in the so-called Romanowsky-Giemsa effect, d. H. a strong and brilliant staining of cell nuclei and parasite nuclei in purple color. Pure Methyienbiau and Thionin are not involved in this important phenomenon.

Noch heute ist das Methylenblau in den Farblösungen 1) bis 4) obligatorischer Bestandteil, weil Giemsa ZbI.Even today, the methylene blue in color solutions 1) to 4) is a mandatory component because Giemsa ZbI.

Bakt. I, Abt. 37,308 (1904) und Dtsch. Med. Wochen?. 33 676 (1907) behauptet hatte, daß die zur Herstellung eines ausreichenden Kontrastes gegen den purpurfarbenen Zellkern notwendige Blaufärbung des Cytoplasmas des Zelleibes, nur durch Methylenblau zu erreichen sei! Die Wahrheit dieser Ansicht Giemsas konnte so lange nicht nachgeprüft werden, als die einzelnen Azofarbstoffe nicht in absolut reiner Form verfügbar waren.Bakt. I, Abt. 37,308 (1904) and Dtsch. Med. Weeks ?. 33 676 (1907) had asserted that the for producing a sufficient contrast against the purple Cell nucleus necessary blue coloration of the cytoplasm of the cell body, can only be achieved with methylene blue! The truth of Giemsa's view could not be verified for as long as the individual azo dyes were not available in absolutely pure form.

b) Zu den anionischen Farbstoffen gehört das Eosin oder besser gesagt die Eosine, da Eosin ebenfalls kaum jemals in reiner Form vorliegt. Nachdem aber als ausreichend erscheint, die Anwendung des tetrabromierten Fluoresceinderivates Eosin Y zu empfehlen, dessen Reinigung aber weniger große Bedeutung hat als die selektive Anwendung des kationischen Farbstoffs Azur B, wird hier auf eine weitere Darstellung der Eigenschaften von Eosin verzichtet.b) Eosin, or rather eosins, belongs to the anionic coloring agents, since eosin hardly belongs either ever exists in pure form. But after it appears to be sufficient, the application of the tetrabrominated Fluorescein derivative eosin Y is recommended, but its purification is less important than the selective application of the cationic dye Azure B, is referred to here on a further illustration of the Properties of eosin omitted.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin, die bisher bekannten, mit chemisch instabilen Farbstoffgemischen arbeitenden und zu unterschiedlich ausfallenden Ergebnissen führenden Verfahren durch ein exakt arbeitendes Verfahren zum Anfärben von hämatologischem Untersuchungsgut unter Verwendung eines stabilen Reagens gleichbleibender Qualität zu ersetzen. Die Erfinder sind zu der Auffassung gelangt, daß jedem einzelnen Azurfarbstoff eine spezifische Färbeeigenschaft zukommt, wobei sich diese ihre Auffassung auf Beobachtungen an lebenden Zellen gründet.The object of the present invention now consists in the previously known, with chemically unstable Dye mixtures working and leading to different results through processes using a precisely working method for staining hematological specimens a stable reagent of consistent quality. The inventors have come to the conclusion that every single azure dye has a specific coloring property, and these are their own The conception is based on observations on living cells.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß dadurch, daß man zum Anfärben des Untersuchungsguts, wie Blutausstriche und Knochenmarksausstriche, eine Lösung aus einem Gemisch des chromatographisch gereinigten kationischen Farbstoffs Azur B mit anionischem Farbstoff Eosin verwendet.This object is achieved according to the invention in that, for staining the material to be examined, such as Blood smears and bone marrow smears, a solution of a mixture of the chromatographically Purified cationic dye azur B with anionic dye eosin used.

Nach Roe, Lillie und Wilcox, Publ. Health Rep. 55, 1272-1278 (1940), soll Azur B mit Eosin eine ziemlich vollständige Färbung ergeben. Jedoch ist es nach heutiger Kenntnis ausgeschlossen, daß diese Autoren mit einem reinen Azur B gearbeitet haben, denn die Erfinder konnten nachweisen (Löhr, Grubhofer, Sohmer, Wittekind, Stain, Technology 49, 359-366, 1974), daß die erst seit etwa fünfzehn Jahren auf breiter Basis angewendete dünnschicht- und säulenchromatographische Isolierung der Azurfarbstoffe jeden einzelnen Azurfarbstoff in wirklich reiner Form zu liefern vermag, und in der gleichen Arbeit zeigen, daß in den etwa zwanzig Jahren, die seit der Einführung chromatographischer Verfahren vergangen sind, keine Vorveröffentlichung die Darstellung des Farbstoffs Azur B in so ausreichender Menge beschreibt, daß damit die notwendigen, ausgedehnten Färbeversuche an hämatologischem Untersuchungsgut durchgeführt werden konnten.After Roe, Lillie and Wilcox, Publ. Health Rep. 55, 1272-1278 (1940), azure B with eosin is said to be a give quite a complete coloration. However, based on current knowledge, it is impossible that this Authors have worked with a pure azure B, because the inventors were able to prove (Löhr, Grubhofer, Sohmer, Wittekind, Stain, Technology 49, 359-366, 1974) that the only since about For fifteen years, thin-layer and column chromatographic isolation of the Azure dyes is able to deliver every single azure dye in a truly pure form, and in the same form Work show that in the approximately twenty years that have passed since the introduction of chromatographic processes are, no prior publication the preparation of the dye azure B in such a sufficient amount describes that with it the necessary, extensive staining experiments on hematological specimens could be carried out.

Fortschrittlich ist der Ersatz der erwähnten Farbstoffgemische durch Azur B-Eosin deshalb, weil a) das Azur B-Eosin in gleichbleibender Qualität über lange Zeiträume geliefert werden kann, was im Falle der Giemsa- u. a. -Mischungen bekanntlich nicht möglich ist (Troepfer, Dtsch. Ges. Inn. Med. 78, 272, 1972), b) Azur B-Eosin Färbungen von mindestens gleicher, wenn nicht besserer Qualität liefert als jene Gemische und c) die Bereitstellung von Azur B in gleichbleibender Qualität einmal absolute Voraussetzung für die weltweit mit gleichbleibenden Farbwerten auszuführende wichtigste Blut- und Knochenmarksfärbung, und zum anderen wahrscheinlich auch eine wichtige Voraussetzung für den optimalen Einsatz von »Färbeapparatu-The replacement of the dye mixtures mentioned by azure B-eosin is progressive because a) the azure B-eosin can be delivered in consistent quality over long periods of time, which in the case of Giemsa- et al. Mixtures are known not to be possible (Troepfer, Dtsch. Ges. Inn. Med. 78, 272, 1972), b) Azure B-Eosin provides stains of at least the same, if not better quality than those mixtures and c) the provision of Azur B in consistent quality once an absolute requirement for the world The most important blood and bone marrow staining to be carried out with constant color values, and for others probably also an important prerequisite for the optimal use of »dyeing apparatus-

ren« für die automatisierte Färbung (automated staining) ist. Geeignete Apparate sind bereits konstruiert und offensichtlich besser als die Farbstoffgemische, auf deren Färbeleistung diese Apparate angewiesen sind.ren «for automated staining. Suitable equipment has already been designed and obviously better than the dye mixtures on whose dyeing performance these machines rely are.

Claims

Claim:

Method for staining and identifying haematological examination material !, thereby marked that one to Staining specimens such as blood smears and bone marrow smears from a solution a mixture of the chromatographically purified cationic dye Azure B with anionic dye Eosin dye used.