DE2459932A1 - METHOD FOR CLEANING UP COENZYME A - Google Patents
METHOD FOR CLEANING UP COENZYME AInfo
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51111.1.ER-BORE - GROKXING * BEUFRL· · 3C1IÖN · HERTEI.51111.1.ER-BORE - GROKXING * BEUFRL · · 3C1IÖN · HERTEI.
MÜNCHEN - IiItATrKSOlIWEIG - KÖLNMUNICH - IiItATrKSOlIWEIG - COLOGNE
18. DEZ. 197418 DEC. 1974
DR1Wl MQLLER-BORt'DRAUNSCHWeia H.W.UROEMINQ.OlPL.-tNO.· MÜNCHEN DR-P. DEUFEL, DlpL.-CMEM.* MÜNCHEN DR-A. SCHÖN. DIPL-CHEM.- MÜNCHEN WERNER KERTEl, mPL-'PHYS* · KULMDR 1 Wl MQLLER-BORt'DRAUNSCHWeia HWUROEMINQ.OlPL.-tNO. MUNICH DR-P. DEUFEL, DlpL.-CMEM. * MUNICH DR-A. NICE. DIPL-CHEM.- MUNICH WERNER KERTEl, mPL-'PHYS * KULM
D/S/Gl - T 1313D / S / Gl - T 1313
Tanabe Seiyaku Co., Ltd., Osaka / Japan Verfahren zur Reinigung von Coenzym ATanabe Seiyaku Co., Ltd., Osaka / Japan Process for purifying coenzyme A.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Coenzym A. Insbesondere befasst sich die Erfindung mit der Reinigung von oxydiertem und reduziertem Coenzym A.The invention relates to a method for purifying coenzyme A. In particular, the invention is concerned with the purification of oxidized and reduced coenzyme A.
Unter dem Begriff "reduziertes Coenzym A" soll ein Coenzym A verstanden werden, das eine freie Merkaptogruppe in seinem Molekül enthält, d.h., dass es sich um eine Verbindung der nachfolgend angegebenen Formel (I) handelt. Unter dem Begriff "oxydiertes Coenzym A" soll ein Disulfidtyp-Dimeres von reduziertem Coenzym A verstanden werden, d.h. die Verbindung, welche durch die Formel (II) dargestellt wird. Der Begriff "Gesamtcoenzym A" betrifft eine Mischung aus reduziertem und oxydiertem Coenzym A.The term “reduced coenzyme A” is to be understood as meaning a coenzyme A which has a free mercapto group in its molecule contains, i.e. that it is a compound of the formula (I) given below. Under the term "oxidized Coenzyme A "shall be understood to mean a disulfide-type dimer of reduced coenzyme A, i.e. the compound which the formula (II) is represented. The term "total coenzyme A" relates to a mixture of reduced and oxidized coenzyme A.
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OOOO
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Π ItΠ It
CH -O-P-0-P-OCH» Δ > t ι *■ CH-OP-0-P-OCH » Δ > t ι * ■
HO 0-ΡΟ HHO 0-ΡΟ H
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OH OH C (CH- } ι Δ OH OH C (CH-} ι Δ
CHOH ι CHOH ι
CONHCH2CH2CONHCH2Ch2SHCONHCH 2 CH 2 CONHCH 2 Ch 2 SH
(I)(I)
Reduziertes Coenzym AReduced coenzyme A
O OO O
Il IlIl Il
CH^-O-P-O-P-OCILCH ^ -O-P-O-P-OCIL
OH OH C(CH-.)OH OH C (CH-.)
ι Jι J
CHOHCHOH
HOHO
(ID Oxydiertes Coenzym A(ID Oxidized Coenzyme A
Es ist bekannt, dass Coenzym A (nachfolgend aus Einfachheitsgründen als "CoA" bezeichnet) ein wichtiger Faktor bei der Biosynthese von Zuckern, Kohlehydraten, Steroiden und Karotinoiden ist und in verschiedenen lebenden Zellen, wie beispielsweise Hefe, Bakterien sowie tierischen Geweben enthalten ist. Es ist ferner bekannt, dass CoA in einer Rohlösung, die aus diesen CoA-enthaltenden lebenden Zellen hergestellt worden ist, sowohl in oxydierter und reduzierter Form als auch in Form eines Disulfide mit einer Thiolverbindung, wie Zystein oder Glutathion, vorliegt. It is known that Coenzyme A (hereinafter referred to as "CoA" for the sake of simplicity) is an important factor in biosynthesis of sugars, carbohydrates, steroids and carotenoids and in various living cells, such as yeast, It contains bacteria as well as animal tissues. It is also known that CoA in a crude solution, which consists of these CoA-containing living cells, both in oxidized and reduced form and in the form of a disulfide with a thiol compound such as cysteine or glutathione.
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Einige Methoden zur Reinigung von CoA sind bereits bekannt. Gemäss einer bekannten Methode wird CoA in der Weise gereinigt, dass eine CoA-Rohlösung mit einem Schwermetallsalz (beispielsweise einem Quecksilber-/ Blei-, Silber- oder Bariumsalz), PhosphowoIframsäureoder einem organischen Lösungsmittel (beispielsweise Azeton) behandelt wird. Gemäss einer anderen Methode wird CoA durch eine Aktivkohle-Adsorptionsmethode oder durch Chromatographie an einer Anionenaustauscherharzsäule gereinigt. Von diesen Methoden wird die Methode der Säulenchromatographie unter Verwendung eines Anxonenaustauscherharzes am häufigsten verwendet. Die bekannten Methoden besitzen jedoch für eine Durchführung in technischem Maßstabe Nachteile. Bei der Durchführung" der chromatographischen Methode ist es beispielsweise schwierig, CoA in einer hohen Ausbeute sowie in hoher Reinheit von einer CoA-Rohlösung zu isolieren, die verschiedene CoA-Analoga enthält, beispielsweise reduziertes CoA, oxydiertes CoA sowie Disulfide von CoA mit Zystein und/oder anderen Thiolverbindungen. Bei der Durchführung der chromatographischen Methode ist es insbesondere praktisch unmöglich, reduziertes CoA in hoher Reinheit aus der CoA-Rohlösung zu gewinnen. Dies ist deshalb der Fall, weil reduziertes CoA, das an einer Anionenaustauschersäule adsorbiert ist, ein ähnliches Verhalten wie Nukleoside und Nukleotide, insbesondere Nukleotide, wie ATP, zeigt, die in unvermeidbarer Weise in der CoA-Rohlösung enthalten sind.Some methods for purifying CoA are already known. According to One known method is to purify CoA in such a way that a raw CoA solution is mixed with a heavy metal salt (for example a mercury / lead, silver or barium salt), phosphotoIframic acid or an organic solvent (e.g. acetone). According to another method CoA is purified by an activated carbon adsorption method or by chromatography on an anion exchange resin column. Of these methods, the column chromatography method using an anxon exchange resin becomes the most common used. However, the known methods have disadvantages for implementation on an industrial scale. During execution" the chromatographic method, for example, it is difficult to obtain CoA in a high yield and in high purity from one To isolate raw CoA solution containing various CoA analogues, for example reduced CoA, oxidized CoA and disulfides of CoA with cysteine and / or other thiol compounds. It is particularly important when performing the chromatographic method practically impossible to obtain reduced CoA in high purity from the raw CoA solution. This is because it is reduced CoA adsorbed on an anion exchange column behaves similarly to nucleosides and nucleotides, in particular Shows nucleotides, such as ATP, which are inevitably contained in the raw CoA solution.
Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines einfachen und bequemen Verfahrens zur Reinigung von CoA. Ferner soll durch die Erfindung ein Verfahren geschaffen werden, bei dessen Durchführung entweder reduziertes oder oxydiertes CoA in hoher Ausbeute sowie mit hoher Reinheit aus einer CoA-Rohlösung isoliert wird, die verschiedene Verunreinigungen enthält (beispielsweise Nukleoside und Nukleotide) sowie CoA-Analoga, wie beispielsweise oxydiertes CoA, reduziertes CoA sowie Disulfide von CoA mit Thiolverbindungen (beispielsweise Zystein oder Glutathion). Durch die Erfindung soll ein Verfahren zur Verfügung gestellt werden,The object of the invention is to create a simple and convenient Process for purifying CoA. Furthermore, the invention is intended to create a method when it is carried out either reduced or oxidized CoA isolated in high yield and with high purity from a crude CoA solution containing various impurities (e.g. nucleosides and nucleotides) as well as CoA analogs such as oxidized CoA, reduced CoA and disulfides of CoA with thiol compounds (for example cysteine or glutathione). By the invention is intended to provide a method,
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bei dessen Durchführung alle Reinigungsmethoden in der Weise durchgeführt werden, dass alle vorstehend erwähnten CoA-Analoga an einem wasserunlöslichen Anionenaustauscher adsorbiert werden. Dabei sollen sich die Nukleoside, Nukleotide sowie anderen Verunreinigungen, die in unvermeidbarer Weise in einer CoA-RoIilösung enthalten sind, leicht aus der CoA-Rohlösung entfernen lassen. Es soll ein Verfahren geschaffen werden, bei dessen Durchführung die CoA-Analoga, wie oxydiertes CoA, reduziertes CoA sowie Disulfide"von CoA mit Zystein oder Glutathion, in Form von entweder oxydiertem oder reduziertem CoA gewonnen werden, und zwar durch Umwandlung der genannten Analoga in oxydiertes oder reduziertes CoA.when performing this, all purification methods are carried out in such a way that all of the above-mentioned CoA analogs be adsorbed on a water-insoluble anion exchanger. The nucleosides, nucleotides and other impurities, which are inevitably contained in a CoA raw solution can easily be removed from the CoA raw solution permit. The aim is to create a method in which the CoA analogs, such as oxidized CoA, are reduced CoA as well as disulfides "of CoA with cysteine or glutathione, in the form obtained from either oxidized or reduced CoA by converting said analogs into oxidized or reduced CoA.
Gemäss einer Ausführungsform der Erfindung wird eine oxydierte CoA-Lösung in hoher Reinheit dadurch erhalten, dass (a) eine CoA-Rohlösung mit einem wasserunlöslichen Anionenaustauscher zur Adsorption von CoA an diesem Austauscher kontaktiert wird, (b) der wasserunlösliche Anionenaustauscher mit einem Reduktionsmittel zur Umwandlung von CoA in reduziertes CoA behandelt wird, (c) der wasserunlösliche Anionenaustauscher solange gewaschen wird, bis die überschüssige Menge an Reduktionsmittel und Thiolverbindungen mit Ausnahme von CoA entfernt worden sind, (d) der wasserunlösliche Anionenaustauscher mit einem Oxydationsmittel zur Umwandlung von reduziertem CoA in oxydiertes CoA behandelt wird, (e) der wasserunlösliche Anionenaustauscher solange gewaschen wird, bis die überschüssige Menge an Oxydationsmittel und Verunreinigungen in der CoA-Rohlösung entfernt ist, und anschliessend (f) das oxydierte CoA von dem wasserunlöslichen Anionenaustauscher eluiert wird.According to one embodiment of the invention, an oxidized CoA solution obtained in high purity by the fact that (a) a CoA raw solution is contacted with a water-insoluble anion exchanger for the adsorption of CoA on this exchanger, (b) Treating the water-insoluble anion exchanger with a reducing agent to convert CoA to reduced CoA (c) the water-insoluble anion exchanger is washed until the excess amount of reducing agent and thiol compounds other than CoA have been removed, (d) the water-insoluble anion exchanger with an oxidizing agent is treated to convert reduced CoA into oxidized CoA, (e) the water-insoluble anion exchanger as long as is washed until the excess amount of oxidizing agent and impurities in the CoA crude solution is removed, and then (f) the oxidized CoA is eluted from the water-insoluble anion exchanger.
Gemäss einer anderen Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung wird eine reduzierte CoA-Lösung in hoher Reinheit dadurch erhalten, dass (a) eine CoA-Rohlösung mit einem wasserunlöslichen Anionenaustauscher zur Adsorption von CoA an diesem Austauscher kontaktiert wird, (b) der wasserunlösliche AnionenaustauscherAccording to another embodiment of the present invention a reduced CoA solution is obtained in high purity by (a) a CoA crude solution with a water-insoluble Anion exchanger is contacted for the adsorption of CoA on this exchanger, (b) the water-insoluble anion exchanger
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mit einem Reduktionsmittel zur Umwandlung von CoA in reduziertes CoA behandelt wird, (c) der wasserunlösliche Anionenaustauscher solange gewaschen wird, bis die überschüssige Menge an Reduktionsmittel und Thiolverbindungen mit Ausnahme von CoA davon entfernt ist, (d) der wässerunlösliche Anionenaustauscher mit einem Oxydationsmittel zur Umwandlung von reduziertem CoA zu oxydiertem CoA behandelt wird, (e) der wasserunlösliche Anionenaustauscher solange gewaschen wird, bis die überschüssige Menge an Oxydationsmittel und Verunreinigungen in der CoA-Rohlösung daraus entfernt ist, (g) der wasserunlösliche Anionenaustauscher v/iederum mit einem Reduktionsmittel zur Umwandlung von oxydiertem CoA in reduziertes CoA behandelt wird, (h) der wasserunlösliche Anionenaustauscher solange gewaschen wird, bis die überschüssige Menge an Reduktionsmittel von ihm entfernt worden ist, und anschliessend (i) das reduzierte CoA von dem wasserunlöslichen Anionenaustauscher eluiert wird.treated with a reducing agent to convert CoA to reduced CoA, (c) the water-insoluble anion exchanger Washing is carried out until the excess amount of reducing agent and thiol compounds with the exception of CoA thereof is removed, (d) the water-insoluble anion exchanger with an oxidizing agent to convert reduced CoA is treated to oxidized CoA, (e) the water-insoluble anion exchanger is washed until the excess Amount of oxidizing agent and impurities in the CoA crude solution is removed therefrom, (g) the water-insoluble anion exchanger v / in turn is treated with a reducing agent to convert oxidized CoA into reduced CoA, (h) the water-insoluble anion exchanger is washed until the excess amount of reducing agent is removed from it and then (i) the reduced CoA is eluted from the water-insoluble anion exchanger.
Die CoA-Rohlösung, die erfindungsgemäss verwendet werden kann, kann aus Extrakten von CoA-enthaltenden lebenden Zellen, beispielsweise CoA-erzeugenden Mikroorganismen und tierischen Geweben bestehen. Beispielsweise wird vorzugsweise der zellenfreie Extrakt eines CoA-erzeugenden Mikroorganismus als CoA-Rohlösung gemäss vorliegender Erfindung verwendet. Diese Extrakte können teilweise vor der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens gereinigt werden. Ferner können die zellfreien Extrakte von CoA-erzeugenden Mikroorganismen nach bekannten Methoden hergestellt werden, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren der Gärungsbrühe eines CoA-erzeugenden Mikroorganismus. Ferner kann man in der Weise verfahren, dass man einen CoA-erzeugenden Mikroorganismus einer Wärmebehandlung, Homogenisierung, Ultraschallzerstörung oder Lysozymbehandlung unterzieht (vgl. Methods in Enzymology, Academic Press Inc., New York, Band 1, Seite 51 (1955)). Bevorzugte Beispiele für CoA-erzeugende Mikroorganismen, die für diesen Zwack verwendet werden können, sind Sarcina lutea IAM (Institute of AppliedThe raw CoA solution that can be used according to the invention can be obtained from extracts of CoA-containing living cells, for example CoA-producing microorganisms and animal tissues exist. For example, the cell-free extract of a CoA-producing microorganism is preferably used as the raw CoA solution used in accordance with the present invention. These extracts can partially be cleaned before carrying out the process according to the invention. Furthermore, the cell-free extracts are produced by CoA-producing microorganisms by known methods, for example by filtration or Centrifugation of the fermentation broth of a CoA-producing microorganism. Furthermore, one can proceed in such a way that one a CoA-producing microorganism of heat treatment, homogenization, ultrasonic disruption, or lysozyme treatment (see Methods in Enzymology, Academic Press Inc., New York, Volume 1, page 51 (1955)). Preferred examples for CoA-producing microorganisms used for this Zwack are Sarcina lutea IAM (Institute of Applied
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Microbiology, Tokyo university, Japan) 1099, Sarcina aurantiaca IAM 1059, Sarcina aurantiaca IFO (Institute for. Fermentation, Osaka, Japan) 3064, Micrococcus rubens IFO 3768, Microbacterium flavum IAM 1642, Brevibacterium ammoniagenes IAM 1641, Corynebacterium alkanophilum nov. sp. ATCC 21071 und Pseudomonas alkanolytica nov. sp. ATCC 21034. Alle diese Mikroorganismen sind der Öffentlichkeit bei den vorstehend erwähnten Hinterlegungsstellen zugänglich. In diesem Zusammenhang ist jedoch darauf hinzuweisen, dass die angegebenen spezifischen Mikroorganismen nicht den Rahmen der Erfindung einschränken sollen. Die Verwendung von zellfreien Extrakten, die aus allen CoA-erzeugenden Mikroorganismen hergestellt werden, fällt in den Rahmen der vorliegenden Erfindung.Microbiology, Tokyo university, Japan) 1099, Sarcina aurantiaca IAM 1059, Sarcina aurantiaca IFO (Institute for. Fermentation, Osaka, Japan) 3064, Micrococcus rubens IFO 3768, Microbacterium flavum IAM 1642, Brevibacterium ammoniagenes IAM 1641, Corynebacterium alkanophilum nov. sp. ATCC 21071 and Pseudomonas alkanolytica nov. sp. ATCC 21034. All of these microorganisms are available to the public at the aforementioned depositories accessible. In this context, however, it should be noted that the specified specific microorganisms are not intended to limit the scope of the invention. The use of cell-free extracts derived from all CoA-producing Microorganisms are produced falls within the scope of the present invention.
De*- wasserunlösliche Anionenaustauscher, der erfindungsgemäss verwendet werden kann, kann aus einem stark basischen Anionenaustauscherharz, einem schwach basischen Anionenaustauscherharz, aus Diäthylaminoäthylzellulose, Diäthylaminoäthyldextran, Epichlorhydrin—Triäthylaminozellulose etc. bestehen. Ein zur Durchführung der Erfindung besonders geeignetes stark basisches Anionenaustauscherharz besteht beispielsweise aus Divinylbenzolvernetztem Trialkylaminopolystyrol, beispielsweise aus einem Material, das unter dem Warenzeichen Amberlite IRA-400 im Handel erhältlich ist (Ionenaustauscherkapazität: 1,4 mÄq/ml, hergestellt von der Rohm und Haas Company). Ferner seien erwähnt Amberlite IRA-402 (Ionenaustauscherkapazität: 1,25 mÄq/ml, hergestellt von der Rohm und Haas Company), Amberlite IRA-405 (Ionenaustauscherkapazität: 1,6 mÄq/ml, hergestellt von der Rohm und Haas Company), Diaion SA 1OA (Ionenaustauscherkapazität: >-1,2 mÄq/ml, hergestellt von der Mitsubishi Chemical Co.), Dowex 1x2 (Ionenaustauscherkapazität: 1,33 mÄq/ml, hergestellt von der Dow Chemical Co.), Dowex 1 χ 16 (Ionenaustauscherkapazität: 1,33 mÄq/ml, hergestellt von der Dow Chemical Co.) sowie Duolite ES 109 (Ionenaustauscherkapazität: 1,4 mÄq/ml, hergestellt von der Diamond Shamrock Chem.). Ferner kann man aufDe * - water-insoluble anion exchanger according to the invention can be used, can be made of a strongly basic anion exchange resin, a weakly basic anion exchange resin, from diethylaminoethyl cellulose, diethylaminoethyldextran, epichlorohydrin-triethylaminocellulose etc. exist. A strongly basic one which is particularly suitable for carrying out the invention Anion exchange resin consists, for example, of divinylbenzene crosslinked Trialkylaminopolystyrene, for example from a material sold under the trademark Amberlite IRA-400 is available (ion exchange capacity: 1.4 meq / ml, manufactured from the Rohm and Haas Company). Amberlite IRA-402 (ion exchange capacity: 1.25 meq / ml, manufactured from Rohm and Haas Company), Amberlite IRA-405 (ion exchange capacity: 1.6 meq / ml, manufactured by Rohm and Haas Company), Diaion SA 10A (ion exchange capacity:> -1.2 meq / ml, manufactured by Mitsubishi Chemical Co.), Dowex 1x2 (ion exchange capacity: 1.33 meq / ml, manufactured from Dow Chemical Co.), Dowex 1 × 16 (ion exchange capacity: 1.33 meq / ml, manufactured by Dow Chemical Co.) and Duolite ES 109 (ion exchange capacity: 1.4 meq / ml, manufactured by Diamond Shamrock Chem.). You can also click
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Divinylbenzol-vernetztes N-Hydroxyäthyl-NjN-dialkylaminopolystyrol zurückgreifen, wie es beispielsweise unter den Warenzeichen Amberlite IRA-410 (Ionenaustauscherkapazität: 1,35 m&'q/ ml, hergestellt von der Rohm und Haas Company), Amberlite IRA-910 (Ionenaustauscherkapazität: 1,1 mXq/ml, hergestellt von der Rohm und Haas Company), Diaion SA 2OA (Ionenaustauscherkapazität: /-1,3 mÄq/ml, hergestellt von der Mitsubishi Chemical Co.) und Dowex 2x4 (Ionenaustauscherkapazität: 1,33 m&q/ml, hergestellt von der Dow Chemical Co.) in den Handel gebracht wird. Geeignete Beispiele für schwach basische Anionenaustauscherharze sind Divinylbenzol-vernetztes Aminopolystyrol, wie beispielsweise Amberlite IR-45 (Ionenaustauscherkapazität: 1,9 mÄq/ml, hergestellt von der Rohm und Haas Co.), Divinylbenzol-vernetztes Dimethylaminopolystyrol, wie Amberlite IRA-93 (Ionenaustauscherkapazität: 1,4 mA'q/ml, hergestellt von der Rohm und Haas Co.), Epichlorhydrin/Ammoniak-Kondensate, wie Dowex-44 (hergestellt von der Dow Chemical Co.) sowie Aminophenol-Anionenaustauscherharze, wie beispielsweise Duolite A-2 (Ionenaustauscherkapazität: 2,3 mA'q/ml, hergestellt von der Diamond Shamrock Chem.). Geeignete Beispiele für Diäthylaminoäthylzellulosen sind DÄAS-Zellulose (Ionenaustauscherkapazität: 0,9 mSq/ml, hergestellt von der Brown Company). Ferner eignet sich DÄAÄ-Sephadex A-25 oder A-50 (Ionenaustauscherkapazität: 3,5 mÄq/ml, hergestellt von der Pharmacia Fine Chemicals) als Diäthylaminoäthylzellulose sowie ECTEORA-Zellulose (Ionenaustauscherkapazität: 0,25 mÄq/ml, hergestellt von der Brown Company) als Epichlorhydrintriäthylaminozellulose. Divinylbenzene-crosslinked N-hydroxyethyl-NjN-dialkylaminopolystyrene use, for example, under the trademark Amberlite IRA-410 (ion exchange capacity: 1.35 m & 'q / ml, manufactured by Rohm and Haas Company), Amberlite IRA-910 (ion exchange capacity: 1.1 mXq / ml, manufactured by of Rohm and Haas Company), Diaion SA 2OA (ion exchange capacity: / -1.3 meq / ml, manufactured by Mitsubishi Chemical Co.) and Dowex 2x4 (ion exchange capacity: 1.33 m & q / ml, prepared by Dow Chemical Co.). Suitable examples of weakly basic anion exchange resins are divinylbenzene-crosslinked aminopolystyrene, such as Amberlite IR-45 (ion exchange capacity: 1.9 meq / ml, manufactured by Rohm and Haas Co.), divinylbenzene-crosslinked dimethylaminopolystyrene, such as Amberlite IRA-93 (ion exchange capacity: 1.4 mA'q / ml, manufactured by Rohm and Haas Co.), epichlorohydrin / ammonia condensates such as Dowex-44 (manufactured from Dow Chemical Co.) and aminophenol anion exchange resins, such as Duolite A-2 (ion exchange capacity: 2.3 mA'q / ml, manufactured by Diamond Shamrock Chem.). Suitable examples of diethylaminoethyl celluloses are DÄAS cellulose (ion exchange capacity: 0.9 mSq / ml) from the Brown Company). DÄAÄ-Sephadex is also suitable A-25 or A-50 (ion exchange capacity: 3.5 meq / ml, manufactured by Pharmacia Fine Chemicals) as diethylaminoethyl cellulose and ECTEORA cellulose (ion exchange capacity: 0.25 meq / ml, manufactured by Brown Company) as epichlorohydrin triethylamino cellulose.
Die Adsorptionsstufe, d.h. die Stufe (a) lässt sich erfindungsgemäss leicht in der Weise durchführen, dass die rohe CoA-Lösung mit dem wasserunlöslichen Anionenaustauscher kontaktiert wird. Beispielsweise wird der wasserunlösliche Anionenaustauscher in der CoA-Rohlösung suspendiert. Die Suspension wird bei Zimmertemperatur während einer gewissen Zeitspanne gerührt und dann zur Gewinnung des wasserunlöslichen AnionenaustauschersThe adsorption stage, i.e. stage (a), can be according to the invention easily carried out in such a way that the crude CoA solution contacts the water-insoluble anion exchanger will. For example, the water-insoluble anion exchanger is suspended in the raw CoA solution. The suspension is at room temperature stirred for a certain period of time and then to recover the water-insoluble anion exchanger
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filtriert. Wahlweise kann die Adsorption unter Anwendung einer Säulenmethode durchgeführt werden. Beispielsweise wird der wasserunlösliche Anionenaustauscher in eine Säule eingefüllt, worauf die CoA-Rohlösung durch die Säule mit einer geeigneten Pliessgeschwindigkeit geschickt wird. Durch eine dieser Maßnahmen werden alle CoA-Analoga (beispielsweise oxydiertes CoA, reduziertes CoA, Disulfide von CoA mit Thiolverbindungen, wie Zystein oder Glutathion), die in der CoA-Rohlösung enthalten sind, an dem wasserunlöslichen Anionenaustauscher absorbiert. Bei der Durchführung der Adsorption ist es vorzuziehen, eine CoA-Rohlösung mit einer Ionenstärke von 0,005 bis 0,04 und insbesondere von 0,01 bis 0,02 zu verwenden. Besitzt die CoA-Rohlösung eine Ionenstärke von mehr als 0,04, dann ist es empfehlenswert, die Lösung mit Wasser vor der Durchführung der Adsorption zu verdünnen. Weist andererseits die CoA-Rohlösung eine Ionenstärke von weniger als 0,005 auf, dann kann ein inerter Elektrolyt, wie Natriumchlorid, der Lösung zugesetzt werden, um die Ionenstärke auf einen Wert zwischen 0,01 und 0,02 einzustellen. Nachdem die ganzen CoA-Analoga an dem wasserunlöslichen Anionenaustauscher adsorbiert worden sind, wird der Anionenaustauscher mit Wasser sowie einer wässrigen Lösung (pH 2 bis 7) mit einer Ionenstärke von 0,005 bis 0,04 und insbesondere zwischen 0,01 und 0,02 gewaschen.filtered. Alternatively, adsorption can be applied using a column method. For example, the water-insoluble anion exchanger is filled into a column, whereupon the CoA crude solution through the column with a suitable Pliess speed is sent. With one of these measures all CoA analogues (e.g. oxidized CoA, reduced CoA, disulfides of CoA with thiol compounds, such as cysteine or glutathione), which are in the CoA raw solution are contained, absorbed on the water-insoluble anion exchanger. When performing adsorption, it is preferable to to use a raw CoA solution with an ionic strength of from 0.005 to 0.04 and in particular from 0.01 to 0.02. Owns If the CoA raw solution has an ionic strength of more than 0.04, then it is recommended that the solution with water before performing to dilute the adsorption. On the other hand, if the raw CoA solution has an ionic strength of less than 0.005, then an inert electrolyte, such as sodium chloride, can be added to the solution to bring the ionic strength to a value between 0.01 and 0.02 to be set. After all of the CoA analogs have been adsorbed on the water-insoluble anion exchanger, the anion exchanger is mixed with water and an aqueous solution (pH 2 to 7) with an ionic strength of 0.005 to 0.04 and in particular washed between 0.01 and 0.02.
Die Behandlung des wasserunlöslichen Anionenaustauschers mit dem Reduktionsmittel (d.h. die Stufe b) wird bei einem pH zwischen 4 und 8 und insbesondere bei einem pH von 7 durchgeführt. Das erfindungsgemäss eingesetzte Reduktionsmittel sollte nicht an dem wasserunlöslichen Anionenaustauscher adsorbiert werden. Geeignete Reduktionsmittel, welche dieser Anforderung genügen, bestehen aus 2-Merkaptoäthanol, Dithiothreitit sowie Dithioerythrit.. Wird beispielsweise die Stufe (b) unter Anwendung der Säulenmethode durchgeführt, dann werden vorzugsweise eine wässrige 0,1 bis 1,O %ige (Gewicht/Volumen) Dithiothreitlösung, eine wässrige 10 bis 30 %ige (Gewicht/Volumen) 2-Merkaptoäthanol-The treatment of the water-insoluble anion exchanger with the reducing agent (i.e. step b) is carried out at a pH between 4 and 8 and in particular at a pH of 7. The reducing agent used according to the invention should not are adsorbed on the water-insoluble anion exchanger. Suitable reducing agents that meet this requirement, consist of 2-mercaptoethanol, dithiothreitol and dithioerythritol .. For example, when step (b) is carried out using the column method, preferably one is used aqueous 0.1 to 1.0% (weight / volume) dithiothreitol solution, an aqueous 10 to 30% (weight / volume) 2-mercaptoethanol
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lösung oder eine wässrige 0,1 bis 1 %ige (Gewicht/Volumen) Dithioerythritlösung als Reduktionsmittellösung verwendet, welche durch die Anionenaustauschersäule geschickt wird. Vorzugsweise wird die Behandlung gemäss der Stufe (b) in einer wässrigen Lösung mit einer Ionenstärke von nicht mehr als 0,05, insbesondere mit einer Ionenstärke von 0,02 bis 0,05, durchgeführt. Durch die Behandlung der Stufe (b) wird oxydiertes CoA, das auf dem wasserunlöslichen Anionenaustauscher adsorbiert ist, in reduziertes CoA umgewandelt. Gleichzeitig werden durch die Behandlung der Stufe (b) Disulfide von CoA mit Thiolverbindungen (beispielsweise Zystein oder Glutathion), die auf dem wasserunlöslichen Anionenaustauscher adsorbiert sind, in zwei Verbindungen zersetzt, und zwar reduziertes CoA sowie Thiolverbindungen, die- von CoA verschieden sind. Nach der Behandlung gemäss der Stufe (b) wird der wasserunlösliche Anionenaustauscher mit einer wässrigen Lösung ;(pH 2 bis 7) mit einer Ionenstärke von 0,02 bis 0,05 gewaschen, wobei die überschüssige Menge an Reduktionsmittel und Thiolverbindungen, mit Ausnahme von reduziertem CoA, von dem wasserunlöslichen Anionenaustauscher entfernt werden.solution or an aqueous 0.1 to 1% (weight / volume) Dithioerythritol solution used as the reducing agent solution, which is sent through the anion exchange column. Preferably if the treatment according to step (b) is carried out in an aqueous solution with an ionic strength of not more than 0.05, in particular with an ionic strength of 0.02 to 0.05. The treatment of step (b) becomes oxidized CoA, which adsorbs on the water-insoluble anion exchanger is converted into reduced CoA. At the same time, the treatment of step (b) disulfides of CoA with Thiol compounds (e.g. cysteine or glutathione) that adsorb on the water-insoluble anion exchanger are decomposed into two compounds, namely reduced CoA and thiol compounds which are different from CoA. After the treatment according to step (b), the water-insoluble anion exchanger is treated with an aqueous solution (pH 2 to 7) washed with an ionic strength of 0.02-0.05, the excess amount of reducing agent and thiol compounds, with the exception of reduced CoA, from which water-insoluble anion exchangers are removed.
Die Behandlung des wasserunlöslichen Anionenaustauschers mit dem Oxydationsmittel (Stufe d) wird bei einem pH-Wert zwischen 3 und 8, insbesondere bei einem pH-Wert von 7, durchgeführt. Das erfindungsgemäss verwendete Oxydationsmittel sollte nicht an dem wasserunlöslichen Anionenaustauscher adsorbiert werden. Geeignete Oxydationsmittel, welche dieser Anforderung genügen, sind Wasserstoffperoxyd sowie Kaliumtrijodid. Beispielsweise werden eine wässrige 0,1 bis T %ige (Gewicht/Volumen) Wasserstoffperoxydlösung sowie eine wässrige 1 bis 4 %ige (Gewicht/ Volumen) Kaliumtrijodidlösung vorzugsweise für diesen Zweck verwendet. Vorzugsweise wird die Behandlung gemäss der Stufe (d) in einer wässrigen Lösung mit einer Ionenstärke von nicht mehr als 0,5, insbesondere mit einer Ionenstärke von 0,05 bis 0,5, durchgeführt. Durch diese Behandlung wird reduziertes CoA,The treatment of the water-insoluble anion exchanger with the oxidizing agent (stage d) is carried out at a pH between 3 and 8, in particular at a pH of 7. The oxidizing agent used according to the invention should not be adsorbed on the water-insoluble anion exchanger. Suitable oxidizing agents which meet this requirement are hydrogen peroxide and potassium triiodide. For example an aqueous 0.1 to T% (weight / volume) hydrogen peroxide solution and an aqueous 1 to 4% (weight / volume) Volume) potassium triiodide solution is preferably used for this purpose. The treatment according to the step is preferably (d) in an aqueous solution with an ionic strength of not more than 0.5, in particular with an ionic strength of 0.05 to 0.5 carried out. This treatment will reduce CoA,
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das an dem wasserunlöslichen Anionenaustauscher adsorbiert ist, in oxydiertes CoA umgewandelt. Nachdem die Behandlung gemäss der Stufe (d) beendet ist, wird der wasserunlösliche Anionenaustauscher mit einem wässrigen Lösungsmittel (pH 2 bis 7) gewaschen. Die bevorzugte Ionenstärke des wässrigen Lösungsmittels, das als Waschlösungsmittel zur Durchführung der Stufe (e) eingesetzt wird, schwankt zwischen 0,06 und 0,7, und zwar je nach dem verwendeten wasserunlöslichen Anionenaustauscher. Wird beispielsweise Diathylaminoäthylzellulose als wasserunlöslicher Anionenaustauscher verwendet, dann eignet sich ein wässriges Lösungsmittel (pH 2 bis T) mit einer Ionenstärke von 0,06 bis 0,1 als Waschlösungsmittel zur Durchführung der Stufe (e). Andererseits eignet sich ein wässriges Lösungsmittel (pH 2 bis 7) mit einer Ionenstärke von 0,4 bis 0,6 als Waschlösungsmittel, wenn Amberlite IRA-93 eingesetzt wird. Wässrige Lösungsmittel (pH 2 bis 7) mit einer Ionenstärke von 0,2 bis 0,3, 0,2 bis 0,3, 0,08 bis 0,12 bzw. 0,5 bis 0,7 werden als Waschlösungsmittel für Dowex 1 χ 2, Dowex 44, DÄAÄ-Sephadex bzw. ECTEORA-Zellulose eingesetzt.which is adsorbed on the water-insoluble anion exchanger, converted into oxidized CoA. After the treatment according to step (d) has ended, the water-insoluble anion exchanger becomes washed with an aqueous solvent (pH 2 to 7). The preferred ionic strength of the aqueous solvent, which is used as the washing solvent for carrying out step (e) varies between 0.06 and 0.7, namely depending on the water-insoluble anion exchanger used. For example, diethylaminoethyl cellulose is considered to be less water-insoluble Anion exchanger is used, then an aqueous solvent (pH 2 to T) with an ionic strength is suitable from 0.06 to 0.1 as a washing solvent for performing step (e). On the other hand, an aqueous solvent is suitable (pH 2 to 7) with an ionic strength of 0.4 to 0.6 as a washing solvent when Amberlite IRA-93 is used. Aqueous solvents (pH 2 to 7) with an ionic strength of 0.2 to 0.3, 0.2 to 0.3, 0.08 to 0.12 and 0.5 to 0.7, respectively used as a washing solvent for Dowex 1 χ 2, Dowex 44, DÄAÄ-Sephadex or ECTEORA cellulose.
Die oxydierte CoA-Lösung wird in einer hohen Reinheit durch Eluieren von oxydiertem CoA von dem wasserunlöslichen Anionenaustauscher, der gemäss- der Stufe (e) erhalten worden ist, erhalten. Ein wässriges Lösungsmittel (pH 2 bis 7) mit einer Ionenstärke von 0,2 bis 1,2 wird als Eluierlösungsmittel zur Durchführung der Stufe (f) eingesetzt. In diesem Zusammenhang ist jedoch darauf hinzuweisen, dass die lonenstärke des Eluierungslösungsmittels um ungefähr 0,05 bis 1,0 höher sein muss als diejenige des zur Durchführung der Stufe (e) eingesetzten Waschlösungsmittels. Wird beispielsweise Diathylaminoäthylzellulose als wasserunlöslicher Anionenaustauscher verwendet, dann muss ein wässriges Lösungsmittel (pH 2 bis 7) mit einer lonenstärke von 0,15 bis 0,25 als Eluierungslösungsmxttel eingesetzt werden. Andererseits muss ein wässriges LösungsmittelThe oxidized CoA solution is obtained in a high purity by eluting oxidized CoA from the water-insoluble anion exchanger obtained according to step (e). An aqueous solvent (pH 2 to 7) with an ionic strength of 0.2 to 1.2 is used as the eluting solvent for carrying out step (f). In this context, however, it should be pointed out that the ionic strength of the eluting solvent must be approximately 0.05 to 1.0 higher than that of the washing solvent used to carry out step (e). If, for example, diethylaminoethyl cellulose is used as a water-insoluble anion exchanger, then an aqueous solvent (pH 2 to 7) with an ionic strength of 0.15 to 0.25 must be used as the eluting solution. On the other hand, it must be an aqueous solvent
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(pH 2 bis 7) mit einer Ionenstärke von 0,4 bis 0,6 als Eluierlösungsmittel eingesetzt werden, wenn Amberlite IRA-93 verwendet wird. Wässrige Lösungsmittel (pH 2 bis 7) mit einer Ionenstärke von 0,4 bis 0,6, 0,4 bis 0,6, 0,25 bis 0,35 bzw. 0,8 bis 1,2 müssen als Eluierlösungsmittel für Dowex 1x2, Dowex 44, DÄAÄ-Sephadex bzw. ECTEORA-Zellulose eingesetzt werden . ■ ■(pH 2 to 7) with an ionic strength of 0.4 to 0.6 as the eluting solvent used when Amberlite IRA-93 is used. Aqueous solvents (pH 2 to 7) with a Ionic strength from 0.4 to 0.6, 0.4 to 0.6, 0.25 to 0.35 or 0.8 to 1.2 must be used as eluting solvent for Dowex 1x2, Dowex 44, DÄAÄ-Sephadex or ECTEORA cellulose can be used . ■ ■
Die reduzierte CöA-Lösung wird in einer hohen Reinheit bei der Durchführung der Stufe (g) durch Behandlung des wasserunlöslichen Anionenaustauschers, d.h. des bei der Stufe (e) erhaltenen Anionenaustauschers, mit einem Reduktionsmittel zur Umwandlung von oxydiertem CoA in reduziertes CoA erhalten. Gemäss der Stufe (h) wird der wasserunlösliche Anionenaustauscher gewaschen, während in der Stufe (i) reduziertes CbA von dem wasserunlöslichen Anionenaustauscher eluiert wird. Im allgemeinen ist- es vorzuziehen, den Anionenaustauscher der Stufe (e) mit Wasser vor der Durchführung der Stufe (g) zu waschen und dieses Waschen solange fortzusetzen, bis die lonenstärke der Waschwässer unterhalb 0,1 liegt, insbesondere unterhalb 0,05. Die Behandlung des wasserunlöslichen Anionenaustauschers mit dem Reduktionsmittel (Stufe g) sowie das anschliessende Waschen (Stufe h) können in der gleichen Weise durchgeführt werden, wie sie im Zusammenhang mit den Stufen (b) und (c) beschrieben worden ist. Die Eluierung des reduzierten CoA von dem wasserunlöslichen Anionenaustauscher (Stufe· i) erfolgt in üblicher Weise. Das wässrige Lösungsmittel, das als Waschlösungsmittel zur Durchführung der Stufe (e) eingesetzt wird, kann als Eluierlösungsmittel zur Durchführung der Stufe (i) verwendet werden.The reduced COA solution is obtained in a high purity when performing step (g) by treating the water-insoluble Anion exchanger, i.e. the anion exchanger obtained in step (e), with a reducing agent for converting get oxidized CoA into reduced CoA. According to step (h), the water-insoluble anion exchanger is washed while in step (i) reduced CbA is eluted from the water-insoluble anion exchanger. In general, it is preferable to wash the anion exchanger of stage (e) with water before carrying out stage (g) and to continue this washing until until the ionic strength of the washing water is below 0.1, in particular below 0.05. Treatment of the water-insoluble Anion exchanger with the reducing agent (stage g) and the subsequent washing (stage h) can be carried out in the same Be carried out in the manner described in connection with steps (b) and (c). The elution of the reduced CoA from the water-insoluble anion exchanger (stage i) takes place in the usual way. The aqueous solvent that is used as the washing solvent for carrying out step (e), can be used as the eluting solvent for carrying out the step (i) can be used.
Bei der Durchführung der vorstehend beschriebenen Methode gemäss vorliegender Erfindung lassen sich die lonenstärke der wässrigen Lösung des Reduktions- oder Oxydationsmittels sowieWhen performing the method described above in accordance with The present invention can determine the ionic strength of the aqueous solution of the reducing or oxidizing agent as well
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die Ionenstärke des wässrigen Lösungsmittels, das als Waschoder Eluierlösungsmittel verwendet wird, leicht durch die darin aufgelöste Salzmenge einstellen. Verschiedene Salze können zur Einstellung der Ionenstärke eingesetzt werden. Die für diesen Zweck geeigneten Salze sind beispielsweise Metallchloride (beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder Lithiumchlorid), Metallsulfate (beispielsweise Ammoniumsulfat), Metallphosphate (beispielsweise Mononatriumphosphat, Dinatriumphosphat, Monokaliumphosphat oder Dikaliumphosphat), saures Kaliumphthalat, Natriumeitrat, Natriumacetat, Natriummaleat, Natriumbarbital, tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan-Hydrochlorid, 2-Amino~2-methyl-1,3-propandiol-Hydrochlorid, Natriumcarbonat oder Natriumsuccinat.the ionic strength of the aqueous solvent used as the washing or eluting solvent is easily influenced by the Adjust the amount of salt dissolved in it. Various salts can be used to adjust the ionic strength. the Salts suitable for this purpose are, for example, metal chlorides (for example sodium chloride, potassium chloride or Lithium chloride), metal sulfates (e.g. ammonium sulfate), metal phosphates (e.g. monosodium phosphate, disodium phosphate, Monopotassium phosphate or dipotassium phosphate), acid potassium phthalate, sodium citrate, sodium acetate, sodium maleate, Sodium barbital, tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride, 2-Amino ~ 2-methyl-1,3-propanediol hydrochloride, sodium carbonate or sodium succinate.
Erfindungsgemäss lässt sich ferner ein CoA·-Rohextrakt, der aus tierischen Geweben (eiispielsweise Hundeleber) oder der Gärbrühe von CoA-erzeugenden Mikroorganismen erhalten worden ist, leicht reinigen. Ferner kann eine überstehende Lösung oder ein Filtrat, die bzw. das durch Zentrifugieren oder Filtrieren der wärmebehandelten Gärbrühe eines CoA-erzeugenden Mikroorganismus erhalten worden ist, als CoA-Rohlösung zur Durchführung der Erfindung eingesetzt werden. Eine CoA-Lösung, die durch Reinigung einer derartigen überstehenden Lösung oder eines derartigen Filtrats mit Aktivkohle erhalten worden ist-, kann ebenfalls zur Durchführung der Erfindung als Roh-CoA-Lösung verwendet werden.According to the invention, a CoA · crude extract can also be derived from animal tissues (e.g. dog liver) or the fermentation broth from CoA-producing microorganisms, easy to clean. Furthermore, a supernatant solution or a filtrate obtained by centrifugation or filtration the heat-treated fermentation broth of a CoA-producing microorganism can be used as a raw CoA solution for carrying out the invention. A CoA solution made by purification such a supernatant solution or such a filtrate with activated carbon can also be obtained can be used as a raw CoA solution to carry out the invention.
Die folgenden Beispiele erläutern praktische und bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung.The following examples illustrate practical and preferred embodiments the invention.
Die quantitative Analyse des reduzierten CoA wird spektrophoto-.metrisch nach der enzymatischen Methode durchgeführt, wobei Phosphotransacetylase verwendet wird (Method of EnzymaticThe quantitative analysis of the reduced CoA is spectrophotometric carried out according to the enzymatic method using phosphotransacetylase (Method of Enzymatic
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Analysis, Academic Press Inc., New York, Seite 512 (1963)). Die quantitative Analyse des gesamten CoA wird in Gegenwart von Zystein nach der Methode von Stadtman et al (J. Biol. Chem. 19.1 (1951), 365) durchgeführt, wobei Phosphotransacetylase verwendet wird. Die Reinheit des CoA wird gemäss folgender Gleichung berechnet:Analysis, Academic Press Inc., New York, p. 512 (1963)). The quantitative analysis of the total CoA is carried out in the presence of Cysteine according to the method of Stadtman et al (J. Biol. Chem. 19.1 (1951), 365) using phosphotransacetylase. The purity of the CoA is determined according to the following equation calculated:
Menge an reduziertem oder gesamtem CoA, das nach der vor-. stehend geschilderten enzymati-Amount of reduced or total CoA after the pre-. the enzymatic
Rp-inhPif- m - sehen Methode ermittelt wird . Rexnheit U) - Menge an gesamtem CoAf das an_ x 100Rp-inhPif- m - see method is determined . Rexnheit U) - Amount of total CoAf that an _ x 100
g g fpossibly
hand der Extinktion bei 258 mu berechnet wirdis calculated using the absorbance at 258 mu
Ferner wird die Ionenstärke einer Lösung aus der spezifischen elektrischen Leitfähigkeit bei 25 C unter Verwendung einer Natriumchloridlösung als Standard bestimmt.Furthermore, the ionic strength of a solution is determined from the specific electrical conductivity determined at 25 C using a sodium chloride solution as a standard.
(Herstellung einer CoA-Rohlösung)(Preparation of a CoA raw solution)
100 1 eines wässrigen Nährmediums (pH 7,0), das Glukose (10 % (Gewicht/Volumen)), Maiswasser (2,2. % (Gewicht/Volumen)), Pepton (1,35 % (Gewicht/Volumen)), Monokaliumphosphat (0,5 % (Gewicht/ Volumen)), Dikaliumphosphat (0,5 % (Gewicht/Volumen)), Magnesiumsulf at-Heptahydrat (0,1 % (Gewicht/Volumen)), Ammoniumacetat (1,0 % (Gewicht/Volumen)) sowie Biotin (0,05 ug/ml) enthält, werden in einen 300 1-Gärungstank eingefüllt und sterilisiert. Dem Nährmedium wird 1.1 einer Impfkultur zugesetzt, die durch Züchten von Sarcina lutea IAM 1099 während einer Zeitspanne von 72 Stunden in einem wässrigen Medium, das die gleichen Bestandteile enthält, wie sie vorstehend aufgezählt100 1 of an aqueous nutrient medium (pH 7.0), the glucose (10% (Weight / volume)), corn water (2.2.% (Weight / volume)), peptone (1.35% (weight / volume)), monopotassium phosphate (0.5% (weight / volume)) Volume)), dipotassium phosphate (0.5% (weight / volume)), magnesium sulf ate-heptahydrate (0.1% (weight / volume)), ammonium acetate Contains (1.0% (weight / volume)) and biotin (0.05 ug / ml), are poured into a 300 liter fermentation tank and sterilized. 1.1 of an inoculum is added to the nutrient medium, which is obtained by culturing Sarcina lutea IAM 1099 during a 72 hours in an aqueous medium containing the same ingredients as enumerated above
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worden sind, erhalten worden ist. Das Nährmedium wird bei 3O°C während einer Zeitspanne von 72 Stunden unter Belüftung (50 1/ Minute) und Rühren (200 Upm) gezüchtet. Eine wässrige Lösung, die Kaiζiumpantothenat (2 mg/ml), Adenin (1 mg/ml) sowie Zysteinhydrochlorid (2 mg/ml) enthält, wird dem Nährmedium zugesetzt, um sein Gesamtvolumen auf 110 1 einzustellen. Dann wird das Medium weiter bei 30°C während einer Zeitspanne von 20 Stunden unter Belüftung (55 l/Minute) und Rühren (400 Upm) gezüchtet. Die auf diese Weise erhaltene Gärbrühe wird auf ungefähr 90 C während einer Zeitspanne von 10 Minuten erhitzt und anschliessend zentrifugiert. 100 1 der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit werden durch eine Säule geschickt, die mit 32 1 Aktivkohle gefüllt ist. Nach einem Waschen mit 150 1 Wasser wird die Säule mit einer wässrigen Azeton/Ammoniaklösung (40 % Azeton:28 % Ammoniak = 100:1, bezogen auf das v:> lumen) eluiert, wobei ein CoA-enthaltender Ablauf gesammelt wird. Der auf diese Weise erhaltene Ablauf wird unter vermindertem Druck zur Entfernung von Azeton und Ammoniak konzentriert. Dann wird der konzentrierte Ablauf auf einen pH-Wert von 3 unter Verwendung von konzentrierter Chlorwasserstoffsäure eingestellt. 20 1 einer CoA-RohlÖsung weiden erhalten. Das in der Lösung insgesamt enthaltene CoA macht 60 g aus (Reinheit: 5 %) .have been received. The nutrient medium is grown at 30 ° C. for a period of 72 hours with aeration (50 l / minute) and stirring (200 rpm). An aqueous solution containing potassium pantothenate (2 mg / ml), adenine (1 mg / ml) and cysteine hydrochloride (2 mg / ml) is added to the nutrient medium in order to adjust its total volume to 110 l. Then the medium is further cultured at 30 ° C. for a period of 20 hours with aeration (55 l / minute) and stirring (400 rpm). The fermentation broth obtained in this way is heated to approximately 90 ° C. for a period of 10 minutes and then centrifuged. 100 l of the supernatant liquid obtained are passed through a column filled with 32 l of activated carbon. After washing with 150 l of water, the column is eluted with an aqueous acetone / ammonia solution (40% acetone: 28% ammonia = 100: 1, based on the v :> lumen), a CoA-containing effluent being collected. The effluent thus obtained is concentrated under reduced pressure to remove acetone and ammonia. The concentrated effluent is then adjusted to pH 3 using concentrated hydrochloric acid. 20 l of a CoA raw solution are obtained. The total CoA contained in the solution is 60 g (purity: 5%).
(Reinigung von oxydiertem CoA unter Verwendung von DÄAÄ-Zellulose) (Purification of oxidized CoA using DÄAÄ cellulose)
Eine Säule, die mit 16 1 DÄAÄ-Zellulose gepackt ist, wird gut mit einer 0,001 η-Chlorwasserstoffsäure gewaschen. 10 1 einer CoA-Rohlösung, die gemäss Beispiel 1 hergestellt worden ist, werden mit Wasser verdünnt, um die Ionenstärke auf 0,02 einzu-A column packed with 16 liters of DÄAÄ cellulose will do fine washed with a 0.001 η hydrochloric acid. 10 1 one CoA raw solution, which has been prepared according to Example 1, are diluted with water to reduce the ionic strength to 0.02
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stellen. Die vedünnnte CoA-Rohlösung wird durch die vorstehend geschilderte DÄAÄ-Zellulosesäule geschickt. Dann wird die Säule mit 70 1 Wasser sowie 50 1 einer wässrigen Lithiumchloridlösung (pH 3, Ionenstärke 0,02) nacheinanderfolgend gewaschen. 40 1 einer wässrigen 20 %igen 2-Merkaptoäthanollösung (pH 6,5, Ionenstärke 0,02) werden durch die Säule geschickt, wobei das ganze CoA, das an der DÄAÄ-Zellulosesämle adsorbiert ist, in reduziertes CoA umgewandelt wird. Die Säule wird mit einer wässrigen Lithiumchloridlösung (pH 3, Ionenstärke 0,02) solange gewaschen, bis die Waschwässer gegenüber der Nitroprussid-Reaktion negativ werden. 40 1 einer wässrigen 1 %igen Wasserstoffperoxydlösung (pH 8, Ionenstärke 0,03) werden durch die Säule geschickt, wobei reduziertes CoA in oxydiertes CoA umgewandelt wird. Die · Säule wird mit 240 1 einer wässrigen Lithiumchloridlösung -(pH 4, Ionenstärke O,1) zur Entfernung von Wasserstoffperoxyd und Verunreinigungen, die an der DÄAK-Zellulosesäule adsorbiert sind, gewaschen. Dann wird die Säule mit einer wässrigen Lithiumchloridlösung (pH 4, Ionenstärke 0,3) gewaschen, wobei 20 1 eines Ablaufs, der oxydiertes CoA enthält, erhalten werden. Der auf diese Weise gesammelte Ablauf wird auf 2 1 unter vermindertem Druck konzentriert. 20 1 Azeton/Methanol (10:1) werden dem konzentrierten Ablauf zugesetzt, um oxydiertes CoA auszufällen. Der Niederschlag wird durch Filtration gesammelt. Der auf diese Weise gesammelte Niederschlag wird in 500 ml.Wasser aufgelöst, worauf 5 1 Azeton/Methanol (10:1) zugesetzt werden, um erneut oxydiertes CoA auszufällen. Diese Operation wird zweimal zur' Entfernung der überschüssigen Menge an Lithiumchlorid wiederholt. Dann wird die wässrige oxydierte CoA-Lösung gefriergetrocknet, wobei oxydiertes CoA ,(Lithiumsalz) erhalten wird. Die Ausbeute, berechnet als Gesamt-CoA (freie Base) beträgt 21,9 g (73 %). Reinheit: 100 %.place. The crude diluted CoA solution is prepared by the above Described DÄAÄ cellulose column sent. Then the pillar washed successively with 70 l of water and 50 l of an aqueous lithium chloride solution (pH 3, ionic strength 0.02). 40 1 of an aqueous 20% 2-mercaptoethanol solution (pH 6.5, Ionic strength 0.02) are sent through the column, whereby the whole CoA adsorbed on the DÄAÄ cellulose seed in reduced CoA is converted. The column is with an aqueous Lithium chloride solution (pH 3, ionic strength 0.02) washed as long as until the wash waters become negative for the nitroprusside reaction. 40 l of an aqueous 1% strength hydrogen peroxide solution (pH 8, ionic strength 0.03) are passed through the column, whereby reduced CoA is converted into oxidized CoA. The · Column is filled with 240 l of an aqueous lithium chloride solution - (pH 4, ionic strength 0.1) to remove hydrogen peroxide and impurities, which are adsorbed on the DÄAK cellulose column, washed. Then the column is washed with an aqueous lithium chloride solution (pH 4, ionic strength 0.3), with 20 1 of one Process containing oxidized CoA can be obtained. The effluent collected in this way is reduced to 2 liters Focused pressure. 20 l acetone / methanol (10: 1) are added to the concentrated effluent to precipitate oxidized CoA. The precipitate is collected by filtration. The precipitate collected in this way is dissolved in 500 ml of water, whereupon 5 1 acetone / methanol (10: 1) are added to precipitate again oxidized CoA. This operation is performed twice for ' Repeatedly removing the excess amount of lithium chloride. Then the aqueous oxidized CoA solution is freeze-dried to obtain oxidized CoA (lithium salt). the Yield calculated as total CoA (free base) is 21.9 g (73%). Purity: 100%.
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(Reinigung von reduziertem CoA unter Verwendung von DA'AÄ-Zellulose) (Purification of reduced CoA using DA'AÄ cellulose)
Eine Säule, die mit 16 1 DÄAÄ-Zellulose gepackt ist, wird gut mit einer 0,001 n-Chlorwasserstoffsäure gewaschen. 10 der gemäss Beispiel 1 hergestellten CoA-Rohlösung werden mit Wasser derartig verdünnt, dass die Ionenstärke 0,02 beträgt. Die verdünnte CoA-Rohlösung wird durch die vorstehend geschilderte DÄAA'-Zellulosesäule geschickt. Dann wird die Säule mit 70 1 Wasser und 50 1 einer wässrigen Lithiumchloridlösung (pH 3, Ionenstärke 0,02) nacheinanderfolgend gewaschen. 40 1 einer wässrigen 20 %igen 2-Merkaptoäthanollösung (pH 6,5, Ionenstärke 0,02) werden durch die Säule geschickt, wobei das ganze an der DÄ'AÄ-Zellulosesäule adsorbierte CoA in reduziertes CoA umgewandelt wird. Die Säule wird mit einer wässrigen Lithiumchloridlösung (pH 3, Ionenstärke 0,02) solange gewaschen, bis die Waschwässer gegenüber der Nitroprussid-Reaktion negativ werden. 40 1 einer wässrigen 1 %igen Wasserstoffperoxydlösung (pH 7, Ionenstärke 0,O3) werden durch die Säule geschickt, wobei das reduzierte CoA in oxydiertes CoA umgewandelt wird. Die Säule wird mit 240 1 einer wässrigen Lithiumchloridlösung (pH 4, Ionenstärke 0,1) zur Entfernung von Wasserstoffperoxyd sowie Verunreinigungen, die an der DÄAA'-Zellulosesäule adsorbiert sind, gewaschen. Die Säule wird ferner solange mit Wasser gewaschen, bis die Ionenstärke des Ablaufs unterhalb 0,02 liegt. 40 1 einer wässrigen 20 %igen 2-Merkaptoäthanollösung (pH 6,5,Ionenstärke 0,02) werden durch die Säule geschickt, wobei oxydiertes CoA in reduziertes CoA umgewandelt wird. Die Säule wird mit 120 1 einer wässrigen Lithiumchloridlösung (pH 3,A column packed with 16 1 DÄAÄ cellulose is washed well with a 0.001 normal hydrochloric acid. 10 the CoA raw solution prepared according to Example 1 are with Water diluted so that the ionic strength is 0.02. The diluted CoA crude solution is replaced by the above Described DÄAA 'cellulose column sent. Then the Column washed successively with 70 l of water and 50 l of an aqueous lithium chloride solution (pH 3, ionic strength 0.02). 40 1 of an aqueous 20% 2-mercaptoethanol solution (pH 6.5, ionic strength 0.02) are sent through the column, all of the CoA adsorbed on the DÄ'AÄ cellulose column is converted into reduced CoA. The column is filled with an aqueous lithium chloride solution (pH 3, ionic strength 0.02) washed until the wash waters become negative for the nitroprusside reaction. 40 1 of an aqueous 1% Hydrogen peroxide solution (pH 7, ionic strength 0, O3) passed through the column, converting the reduced CoA to oxidized CoA. The column becomes one with 240 1 aqueous lithium chloride solution (pH 4, ionic strength 0.1) to remove hydrogen peroxide and impurities, which are adsorbed on the DÄAA 'cellulose column, washed. The column is also washed with water until the ionic strength of the effluent is below 0.02. 40 1 one aqueous 20% 2-mercaptoethanol solution (pH 6.5, ionic strength 0.02) are passed through the column, converting oxidized CoA into reduced CoA. The pillar is mixed with 120 l of an aqueous lithium chloride solution (pH 3,
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Ionenstärke 0,02) gewaschen. Dann wird die Säule mit einer wässrigen Lithiumchloridlösung (pH 3, Ionenstärke 0,1) eluiert, wobei 40 1 eines Ablaufs, der reduziertes CoA enthält, gesammelt werden. Der auf diese Weise gesammelte Ablauf wird mit Azeton/ Methanol in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 behandelt und anschliessend gefriergetrocknet, wobei reduziertes CoA (Lithiumsalz) erhalten wird. Die Ausbeute, berechnet als gesamtes CoA (freie Base) beträgt 20,4 g (68 %). Die Reinheit (Qesamt-CoA) wird zu 100 % ermittelt, während die Reinheit des reduzierten CoA 97 % beträgt.Ionic strength 0.02). Then the column with a aqueous lithium chloride solution (pH 3, ionic strength 0.1) eluted, with 40 1 of an effluent containing reduced CoA collected will. The effluent collected in this way is treated with acetone / methanol in the same manner as in Example 2 and then freeze-dried, with reduced CoA (lithium salt) being obtained. The yield calculated as total CoA (free base) is 20.4 g (68%). The purity (Qesamt-CoA) is determined to be 100%, while the purity of the reduced CoA is 97%.
(Reinigung von oxydiertem CoA unter Verwendung von Dowex 1x2)(Purification of oxidized CoA using Dowex 1x2)
Eine Säule, die mit 5 1 Dowex 1x2 gepackt ist, wird gut mit einer 0,1 n-Chlorwasserstoffsäure gewaschen. 5 1 einer CoA-Rohlösung, die.gemäss Beispiel 1 hergestellt worden ist, werden mit Wasser verdünnt, um die Ionenstärke auf 0,05 einzustellen. Die verdünnte CoA-Rohlösung wird durch die vorstehend geschilderte Dowex 1 χ 2-Säule geschickt. Dann wird die Säule nacheinanderfolgend mit 15 1 Wasser sowie 15 1 einer wässrigen Lithiumchloridlösung (pH 2,5, Ionenstärke 0,05) gewaschen. 10 1 einer wässrigen 2 %igen Dithiothreitlösung (pH 7,0, Ionenstärke 0,02) werden durch die Säule geschickt, wobei das ganze an der Dowex 1 χ 2-Säuie adsorbierte CoA in reduziertes CoA umgewandelt wird. Die Säule wird mit einer wässrigen 0,01 η salzsauren Lithium- . ■ Chloridlösung (pH 2,0, Ionenstärke 0,05) solange gewaschen, bis die Waschlösungen gegenüber der Nitroprussid-Reaktion negativ werden. 10 1 einer wässrigen 2 %igen Kaliumtrijodidlösung (pH 7,5, Ionenstärke 0,04) werden durch die Säule geschickt, wobei reduziertes CoA in oxydiertes CoA umgewandelt wird. Die Säule wird mit 60 1 einer wässrigen 0,01 η salzsauren Lithiumchlorid-A column packed with 5 1 Dowex 1x2 will do fine with a 0.1 N hydrochloric acid. 5 1 of a CoA raw solution, die.gemäß has been produced in Example 1, are with Diluted water to adjust the ionic strength to 0.05. The diluted CoA crude solution is replaced by the above Dowex 1 χ 2 column sent. Then the column becomes sequential washed with 15 l of water and 15 l of an aqueous lithium chloride solution (pH 2.5, ionic strength 0.05). 10 1 one aqueous 2% dithiothreitol solution (pH 7.0, ionic strength 0.02) are sent through the column, with the whole at the Dowex 1 χ 2-acid adsorbed CoA is converted into reduced CoA. The column is with an aqueous 0.01 η hydrochloric acid lithium. ■ Chloride solution (pH 2.0, ionic strength 0.05) washed until the washing solutions are negative for the nitroprusside reaction will. 10 1 of an aqueous 2% potassium triiodide solution (pH 7.5, ionic strength 0.04) are sent through the column, where reduced CoA is converted into oxidized CoA. The column is filled with 60 1 of an aqueous 0.01 η hydrochloric acid lithium chloride
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- 1 βίο sung (pH 2,0, Ionenstärke 0,25) zur Entfernung von Kaliumtrijodid und Verunreinigungen, die an der Dowex 1 χ 2-Säule adsorbiert sind, gewaschen. Dann wird die Säule mit einer wässrigen 0,01 η salzsauren Lithiumchloridlösung /pH 2,0f Ionenstärke 0,5) eluiert, wobei 8 1 eines oxydierten CoA-enthaltenden Ablaufs gesammelt werden. Der auf diese Weise gesammelte Ablauf wird unter vermindertem Druck auf 2 1 konzentriert. Der konzentrierte Ablauf wird dann in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise behandelt, wobei oxydiertes CoA (Lithiumsalz) erhalten wird. Die Ausbeute, berechnet als Gesamt-CoA (freie Base) beträgt 10,5-g (70 %). Reinheit: 100 % .- 1 βίο solution (pH 2.0, ionic strength 0.25) to remove potassium triiodide and impurities that are adsorbed on the Dowex 1 χ 2 column, washed. The column is then eluted with an aqueous 0.01 η hydrochloric acid lithium chloride solution / pH 2.0 f ionic strength 0.5), 8 l of an oxidized CoA-containing effluent being collected. The effluent thus collected is concentrated to 2 liters under reduced pressure. The concentrated effluent is then treated in the manner described in Example 2 to give oxidized CoA (lithium salt). The yield, calculated as total CoA (free base), is 10.5 g (70%). Purity: 100%.
(Reinigung von reduziertem CoA unter Verwendung von Dowex 1x2)(Purification of reduced CoA using Dowex 1x2)
Eine Säule, die mit 5 1 Dowex 1x2 gepackt ist, wird gut mit einer 0,01 n-Chlorwasserstoffsäure gewaschen. 5 1 einer CoA-Rohlösung, die gemäss Beispiel 1 hergestellt worden ist, werden mit Wasser zur Einstellung der Ionenstärke auf 0,05 verdünnt. Die verdünnte CoA-Rohlösung wird durch die vorstehend erwähnte Dowex 1 χ 2-Säule geschickt. Dann wird die Säule mit 15 1 Wasser und dann mit 15 1 einer wässrigen 0,01 η salzsauren Lithiumchloridlösung (pH 2,0, Ionenstärke 0,05) gewaschen. 10 1 einer wässrigen 2 %igen Dithiothreitlösung (pH 7, Ionenstärke 0,02) werden durch die Säule geschickt, wobei das ganze an der Dowex 1 χ 2-Säule adsorbierte CoA in reduziertes CoA umgewandelt wird. Die Säule wird mit einer wässrigen 0,01 η salzsauren Lithiumchloridlösung (pH 2,0, Ionenstärke 0,05) solange gewaschen, bis die Waschlösungen gegenüber der Nitroprussiü-Reaktion negativ werden.A column packed with 5 liters of Dowex 1x2 will be fine washed with a 0.01 N hydrochloric acid. 5 1 one CoA raw solution, which has been prepared according to Example 1, is mixed with water to adjust the ionic strength to 0.05 diluted. The diluted CoA crude solution is passed through the aforementioned Dowex 1 × 2 column. Then the Column with 15 l of water and then with 15 l of an aqueous 0.01 η hydrochloric acid lithium chloride solution (pH 2.0, ionic strength 0.05) washed. 10 1 of an aqueous 2% dithiothreitol solution (pH 7, ionic strength 0.02) are sent through the column, all of the CoA adsorbed on the Dowex 1 χ 2 column is converted into reduced CoA. The pillar will Washed with an aqueous 0.01 η hydrochloric acid lithium chloride solution (pH 2.0, ionic strength 0.05) until the washing solutions negative for the nitroprussiü reaction.
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10 1 einer wässrigen 2 %igen Kaliumtrijodidlösung .(pH 7,5, lonenstärke 0,04) werden durch die Säule geschickt, wobei reduziertes CoA in oxydiertes CoA umgewandelt wird. Die Säule wird mit 60 1 einer wässrigen 0,01 η salzsauren Lithiumchloridlösung (pH 2,5, lonenstärke 0,25) zur Entfernung von Kaliumtrijodid sowie Verunreinigungen, die an der Dowex 1 χ 2-Säule adsorbiert sind, gewaschen. Die Säule wird ferner mit Wasser solange gewaschen, bis die lonenstärke unterhalb 0,1 liegt. 10 1 einer wässrigen 2 %igen Dithiothreitlösung (pH 7,0, lonenstärke 0,02) werden durch die Säule geschickt, wobei oxydiertes CoA in reduziertes CoA umgewandelt wird. Die Säule wird mit 30 1 einer wässrigen 0,01 η salzsauren Lithiumchloridlösung (pH 2,0, lonenstärke 0,05) gewaschen. Dann wird die Säule mit einer wässrigen 0,01 η salzsauren Lithiumchloridlösung (pH 2,0, lonenstärke 0,2) eluiert, wobei 12 1 eines Ablaufs, der reduziertes CoA enthält, gesammelt werden. Der auf diese Weise gesammelte Ablauf wird durch Gefriertrocknen auf 1 1 konzentriert und dann nach der in Beispiel 2 beschriebenen Methode behandelt, wobei reduziertes CoA (Lithiumsalz) erhalten wird. Die Ausbeute, berechnet als gesamtes CoA (freie Base) beträgt 9,9 g (66 %). Die Reinheit des gesamten CoA beträgt 98 %, die Reinheit des reduzierten CoA 94 %.10 1 of an aqueous 2% potassium triiodide solution (pH 7.5, ionic strength 0.04) are passed through the column, whereby reduced CoA is converted into oxidized CoA. The pillar is mixed with 60 1 of an aqueous 0.01 η hydrochloric acid lithium chloride solution (pH 2.5, ionic strength 0.25) to remove potassium triiodide as well as impurities on the Dowex 1 χ 2 column are adsorbed, washed. The column is also washed with water until the ionic strength is below 0.1. 10 1 of an aqueous 2% dithiothreitol solution (pH 7.0, ionic strength 0.02) are passed through the column, whereby oxidized CoA is converted into reduced CoA. The column is filled with 30 l of an aqueous 0.01 η hydrochloric acid lithium chloride solution (pH 2.0, ionic strength 0.05). Then the column is filled with an aqueous 0.01 η hydrochloric acid lithium chloride solution (pH 2.0, ionic strength 0.2) eluted, collecting 12 liters of effluent containing reduced CoA. Of the The effluent collected in this way is concentrated to 1 liter by freeze-drying and then according to that described in Example 2 Method treated, whereby reduced CoA (lithium salt) is obtained. The yield, calculated as total CoA (free Base) is 9.9 g (66%). The purity of the total CoA is 98%, the purity of the reduced CoA is 94%.
(Reinigung von oxydiertem CoA unter Verwendung von DÄA&- Sephadex A-25)(Purification of oxidized CoA using DÄA & - Sephadex A-25)
10 1 einer CoA-Rohlösung, die gemäss Beispiel 1 hergestellt worden ist, werden mit Wasser zur Einstellung der lonenstärke auf 0,02 verdünnt. 15 1 eines DÄAÄ-Sephadex A-25, das zuvor gründlich mit 0,001 n-Chlorwasserstoffsäure gewaschen worden ist, werden der verdünnten CoA-Rohlösung zugesetzt. Die Mi-10 1 of a raw CoA solution prepared according to Example 1 are diluted with water to adjust the ionic strength to 0.02. 15 1 of a DÄAÄ-Sephadex A-25, which previously washed thoroughly with 0.001 N hydrochloric acid are added to the dilute CoA raw solution. The Mi
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schung wird bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 5 Stunden gerührt. Das DÄAÄ-Sephadex A-25 wird als feste Phase durch Filtrieren der Mischung gewonnen. Dann wird das FiItrat auf die feste Phase des DÄAÄ-Sephadex A-25 gegossen, wobei CoA, das in dem Filtrat zurückgeblieben ist, auf dem DÄAÄ-Sephadex A-2 5 adsorbiert wird. Das abgetrennte DÄAÄ--Sephadex A-25 wird in 50 1 einer wässrigen Lithiumchloridlösung (pH 2f5, Ionenstärke 0,02) suspendiert, bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 1 Stunde gerührt und dann abfiltriert (diese Maßnahme wird solange wiederholt, bis die Materialien, die nicht auf dem DÄAÄ-Sephadex A-25 adsorbiert worden sind, vollständig entfernt worden sind). Das auf diese Weise erhaltene DÄAÄ-Sephadex A-25 wird in 50 1 Wasser suspendiert. 2-Merkaptoäthanol wird der Suspension in der Weise zugesetzt, dass die Endkonzentration des 2-Merkaptoäthanols 20 % (Gewicht/Volumen) erreicht. Nach einer Einstellung des pH-Wertes auf einen Wert von 3 wird die Suspension bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 2 Stunden gerührt. Dann wird das DÄAÄ-Sephadex A-25 als feste Phase durch Filtrieren der Suspension abgetrennt, worauf das Filtrat auf die feste Phase des DÄAÄ-Sephadex A-25 gegossen wird. Das ganze an dem DÄAÄ-Sephadex A-25 adsorbierte CoA wird in reduziertes CoA durch die vorstehend beschriebenen Maßnahmen umgewandelt. Das abgetrennte DÄAÄ-Sephadex A-25 wird in 50 1 einer wässrigen Lithiumchloridlösung (pH 2,5, Ionenstärke OfO2) suspendiert, bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 1 Stunde gerührt und dann filtriert (diese Maßnahme wird solange wiederholt, bis das Filtrat gegenüber der Nitroprussid-Reaktion negativ.wird). Das auf diese Weise erhaltene DÄAÄ-Sephadex A-25 wird in 50 1 Wasser suspendiert. Wässriges Wasserstoffperoxyd wird der Suspension in einer solchen Menge zugesetzt, dass die Endkonzentration des Wasserstoffperoxyds 1 % (Gewicht/Volumen)The mixture is stirred at room temperature for a period of 5 hours. The DÄAÄ-Sephadex A-25 is obtained as a solid phase by filtering the mixture. Then, the filtrate is poured onto the solid phase of the DÄAÄ-Sephadex A-25, whereby CoA remaining in the filtrate is adsorbed on the DÄAÄ-Sephadex A-25. The separated DÄAÄ - Sephadex A-25 is suspended in 50 l of an aqueous lithium chloride solution (pH 2 f 5, ionic strength 0.02), stirred at room temperature for a period of 1 hour and then filtered off (this measure is repeated until the Materials that have not been adsorbed on the DÄAÄ-Sephadex A-25 have been completely removed). The DÄAÄ-Sephadex A-25 obtained in this way is suspended in 50 l of water. 2-mercaptoethanol is added to the suspension in such a way that the final concentration of the 2-mercaptoethanol reaches 20% (weight / volume). After adjusting the pH to a value of 3, the suspension is stirred at room temperature for a period of 2 hours. The DÄAÄ-Sephadex A-25 is then separated off as a solid phase by filtering the suspension, whereupon the filtrate is poured onto the solid phase of the DÄAÄ-Sephadex A-25. All of the CoA adsorbed on the DÄAÄ Sephadex A-25 is converted into reduced CoA by the measures described above. The separated DÄAÄ-Sephadex A-25 is suspended in 50 l of an aqueous lithium chloride solution (pH 2.5, ionic strength O f O2), stirred at room temperature for a period of 1 hour and then filtered (this measure is repeated until the filtrate negative for the nitroprusside reaction). The DÄAÄ-Sephadex A-25 obtained in this way is suspended in 50 l of water. Aqueous hydrogen peroxide is added to the suspension in such an amount that the final concentration of the hydrogen peroxide is 1% (weight / volume)
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beträgt. Nach dem Einstellen des pH-Wertes auf 7 wird die Suspension bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 2 Stunden gerührt. Dann wird das DÄAÄ-Sephadex A-25 als feste Phase durch Filtrieren der Suspension abgetrennt, worauf das Filtrat auf die feste Phase des DiiAÄ-Sephadex A-25 gegossen wird. Reduziertes CoA, das an dem DÄAÄ-Sephadex A-25 adsorbiert ist, wird dabei in oxydiertes CoA umgewandelt. Das abgetrennte DÄAÄ-Sephadex A-25 wird in 50 1 einer wässrigen Lithiumchloridlösung '.(pH 2,5, Ionenstärke 0,1) suspendiert, bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 2 Stunden gerührt und anschliessend filtriert (diese Maßnahme wird solange wiederholt, bis das Wasserstoffperoxyd sowie die anderen Verunreinigungen vollständig entfernt sind). Das DÄAÄ-Sephadex A-25, das auf diese Weise erhalten wird, wird in 20 1 einer wässrigen Lithiumchloridlösung (pH 3, Ionenstärke 0,5) suspendiert, während einer Zeitspanne von 3 Stunden gerührt und dann filtriert, wobei ein Filtrat erhalten wird t das oxydiertes CoA enthält. Nachdem diese Maßnahme wiederholt worden ist, wird das auf diese Weise erhaltene Filtrat in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 behandelt, wobei oxydiertes CoA (Lithiumsalz) erhalten wird. Die Ausbeute, berechnet als Gesamt-CoA (freie Base) beträgt 18g (60 %). Reinheit: 97 %.amounts to. After adjusting the pH to 7, the suspension is stirred at room temperature for a period of 2 hours. The DÄAÄ-Sephadex A-25 is then separated off as a solid phase by filtering the suspension, whereupon the filtrate is poured onto the solid phase of the DiiAÄ-Sephadex A-25. Reduced CoA, which is adsorbed on the DÄAÄ-Sephadex A-25, is converted into oxidized CoA. The separated DÄAÄ Sephadex A-25 is suspended in 50 liters of an aqueous lithium chloride solution (pH 2.5, ionic strength 0.1), stirred at room temperature for a period of 2 hours and then filtered (this measure is repeated until the hydrogen peroxide and other impurities have been completely removed). The DÄAÄ-Sephadex A-25 which is obtained in this manner is suspended in 20 1 of an aqueous lithium chloride solution (pH 3, ionic strength 0.5), over a period of 3 hours, stirred and then filtered to obtain a filtrate t which contains oxidized CoA. After this operation is repeated, the filtrate thus obtained is treated in the same manner as in Example 2 to obtain oxidized CoA (lithium salt). The yield, calculated as total CoA (free base), is 18 g (60%). Purity: 97%.
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